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Medicine

Un modelo modificado de dos riñones y un ratón clip de regulación de renina en la estenosis de la arteria renal

Published: October 26, 2020 doi: 10.3791/61058
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine/Clinical Pharmacology Division, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Se desarrolló un modelo modificado de ratón Goldblatt de 2 riñones 1 clip (2K1C) utilizando tubos de poliuretano para iniciar la estenosis de la arteria renal, induciendo un aumento en la expresión de renina y lesión renal. Aquí, describimos un procedimiento detallado de preparación y colocación del manguito en la arteria renal para generar un modelo de ratón 2K1C reproducible y consistente.

Abstract

La estenosis de la arteria renal es una afección común en pacientes con enfermedad coronaria o vascular periférica donde el sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA) está sobreactivado. En este contexto, hay un estrechamiento de las arterias renales que estimulan un aumento en la expresión y liberación de renina, la proteasa limitante de la velocidad en RAAS. El aumento resultante en la expresión de renina es un impulsor conocido de la hipertensión renovascular, frecuentemente asociada con lesión renal y daño a los órganos terminales. Por lo tanto, existe un gran interés en desarrollar nuevos tratamientos para esta condición. El mecanismo molecular y celular del control de la renina en la estenosis de la arteria renal no se comprende completamente y justifica una mayor investigación. Para inducir estenosis de la arteria renal en ratones, se desarrolló un modelo modificado de ratón Goldblatt de 2 riñones 1 clip (2K1C). El riñón derecho se estenosó en ratones de tipo salvaje y se utilizaron ratones operados con simulacro como control. Después de la estenosis de la arteria renal, determinamos la expresión de renina y la lesión renal. Se recolectaron riñones y se utilizaron cortezas frescas para determinar la expresión de proteínas y ARNm de renina. Este modelo animal es reproducible y se puede utilizar para estudiar respuestas fisiopatológicas, vías moleculares y celulares involucradas en la hipertensión renovascular y la lesión renal.

Introduction

La estenosis de la arteria renal (RAStenosis) es un problema intratable que afecta a alrededor del 6% de las personas mayores de 65 años y en hasta el 40% de las personas con enfermedad coronaria o vascular periférica 1,2. Los tratamientos actuales para la enfermedad son limitados; por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar nuevas terapias para tratar la hipertensión renovascular o la hipertensión resistente inducida por RAStenosis. El sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA) es la vía clave implicada en la patogénesis de la hipertensión inducida por RAStenosis o hipertensión renovascular 3,4. Las terapias conocidas dirigidas al SRAA, como los inhibidores de la ECA o los bloqueadores de los receptores de angiotensina, alivian la hipertensión, pero necesitan un examen minucioso para detectar insuficiencia renal e hiperpotasemia 5,6,7. La renina cataliza el paso de limitación de velocidad en RAAS; convierte el angiotensinógeno en angiotensina I. En la aterosclerosis, la formación de placa causa el estrechamiento de la arteria renal que impulsa la secreción de renina, lo que resulta en hipertensión renovascular y daño renal8. Varios estudios han reportado un aumento de los niveles de estrés oxidativo durante la hipertensión renovascular en humanos, que fueron corroborados con el modelo de dos ratones de riñón un clip (2K1C), así como otros modelos animales hipertensos 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . El mecanismo molecular del control de la expresión de renina durante la hipertensión renovascular inducida por RAStenosis no se comprende bien y justifica una mayor investigación.

Los modelos animales experimentales que recapitulan RAStenosis de manera confiable y reproducible son importantes para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares del control de la expresión de renina para el desarrollo de nuevas terapias. El modelo de ratón 2K1C es un modelo experimental bien establecido para estudiar la patogénesis de la hipertensión renovascular17,18,19,20. Este modelo es generado por la constricción de la arteria renal utilizando un clip 17,20,21, produciendo así la oclusión de la arteria renal que resulta en un aumento de la expresión de renina e hipertensión17,19,20,21. Sin embargo, no hay informes técnicos disponibles, que describen un procedimiento paso a paso para generar estenosis de la arteria renal en modelos animales.

Se han utilizado clips de plata convencionales en forma de U, tubos de poliuretano y otros clips para constreñir la arteria renal para inducir la estenosis de la arteria renal. Algunos estudios han demostrado que el diseño y el material del clip son críticos para obtener datos confiables y reproducibles con el modelo animal 2K1C. Según Lorenz et al., el uso de clips de plata convencionales diseñados en U induce una baja tasa de éxito de la hipertensión arterial (40-60%)21. Debido al diseño del clip, la arteria renal se presiona lateralmente, lo que desencadena algunas constricciones y una mayor probabilidad de desprenderse de la arteria renal. La maleabilidad y ductilidad de la plata pueden permitir cambios en los anchos de los clips; por lo tanto, causando diferentes niveles de hipertensión entre los ratones. Los dióxidos de plata en el clip pueden causar inflamación perivascular, proliferación de la íntima y granulación del tejido, alterando el diámetro de la arteria renal22. Debido a la variabilidad en los niveles de hipertensión obtenidos con el clip de plata convencional U-design, Warner et al. y Lorenz et al. han utilizado con éxito un tubo de poliuretano de diseño más redondo para iniciar la estenosis de la arteria renal en ratones, generando una inducción más confiable y consistente de los dos riñones un clip animal modelo20,21.

En este informe, describimos un protocolo quirúrgico para generar RAStenosis experimental en ratones, utilizando el tubo de poliuretano para constreñir la arteria renal. El manguito de diseño redondo de poliuretano es un clip más reproducible, confiable y de bajo costo para generar estenosis en el ratón. El objetivo de este modelo experimental es estudiar y definir el mecanismo molecular y celular del control de la expresión de renina durante la estenosis de la arteria renal. Confirmamos el éxito del modelo de ratones RAStenosis midiendo la expresión de renina y el marcador de lesión renal de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (N-GAL).

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Protocol

Los ratones fueron alojados y cuidados en la División de Cuidado de Animales del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt (VUMC) siguiendo las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de VUMC antes de comenzar los experimentos.

1. Preparación y disección de animales

  1. Encienda el germinador y la bomba de agua de la almohadilla térmica unos 30 minutos antes de comenzar la cirugía.
  2. Corte tubos de poliuretano de 0,5 mm de longitud con un bisturí afilado. Retire 0,2 mm de la circunferencia haciendo un corte longitudinal para hacer un manguito.
    NOTA: Esta es una parte crítica del procedimiento de estenosis de la arteria renal que requiere extrema precisión, atención a los detalles y paciencia. Trate de cortar varias piezas de tubos de poliuretano a la vez. Realice todo este procedimiento bajo el microscopio.
  3. Antes de continuar, póngase guantes estériles quirúrgicos y una máscara quirúrgica.
  4. Utilice ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT) de 6-8 semanas. Use un número igual de ratones machos y hembras para evitar cualquier sesgo sexual.
  5. Registre el peso de los ratones antes de realizar la cirugía. El peso ideal para realizar estenosis de la arteria renal con tubo de poliuretano es de 18-22 g. Manipule los ratones suavemente y no agite mientras inyecta la anestesia. Administrar analgesia preoperatoria (Ketofgen, 5 mg/kg de peso corporal).
    NOTA: Al transferir los ratones de su habitación de alojamiento a la sala de cirugía, llévelos con gran delicadeza y cuidado para evitar la agitación. Llevar jaulas de ratones en las manos en lugar de un carrito es muy recomendable.
  6. Anestesiar a los ratones con una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) mediante inyecciones intraperitoneales (I.P.).
  7. Coloque el ratón de nuevo dentro de la jaula hasta que esté completamente anestesiado. Toma alrededor de 4-5 minutos antes de que el ratón esté completamente inconsciente. Pellizque la cola o el dedo del pie con fórceps para verificar si el ratón está completamente inconsciente y listo para la cirugía.
  8. Coloque el mouse boca arriba sobre una toalla de papel. Retire el vello del abdomen lateral con un cortapelos eléctrico siguiendo la dirección opuesta al crecimiento del vello. Después de afeitarse el sitio quirúrgico, limpie el área con un exfoliante quirúrgico que contenga yodo (o clorhexidina) seguido de un enjuague con etanol al 70% (o solución salina estéril).  Repita 3 veces.
    NOTA: El procedimiento de depilación debe realizarse a cierta distancia o preferiblemente en un banco diferente al del banco de procedimiento de cirugía para evitar cualquier interferencia de vello y contaminación del vello durante el procedimiento quirúrgico.
  9. Cubra la almohadilla térmica con una lámina estéril. Lleve el ratón al banco quirúrgico y colóquelo sobre la lámina estéril, mirando hacia el lado lateral derecho del ratón hacia el microscopio. Mantener una temperatura constante de la almohadilla de 37 °C con agua circulante.
  10. Abra la bolsa esterilizada que contiene todo el equipo quirúrgico. Usando un microscopio de disección y tijeras estériles para objetos punzantes, haga una pequeña incisión en el flanco (cerca de la13ª costilla torácica, la última costilla en el ratón) y a unos 0,5 cm de distancia de las vértebras. Proceda a lo largo de las vértebras lumbares y haga una incisión de 1 pulgada.
  11. Retire la piel y el músculo para exponer el riñón.
  12. Limpie y elimine la grasa circundante con hisopos de algodón estériles para aislar la arteria renal. Aislar el nervio renal de la arteria renal usando fórceps curvos.
  13. Al realizar la cirugía simulada, aplique suturas para cerrar la piel y aplique antibióticos a la herida cerrada, luego proceda a los cuidados postoperatorios. Si no es así, proceda con la siguiente sección para estenosis de la arteria.
    NOTA: Cada experimento debe tener animales simulados como controles del procedimiento quirúrgico. Los animales simulados consisten en ratones que han pasado por el procedimiento quirúrgico de exponer la arteria renal sin colocar un manguito sobre ella.

2. Estenosis de la arteria renal derecha

  1. Coloque dos suturas de nylon debajo de la arteria renal derecha, haga nudos sueltos y luego coloque el manguito alrededor de la arteria renal principal aproximadamente equidistante entre el riñón y la bifurcación de la aorta
  2. Cierre el manguito con las suturas de nylon. Haga cuatro nudos para cada sutura para evitar la probabilidad de perder las suturas después de la cirugía.
  3. Cierre la incisión en el músculo aplicando una sutura continua simple.
  4. Haga suturas simples interrumpidas para cerrar la piel.
  5. Administrar analgésicos aprobados por IACUC.
    NOTA: Herramientas quirúrgicas de autoclave antes de cada uso. Si se realiza más de una cirugía a la vez, limpie todas las herramientas usadas con un medidor de alcohol estéril y colóquelas en un germinador caliente durante 15-30 s después de cada cirugía. Cambie los guantes estériles también para cada ratón.

3. Cuidados postoperatorios

  1. Devuelva a los ratones a su jaula y deje la jaula medio encendida, mitad apagada, una almohadilla de calentamiento de agua circulante durante 2 a 3 horas. Agregue alimentos de recuperación de la dieta en gel dentro de la jaula.
  2. Administrar analgésico (ketoprofeno) por vía intraperitoneal (dosis: 5 mg/kg pc) al día siguiente.
  3. Pesar los ratones durante los próximos dos días; si algunos ratones pierden más del 20% de su peso consulte con el veterinario y decida si el animal necesita ser sacrificado siguiendo el procedimiento apropiado autorizado por IACUC.
  4. Controle a los ratones diariamente para evaluar si hay enrojecimiento, hinchazón, dolor o infección.
  5. Buscar consulta veterinaria por complicaciones postoperatorias de acuerdo con las políticas institucionales de IACUC.

4. Recolección de tejidos

  1. Cosechar tejido 3 semanas después del procedimiento quirúrgico. Registra el peso de cada ratón.
  2. Eutanasia del ratón con un procedimiento aprobado por IACUC.
  3. Coloque el ratón en una plataforma estéril en posición supina para diseccionar.
  4. Asegure y extienda las extremidades para limitar el movimiento.
  5. Rocíe bien los ratones con etanol al 70%.
  6. Haga una incisión en la línea media para abrir el abdomen y el área del pecho con tijeras afiladas.
  7. Retire la piel y la pared peritoneal.
  8. Exponga cuidadosamente el corazón y perfore el ventrículo derecho y exangre al ratón.
  9. Extirpar ambos riñones con fórceps. Los riñones se encuentran en la parte posterior de los ratones.
    NOTA: No mezcle ambos riñones. Tenga cuidado con los riñones estenosados, simulados y contralaterales.
  10. Retire la cápsula de riñón, límpielas de cualquier grasa y registre el peso de cada riñón por separado.
  11. Cortar una sección longitudinal de ambos riñones y fijar en PFA al 4% durante la noche a 4 °C para ser procesado posteriormente para la incrustación de parafina, para realizar hibridación in situ (ISH) e inmunohistoquímica (IHC). Siga los protocolos ISH e IHC como se informó23,24.
  12. Aísle la corteza del riñón restante y congele rápidamente en nitrógeno líquido para realizar Western blot. Almacenar las muestras a -80 °C hasta su análisis.
  13. Cuantificar las expresiones de renina y N-GAL con Western blot como se describe en la literatura23,24.

5. Estadísticas

  1. Utilice ANOVA unidireccional o bidireccional para experimentos con tres o más condiciones seguidas de pruebas post-hoc de Bonferroni para comparaciones entre grupos individuales. Considere un valor p igual o menor que 0.05 significativo. Utilice software (por ejemplo, GraphPad Prism 8.2) para realizar todos los análisis estadísticos.

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Representative Results

La constricción de la arteria renal aumenta la expresión de renina en el riñón estenosado mientras reprime la expresión en el riñón contralateral. Los dos riñones de un clip (2K1C) o el modelo de Goldblatt de estenosis inducen un aumento de la expresión de renina y lesión renal. Esto es reconocido como el modelo mejor representativo de estenosis unilateral de la arteria renal en humanos.

La expresión de renina y prorenina (precursor de la renina) se midió mediante inmunotransferencia. Los datos muestran que la expresión de renina y prorenina aumentó en el riñón estenosado en comparación con los riñones contralaterales y simulados, lo que sugiere que el manguito estaba constriñendo la arteria renal causando cambios en la perfusión renal (Figura 1). Para visualizar la localización de la expresión de renina, se realizó IHC. IHQ corroboró los datos de inmunotransferencia que muestran una mayor expresión de renina en el riñón recortado (Figura 2). Además, se observó reclutamiento de células yuxtaglomerulares (JG) a lo largo de la arteriola aferente en el riñón estenosado (Figura 2). Para investigar el efecto sobre los niveles de expresión de ARNm de renina, se realizó ISH. Los datos de ISH sugieren un aumento del ARNm de renina y el reclutamiento de células JG en el riñón estenosado en comparación con los riñones contralaterales y simulados (Figura 3).

Otra característica de la estenosis de la arteria renal es la regulación positiva de los marcadores de lesión renal debido a cambios en la perfusión renal, producción de superóxido e hipertensión 2,25,26. La lipocalina asociada a gelatinasa neutrófila (NGAL) es un marcador de lesión aguda bien caracterizado y se sobreexpresa durante la lesión renal27,28. Por lo tanto, el marcador NGAL de lesión renal aguda se midió mediante inmunotransferencia. Los datos de inmunotransferencia mostraron que el N-GAL estaba altamente regulado al alza en el riñón estenosado en comparación con los riñones contralaterales y simulados (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Expresión de renina. Después de 15 y 3 días de estenosis de la arteria renal, los ratones fueron sacrificados. Se cosecharon riñones y la expresión de renina se determinó mediante Western blot. (A) muestra imágenes representativas de Western blots de ratones estenosados (panel izquierdo) y simulados de 15 días (panel derecho). (B) muestra el análisis densitométrico de las bandas de proteínas prorenina (panel izquierdo) y renina (panel derecho). Se utilizó beta-actina como control de carga. (C) muestra las imágenes representativas de Western blots de ratones estenosados (panel izquierdo) y simulados de 3 días (panel derecho). (D) muestra un análisis densitométrico de las bandas de proteínas prorenina (panel izquierdo) y renina (panel derecho). Se utilizó beta-actina como control de carga. Los datos se presentan como la media ± el valor DE. P calculado con ANOVA bidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey. *P<0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, N=3-6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis inmunohistoquímico para visualización y localización de la expresión de renina después de la estenosis de la arteria renal. Los riñones se aislaron después de la eutanasia de ratones de estenosis de la arteria renal de 3 días. Una pieza del corte longitudinal de todo el riñón se fijó con una solución de formalina tamponada neutra al 4%, después de eso se deshidrató en una serie de etanol graduado y se incrustó en parafina. La tinción verde representa la expresión de proteína renina; azul, núcleos. (A) Imágenes microscópicas representativas de riñón estenosado (lado izquierdo), riñón contralateral (lado derecho) de ratones estenosados. (B) Imágenes representativas de microscopía de riñón simulado (lado izquierdo) y riñón contralateral (lado derecho) de ratones simulados. Barra de escala 30 micras. Aumento de 90X. (C) Imágenes microscópicas representativas de riñón estenosado (lado izquierdo), riñón contralateral (lado derecho) de ratones estenosados. (D) Imágenes representativas de microscopía de riñón simulado (lado izquierdo) y riñón contralateral (lado derecho) de ratones simulados. Estas imágenes fueron tomadas principalmente de la región de la corteza. Barra de escala 50 μm. Aumento de 15x. Los círculos punteados blancos denotan la ubicación de los glomérulos. G: G: Glomérulos, AfAr: Arteriola aferente, N=4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de hibridación in situ de la expresión del ARNm de renina después de la estenosis de la arteria renal. Después de 3 días de estenosis de la arteria renal, los ratones fueron sacrificados y los riñones fueron aislados y fijados por perfusión con una solución de formalina tamponada neutra al 4%, deshidratados en una serie de etanol graduado e incrustados en parafina. La hibridación in situ se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. La tinción de color rojo oscuro representa la expresión de renina del ARNm; azul, núcleos. (A) . Imagen microscópica representativa de riñones estenosados (lado izquierdo) y riñón contralateral (lado derecho) de ratones estenosados. (B) . Imagen microscópica representativa de riñón simulado (lado izquierdo) y riñón contralateral (lado derecho) de ratones simulados. Barra de escala 50 μm. Los círculos punteados blancos denotan glomérulos que expresan renina. G: G: Glomérulos, AfAr: Arteriola aferente, N=4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Expresión de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (N-GAL) después de la estenosis de la arteria renal. Después de la estenosis de la arteria renal de 3 días, los ratones fueron sacrificados y se cosecharon riñones, y la expresión de N-GAL se midió con Western blot. (A) Imágenes representativas de Western blots de ratones estenosados (panel izquierdo) y simulados de 3 días (panel derecho). Se utilizó beta-actina como control de carga. (B) Análisis densitométrico de bandas N-GAL. Los valores de densidad proteica de N-GAL se normalizaron a β-actina. Los datos se presentan como la media ± el valor DE. P calculado con ANOVA bidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey. **P<0.01, ***P< 0.001, N=3-5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La estenosis de la arteria renal es una causa importante de hipertensión secundaria o resistente, y lesión renal 1,29. El modelo Goldblatt de dos riñones y un clip (2K1C) se ha empleado para estudiar la hipertensión renovascular inducida por RAStenosis 1,17,18,19. Varios estudios previos con varios modelos animales han demostrado que la estenosis en la arteria renal es un fuerte estimulador de la sobreexpresión y liberación de renina, y la lesión renal 18,30,31,32,33,34,35. Además, este modelo se utiliza para estudiar la infiltración de células inmunes, fibrosis, inflamación y marcadores de lesión renal aguda y crónica29.

Aquí, describimos un procedimiento detallado y paso a paso para generar un modelo de estenosis de la arteria renal reproducible, confiable y consistente en ratones. Anteriormente, se emplearon clips metálicos para iniciar la estenosis de la arteria renal36,37,38. Como alternativa, utilizamos tubos redondos de poliuretano (MRE 025; diámetro interno (ID) = 0,30 mm; diámetro exterior (OD) = 0,63 mm; espesor de pared, (WT) = 0,16 mm). Utilizamos tubos, ya que la colocación de un manguito de poliuretano resultaría en constricción en dos dimensiones (constricción) en lugar de una (aplanamiento), como con un clip de metal. Además, el uso de tubos redondos de poliuretano proporciona una ventaja de constricción uniforme en la arteria renal. El paso crítico y los desafíos son cortar el tamaño correcto de los tubos de poliuretano, lo que requiere una atención extrema a los detalles que deben realizarse con un microscopio. Otro criterio crítico es mantener a los ratones entre 18-22 g para encajar el tubo en la arteria renal. Los ratones dentro de este rango de peso normalmente tienen un diámetro externo de la arteria renal (OD) que está constantemente dentro del rango del diámetro del manguito del tubo. Una limitación del método es que los ratones pesados (por encima de 25 g) o pequeños (por debajo de 16 g) son difíciles de realizar la cirugía debido al tamaño del tubo y el manguito hecho en él. Sin embargo, cuando sea necesario, se pueden hacer cambios en el tubo de poliuretano para acomodar ratones más jóvenes o más viejos.

Hemos realizado estudios de 3 días y 15 días para iniciar la estenosis de la arteria renal en ratones con una tasa de éxito de aproximadamente el 95%. En nuestra experiencia, la inducción de la estenosis de la arteria renal utilizando este método produjo resultados confiables, reproducibles y consistentes entre los ratones, independientemente del sexo. Para confirmar la constricción de la arteria renal, se midió la expresión de renina y la lesión renal. Nuestros datos sugieren que la expresión de renina aumentó significativamente en el riñón estenosado.

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Disclosures

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses, financieros o de otro tipo.

Acknowledgments

La investigación fue apoyada por la Subvención de Desarrollo de Científicos Investigadores del NHLBI (1K01HL135461-01) a JAG. Gracias a David Carmona-Berrio e Isabel Adarve-Rengifo por su asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diet Gel Clear H2O Diet-Gel 76A Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad Hallowell 000A2788B Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture Ethicon 662G 4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture Ethicon 2815 G 8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500 Braintree Scientific Inc. GER 5287 Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen Zoetis Ketofen Painkiller
Polyurethane Braintree Scientific Inc. MRE-025 This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks Medline MDS093901 It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co 204-1000 This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes Dynarex 4410 It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment Medi-First 22312
Water pump Stryker T/pump Professionals Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery

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Medicina Número 164 Dos riñones un clip (2K1C) Estenosis de la arteria renal Sistema de renina angiotensina aldosterona expresión de renina lesión renal modelo de ratón
Un modelo modificado de dos riñones y un ratón clip de regulación de renina en la estenosis de la arteria renal
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Saleem, M., Barturen-Larrea, P., Saavedra, L., Gomez, J. A. A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis. J. Vis. Exp. (164), e61058, doi:10.3791/61058 (2020).

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