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Medicine

गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस में रेनिन विनियमन का एक संशोधित दो गुर्दे एक क्लिप माउस मॉडल

Published: October 26, 2020 doi: 10.3791/61058
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine/Clinical Pharmacology Division, Vanderbilt University Medical Center

Summary

एक संशोधित 2 गुर्दे 1 क्लिप (2 के 1 सी) गोल्डब्लैट माउस मॉडल को गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस शुरू करने के लिए पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग का उपयोग करके विकसित किया गया था, जिससे रेनिन अभिव्यक्ति और गुर्दे की चोट में वृद्धि हुई। यहां, हम एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुसंगत 2K1C माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए गुर्दे की धमनी पर कफ तैयार करने और रखने की एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

Abstract

गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस कोरोनरी या परिधीय संवहनी रोग वाले रोगियों में एक सामान्य स्थिति है जहां रेनिन एंजियोटेंसिन एल्डोस्टेरोन सिस्टम (आरएएएस) अति सक्रिय होता है। इस संदर्भ में, गुर्दे की धमनियों का संकुचन होता है जो आरएएएस में दर-सीमित प्रोटीज रेनिन की अभिव्यक्ति और रिहाई में वृद्धि को उत्तेजित करता है। रेनिन अभिव्यक्ति में परिणामी वृद्धि रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप का एक ज्ञात चालक है, जो अक्सर गुर्दे की चोट और अंत अंग क्षति से जुड़ा होता है। इस प्रकार, इस स्थिति के लिए उपन्यास उपचार विकसित करने में बहुत रुचि है। गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस में रेनिन नियंत्रण के आणविक और सेलुलर तंत्र को पूरी तरह से समझा नहीं गया है और आगे की जांच की आवश्यकता है। चूहों में गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस को प्रेरित करने के लिए, एक संशोधित 2 गुर्दे 1 क्लिप (2 के 1 सी) गोल्डब्लैट माउस मॉडल विकसित किया गया था। दाहिने गुर्दे को जंगली प्रकार के चूहों में स्टेनोज़ किया गया था और शम संचालित चूहों को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के बाद, हमने रेनिन अभिव्यक्ति और गुर्दे की चोट का निर्धारण किया। गुर्दे काटे गए थे, और रेनिन की प्रोटीन और एमआरएनए अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए ताजा कॉर्टिस का उपयोग किया गया था। यह पशु मॉडल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसका उपयोग पैथोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं, आणविक और सेलुलर मार्गों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो उच्च रक्तचाप और गुर्दे की चोट में शामिल हैं।

Introduction

गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस (रैस्टेनोसिस) एक असभ्य समस्या है जो 65 वर्ष से अधिक उम्र के लगभग 6% लोगों और कोरोनरी या परिधीय संवहनी रोग 1,2 वाले 40% लोगों को प्रभावित करती है। रोग के लिए वर्तमान उपचार सीमित हैं; इसलिए, रैस्टेनोसिस द्वारा प्रेरित रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप या प्रतिरोधी उच्च रक्तचाप के इलाज के लिए नए उपचार विकसित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। रेनिन एंजियोटेंसिन एल्डोस्टेरोन प्रणाली (आरएएएस) आरएस्टेनोसिस प्रेरित उच्च रक्तचाप या रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप 3,4 के रोगजनन में शामिल प्रमुख मार्ग है। आरएएएस को लक्षित करने वाले ज्ञात उपचार, जैसे एसीई अवरोधक या एंजियोटेंसिन रिसेप्टर ब्लॉकर्स, उच्च रक्तचाप को कम करते हैं, लेकिन गुर्दे की विफलता और हाइपरकेलेमिया 5,6,7 के लिए करीबी जांच की आवश्यकता होती है। रेनिन आरएएएस में दर-सीमित कदम को उत्प्रेरित करता है; यह एंजियोटेंसिन को एंजियोटेंसिन आई में परिवर्तित करता है। एथेरोस्क्लेरोसिस में, पट्टिका गठन गुर्दे की धमनी के संकुचन का कारण बनता है जो रेनिन स्राव को चलाता है, जिसके परिणामस्वरूप रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप और गुर्दे की क्षतिहोती है 8. कई अध्ययनों ने मनुष्यों में रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप के दौरान ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर में वृद्धि की सूचना दी है, जो दो गुर्दे एक क्लिप (2के 1 सी) चूहों के मॉडल के साथ-साथ अन्य उच्च रक्तचाप से ग्रस्त पशु मॉडल 2,9,10,11,12,13,14,15,16 के साथ पुष्टि की गई थी . रैस्टेनोसिस प्रेरित रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप के दौरान रेनिन अभिव्यक्ति नियंत्रण का आणविक तंत्र अच्छी तरह से समझा नहीं गया है और आगे की जांच का वारंट करता है।

प्रयोगात्मक पशु मॉडल जो मज़बूती से और पुनरुत्पादनशील रूप से आरएस्टेनोसिस को दोहराते हैं, उपन्यास उपचारों के विकास के लिए रेनिन अभिव्यक्ति नियंत्रण के सेलुलर और आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण हैं। 2K1C माउस मॉडल17,18,19,20 रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक मॉडल है। यह मॉडल एक क्लिप17,20,21 का उपयोग करके गुर्दे की धमनी के कसना द्वारा उत्पन्न होता है, इसलिए गुर्दे की धमनी रोड़ा पैदा करता है जिसके परिणामस्वरूप रेनिन अभिव्यक्ति और उच्च रक्तचाप 17,19,20,21 में वृद्धि होती है। हालांकि, कोई तकनीकी रिपोर्ट उपलब्ध नहीं है, जो पशु मॉडल में गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस उत्पन्न करने के लिए चरण दर चरण प्रक्रिया का वर्णन करती है।

पारंपरिक यू-आकार की चांदी क्लिप, पॉलीयूरेथेन ट्यूब और अन्य क्लिप का उपयोग गुर्दे की धमनी को संकुचित करने के लिए किया गया है ताकि गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस को प्रेरित किया जा सके। कुछ अध्ययनों से पता चला है कि क्लिप का डिज़ाइन और सामग्री 2K1C पशु मॉडल के साथ विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। लोरेंज एट अल के अनुसार, पारंपरिक यू-डिज़ाइन किए गए चांदी क्लिप का उपयोग उच्च रक्तचाप (40-60%) 21 की कम सफलता दर को प्रेरित करता है। क्लिप डिजाइन के कारण, गुर्दे की धमनी को पार्श्व रूप से दबाया जाता है, जिससे कुछ कसना और गुर्दे की धमनी से बेदखल होने की अधिक संभावना होती है। सिल्वर लचीलापन और लचीलापन क्लिप चौड़ाई में परिवर्तन की अनुमति दे सकता है; इसलिए, चूहों के बीच विभिन्न उच्च रक्तचाप के स्तर का कारण बनता है। क्लिप पर चांदी डाइऑक्साइड पेरिवास्कुलर सूजन, अंतरंग प्रसार और ऊतक दानेदार बनाने का कारण बन सकता है, गुर्दे की धमनी व्यास22 को बदल सकता है। पारंपरिक यू-डिज़ाइन सिल्वर क्लिप के साथ प्राप्त उच्च रक्तचाप के स्तर में परिवर्तनशीलता के कारण, वार्नर एट अल और लोरेंज एट अल ने चूहों में गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस शुरू करने के लिए एक राउंडर-डिज़ाइन पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग का सफलतापूर्वक उपयोग किया है, जिससे दो गुर्दे एक क्लिप पशु मॉडल20,21 का अधिक विश्वसनीय और सुसंगत प्रेरण उत्पन्न होता है।

इस रिपोर्ट में, हम चूहों में प्रयोगात्मक रैस्टेनोसिस उत्पन्न करने के लिए एक सर्जिकल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, गुर्दे की धमनी को संकुचित करने के लिए पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग का उपयोग करते हैं। पॉलीयूरेथेन राउंड-डिज़ाइन कफ माउस में स्टेनोसिस उत्पन्न करने के लिए एक अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विश्वसनीय और कम लागत वाली क्लिप है। इस प्रयोगात्मक मॉडल का लक्ष्य गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के दौरान रेनिन अभिव्यक्ति नियंत्रण के आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन और परिभाषित करना है। हमने रेनिन अभिव्यक्ति और गुर्दे की चोट मार्कर न्यूट्रोफिल जिलेटिनेज से जुड़े लिपोकालिन (एन-जीएएल) को मापकर आरएएस्टेनोसिस चूहों के मॉडल की सफलता की पुष्टि की।

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Protocol

चूहों को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) दिशानिर्देशों और गाइड फॉर द केयर एंड यूज ऑफ लेबोरेटरी एनिमल्स, यूएस डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ एंड ह्यूमन सर्विसेज के बाद वेंडरबिल्ट यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (वीयूएमसी) डिवीजन ऑफ एनिमल केयर में रखा गया था। प्रयोगों को शुरू करने से पहले वीयूएमसी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी।

1. पशु तैयारी और विच्छेदन

  1. सर्जरी शुरू करने से लगभग 30 मिनट पहले हीटिंग पैड के अंकुरक और पानी पंप को चालू करें।
  2. एक तेज स्केलपेल के साथ 0.5 मिमी लंबाई पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग काट लें। कफ बनाने के लिए लंबाई में कटौती करके परिधि के 0.2 मिमी को हटा दें।
    नोट: यह गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है जिसके लिए अत्यधिक परिशुद्धता, विवरण और धैर्य पर ध्यान देने की आवश्यकता होती है। एक समय में पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग के कई टुकड़ों को काटने की कोशिश करें। माइक्रोस्कोप के तहत इस प्रक्रिया के सभी प्रदर्शन.
  3. आगे बढ़ने से पहले, सर्जिकल बाँझ दस्ताने और एक सर्जिकल मास्क पहनें।
  4. 6-8 सप्ताह के सी 57 बीएल / 6 जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों का उपयोग करें। किसी भी सेक्स पूर्वाग्रह से बचने के लिए नर और मादा चूहों की समान संख्या का उपयोग करें।
  5. सर्जरी करने से पहले चूहों के वजन को रिकॉर्ड करें। पॉलीयूरेथेन ट्यूब के साथ गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस करने के लिए आदर्श वजन 18-22 ग्राम है। चूहों को धीरे से संभालें और संज्ञाहरण को इंजेक्ट करते समय आंदोलन न करें। प्री-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया (केटोफगेन, 5 मिलीग्राम /
    नोट: चूहों को अपने आवास कक्ष से सर्जरी कक्ष में स्थानांतरित करते समय, आंदोलन से बचने के लिए उन्हें बड़ी नम्रता और देखभाल के साथ ले जाएं। ट्रॉली के बजाय हाथों में चूहों के पिंजरे ले जाने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
  6. इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (100 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू) और ज़ाइलाज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू) के मिश्रण के साथ चूहों को संवेदनाहारी करें।
  7. पूरी तरह से संवेदनाहारी जब तक पिंजरे के अंदर माउस वापस रखें। माउस को पूरी तरह से बेहोश होने में लगभग 4-5 मिनट लगते हैं। माउस पूरी तरह बेहोश है और सर्जरी के लिए तैयार है, यह जांचने के लिए संदंश के साथ पूंछ या पैर की अंगुली चुटकी लें।
  8. माउस को एक पेपर तौलिया पर अपनी पीठ पर रखें। बालों के विकास की विपरीत दिशा के बाद एक इलेक्ट्रिक हेयर क्लिपर का उपयोग करके पार्श्व पेट के बालों को हटा दें। सर्जिकल साइट को शेव करने के बाद, आयोडीन (या क्लोरहेक्सिडीन) युक्त सर्जिकल स्क्रब के साथ क्षेत्र को साफ करें, इसके बाद 70% इथेनॉल (या बाँझ खारा) के साथ कुल्ला करें।  इसे 3 बार दोहराएं।
    नोट: बालों को हटाने की प्रक्रिया को सर्जरी प्रक्रिया के दौरान किसी भी बाल हस्तक्षेप और बाल संदूषण से बचने के लिए सर्जरी प्रक्रिया बेंच की तुलना में कुछ दूरी पर या अधिमानतः एक अलग बेंच पर किया जाना चाहिए।
  9. हीटिंग पैड को बाँझ शीट के साथ कवर करें। सर्जिकल बेंच पर माउस लाओ और माइक्रोस्कोप की ओर माउस के दाहिने पार्श्व पक्ष का सामना करना पड़, बाँझ शीट पर जगह। परिसंचारी पानी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस का निरंतर पैड तापमान बनाए रखें।
  10. सभी सर्जिकल उपकरणों से युक्त निष्फल बैग खोलें। एक विदारक माइक्रोस्कोप और बाँझ शार्प कैंची का उपयोग करके, एक छोटा सा फ्लैंक चीरा (13वें वक्षीय रिब के करीब, माउस में अंतिम रिब) और कशेरुकाओं से लगभग 0.5 सेमी दूर बनाएं। काठ कशेरुकाओं के साथ आगे बढ़ें और 1 इंच चीरा बनाएं।
  11. गुर्दे को उजागर करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों को वापस खींचें।
  12. गुर्दे की धमनी को अलग करने के लिए बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके आसपास के वसा को साफ और हटा दें। घुमावदार संदंश का उपयोग कर गुर्दे की धमनी से गुर्दे की तंत्रिका को अलग करें।
  13. शम सर्जरी करते समय, त्वचा को बंद करने के लिए टांके लागू करें और बंद घाव पर एंटीबायोटिक लागू करें, फिर पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल के लिए आगे बढ़ें। यदि नहीं, तो धमनी को स्टेनोज करने के लिए निम्नलिखित अनुभाग के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: सर्जिकल प्रक्रिया के नियंत्रण के रूप में हर प्रयोग में नकली जानवर होने चाहिए। शाम जानवरों में चूहे होते हैं जो उस पर कफ रखे बिना गुर्दे की धमनी को उजागर करने की सर्जिकल प्रक्रिया से गुजर चुके हैं।

2. सही गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस

  1. सही गुर्दे की धमनी के नीचे दो नायलॉन टांके रखें, ढीले समुद्री मील बनाएं, और फिर मुख्य गुर्दे की धमनी के चारों ओर कफ रखें जो गुर्दे और महाधमनी द्विभाजन के बीच लगभग समान दूरी पर है
  2. नायलॉन टांके का उपयोग करके कफ को बंद करें। सर्जरी के बाद टांके खोने की संभावना से बचने के लिए प्रत्येक सिवनी के लिए चार समुद्री मील बनाएं।
  3. एक साधारण निरंतर सिवनी लागू करके मांसपेशियों में चीरा बंद करें।
  4. त्वचा को बंद करने के लिए सरल बाधित टांके बनाएं।
  5. आईएसीयूसी अनुमोदित एनाल्जेसिक का प्रशासन करें।
    नोट: हर उपयोग से पहले आटोक्लेव सर्जिकल उपकरण। यदि एक बार में एक से अधिक सर्जरी की जा रही है, तो सभी उपयोग किए गए उपकरणों को बाँझ अल्कोहल गेज के साथ पोंछ लें और उन्हें प्रत्येक सर्जरी के बाद 15-30 एस के लिए गर्म अंकुरक में रखें। प्रत्येक माउस के लिए बाँझ दस्ताने भी बदलें।

3. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल

  1. चूहों को अपने पिंजरे में लौटें और पिंजरे को आधा, आधा बंद, 2 - 3 घंटे के लिए एक परिसंचारी पानी हीटिंग पैड छोड़ दें। पिंजरे के अंदर जेल आहार वसूली भोजन जोड़ें।
  2. अगले दिन दर्द निवारक (केटोप्रोफेन) इंट्रापेरिटोनियल (खुराक: 5 मिलीग्राम /
  3. अगले दो दिनों के लिए चूहों का वजन; यदि कुछ चूहे अपने वजन का 20% से अधिक खो देते हैं तो पशुचिकित्सा से परामर्श करें और तय करें कि क्या जानवर को उचित आईएसीयूसी अधिकृत प्रक्रिया के बाद इच्छामृत्यु की आवश्यकता है।
  4. लालिमा, सूजन, दर्द या संक्रमण का आकलन करने के लिए चूहों की दैनिक निगरानी करें।
  5. संस्थागत आईएसीयूसी नीतियों के अनुसार पश्चात की जटिलताओं के लिए पशु चिकित्सा परामर्श प्राप्त करें ..

4. ऊतक फसल

  1. सर्जिकल प्रक्रिया के 3 सप्ताह बाद हार्वेस्ट ऊतक। प्रत्येक माउस का वजन रिकॉर्ड करें।
  2. एक आईएसीयूसी अनुमोदित प्रक्रिया के साथ माउस को इच्छामृत्यु दें।
  3. विच्छेदन करने के लिए लापरवाह स्थिति में एक बाँझ मंच पर माउस रखें।
  4. आंदोलन को सीमित करने के लिए अंगों को सुरक्षित और विस्तारित करें।
  5. 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से चूहों स्प्रे।
  6. तेज कैंची का उपयोग करके पेट और छाती क्षेत्र को खोलने के लिए एक मिडलाइन चीरा बनाएं।
  7. त्वचा और पेरिटोनियल दीवार को वापस खींचें।
  8. ध्यान से दिल का पर्दाफाश और सही वेंट्रिकल पंचर और माउस बाहर निकालना।
  9. संदंश का उपयोग कर दोनों गुर्दे निकालें। गुर्दे चूहों की पीठ पर स्थित हैं।
    नोट: दोनों गुर्दे मिश्रण न करें। स्टेनोस्ड, शम और कॉन्ट्रालेटरल किडनी से अवगत रहें।
  10. गुर्दे कैप्सूल निकालें, उन्हें किसी भी वसा से साफ करें और प्रत्येक गुर्दे के वजन को अलग से रिकॉर्ड करें।
  11. दोनों गुर्दे के अनुदैर्ध्य खंड को काटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पीएफए में तय करें ताकि बाद में पैराफिन एम्बेडिंग के लिए संसाधित किया जा सके, सीटू संकरण (आईएसएच) और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) में प्रदर्शन करने के लिए। आईएसएच और आईएचसी प्रोटोकॉल का पालन करें जैसा कि23,24 की सूचना दी गई है।
  12. पश्चिमी धब्बा करने के लिए तरल नाइट्रोजन में शेष गुर्दे और फ्लैश फ्रीज के प्रांतस्था को अलग करें। विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  13. साहित्य23,24 में वर्णित पश्चिमी धब्बा के साथ रेनिन, और एन-जीएएल अभिव्यक्तियों की मात्रा निर्धारित करें।

5. सांख्यिकी

  1. अलग-अलग समूहों के बीच तुलना के लिए बोनफेरोनी पोस्ट-हॉक परीक्षणों के बाद तीन या अधिक स्थितियों के साथ प्रयोगों के लिए एक तरफा या दो-तरफा एनोवा का उपयोग करें। 0.05 से कम पी-मान पर विचार करें। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए सॉफ़्टवेयर (जैसे, ग्राफपैड प्रिज्म 8.2) का उपयोग करें।

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Representative Results

गुर्दे की धमनी कसना कंट्रालेटरल किडनी में अभिव्यक्ति को दबाते हुए स्टेनोस्ड किडनी में रेनिन अभिव्यक्ति को बढ़ाता है। स्टेनोसिस के दो गुर्दे एक क्लिप (2 के 1 सी) या गोल्डब्लैट मॉडल रेनिन अभिव्यक्ति और गुर्दे की चोट में वृद्धि को प्रेरित करता है। यह मनुष्यों में एकतरफा गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के सर्वोत्तम प्रतिनिधि मॉडल के रूप में पहचाना जाता है।

रेनिन और प्रोरेनिन (रेनिन के अग्रदूत) की अभिव्यक्ति को इम्यूनोब्लॉटिंग का उपयोग करके मापा गया था। डेटा से पता चलता है कि रेनिन और प्रोरेनिन अभिव्यक्ति कॉन्ट्रालेटरल और शम किडनी की तुलना में स्टेनोस्ड किडनी में वृद्धि हुई है, यह सुझाव देते हुए कि कफ गुर्दे की धमनी को संकुचित कर रहा था जिससे गुर्दे के छिड़काव (चित्रा 1) में परिवर्तन हो रहा था। रेनिन अभिव्यक्ति के स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए, आईएचसी का प्रदर्शन किया गया था। आईएचसी ने क्लिप किए गए गुर्दे (चित्रा 2) में रेनिन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति दिखाते हुए इम्यूनोब्लॉटिंग डेटा की पुष्टि की। इसके अलावा, अभिवाही धमनी के साथ जुक्सटाग्लोमेरुलर (जेजी) कोशिकाओं की भर्ती स्टेनोज्ड गुर्दे (चित्रा 2) में देखी गई थी। रेनिन एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों पर प्रभाव की जांच करने के लिए, आईएसएच का प्रदर्शन किया गया था। आईएसएच डेटा कॉन्ट्रालेटरल और शम किडनी (चित्रा 3) की तुलना में स्टेनोस्ड किडनी में रेनिन एमआरएनए और जेजी कोशिकाओं की भर्ती में वृद्धि का सुझाव देता है।

गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस की एक और विशेषता गुर्दे के छिड़काव, सुपरऑक्साइड उत्पादन और उच्च रक्तचाप2,25,26 में परिवर्तन के कारण गुर्दे की चोट मार्करों का उत्थान है। न्यूट्रोफिल जिलेटिनेज से जुड़े लिपोकैलिन (एनजीएएल) एक अच्छी तरह से विशेषता तीव्र चोट मार्कर है और गुर्दे की चोट27,28 के दौरान अतिरंजित है। इसलिए, तीव्र गुर्दे की चोट मार्कर एनजीएएल को इम्यूनोब्लोटिंग का उपयोग करके मापा गया था। इम्यूनोब्लॉटिंग डेटा से पता चला है कि एन-जीएएल को कॉन्ट्रालेटरल और शम किडनी (चित्रा 4) की तुलना में स्टेनोस्ड किडनी में अत्यधिक अपग्रेड किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: रेनिन अभिव्यक्ति। गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के 15- और 3-दिनों के बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई थी। गुर्दे काटे गए थे, और रेनिन अभिव्यक्ति पश्चिमी धब्बा द्वारा निर्धारित की गई थी। (ए) 15 दिनों के स्टेनोज्ड (बाएं पैनल) और शम चूहों (दाएं पैनल) से प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बे छवियों को दिखा रहा है। (बी) प्रोरेनिन (बाएं पैनल) और रेनिन (दाएं पैनल) प्रोटीन बैंड के घनत्वमितीय विश्लेषण को दिखा रहा है। बीटा-एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (सी) 3-दिवसीय स्टेनोस्ड (बाएं पैनल) और शम चूहों (दाएं पैनल) से प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा छवियों को दिखा रहा है। (डी) प्रोरेनिन (बाएं पैनल) और रेनिन (दाएं पैनल) प्रोटीन बैंड का घनत्वमितीय विश्लेषण दिखा रहा है। बीटा-एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है पी मान की गणना दो-तरफा एनोवा के साथ की जाती है, जिसके बाद तुकी पोस्ट-हॉक परीक्षण होता है। * पी<0.05, ** पी< 0.01, *** पी< 0.001, एन = 3-6। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के बाद रेनिन अभिव्यक्ति के दृश्य और स्थानीयकरण के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण। 3-दिवसीय गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस से चूहों को इच्छामृत्यु देने के बाद गुर्दे को अलग किया गया था। पूरे गुर्दे के अनुदैर्ध्य कटौती से एक टुकड़ा 4% तटस्थ बफर फॉर्मलिन समाधान के साथ तय किया गया था, उसके बाद एक स्नातक इथेनॉल श्रृंखला में निर्जलित, और पैराफिन में एम्बेडेड। ग्रीन धुंधला रेनिन प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है; नीला, नाभिक। (ए) स्टेनोस्ड चूहों से स्टेनोस्ड किडनी (बाईं ओर), कॉन्ट्रालेटरल किडनी (दाईं ओर) की प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां। (बी) शम चूहों से शम किडनी (बाईं ओर), और कॉन्ट्रालेटरल किडनी (दाईं ओर) की प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां। स्केल बार 30 माइक्रोन। 90X आवर्धन। (सी) स्टेनोस्ड चूहों से स्टेनोस्ड किडनी (बाईं ओर), कॉन्ट्रालेटरल किडनी (दाईं ओर) की प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां। (डी) शम चूहों से शम किडनी (बाईं ओर), और कॉन्ट्रालेटरल किडनी (दाईं ओर) की प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां। ये छवियां मुख्य रूप से कॉर्टेक्स क्षेत्र से ली गई थीं। स्केल बार 50 μm. 15x आवर्धन। सफेद बिंदीदार वृत्त ग्लोमेरुली के स्थान को दर्शाते हैं। जी: ग्लोमेरुली, एएफएआर: अभिवाही धमनी, एन = 4। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के बाद रेनिन एमआरएनए अभिव्यक्ति के सीटू संकरण विश्लेषण में। गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के 3 दिनों के बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई थी और गुर्दे को 4% तटस्थ बफर किए गए फॉर्मलिन समाधान के साथ अलग और छिड़काव-तय किया गया था, एक स्नातक इथेनॉल श्रृंखला में निर्जलित किया गया था, और पैराफिन में एम्बेडेड था। सीटू संकरण में निर्माता के निर्देशों का पालन किया गया था। गहरे लाल धुंधला एमआरएनए रेनिन अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है; नीला, नाभिक। (अ) . स्टेनोस्ड किडनी (बाईं ओर), और स्टेनोस्ड चूहों से कॉन्ट्रालेटरल किडनी (दाईं ओर) की प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवि। (ब) . शम चूहों से शम किडनी (बाईं ओर), और कॉन्ट्रालेटरल किडनी (दाईं ओर) की प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवि। स्केल बार 50 μm. सफेद बिंदीदार वृत्त रेनिन को व्यक्त करने वाले ग्लोमेरुली को दर्शाते हैं। जी: ग्लोमेरुली, एएफएआर: अभिवाही धमनी, एन = 4। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के बाद न्यूट्रोफिल जिलेटिनेज से जुड़े लिपोकालिन (एन-जीएएल) अभिव्यक्ति। 3-दिवसीय गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और गुर्दे काटे गए, और पश्चिमी धब्बा द्वारा एन-जीएएल अभिव्यक्ति उपाय। (ए) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा 3-दिवसीय स्टेनोस्ड (बाएं पैनल) और शम चूहों (दाएं पैनल) से छवियां। बीटा-एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (बी) एन-जीएएल बैंड का घनत्वमितीय विश्लेषण। एन-जीएएल के प्रोटीन घनत्व मूल्यों को β-एक्टिन के लिए सामान्यीकृत किया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है पी मान की गणना दो-तरफा एनोवा के साथ की जाती है, जिसके बाद तुकी पोस्ट-हॉक परीक्षण होता है। ** पी<0.01, *** पी< 0.001, एन = 3-5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस माध्यमिक या प्रतिरोधी उच्च रक्तचाप का एक महत्वपूर्ण कारण है, और गुर्दे की चोट 1,29 है। दो गुर्दे एक क्लिप (2के 1 सी) गोल्डब्लैट मॉडल को रैस्टेनोसिस प्रेरित रेनोवास्कुलर उच्च रक्तचाप 1,17,18,19 का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। विभिन्न जानवरों के मॉडल का उपयोग करके पिछले कई अध्ययनों से पता चला है कि गुर्दे की धमनी में स्टेनोसिस रेनिन ओवरएक्सप्रेशन और रिलीज का एक मजबूत उत्तेजक है, और गुर्दे की चोट 18,30,31,32,33,34,35 है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ, फाइब्रोसिस, सूजन और तीव्र और पुरानी गुर्दे की चोट मार्करों का अध्ययन करने के लिएकिया जाता है।

यहां, हमने चूहों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विश्वसनीय और सुसंगत गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत और चरण-दर-चरण प्रक्रिया का वर्णन किया है। इससे पहले, गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस 36,37,38 शुरू करने के लिए धातु क्लिप को नियोजित किया गया है। एक विकल्प के रूप में, हमने पॉलीयूरेथेन राउंड ट्यूबिंग (एमआरई 025; आंतरिक व्यास (आईडी) = 0.30 मिमी; बाहरी व्यास (ओडी) = 0.63 मिमी; दीवार की मोटाई, (डब्ल्यूटी) = 0.16 मिमी) का उपयोग किया। हमने ट्यूबिंग का उपयोग किया, क्योंकि एक पॉलीयूरेथेन कफ के प्लेसमेंट के परिणामस्वरूप धातु क्लिप के साथ एक (चपटा) के बजाय दो आयामों (कसना) में कसना होगा। इसके अलावा, पॉलीयूरेथेन राउंड ट्यूबिंग का उपयोग करने से गुर्दे की धमनी में समान कसना का लाभ मिलता है। महत्वपूर्ण कदम और चुनौतियां पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग के सही आकार में कटौती करना है, जिसके लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किए जाने वाले विवरणों पर अत्यधिक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। एक और महत्वपूर्ण मानदंड गुर्दे की धमनी पर ट्यूबिंग फिट करने के लिए चूहों को 18-22 ग्राम के बीच रखना है। इस वजन सीमा के भीतर चूहों में आमतौर पर एक गुर्दे की धमनी बाहरी व्यास (ओडी) होता है जो लगातार ट्यूबिंग कफ व्यास की सीमा के भीतर होता है। विधि की एक सीमा यह है कि भारी (25 ग्राम से ऊपर) या छोटे (16 ग्राम से नीचे) चूहों को ट्यूब और कफ के आकार के कारण सर्जरी करना मुश्किल होता है। हालांकि, जब आवश्यक हो, तो छोटे या पुराने चूहों को समायोजित करने के लिए पॉलीयूरेथेन ट्यूबिंग में परिवर्तन किया जा सकता है।

हमने लगभग 95% सफलता दर के साथ चूहों में गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस शुरू करने के लिए 3-दिवसीय और 15-दिवसीय अध्ययन किया है। हमारे अनुभव में, इस पद्धति का उपयोग करके गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस के प्रेरण ने सेक्स की परवाह किए बिना चूहों के बीच विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुसंगत परिणाम उत्पन्न किए। गुर्दे की धमनी के कसना की पुष्टि करने के लिए, हमने रेनिन अभिव्यक्ति और गुर्दे की चोट को मापा। हमारे आंकड़े बताते हैं कि स्टेनोस्ड किडनी में रेनिन अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई है।

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Disclosures

लेखकों द्वारा ब्याज, वित्तीय या अन्यथा का कोई संघर्ष घोषित नहीं किया जाता है।

Acknowledgments

अनुसंधान को जेएजी को एनएचएलबीआई अनुसंधान वैज्ञानिक विकास अनुदान (1K01HL135461-01) द्वारा समर्थित किया गया था। डेविड कार्मोना-बेरियो और इसाबेल अदार्व-रेंजिफो को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diet Gel Clear H2O Diet-Gel 76A Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad Hallowell 000A2788B Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture Ethicon 662G 4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture Ethicon 2815 G 8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500 Braintree Scientific Inc. GER 5287 Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen Zoetis Ketofen Painkiller
Polyurethane Braintree Scientific Inc. MRE-025 This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks Medline MDS093901 It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co 204-1000 This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes Dynarex 4410 It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment Medi-First 22312
Water pump Stryker T/pump Professionals Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery

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References

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दवा अंक 164 दो गुर्दे एक क्लिप (2K1C) गुर्दे की धमनी स्टेनोसिस रेनिन एंजियोटेंसिन एल्डोस्टेरोन प्रणाली रेनिन अभिव्यक्ति गुर्दे की चोट माउस मॉडल
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Saleem, M., Barturen-Larrea, P., Saavedra, L., Gomez, J. A. A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis. J. Vis. Exp. (164), e61058, doi:10.3791/61058 (2020).

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