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Medicine

Ein modifiziertes Zwei-Nieren-One-Clip-Mausmodell der Reninregulation bei Nierenarterienstenose

Published: October 26, 2020 doi: 10.3791/61058
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine/Clinical Pharmacology Division, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Ein modifiziertes Goldblatt-Mausmodell mit 2 Nieren 1 Clip (2K1C) wurde unter Verwendung von Polyurethanschläuchen entwickelt, um eine Nierenarterienstenose einzuleiten, die eine Erhöhung der Reninexpression und Nierenschädigung induziert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung und Platzierung der Manschette auf der Nierenarterie, um ein reproduzierbares und konsistentes 2K1C-Mausmodell zu erstellen.

Abstract

Nierenarterienstenose ist eine häufige Erkrankung bei Patienten mit koronarer oder peripherer Gefäßerkrankung, bei der das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) überaktiviert ist. In diesem Zusammenhang kommt es zu einer Verengung der Nierenarterien, die eine Erhöhung der Expression und Freisetzung von Renin, der geschwindigkeitsbegrenzenden Protease bei RAAS, stimuliert. Der daraus resultierende Anstieg der Reninexpression ist ein bekannter Treiber der renovaskulären Hypertonie, die häufig mit Nierenschäden und Endorganschäden einhergeht. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung neuartiger Behandlungen für diese Erkrankung. Der molekulare und zelluläre Mechanismus der Reninkontrolle bei Nierenarterienstenose ist nicht vollständig verstanden und erfordert weitere Untersuchungen. Um eine Nierenarterienstenose bei Mäusen zu induzieren, wurde ein modifiziertes 2-Nieren-1-Clip (2K1C) Goldblatt-Mausmodell entwickelt. Die rechte Niere wurde bei Wildtyp-Mäusen stenosiert und scheinoperierte Mäuse wurden als Kontrolle verwendet. Nach Nierenarterienstenose bestimmten wir die Reninexpression und Nierenschädigung. Nieren wurden geerntet, und frische Kortices wurden verwendet, um die Protein- und mRNA-Expression von Renin zu bestimmen. Dieses Tiermodell ist reproduzierbar und kann verwendet werden, um pathophysiologische Reaktionen, molekulare und zelluläre Signalwege zu untersuchen, die an renovaskulärer Hypertonie und Nierenschäden beteiligt sind.

Introduction

Die Nierenarterienstenose (RAStenosis) ist ein hartnäckiges Problem, von dem etwa 6% der Menschen über 65 und bis zu 40% der Menschen mit koronarer oder peripherer Gefäßerkrankung betroffen sind 1,2. Aktuelle Behandlungen für die Krankheit sind begrenzt; Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der renovaskulären Hypertonie oder der resistenten Hypertonie, die durch RAStenosis induziert wird. Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ist der Schlüsselweg, der an der Pathogenese der RAStenosis-induzierten Hypertonie oder der renovaskulären Hypertonie beteiligtist 3,4. Bekannte Therapien, die auf RAAS abzielen, wie ACE-Hemmer oder Angiotensin-Rezeptorblocker, lindern Bluthochdruck, müssen jedoch eingehend auf Nierenversagen und Hyperkaliämie untersuchtwerden 5,6,7. Renin katalysiert den ratenbegrenzenden Schritt in RAAS; es wandelt Angiotensinogen in Angiotensin I um. Bei Atherosklerose verursacht die Bildung von Plaque die Verengung der Nierenarterie, die die Reninsekretion antreibt, was zu renovaskulärer Hypertonie und Nierenschäden führt8. Eine Reihe von Studien berichtete über erhöhte oxidative Belastungen während der renovaskulären Hypertonie beim Menschen, die mit dem Modell der zwei Nieren One Clip (2K1C) Mäuse sowie anderen hypertensivenTiermodellen 2,9,10,11,12,13,14,15,16 bestätigt wurden. . Der molekulare Mechanismus der Reninexpressionskontrolle während der RAStenosis-induzierten renovaskulären Hypertonie ist nicht gut verstanden und rechtfertigt weitere Untersuchungen.

Experimentelle Tiermodelle, die RAStenosis zuverlässig und reproduzierbar rekapitulieren, sind wichtig, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Renin-Expressionskontrolle für die Entwicklung neuartiger Therapien aufzuklären. Das 2K1C-Mausmodell ist ein etabliertes experimentelles Modell zur Untersuchung der Pathogenese der renovaskulären Hypertonie17,18,19,20. Dieses Modell wird durch die Verengung der Nierenarterie unter Verwendung eines Clips 17,20,21 erzeugt, wodurch ein Nierenarterienverschluss erzeugt wird, der zu einer Erhöhung der Reninexpression und Hypertonieführt 17,19,20,21. Es liegen jedoch keine technischen Berichte vor, die ein schrittweises Vorgehen zur Erzeugung einer Nierenarterienstenose im Tiermodell beschreiben.

Herkömmliche U-förmige Silberclips, Polyurethanröhrchen und andere Clips wurden verwendet, um die Nierenarterie zu verengen, um eine Nierenarterienstenose zu induzieren. Einige Studien haben gezeigt, dass das Design und das Material des Clips entscheidend sind, um zuverlässige und reproduzierbare Daten mit dem 2K1C-Tiermodell zu erhalten. Laut Lorenz et al. induziert die Verwendung herkömmlicher U-designter Silberclips eine niedrige Erfolgsrate von Bluthochdruck (40-60%)21. Aufgrund des Clip-Designs wird die Nierenarterie seitlich gedrückt, was einige Verengungen und eine größere Wahrscheinlichkeit auslöst, von der Nierenarterie entfernt zu werden. Silberformbarkeit und Duktilität können Änderungen der Clipbreiten ermöglichen; Daher verursacht dies unterschiedliche Hypertoniewerte bei Mäusen. Silberdioxid auf dem Clip kann perivaskuläre Entzündungen, Intimproliferation und Gewebegranulation verursachen und den Durchmesser der Nierenarterieverändern 22. Aufgrund der Variabilität der Hypertoniegrade, die mit dem herkömmlichen U-Design-Silberclip erzielt wurden, haben Warner et al. und Lorenz et al. erfolgreich einen Polyurethanschlauch mit runderen Design verwendet, um eine Nierenarterienstenose bei Mäusen einzuleiten, wodurch eine zuverlässigere und konsistentere Induktion des Tiermodells20,21 mit zwei Nieren erzeugt wurde.

In diesem Bericht beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll zur Erzeugung einer experimentellen RAStenose bei Mäusen, wobei der Polyurethanschlauch verwendet wird, um die Nierenarterie zu verengen. Die Polyurethan-Manschette mit rundem Design ist ein reproduzierbarerer, zuverlässigerer und kostengünstigerer Clip zur Erzeugung von Stenosen bei Mäusen. Ziel dieses experimentellen Modells ist es, den molekularen und zellulären Mechanismus der Reninexpressionskontrolle während der Nierenarterienstenose zu untersuchen und zu definieren. Wir bestätigten den Erfolg des RAStenosis-Mäusemodells durch Messung der Reninexpression und des Nierenverletzungsmarkers neutrophiles Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (N-GAL).

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Protocol

Mäuse wurden im Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Division of Animal Care nach den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des US-Gesundheitsministeriums untergebracht und gepflegt. Alle Tierverfahren wurden vor Beginn der Experimente vom VUMC Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Tierpräparation und Präparation

  1. Schalten Sie den Keimer und die Wasserpumpe des Heizkissens ca. 30 min vor Beginn der Operation ein.
  2. Schneiden Sie 0,5 mm lange Polyurethanschläuche mit einem scharfen Skalpell. Entfernen Sie 0,2 mm des Umfangs, indem Sie einen Schnitt der Länge nach machen, um eine Manschette zu machen.
    HINWEIS: Dies ist ein kritischer Teil der Nierenarterienstenose, der äußerste Präzision, Liebe zum Detail und Geduld erfordert. Versuchen Sie, mehrere Stücke Polyurethanschläuche gleichzeitig zu schneiden. Führen Sie alle diese Verfahren unter dem Mikroskop durch.
  3. Bevor Sie fortfahren, ziehen Sie chirurgische sterile Handschuhe und eine chirurgische Maske an.
  4. Verwenden Sie C57BL / 6 Wildtyp-Mäuse (WT) von 6-8 Wochen. Verwenden Sie eine gleiche Anzahl von männlichen und weiblichen Mäusen, um sexuelle Verzerrungen zu vermeiden.
  5. Notieren Sie das Gewicht der Mäuse, bevor Sie eine Operation durchführen. Das Idealgewicht für die Durchführung einer Nierenarterienstenose mit Polyurethanschlauch beträgt 18-22 g. Behandeln Sie Mäuse vorsichtig und bewegen Sie sich nicht, während Sie die Anästhesie injizieren. Präoperative Analgesie (Ketofgen, 5 mg/kg Körpergewicht) verabreichen.
    HINWEIS: Wenn Sie die Mäuse von ihrem Wohnzimmer in den Operationssaal bringen, tragen Sie sie mit großer Sanftheit und Vorsicht, um Unruhe zu vermeiden. Es wird dringend empfohlen, Mäusekäfige in den Händen anstelle eines Trolleys zu tragen.
  6. Betäuben Sie die Mäuse mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg KG) und Xylazin (10 mg/kg KG) über intraperitoneale (I.P.) Injektionen.
  7. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig, bis sie vollständig betäubt ist. Es dauert etwa 4-5 Minuten, bis die Maus völlig bewusstlos ist. Kneifen Sie den Schwanz oder Zeh mit einer Pinzette, um zu überprüfen, ob die Maus völlig bewusstlos und bereit für die Operation ist.
  8. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Papiertuch. Entfernen Sie die Haare des seitlichen Bauches mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in entgegengesetzter Richtung des Haarwuchses. Nachdem Sie die Operationsstelle rasiert haben, reinigen Sie den Bereich mit einem chirurgischen Peeling, das Jod (oder Chlorhexidin) enthält, gefolgt von einer Spülung mit 70% Ethanol (oder steriler Kochsalzlösung).  Wiederholen Sie 3 mal.
    HINWEIS: Die Haarentfernung muss in einiger Entfernung oder vorzugsweise auf einer anderen Bank als die Operationsbank durchgeführt werden, um Haarstörungen und Haarkontaminationen während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden.
  9. Decken Sie das Heizkissen mit einem sterilen Blatt ab. Bringen Sie die Maus zur Operationsbank und legen Sie sie auf das sterile Blatt, wobei Sie die rechte seitliche Seite der Maus in Richtung Mikroskop zeigen. Halten Sie eine konstante Pad-Temperatur von 37 °C mit zirkulierendem Wasser aufrecht.
  10. Öffnen Sie den sterilisierten Beutel mit allen chirurgischen Geräten. Machen Sie mit einem Seziermikroskop und einer sterilen scharfen Schere einen kleinen Flankenschnitt (nahe der 13. Brustrippe, die letzte Rippe bei der Maus) und etwa 0,5 cm von den Wirbeln entfernt. Gehen Sie entlang der Lendenwirbel und machen Sie einen 1-Zoll-Einschnitt.
  11. Ziehen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die Niere freizulegen.
  12. Reinigen und entfernen Sie das umgebende Fett mit sterilen Wattestäbchen, um die Nierenarterie zu isolieren. Isolieren Sie den Nierennerv mit einer gekrümmten Pinzette von der Nierenarterie.
  13. Wenn Sie die Scheinoperation durchführen, legen Sie Nähte an, um die Haut zu schließen, und tragen Sie ein Antibiotikum auf die geschlossene Wunde auf, dann fahren Sie mit der postoperativen Pflege fort. Wenn nicht, fahren Sie mit dem folgenden Abschnitt fort, um die Arterie zu stenosieren.
    HINWEIS: Jedes Experiment sollte Scheintiere als Kontrollen des chirurgischen Eingriffs haben. Scheintiere bestehen aus Mäusen, die den chirurgischen Eingriff durchlaufen haben, bei dem die Nierenarterie freigelegt wurde, ohne eine Manschette darauf zu legen.

2. Rechtsrenarterienstenose

  1. Legen Sie zwei Nylonnähte unter die rechte Nierenarterie, machen Sie lose Knoten und legen Sie dann die Manschette um die Hauptnierenarterie ungefähr gleich weit entfernt zwischen Niere und Aortenbifurkation
  2. Schließen Sie die Manschette mit den Nylonnähten. Machen Sie vier Knoten für jede Naht, um die Wahrscheinlichkeit zu vermeiden, dass die Nähte nach der Operation verloren gehen.
  3. Schließen Sie den Schnitt im Muskel, indem Sie eine einfache durchgehende Naht anwenden.
  4. Machen Sie einfache unterbrochene Nähte, um die Haut zu schließen.
  5. Verabreichen Sie IACUC-zugelassene Analgetika.
    HINWEIS: Autoklavieren Sie chirurgische Instrumente vor jedem Gebrauch. Wenn mehr als eine Operation gleichzeitig durchgeführt wird, wischen Sie alle verwendeten Werkzeuge mit einem sterilen Alkoholmessgerät ab und legen Sie sie nach jeder Operation für 15-30 s in einen heißen Keimer. Wechseln Sie sterile Handschuhe auch für jede Maus.

3. Nachsorge

  1. Bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück und lassen Sie den Käfig halb an, halb aus, ein zirkulierendes Wasserheizkissen für 2 - 3 Stunden. Fügen Sie Gel-Diät-Erholungsnahrung in den Käfig ein.
  2. Schmerzmittel (Ketoprofen) intraperitoneal (Dosis: 5 mg/kg Körpergewicht) am nächsten Tag verabreichen.
  3. Wiegen Sie die Mäuse für die nächsten zwei Tage; Wenn einige Mäuse mehr als 20% ihres Gewichts verlieren, konsultieren Sie den Tierarzt und entscheiden Sie, ob das Tier nach dem entsprechenden IACUC-zugelassenen Verfahren eingeschläfert werden muss.
  4. Überwachen Sie die Mäuse täglich, um Rötungen, Schwellungen, Schmerzen oder Infektionen zu beurteilen.
  5. Suchen Sie tierärztliche Beratung für postoperative Komplikationen in Übereinstimmung mit den institutionellen IACUC-Richtlinien.

4. Gewebeentnahme

  1. Gewebe 3 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff entnehmen. Notieren Sie das Gewicht jeder Maus.
  2. Euthanasieren Sie die Maus mit einem IACUC-zugelassenen Verfahren.
  3. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine sterile Plattform, um sie zu sezieren.
  4. Sichern und strecken Sie die Gliedmaßen, um die Bewegung einzuschränken.
  5. Besprühen Sie die Mäuse gründlich mit 70% Ethanol.
  6. Machen Sie einen Mittellinienschnitt, um den Bauch und den Brustbereich mit einer scharfen Schere zu öffnen.
  7. Ziehen Sie die Haut und die Peritonealwand zurück.
  8. Belichten Sie vorsichtig das Herz und punktieren Sie den rechten Ventrikel und entbluten Sie die Maus.
  9. Entfernen Sie beide Nieren mit einer Pinzette. Nieren befinden sich auf dem Rücken der Mäuse.
    HINWEIS: Mischen Sie nicht beide Nieren. Achten Sie auf stenosierte, vorgetäuschte und kontralaterale Nieren.
  10. Entfernen Sie die Nierenkapsel, reinigen Sie sie von jeglichem Fett und notieren Sie das Gewicht jeder Niere separat.
  11. Schneiden Sie einen Längsschnitt beider Nieren ab und fixieren Sie 4% PFA über Nacht bei 4 ° C, um später für die Paraffineinbettung verarbeitet zu werden, um eine In-situ-Hybridisierung (ISH) und Immunhistochemie (IHC) durchzuführen. Befolgen Sie die ISH- und IHC-Protokolle wie berichtet23,24.
  12. Isolieren Sie den Kortex der verbleibenden Niere und gefrieren Sie in flüssigem Stickstoff, um Western Blot durchzuführen. Lagern Sie die Proben bis zur Analyse bei -80 °C.
  13. Quantifizieren Sie Renin- und N-GAL-Ausdrücke mit Western Blot, wie in der Literatur 23,24 beschrieben.

5. Statistik

  1. Verwenden Sie Einweg- oder Zweiweg-ANOVA für Experimente mit drei oder mehr Bedingungen, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Tests für Vergleiche zwischen einzelnen Gruppen. Betrachten Sie einen p-Wert gleich oder kleiner als 0,05 als signifikant. Verwenden Sie Software (z. B. GraphPad Prism 8.2), um alle statistischen Analysen durchzuführen.

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Representative Results

Die Verengung der Nierenarterien erhöht die Reninexpression in der stenosierten Niere und unterdrückt die Expression in der kontralateralen Niere. Das Zwei-Nieren-Eins-Clip (2K1C) oder Goldblatt-Modell der Stenose induziert eine erhöhte Reninexpression und Nierenschädigung. Dies gilt als das beste repräsentative Modell der einseitigen Nierenarterienstenose beim Menschen.

Die Expression von Renin und Prorenin (Vorstufe von Renin) wurde mittels Immunoblotting gemessen. Die Daten zeigen, dass die Renin- und Proreninexpression in der stenosierten Niere im Vergleich zu kontralateralen und Scheinnieren zunahm, was darauf hindeutet, dass die Manschette die Nierenarterie verengte, was zu Veränderungen der Nierenperfusion führte (Abbildung 1). Um die Lokalisierung der Reninexpression zu visualisieren, wurde IHC durchgeführt. IHC bestätigte Immunoblotting-Daten, die eine erhöhte Expression von Renin in der gestutzten Niere zeigten (Abbildung 2). Darüber hinaus wurde eine juxtaglomeruläre (JG) Zellrekrutierung entlang der afferenten Arteriole in der stenosierten Niere beobachtet (Abbildung 2). Um die Wirkung auf die Renin-mRNA-Expression zu untersuchen, wurde ISH durchgeführt. Die ISH-Daten deuten auf eine erhöhte Rekrutierung von Renin-mRNA- und JG-Zellen in der stenosierten Niere im Vergleich zu kontralateralen und Scheinnieren hin (Abbildung 3).

Ein weiteres Merkmal der Nierenarterienstenose ist die Hochregulierung von Nierenverletzungsmarkern aufgrund von Veränderungen der Nierenperfusion, der Superoxidproduktion und der Hypertonie 2,25,26. Neutrophiles Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL) ist ein gut charakterisierter akuter Verletzungsmarker und wird während einer Nierenschädigung überexprimiert27,28. Daher wurde der akute Nierenschädigungsmarker NGAL mittels Immunoblotting gemessen. Immunoblotting-Daten zeigten, dass N-GAL in der stenosierten Niere im Vergleich zu den kontralateralen und Scheinnieren stark hochreguliert war (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Renin-Ausdruck. Nach 15 und 3 Tagen Nierenarterienstenose wurden Mäuse eingeschläfert. Nieren wurden geerntet, und die Reninexpression wurde durch Western Blot bestimmt. (A) zeigt repräsentative Western-Blot-Bilder von 15-Tage-Stenosen (linkes Bild) und Scheinmäusen (rechtes Bild). (B) zeigt die densitometrische Analyse von Prorenin- (linkes Bild) und Renin-Proteinbanden (rechtes Bild). Beta-Aktin wurde als Belastungskontrolle verwendet. (C) zeigt die repräsentativen Western Blots Bilder von 3-tägigen stenosierten (linkes Bild) und Scheinmäusen (rechtes Bild). (D) zeigt eine densitometrische Analyse von Prorenin- (linkes Bild) und Renin-Proteinbanden (rechtes Bild). Beta-Aktin wurde als Belastungskontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. P-Wert, berechnet mit Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukey-Post-hoc-Test. *P<0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, N=3-6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Immunhistochemische Analyse zur Visualisierung und Lokalisation der Reninexpression nach Nierenarterienstenose. Die Nieren wurden nach dem Einschläfern von Mäusen aus einer 3-tägigen Nierenarterienstenose isoliert. Ein Stück aus dem Längsschnitt der gesamten Niere wurde mit 4% neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert, danach in einer graduierten Ethanolserie dehydriert und in Paraffin eingebettet. Die grüne Färbung stellt die Reninproteinexpression dar; blau, Kerne. (A) Repräsentative Mikroskopiebilder von stenosierter Niere (linke Seite), kontralateraler Niere (rechte Seite) von stenosierten Mäusen. (B) Repräsentative Mikroskopiebilder von Scheinniere (linke Seite) und kontralaterale Niere (rechte Seite) von Scheinmäusen. Maßstabsbalken 30 Mikrometer. 90-fache Vergrößerung. (C) Repräsentative Mikroskopiebilder der stenosierten Niere (linke Seite), kontralaterale Niere (rechte Seite) von stenosierten Mäusen. (D) Repräsentative Mikroskopiebilder von Scheinniere (linke Seite) und kontralateraler Niere (rechte Seite) von Scheinmäusen. Diese Bilder wurden hauptsächlich aus der Kortexregion aufgenommen. Maßstabsleiste 50 μm. 15-fache Vergrößerung. Weiß gepunktete Kreise kennzeichnen den Standort der Glomeruli. G: Glomeruli, AfAr: Afferente Arteriole, N=4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: In situ Hybridisierungsanalyse der Renin-mRNA-Expression nach Nierenarterienstenose. Nach 3-tägiger Nierenarterienstenose wurden Mäuse eingeschläfert und Nieren isoliert und mit 4% neutraler gepufferter Formalinlösung perfusionsfixiert, in einer graduierten Ethanolserie dehydriert und in Paraffin eingebettet. Die In-situ-Hybridisierung wurde nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die dunkelrote Färbung stellt die mRNA-Reninexpression dar; blau, Kerne. (A) . Repräsentative Mikroskopieaufnahme von stenosierten Nieren (linke Seite) und kontralateraler Niere (rechte Seite) von stenosierten Mäusen. (B) . Repräsentatives Mikroskopiebild der Scheinniere (linke Seite) und der kontralateralen Niere (rechte Seite) von Scheinmäusen. Maßstabsbalken 50 μm. Weiß gepunktete Kreise bezeichnen Glomeruli, die Renin ausdrücken. G: Glomeruli, AfAr: Afferente Arteriole, N=4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Neutrophile Gelatinase-assoziierte Lipocalin (N-GAL)- Expression nach Nierenarterienstenose. Nach 3-tägiger Nierenarterienstenose wurden Mäuse eingeschläfert und Nieren entnommen und die N-GAL-Expressionsmessung durch Western Blot gemessen. (A) Repräsentative Western Blots Bilder von 3-Tage-Stenosen (linkes Bild) und Scheinmäusen (rechtes Bild). Beta-Aktin wurde als Belastungskontrolle verwendet. (B) Densitometrische Analyse von N-GAL-Banden. Die Proteindichtewerte von N-GAL wurden auf β-Aktin normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. P-Wert, berechnet mit Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukey-Post-hoc-Test. **P<0,01, ***P< 0,001, N=3-5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Nierenarterienstenose ist eine wichtige Ursache für sekundäre oder resistente Hypertonie und Nierenschädigung 1,29. Das Goldblatt-Modell mit zwei Nieren (2K1C) wurde verwendet, um RAStenosis-induzierte renovaskuläre Hypertonie 1,17,18,19 zu untersuchen. Eine Reihe früherer Studien mit verschiedenen Tiermodellen haben gezeigt, dass eine Stenose in der Nierenarterie ein starker Stimulator der Reninüberexpression und -freisetzung sowie der Nierenschädigung ist 18,30,31,32,33,34,35. Darüber hinaus wird dieses Modell verwendet, um Immunzellinfiltration, Fibrose, Entzündungen sowie akute und chronische Nierenverletzungsmarker zu untersuchen29.

Hier haben wir ein detailliertes und schrittweises Verfahren beschrieben, um ein reproduzierbares, zuverlässiges und konsistentes Nierenarterienstenose-Modell bei Mäusen zu generieren. Früher wurden Metallclips verwendet, um die Nierenarterienstenose36,37,38 einzuleiten. Alternativ verwendeten wir Polyurethan-Rundrohre (MRE 025; Innendurchmesser (ID) = 0,30 mm; Außendurchmesser (OD) = 0,63 mm; Wandstärke, (WT) = 0,16 mm). Wir haben Schläuche verwendet, da die Platzierung einer Polyurethanmanschette zu einer Verengung in zwei Dimensionen (Einschnürung) und nicht in einer (Abflachung) wie bei einem Metallclip führen würde. Auch die Verwendung von Polyurethan-Rundrohren bietet den Vorteil einer gleichmäßigen Verengung in der Nierenarterie. Der kritische Schritt und die Herausforderungen bestehen darin, die richtige Größe von Polyurethanschläuchen zu schneiden, was extreme Aufmerksamkeit für Details erfordert, die mit einem Mikroskop durchgeführt werden müssen. Ein weiteres kritisches Kriterium ist es, Mäuse zwischen 18-22 g zu halten, um den Schlauch auf die Nierenarterie zu passen. Mäuse in diesem Gewichtsbereich haben normalerweise einen äußeren Durchmesser (OD) der Nierenarterie, der konstant im Bereich des Schlauchmanschettendurchmessers liegt. Eine Einschränkung der Methode besteht darin, dass schwere (über 25 g) oder kleine (unter 16 g) Mäuse aufgrund der Größe des Röhrchens und der Manschette schwer operiert werden können. Bei Bedarf können jedoch Änderungen an den Polyurethanschläuchen vorgenommen werden, um jüngere oder ältere Mäuse unterzubringen.

Wir haben 3-Tage- und 15-Tage-Studien durchgeführt, um eine Nierenarterienstenose bei Mäusen mit einer Erfolgsrate von etwa 95% einzuleiten. Nach unserer Erfahrung führte die Induktion der Nierenarterienstenose mit dieser Methode zu zuverlässigen, reproduzierbaren und konsistenten Ergebnissen bei den Mäusen, unabhängig vom Geschlecht. Um die Verengung der Nierenarterie zu bestätigen, haben wir die Reninexpression und Nierenschädigung gemessen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Reninexpression in der stenosierten Niere signifikant erhöht ist.

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Disclosures

Es werden keine Interessenkonflikte, finanziell oder anderweitig, von den Autoren erklärt.

Acknowledgments

Die Forschung wurde durch den NHLBI Research Scientist Development Grant (1K01HL135461-01) an JAG unterstützt. Vielen Dank an David Carmona-Berrio und Isabel Adarve-Rengifo für ihre technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diet Gel Clear H2O Diet-Gel 76A Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad Hallowell 000A2788B Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture Ethicon 662G 4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture Ethicon 2815 G 8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500 Braintree Scientific Inc. GER 5287 Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen Zoetis Ketofen Painkiller
Polyurethane Braintree Scientific Inc. MRE-025 This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks Medline MDS093901 It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co 204-1000 This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes Dynarex 4410 It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment Medi-First 22312
Water pump Stryker T/pump Professionals Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery

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References

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Medizin Ausgabe 164 Zwei Nieren ein Clip (2K1C) Nierenarterienstenose Renin Angiotensin Aldosteron System Reninexpression Nierenverletzung Mausmodell
Ein modifiziertes Zwei-Nieren-One-Clip-Mausmodell der Reninregulation bei Nierenarterienstenose
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Saleem, M., Barturen-Larrea, P., Saavedra, L., Gomez, J. A. A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis. J. Vis. Exp. (164), e61058, doi:10.3791/61058 (2020).

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