Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج فأر مصاب واحد من الكلى المعدل لتنظيم الرينين في تضيق الشريان الكلوي

Published: October 26, 2020 doi: 10.3791/61058
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine/Clinical Pharmacology Division, Vanderbilt University Medical Center

Summary

تم تطوير نموذج فأر Goldblatt معدل 2 كليب الكلى 1 (2K1C) باستخدام أنابيب البولي يوريثين لبدء تضيق الشريان الكلوي ، مما يؤدي إلى زيادة في التعبير عن الرينين وإصابة الكلى. هنا ، نصف إجراء مفصلا لإعداد ووضع الكفة على الشريان الكلوي لإنشاء نموذج ماوس 2K1C قابل للتكرار ومتسق.

Abstract

تضيق الشريان الكلوي هو حالة شائعة في المرضى الذين يعانون من أمراض الأوعية الدموية التاجية أو الطرفية حيث يتم تنشيط نظام الألدوستيرون أنجيوتنسين الرينين (RAAS). في هذا السياق ، هناك تضييق في الشرايين الكلوية التي تحفز زيادة في التعبير عن الرينين وإطلاقه ، وهو البروتياز الذي يحد من المعدل في RAAS. الارتفاع الناتج في تعبير الرينين هو محرك معروف لارتفاع ضغط الدم الوعائي ، وغالبا ما يرتبط بإصابة الكلى وتلف الأعضاء النهائية. وبالتالي ، هناك اهتمام كبير بتطوير علاجات جديدة لهذه الحالة. الآلية الجزيئية والخلوية للسيطرة على الرينين في تضيق الشريان الكلوي ليست مفهومة تماما وتستدعي المزيد من التحقيق. للحث على تضيق الشريان الكلوي في الفئران ، تم تطوير نموذج فأر Goldblatt معدل 2 كليب الكلى 1 (2K1C). تم تضيق الكلى اليمنى في الفئران من النوع البري وتم استخدام الفئران التي تعمل بشكل صوري كسيطرة. بعد تضيق الشريان الكلوي ، حددنا تعبير الرينين وإصابة الكلى. تم حصاد الكلى ، وتم استخدام القشرة الطازجة لتحديد تعبير البروتين والحمض النووي الريبوزي المرسال عن الرينين. هذا النموذج الحيواني قابل للتكرار ويمكن استخدامه لدراسة الاستجابات الفسيولوجية المرضية والمسارات الجزيئية والخلوية المشاركة في ارتفاع ضغط الدم الوعائي وإصابة الكلى.

Introduction

تضيق الشريان الكلوي (RAStenosis) هو مشكلة مستعصية تؤثر على حوالي 6٪ من الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما وفي ما يصل إلى 40٪ من الأشخاص المصابين بأمراض الأوعية الدموية التاجية أو الطرفية 1,2. العلاجات الحالية للمرض محدودة. لذلك ، هناك حاجة ماسة لتطوير علاجات جديدة لعلاج ارتفاع ضغط الدم الوعائي أو ارتفاع ضغط الدم المقاوم الناجم عن RAStenosis. نظام الألدوستيرون أنجيوتنسين الرينين (RAAS) هو المسار الرئيسي المشارك في التسبب في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن RAStenosis أو ارتفاع ضغط الدم الوعائي 3,4. العلاجات المعروفة التي تستهدف RAAS ، مثل مثبطات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين أو حاصرات مستقبلات الأنجيوتنسين ، تخفف من ارتفاع ضغط الدم ، ولكنها تحتاج إلى فحص دقيق للفشل الكلوي وفرط بوتاسيوم الدم 5,6,7. الرينين يحفز خطوة الحد من المعدل في RAAS. يحول الأنجيوتنسينوجين إلى الأنجيوتنسين I. في تصلب الشرايين ، يسبب تكوين اللويحات تضييق الشريان الكلوي الذي يدفع إفراز الرينين ، مما يؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم الوعائي وتلف الكلى8. أبلغ عدد من الدراسات عن زيادة مستويات الإجهاد التأكسدي أثناء ارتفاع ضغط الدم الوعائي لدى البشر ، والتي تم تأكيدها بنموذج الفئران ذات المشبك الواحد (2K1C) بالإضافة إلى نماذج حيوانية أخرى لارتفاع ضغط الدم 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . الآلية الجزيئية للتحكم في التعبير عن الرينين أثناء ارتفاع ضغط الدم الوعائي الناجم عن RAStenosis ليست مفهومة جيدا وتستدعي المزيد من التحقيق.

تعد النماذج الحيوانية التجريبية التي تلخص RAStenosis بشكل موثوق ومتكرر مهمة في توضيح الآليات الخلوية والجزيئية للتحكم في تعبير الرينين لتطوير علاجات جديدة. نموذج الفأر 2K1C هو نموذج تجريبي راسخ لدراسة التسبب في ارتفاع ضغط الدم الوعائي17،18،19،20. يتم إنشاء هذا النموذج عن طريق انقباض الشريان الكلوي باستخدام مقطع 17،20،21 ، وبالتالي إنتاج انسداد الشريان الكلوي الذي يؤدي إلى زيادة في التعبير عن الرينين وارتفاع ضغط الدم17،19،20،21. ومع ذلك ، لا توجد تقارير فنية متاحة ، والتي تصف إجراء خطوة بخطوة لتوليد تضيق الشريان الكلوي في النماذج الحيوانية.

تم استخدام مقاطع الفضة التقليدية على شكل حرف U وأنابيب البولي يوريثين وغيرها من المشابك لتضييق الشريان الكلوي للحث على تضيق الشريان الكلوي. أظهرت بعض الدراسات أن تصميم ومواد المقطع أمران حاسمان للحصول على بيانات موثوقة وقابلة للتكرار باستخدام النموذج الحيواني 2K1C. وفقا ل Lorenz et al. ، فإن استخدام مقاطع الفضة التقليدية المصممة على شكل حرف U يحفز معدل نجاح منخفض لارتفاع ضغط الدم (40-60٪)21. بسبب تصميم المشبك ، يتم الضغط على الشريان الكلوي أفقيا ، مما يؤدي إلى بعض الانقباضات واحتمال أكبر للإزاحة من الشريان الكلوي. قد تسمح مرونة الفضة وليونتها بإجراء تغييرات في عرض المشبك ؛ لذلك ، مما تسبب في مستويات مختلفة من ارتفاع ضغط الدم بين الفئران. يمكن أن تسبب ثاني أكسيد الفضة على المشبك التهابا حول الأوعية الدموية ، والانتشار الداخلي ، وتحبيب الأنسجة ، مما يغير قطر الشريان الكلوي22. نظرا للتباين في مستويات ارتفاع ضغط الدم التي تم الحصول عليها باستخدام المشبك الفضي التقليدي U-design ، نجح Warner et al. و Lorenz et al. في استخدام أنبوب البولي يوريثين ذو التصميم الدائري لبدء تضيق الشريان الكلوي في الفئران ، مما أدى إلى توليد تحريض أكثر موثوقية واتساقا للنموذج الحيواني للكليتين ذات المقطع الواحد20,21.

في هذا التقرير ، نصف بروتوكولا جراحيا لتوليد RAStenosis التجريبي في الفئران ، باستخدام أنبوب البولي يوريثين لتضييق الشريان الكلوي. الكفة ذات التصميم الدائري من البولي يوريثين هي مشبك أكثر قابلية للتكرار وموثوق به ومنخفض التكلفة لتوليد تضيق في الماوس. الهدف من هذا النموذج التجريبي هو دراسة وتحديد الآلية الجزيئية والخلوية للتحكم في تعبير الرينين أثناء تضيق الشريان الكلوي. لقد أكدنا نجاح نموذج الفئران RAStenosis عن طريق قياس تعبير الرينين وعلامة إصابة الكلى العدلات المرتبطة بالجيلاتيناز (N-GAL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إيواء الفئران ورعايتها في قسم رعاية الحيوان في المركز الطبي بجامعة فاندربيلت (VUMC) باتباع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ودليل رعاية واستخدام المختبر ، وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة VUMC المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات قبل بدء التجارب.

1. إعداد الحيوان وتشريحه

  1. قم بتشغيل عامل النبت ومضخة المياه في وسادة التدفئة قبل حوالي 30 دقيقة من بدء الجراحة.
  2. قطع أنابيب البولي يوريثين بطول 0.5 مم باستخدام مشرط حاد. قم بإزالة 0.2 مم من المحيط عن طريق إجراء قطع بالطول لإنشاء كفة.
    ملاحظة: هذا جزء مهم من إجراء تضيق الشريان الكلوي الذي يتطلب دقة فائقة واهتماما بالتفاصيل والصبر. حاول قطع عدة قطع من أنابيب البولي يوريثين في وقت واحد. تنفيذ كل هذا الإجراء تحت المجهر.
  3. قبل المضي قدما ، ضع قفازات جراحية معقمة وقناعا جراحيا.
  4. استخدم الفئران C57BL/6 من النوع البري (WT) لمدة 6-8 أسابيع. استخدم عددا متساويا من الفئران الذكور والإناث لتجنب أي تحيز جنسي.
  5. سجل وزن الفئران قبل إجراء الجراحة. الوزن المثالي لأداء تضيق الشريان الكلوي مع أنبوب البولي يوريثين هو 18-22 جم. تعامل مع الفئران بلطف ولا تهيج أثناء حقن التخدير. إدارة مسكن ما قبل الجراحة (Ketofgen ، 5 ملغ / كغم من الجسم wieght).
    ملاحظة: أثناء نقل الفئران من غرفة السكن الخاصة بهم إلى غرفة الجراحة ، احملها بلطف وعناية كبيرين لتجنب الإثارة. يوصى بشدة بحمل أقفاص الفئران في اليدين بدلا من العربة.
  6. تخدير الفئران بمزيج من الكيتامين (100 مغ/كغ من وزن الجسم) وزيلازين (10 مغ/كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق (I.P).
  7. ضع الماوس مرة أخرى داخل القفص حتى يتم تخديره بالكامل. يستغرق الأمر حوالي 4-5 دقائق قبل أن يكون الماوس فاقدا للوعي تماما. قرصة الذيل أو إصبع القدم مع ملقط للتحقق مما إذا كان الماوس فاقدا للوعي تماما وجاهزا للجراحة.
  8. ضع الماوس على ظهره على منشفة ورقية. قم بإزالة شعر البطن الجانبي باستخدام ماكينة قص الشعر الكهربائية باتباع الاتجاه المعاكس لنمو الشعر. بعد حلاقة الموقع الجراحي ، قم بتنظيف المنطقة باستخدام مقشر جراحي يحتوي على اليود (أو الكلورهيكسيدين) يليه شطف بنسبة 70٪ من الإيثانول (أو محلول ملحي معقم).  كرر 3 مرات.
    ملاحظة: يجب إجراء عملية إزالة الشعر على مسافة ما أو يفضل أن تكون على مقعد مختلف عن مقعد إجراء الجراحة لتجنب أي تداخل في الشعر وتلوث الشعر أثناء إجراء الجراحة.
  9. قم بتغطية وسادة التدفئة بورقة معقمة. أحضر الماوس إلى المقعد الجراحي وضعه على الورقة المعقمة ، في مواجهة الجانب الجانبي الأيمن للفأر نحو المجهر. الحفاظ على درجة حرارة وسادة ثابتة من 37 درجة مئوية مع الماء المتداول.
  10. افتح الكيس المعقم الذي يحتوي على جميع المعدات الجراحية. باستخدام مجهر تشريح ومقص حاد معقم ، قم بعمل شق صغير في الجناح (بالقرب من الضلعالصدري 13 ، الضلع الأخير في الماوس) وعلى بعد حوالي 0.5 سم من الفقرات. المضي قدما على طول الفقرات القطنية وإجراء شق 1 بوصة.
  11. اسحب الجلد والعضلات إلى الخلف لفضح الكلى.
  12. تنظيف وإزالة الدهون المحيطة باستخدام مسحات القطن المعقمة لعزل الشريان الكلوي. عزل العصب الكلوي عن الشريان الكلوي باستخدام ملقط منحني.
  13. عند إجراء الجراحة الصورية ، ضع الغرز لإغلاق الجلد وتطبيق المضادات الحيوية على الجرح المغلق ، ثم انتقل إلى رعاية ما بعد الجراحة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فتابع القسم التالي لتضيق الشريان.
    ملاحظة: يجب أن تحتوي كل تجربة على صورية كعناصر تحكم في الإجراء الجراحي. تتكون الحيوانات الوهمية من الفئران التي خضعت للإجراء الجراحي المتمثل في كشف الشريان الكلوي دون وضع الكفة عليه.

2. تضيق الشريان الكلوي الأيمن

  1. ضع غرطتين من النايلون تحت الشريان الكلوي الأيمن ، واصنع عقدة فضفاضة ، ثم ضع الكفة حول الشريان الكلوي الرئيسي على مسافة متساوية تقريبا بين تشعب الكلى والشريان الأورطي
  2. أغلق الكفة باستخدام خيوط النايلون. اصنع أربع عقد لكل خياطة لتجنب احتمال فقدان الغرز بعد الجراحة.
  3. أغلق الشق في العضلات عن طريق تطبيق خياطة مستمرة بسيطة.
  4. اصنع خيوط متقطعة بسيطة لإغلاق الجلد.
  5. إدارة المسكنات المعتمدة من IACUC.
    ملاحظة: أدوات الأوتوكلاف الجراحية قبل كل استخدام. إذا تم إجراء أكثر من عملية جراحية واحدة في وقت واحد ، فامسح جميع الأدوات المستخدمة باستخدام مقياس كحول معقم وضعها في نبات ساخن لمدة 15-30 ثانية بعد كل عملية جراحية. تغيير قفازات معقمة أيضا لكل ماوس.

3. رعاية ما بعد الجراحة

  1. أعد الفئران إلى قفصها واترك القفص نصفه قيد التشغيل ، ونصف ، وسادة تسخين المياه المتداولة لمدة 2-3 ساعات. إضافة هلام الغذاء استعادة النظام الغذائي داخل القفص.
  2. إعطاء مسكن الألم (كيتوبروفين) داخل الصفاق (الجرعة: 5 ملغ / كغ من وزن الجسم) في اليوم التالي.
  3. وزن الفئران لليومين المقبلين ؛ إذا فقدت بعض الفئران أكثر من 20٪ من وزنها ، فاستشر الطبيب البيطري وقرر ما إذا كان الحيوان بحاجة إلى القتل الرحيم باتباع الإجراء المناسب المعتمد من IACUC.
  4. راقب الفئران يوميا لتقييم الاحمرار أو التورم أو الألم أو العدوى.
  5. طلب استشارة بيطرية لمضاعفات ما بعد الجراحة وفقا لسياسات IACUC المؤسسية.

4. حصاد الأنسجة

  1. حصاد الأنسجة بعد 3 أسابيع من العملية الجراحية. سجل وزن كل ماوس.
  2. القتل الرحيم للفأر مع إجراء معتمد من IACUC.
  3. ضع الماوس على منصة معقمة في وضع ضعيف للتشريح.
  4. تأمين الأطراف وتمديدها للحد من الحركة.
  5. رش الفئران جيدا مع 70 ٪ من الإيثانول.
  6. قم بعمل شق في خط الوسط لفتح منطقة البطن والصدر باستخدام مقص حاد.
  7. اسحب الجلد والجدار البريتوني.
  8. كشف القلب بعناية وثقب البطين الأيمن وإخراج الماوس.
  9. إزالة كلتا الكليتين باستخدام الملقط. تقع الكلى على الجزء الخلفي من الفئران.
    ملاحظة: لا تخلط الكليتين. كن على دراية بالكلى الضيقة والزائفة والمعاكسة.
  10. إزالة كبسولة الكلى، وتنظيفها من أي دهون وتسجيل وزن كل كلية على حدة.
  11. قطع قسم طولي من كل من الكلى وثابتة في 4٪ PFA بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لتتم معالجتها لاحقا لتضمين البارافين ، لإجراء التهجين في الموقع (ISH) والكيمياء النسيجية المناعية (IHC). اتبع بروتوكولات ISH و IHC كما ورد في23,24.
  12. عزل قشرة الكلى المتبقية وتجميد فلاش في النيتروجين السائل لأداء لطخة الغربية. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
  13. حدد كميا الرينين ، وتعبيرات N-GAL مع لطخة غربية كما هو موضح في الأدب23,24.

5. الإحصائيات

  1. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه لإجراء تجارب مع ثلاثة شروط أو أكثر متبوعة باختبارات Bonferroni اللاحقة المخصصة للمقارنات بين المجموعات الفردية. ضع في اعتبارك قيمة p تساوي أو تقل عن 0.05 معنوية. استخدم البرامج (على سبيل المثال، GraphPad Prism 8.2) لإجراء جميع التحليلات الإحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يزيد انقباض الشريان الكلوي من تعبير الرينين في الكلى الضيقة، بينما يقمع التعبير في الكلى المقابلة. الكلى اثنين من مقطع واحد (2K1C) أو نموذج Goldblatt من تضيق يحفز زيادة التعبير عن الرينين وإصابة الكلى. ومن المسلم به أن هذا هو أفضل نموذج تمثيلي لتضيق الشريان الكلوي من جانب واحد في البشر.

تم قياس التعبير عن الرينين والبرورينين (سلائف الرينين) باستخدام النشاف المناعي. تظهر البيانات أن تعبير الرينين والبرورينين زاد في الكلى الضيقة، مقارنة بالكلى المتعارضة والوهمية، مما يشير إلى أن الكفة كانت تضيق الشريان الكلوي مما تسبب في تغيرات في التروية الكلوية (الشكل 1). لتصور توطين تعبير الرينين ، تم تنفيذ IHC. أكدت المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بيانات النشاف المناعي التي تظهر زيادة التعبير عن الرينين في الكلى المقطوعة (الشكل 2). علاوة على ذلك ، شوهد تجنيد الخلايا المتجاورة (JG) على طول الشرايين القريبة في الكلى الضيقة (الشكل 2). للتحقيق في التأثير على مستويات تعبير الرينين mRNA ، تم إجراء ISH. تشير بيانات ISH إلى زيادة تجنيد خلايا الرينين mRNA و JG في الكلى الضيقة، مقارنة بالكلى المتعارضة والوهمية (الشكل 3).

سمة أخرى من سمات تضيق الشريان الكلوي هي زيادة تنظيم علامات إصابة الكلى بسبب التغيرات في تروية الكلى وإنتاج الأكسيد الفائق وارتفاع ضغط الدم2،25،26. الليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز العدلة (NGAL) هو علامة إصابة حادة مميزة بشكل جيد ويتم التعبير عنه بشكل مبالغ فيه أثناء إصابة الكلى27,28. لذلك ، تم قياس علامة إصابة الكلى الحادة NGAL باستخدام النشاف المناعي. أظهرت بيانات النشاف المناعي أن N-GAL كان منظما بشكل كبير في الكلى الضيقة، مقارنة بالكلى المتناقضة والوهمية (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: تعبير الرينين. بعد 15 و 3 أيام من تضيق الشريان الكلوي ، تم قتل الفئران الرحيمة. تم حصاد الكلى ، وتم تحديد تعبير الرينين بواسطة لطخة غربية. (أ) يعرض صورا تمثيلية لبقع غربية من 15 يوما مخففة (اللوحة اليسرى) والفئران الوهمية (اللوحة اليمنى). (B) يظهر التحليل المكثف لنطاقات بروتين البرينين (اللوحة اليسرى) والرينين (اللوحة اليمنى). تم استخدام بيتا أكتين كعنصر تحكم في التحميل. (C) يعرض صور البقع الغربية التمثيلية من 3 أيام من الضيق (اللوحة اليسرى) والفئران الوهمية (اللوحة اليمنى). (D) يظهر التحليل المكثف لنطاقات بروتين البرينين (اللوحة اليسرى) والرينين (اللوحة اليمنى). تم استخدام بيتا أكتين كعنصر تحكم في التحميل. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± قيمة SD. P المحسوبة باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey post-hoc . * P<0.05 ، ** P < 0.01 ، ***P < 0.001 ، N = 3-6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل الكيمياء النسيجية المناعية لتصور وتوطين تعبير الرينين بعد تضيق الشريان الكلوي. تم عزل الكلى بعد القتل الرحيم للفئران من تضيق الشريان الكلوي لمدة 3 أيام. تم إصلاح قطعة واحدة من القطع الطولي للكلية بأكملها بمحلول فورمالين محايد محايد بنسبة 4٪ ، وبعد ذلك تم تجفيفه في سلسلة إيثانول متدرجة ، وجزءا لا يتجزأ من البارافين. التلطيخ الأخضر يمثل تعبير بروتين الرينين. الأزرق ، النوى. (أ) صور مجهرية تمثيلية للكلى الضيقة، والكلى المقابلة (الجانب الأيمن) من الفئران الضيقة. (ب) صور مجهرية تمثيلية للكلى الوهمية (الجانب الأيسر) ، والكلى المقابلة (الجانب الأيمن) من الفئران الوهمية. شريط مقياس 30 ميكرون. تكبير 90X. (ج) صور مجهرية تمثيلية للكلى الضيقة، والكلى المقابلة (الجانب الأيمن) من الفئران الضيقة. (د) صور مجهرية تمثيلية للكلى الوهمية (الجانب الأيسر) ، والكلى المقابلة (الجانب الأيمن) من الفئران الوهمية. تم التقاط هذه الصور بشكل رئيسي من منطقة القشرة. شريط المقياس 50 ميكرومتر. تشير الدوائر البيضاء المنقطة إلى موقع الكبيبات. G: الكبيبات ، AfAr: الشريان Afferent ، N = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل التهجين في الموقع لتعبير الحمض النووي الريبي المرسال عن الرينين بعد تضيق الشريان الكلوي. بعد 3 أيام من تضيق الشريان الكلوي ، تم قتل الفئران الرحيم وتم عزل الكلى وتثبيت التروية بمحلول الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 4٪ ، وتجفيفها في سلسلة إيثانول متدرجة ، وتضمينها في البارافين. تم إجراء التهجين في الموقع باتباع تعليمات الشركة المصنعة. يمثل التلطيخ الأحمر الداكن تعبير الرينين mRNA. الأزرق ، النوى. (أ) . صورة مجهرية تمثيلية للكلى الضيقة (الجانب الأيسر) ، والكلى المقابلة (الجانب الأيمن) من الفئران الضيقة. (ب) . صورة مجهرية تمثيلية للكلى الوهمية (الجانب الأيسر) ، والكلى المقابلة (الجانب الأيمن) من الفئران الصورية. شريط مقياس 50 ميكرومتر. تشير الدوائر البيضاء المنقطة إلى الكبيبات التي تعبر عن الرينين. G: الكبيبات ، AfAr: الشريان Afferent ، N = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تعبير الليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز العدلة (N-GAL) بعد تضيق الشريان الكلوي. بعد تضيق الشريان الكلوي لمدة 3 أيام ، تم قتل الفئران الرحيم وحصاد الكلى ، وقياس تعبير N-GAL بواسطة لطخة غربية. (أ) صور البقع الغربية التمثيلية من 3 أيام من الستنوس (اللوحة اليسرى) والفئران الوهمية (اللوحة اليمنى). تم استخدام بيتا أكتين كعنصر تحكم في التحميل. (ب) التحليل المكثف لنطاقات N-GAL. تم تطبيع قيم كثافة البروتين من N-GAL إلى β الأكتين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± قيمة SD. P المحسوبة باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey post-hoc . ** P<0.01 ، ***P < 0.001 ، N = 3-5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تضيق الشريان الكلوي هو سبب مهم لارتفاع ضغط الدم الثانوي أو المقاوم ، وإصابة الكلى 1,29. تم استخدام نموذج Goldblatt ثنائي الكلى مقطع واحد (2K1C) لدراسة ارتفاع ضغط الدم الوعائي الناجم عن RAStenosis 1،17،18،19. وقد أظهر عدد من الدراسات السابقة باستخدام نماذج الحيوانات المختلفة أن تضيق الشريان الكلوي هو محفز قوي للإفراط في التعبير عن الرينين وإطلاقه ، وإصابة الكلى18،30،31،32،33،34،35. علاوة على ذلك ، يتم استخدام هذا النموذج لدراسة تسلل الخلايا المناعية والتليف والالتهابات وعلامات إصابة الكلى الحادة والمزمنة29.

هنا ، وصفنا إجراء مفصلا وخطوة بخطوة لإنشاء نموذج تضيق الشريان الكلوي القابل للتكرار والموثوق به والمتناسق في الفئران. في وقت سابق ، تم استخدام مقاطع معدنية لبدء تضيق الشريان الكلوي 36،37،38. كبديل ، استخدمنا أنابيب البولي يوريثين المستديرة (MRE 025 ؛ القطر الداخلي (ID) = 0.30 مم ؛ القطر الخارجي (OD) = 0.63 مم ؛ سمك الجدار ، (WT) = 0.16 مم). استخدمنا الأنابيب ، لأن وضع كفة البولي يوريثين سيؤدي إلى انقباض في بعدين (انقباض) بدلا من واحد (تسطيح) ، كما هو الحال مع مشبك معدني. أيضا ، يوفر استخدام أنابيب البولي يوريثين المستديرة ميزة انقباض موحد في الشريان الكلوي. تتمثل الخطوة والتحديات الحاسمة في قطع الحجم المناسب لأنابيب البولي يوريثين ، الأمر الذي يتطلب اهتماما شديدا بالتفاصيل التي يجب إجراؤها باستخدام المجهر. معيار حاسم آخر هو إبقاء الفئران بين 18-22 جم لتناسب الأنابيب على الشريان الكلوي. عادة ما يكون للفئران ضمن نطاق الوزن هذا قطر خارجي للشريان الكلوي (OD) يقع باستمرار ضمن نطاق قطر كفة الأنابيب. أحد قيود هذه الطريقة هو أن الفئران الثقيلة (فوق 25 جم) أو الصغيرة (أقل من 16 جم) يصعب إجراء عملية جراحية عليها بسبب حجم الأنبوب والكفة المصنوعة فيه. ومع ذلك ، عند الاقتضاء ، يمكن إجراء تغييرات في أنابيب البولي يوريثين لاستيعاب الفئران الأصغر سنا أو الأكبر سنا.

لقد أجرينا دراسات لمدة 3 أيام و 15 يوما لبدء تضيق الشريان الكلوي في الفئران بمعدل نجاح حوالي 95٪. في تجربتنا ، أدى تحريض تضيق الشريان الكلوي باستخدام هذه الطريقة إلى نتائج موثوقة وقابلة للتكرار ومتسقة بين الفئران بغض النظر عن الجنس. لتأكيد انقباض الشريان الكلوي ، قمنا بقياس تعبير الرينين وإصابة الكلى. تشير بياناتنا إلى أن تعبير الرينين زاد بشكل كبير في الكلى الضيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن المؤلفون عن أي تضارب في المصالح، سواء كانت مالية أو غير مالية.

Acknowledgments

تم دعم البحث من قبل منحة تطوير علماء أبحاث NHLBI (1K01HL135461-01) إلى JAG. شكرا لديفيد كارمونا - بيريو وإيزابيل أدارفي - رينجيفو على مساعدتهما التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diet Gel Clear H2O Diet-Gel 76A Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad Hallowell 000A2788B Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture Ethicon 662G 4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture Ethicon 2815 G 8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500 Braintree Scientific Inc. GER 5287 Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen Zoetis Ketofen Painkiller
Polyurethane Braintree Scientific Inc. MRE-025 This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks Medline MDS093901 It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co 204-1000 This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes Dynarex 4410 It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment Medi-First 22312
Water pump Stryker T/pump Professionals Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kashyap, S., et al. Blockade of CCR2 reduces macrophage influx and development of chronic renal damage in murine renovascular hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 310 (5), 372-384 (2016).
  2. Wang, W., et al. Changes in inflammatory biomarkers after renal revascularization in atherosclerotic renal artery stenosis. Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (9), 1437-1443 (2016).
  3. Yerram, P., Karuparthi, P. R., Chaudhary, K. Pathogenesis and management of renovascular hypertension and ischemic nephropathy. Minerva Urologica e Nefrologica. 64 (1), 63-72 (2012).
  4. Covic, A., Gusbeth-Tatomir, P. The role of the renin-angiotensin-aldosterone system in renal artery stenosis, renovascular hypertension, and ischemic nephropathy: diagnostic implications. Progress in Cardiovascular Diseases. 52 (3), 204-208 (2009).
  5. Barreras, A., Gurk-Turner, C. Angiotensin II receptor blockers. Proceedings. 16 (1), Baylor University. Medical Center. 123-126 (2003).
  6. Sica, D. A. Angiotensin-converting enzyme inhibitors side effects--physiologic and non-physiologic considerations. Journal of Clinical Hypertension. 6 (7), 410-416 (2004).
  7. Hill, R. D., Vaidya, P. N. Angiotensin II Receptor Blockers (ARB, ARb). StatPearls. , (2019).
  8. Durante, A., et al. Role of the renin-angiotensin-aldosterone system in the pathogenesis of atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 18 (7), 981-1004 (2012).
  9. Chen, K., et al. Plasma reactive carbonyl species: Potential risk factor for hypertension. Free Radical Research. 45 (5), 568-574 (2011).
  10. Zhang, X., et al. Angiotensin receptor blockade has protective effects on the poststenotic porcine kidney. Kidney International. 84 (4), 767-775 (2013).
  11. Zou, X., et al. Renal scattered tubular-like cells confer protective effects in the stenotic murine kidney mediated by release of extracellular vesicles. Scientific Reports. 8 (1), 1263 (2018).
  12. Kinra, M., Mudgal, J., Arora, D., Nampoothiri, M. An insight into the role of cyclooxygenase and lipooxygenase pathway in renal ischemia. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (21), 5017-5020 (2017).
  13. Cavalcanti, C. O., et al. Inhibition of PDE5 Restores Depressed Baroreflex Sensitivity in Renovascular Hypertensive Rats. Frontiers in Physiology. 7, 15 (2016).
  14. Dias, A. T., et al. Sildenafil ameliorates oxidative stress and DNA damage in the stenotic kidneys in mice with renovascular hypertension. Journal of Translational Medicine. 12, 35 (2014).
  15. Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 146 (3), 160-173 (2005).
  16. Reckelhoff, J. F., Romero, D. G., Yanes Cardozo, L. L. Sex, Oxidative Stress, and Hypertension: Insights From Animal Models. Physiology (Bethesda). 34 (3), 178-188 (2019).
  17. Goldblatt, H., Lynch, J., Hanzal, R. F., Summerville, W. W. Studies on Experimental Hypertension : I. The Production of Persistent Elevation of Systolic Blood Pressure by Means of Renal Ischemia. Journal of Experimental Medicine. 59 (3), 347-379 (1934).
  18. Gollan, F., Richardson, E., Goldblatt, H. Hypertension in the systemic blood of animals with experimental renal hypertension. Journal of Experimental Medicine. 88 (4), 389-400 (1948).
  19. Lewis, H. A., Goldblatt, H. Studies on Experimental Hypertension: XVIII. Experimental Observations on the Humoral Mechanism of Hypertension. Bulletin of the New York Academy of Medicine. 18 (7), 459-487 (1942).
  20. Warner, G. M., et al. Genetic deficiency of Smad3 protects the kidneys from atrophy and interstitial fibrosis in 2K1C hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 302 (11), 1455-1464 (2012).
  21. Lorenz, J. N., et al. Renovascular hypertension using a modified two-kidney, one-clip approach in mice is not dependent on the alpha1 or alpha2 Na-K-ATPase ouabain-binding site. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 301 (3), 615-621 (2011).
  22. Ebina, K., Iwabuchi, T., Suzuki, S. Histological change in permanently clipped or ligated cerebral arterial wall. Part II: Autopsy cases of aneurysmal neck clipping. Acta Neurochirurgica. 66 (1-2), 23-42 (1982).
  23. Saleem, M., et al. Sox6: A new modulator of renin expression during physiological conditions. bioRxiv. , (2019).
  24. Saleem, M., et al. Sox6 as a new modulator of renin expression in the kidney. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2019).
  25. Chade, A. R., Williams, M. L., Engel, J., Guise, E., Harvey, T. W. A translational model of chronic kidney disease in swine. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (2), 364-373 (2018).
  26. Xue, Y., Xu, Z., Chen, H., Gan, W., Chong, T. Low-energy shock wave preconditioning reduces renal ischemic reperfusion injury caused by renal artery occlusion. Acta Cirúrgica Brasileira. 32 (7), 550-558 (2017).
  27. Lalanne, A., Beaudeux, J. L., Bernard, M. A. NGAL: a biomarker of acute and chronic renal dysfunction. Annales de Biologie Clinique. 69 (6), 629-636 (2011).
  28. Bolignano, D., et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a marker of kidney damage. American Journal of Kidney Diseases. 52 (3), 595-605 (2008).
  29. Kashyap, S., et al. Development of renal atrophy in murine 2 kidney 1 clip hypertension is strain independent. Research in Veterinary Science. 107, 171-177 (2016).
  30. Anderson, W. P., Woods, R. L., Kline, R. L., Korner, P. I. Acute haemodynamic responses to unilateral renal artery stenosis in conscious dogs. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 12 (3), 305-309 (1985).
  31. Imanishi, M., et al. Critical degree of renal arterial stenosis that causes hypertension in dogs. Angiology. 43 (10), 833-842 (1992).
  32. Ziecina, R., Abramczyk, P., Lisiecka, A., Papierski, K., Przybylski, J. Adrenal-renal portal circulation contributes to decrease in renal blood flow after renal artery stenosis in rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 49 (4), 553-560 (1998).
  33. Johnson, J. A., Ichikawa, S., Kurz, K. D., Fowler, W. L., Payne, C. G. Pressor responses to vasopressin in rabbits with 3-day renal artery stenosis. American Journal of Physiology. 240 (6), 862-867 (1981).
  34. Eirin, A., et al. Changes in glomerular filtration rate after renal revascularization correlate with microvascular hemodynamics and inflammation in Swine renal artery stenosis. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (5), 720-728 (2012).
  35. Ma, Z., Jin, X., He, L., Wang, Y. CXCL16 regulates renal injury and fibrosis in experimental renal artery stenosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory. 311 (3), 815-821 (2016).
  36. Cheng, J., et al. Temporal analysis of signaling pathways activated in a murine model of two-kidney, one-clip hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (4), 1055-1068 (2009).
  37. Wiesel, P., Mazzolai, L., Nussberger, J., Pedrazzini, T. Two-kidney, one clip and one-kidney, one clip hypertension in mice. Hypertension. 29 (4), 1025-1030 (1997).
  38. Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. Models of experimental hypertension in mice. Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).

Tags

الطب ، العدد 164 ، كليتان مقطع واحد (2K1C) ، تضيق الشريان الكلوي ، نظام رينين أنجيوتنسين الألدوستيرون ، تعبير الرينين ، إصابة الكلى ، نموذج الفأر
نموذج فأر مصاب واحد من الكلى المعدل لتنظيم الرينين في تضيق الشريان الكلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleem, M., Barturen-Larrea, P.,… More

Saleem, M., Barturen-Larrea, P., Saavedra, L., Gomez, J. A. A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis. J. Vis. Exp. (164), e61058, doi:10.3791/61058 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter