Summary
여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 1 차도 파민 뉴런에서 α-synuclein 축적의 견고하고 재현 가능한 모델을 확립하는 것입니다. 면역 염색 및 편견없는 자동화 된 이미지 분석과 결합된 이 모델은 뉴런 배양에서 α-synuclein aggregation에 대한 약물 및 유전 적 조작의 영향을 분석 할 수 있습니다. 1 차적인 중뇌 배양은 선의의 배아 도파민 뉴런의 신뢰할 수있는 소스를 제공합니다. 본 프로토콜에서, 파킨슨병의 특징적 조직병리학, 루이 바디(LB)는, 신경 배양 매체에 직접 α-synuclein 사전 형성된 섬유브릴(PfFs)의 첨가에 의해 모방된다. 도파민 뉴런의 소마에 내인성 인산화 α-synuclein의 축적은 PFF 추가 후 7 일에서 이미 면역 염색에 의해 검출된다. 체외 세포 배양 조건은 또한 작은 분자 약물 및 신경 영양인과 같은 α-synuclein 축적을 방지하는 치료법의 적용 및 평가뿐만 아니라 유전자 조작을 위한 렌즈바이러스 벡터(예: CRISPR/Cas9 포함)에 적합합니다. 96 웰 플레이트에서 뉴런을 배양하여 실험 용 설정의 견고성과 힘을 증가시킵니다. 실험의 끝에서, 세포는 면역 세포 화학 및 형광 현미경 영상에 대한 파라 포름알데히드로 고정된다. 다중 스펙트럼 형광 심은 96 웰 플레이트의 자동화 된 현미경 검사를 통해 얻어진다. 이러한 데이터는 편견없는 고함량 표현형 분석을 위한 플랫폼을 제공하는 무료 소프트웨어를 사용하여 (예를 들어, 인계 α-synuclein 함유 도파민 뉴런의 수를 잘 계산)을 정량화한다. 1차 도파민 뉴런에서 인포이성 α-synuclein 축적의 PFF 유도 모델링은 고처리량 약물 스크리닝 및 세포 표현형 분석을 위한 기회와 함께 α-synuclein 포함의 형성 및 제거를 중재하는 기본 메커니즘을 연구하는 신뢰할 수 있는 도구를 제공한다.
Introduction
파킨슨병(PD)은 지하 니그라(SN)에서 중뇌 도파민 뉴런의 사망, 기저신경질에서 도파민 톤의 후속 손실, 그리고 그에 따른 운동 장애1,,2를특징으로 하는 신경퇴행성 질환이다. PD 환자의 두뇌에 있는 중요한 조직 병리학 특징은 Lewy 바디 (LB)에게 불린 신경 세포 내 단백질/지질 집계, 또는 신경질에서, Lewy neurites (LN), 통칭Lewy병리학으로알려져 있습니다 3. 두뇌에 있는 Lewy 병리학은 신경 연결을 통해 병원성 요인의 퍼짐을 닮은 전진 PD와 함께 진행하는 것처럼 보입니다. 풍부한 Lewy 병리학은 신경 변성 4에 의해 영향을 받는 그밖 지역에 있는 SN및 세포에 있는 도파민 뉴런에서 찾아낸다4. 그러나, 질병 진행 도중, 단백질 집계의 퍼짐 및 개시는 항상 신경 죽음과 상관관계가 있지 않으며 신경 죽음에 Lewy 병리학의 정확한 기여는 아직도불분명5.
LB 와 LN은 membranous 및 단백질 성분3로구성된 것으로 나타났다. 전자는 막 파편, 혈관 구조 (아마도 리소좀 및 자가식) 및 미토콘드리아3입니다. 후자는 적어도 300 가지 다른 단백질6로구성됩니다. Spillantini외. 7에 의한 특징적인 연구 결과는 Lewy 병리학의 주요 단백질 성분이 α-synuclein이다는 것을 보여주었습니다. 뉴런에서 발현되고, 막 융합 및 신경전달물질 방출과 연계되고, 루이 병리학에서 α-synuclein은 대부분 잘못 접혀, 아밀로이드 피브릴 형태로 존재하며, 그 중 대부분은 Ser129(pS129-αsyn)4,,8에서인광된다.
중요한 것은, 또한 프리온과 같은 특성으로 인해 잘못 접힌 α-synuclein이 루이 병리학 형성4에서원인 역할을 할 수 있음을 입증하였다. 잘못 접힌 α-synuclein의 프리온 유사 특성은 환자로부터 중뇌 추출물과 외인성으로 제조된 α-synuclein 전형성 피브릴(PFF)으로 모두 배양 및 생체 내99,10의뉴런뉴클레인 골재를 유도하였다. PFF는 도파민 뉴런에서 α-synuclein 병리학의 진행을 연구하는 신뢰할 수 있고 강력한 모델을 제시합니다. PFF는 배양 된 1 차적인 뉴런에 적용되거나 동물 뇌에 주입될 때, 그들은 루이 병리학에서 볼 수있는 많은 특징을 재구성하는 신경질과 세포 소마(11)에 α-synuclein 함유 포함 포함의 형성으로 이어집니다. 관찰된 포함은 트리톤 X에서 세제-용용성, 유비퀴티네이트, 아밀로이드 특이염 티오플라빈 S로 염색되고, Ser12911,,12에서α-synuclein hyperphosphorylated를 함유한다. 중요한 것은, 이들 포함은 α-시뉴클레인 녹아웃동물(11)에서형성되지 않으며, 내인성 α-synuclein에 대한 형성의 의존성을 나타낸다.
그럼에도 불구하고, 인간 LB와 LN이 매우 이질적인3이기때문에 PD 환자에서 발견되는 PFF 유도 된 포함 및 Lewy 병리학을 직접 비교하기가 어렵습니다. Lewy 병리학의 관찰된 이질성은 형성의 다른 단계, 상이한 해부학적 위치, 또는 잘못된 접힌 α-synuclein의 형성의 차이에 의해 집합 프로세스를 개시하기 때문에 발생할 수 있습니다. 동일한 요인이 PFF 유도 pS129-αsyn 양성 포함에 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로, 최근에는 1차 신경배양에서 PFF 유도 pS129-αsyn 양성 포함이 장기간 잠복기12,13후에LB를 밀접하게 닮은 구조로 성숙할 수 있는 병리학의 초기 단계를나타낸다는것이 입증되었다.
Lewy 병리학 확산이 초기 단계 질병 마커 중 하나로 간주되기 때문에 PFF를 가진 잘못 접힌 α-synuclein의 조기 확산 및 축적을 모델링하는 것은 약물 개발에 유용합니다. 따라서, 집계 예방 치료는 매우 초기 단계에서 PD의 진행을 중단하거나 늦추기 위해 유망할 수 있다. α-시뉴클레인 축적을 늦추거나 중지하기 위한 여러 임상 시험이 진행 중14회진행 중이다. 후기 환자의 경우, 도파민 뉴런 전구의 이식은 더 나은 치료 대안이 될 수 있다15. 그러나, Lewy 병리학은 PD 참을성 있는 두뇌의 사후 분석 도중 이식된 배아 뉴런에서 문서화되었다16,,17,또한 α-synuclein 축적에 대하여 보호를 위한 필요를 나타내는.
시험관에서, α-synuclein PFFs는 설치류 1차 해마 또는 피질 뉴런에서 불멸의 세포주에서 응집을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 어느 것도 도파민 뉴런을 다시 수상에 가깝지 않습니다10. 이러한 뉴런을 배양하려면 시험관 내 특정 수의 뉴런도금이 필요하다18. 제한된 물질(예: 1차 도파민 뉴런)으로 높은 도금 밀도를 달성하기 위해 마이크로 섬 배양 방법이 일반적으로 활용된다. 마이크로 섬 배양에서, 세포는 처음에 큰 우물18의중간에 표면 장력에 의해 함께 유지 된 매체 (일반적으로 몇 마이크로 리터)의 작은 방울에서 도금된다. 뉴런이 부착된 후, 세포가 작은 도금 영역에서 고밀도로 갇혀 있는 동안 전체 우물은 배지로 채워져 있습니다. 마이크로 섬은 높은 도금 밀도를 달성하는 것 외에도 세포 밀도와 생존의 변화가 빈번한 우물 가장자리 근처의 도금도 방지합니다. 마이크로 섬은 종종 상대적으로 큰 우물이나 요리에 활용; 그러나, 마이크로 섬에 중간 뇌 신경 배양을 설립 96 잘 플레이트 형식은 중간 - 고처리량 전력을 가진 선의의 도파민 뉴런에서 루이 병리학의 연구를 가능하게. 이러한 뉴런을 가진 체외 실험은 우리가 시험관 내및 생체 내19,,20,,21,22에서 성숙한 도파민 뉴런의 생존을 촉진하고 도파민 뉴런23에서α-synuclein 골체의 형성을 방지하는 신경교 세포 주 유래 신경 영양자 (GDNF)를 발견할 수 있었습니다., 인간 환자 유도 만능 줄기 세포 유래 도파민 뉴런은 인체 기원과 시험관내 의 생존 시간 이상으로 인해 더 정확한 모델을 구성합니다. 그러나, 인간 뉴런에서 α-synuclein 병리학의 유도는 마우스 배아 뉴런에서 1주일, 및/또는 다중 스트레스요인(예를 들어, α-synuclein 과발현 및 PFFs의 조합)에 비해 여러 달 후에 관찰된다24,,25. 또한, 인간의 도파민 뉴런의 유지 보수는 1 차적인 배아 뉴런에 비해 더 비싸고 힘들며, 본질적으로 고처리량 응용 프로그램에서 사용을 제한합니다.
또한, 1차 도파민 뉴런 배양은 유전자 변형(예를 들어, CRISPR/Cas9) 및/또는약리학제제(23)로치료될 수 있다. 그(것)들은 분자 통로 해부 및 약 도서관 검열 같이 응용을 위한 빠르고 재현가능한 플랫폼을 구성합니다. 이러한 배양에서 제한된 물질을 얻을 수 있지만, 여전히 작은 크기의 유전체학 / 프로테오믹스 분석을 수행 할 수 있습니다. 96 개의 잘 포맷에서 1 차적인 뉴런을 배양하는 것은 면역 세포 화학 및 형광 현미경 기술, 고함량 표현형 분석에 선행됩니다. 96개의 웰 플레이트의 자동화된 이미징에서 유래된 다중 스펙트럼 형광 이미지는 정량적 결과(예를 들어, 웰당 LB 함유 뉴런의 수)로 변환될 수 있다. 이러한 분석은 CellProfiler26,,27과같은 무료 소프트웨어로 수행 할 수 있습니다. 전반적으로, 96 개의 웰 플레이트에서 도금 된 1 차 배아 중뇌 배양은 높은 처리량 표현형 스크리닝의 기회와 함께 도파민 뉴런과 α-synuclein 응집을 연구하는 강력하고 효율적인 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
모든 동물 실험은 핀란드 국립 동물 실험 위원회의 승인을 받았으며 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 유럽 법률에 따라 수행되었습니다.
1. 준비
- DMEM/F12로 완성된 도파민 뉴런 배지(DPM)는 0.46%, L-글루타민 1%, N2, 0.2% 프리모신으로 준비한다. 재료를 혼합 한 후 DPM을 필터링합니다. DPM을 4°C에 저장하고 각 알리쿼트를 한 번만 데우세요.
참고: DPM은 도파민뉴런(23)에서α-synuclein 축적을 감소시키기 때문에 GDNF를 함유해서는 안 된다. - 매우 소수성인 실리콘 유리 파이펫을 준비하여 배아 뉴런의 초기 처리 중에 표면에 부착되고 세포의 손실을 최소화합니다.
- 10mL의 실리콘 유체를 증류수 1L에 넣고 2L 용기에 저어서 섞습니다. 유리 파이펫을 실리콘 용액에 15분 동안 담그십시오.
- 파이펫을 증류수로 3-5배 헹구세요. 실온(RT)에서 하룻밤 동안 파이펫을 말리거나 100-120°C가열멸균 공간에서 1-2시간 동안 건조하여 건조 속도를 높이십시오.
- 밀봉된 오토클레이브 백에서 표준 오토클레이빙으로 파이펫을 살균합니다.
- 폴리 L-올니틴(PO)을 96μL의 포액을 뉴런의 파종에 사용할 수 있는 96웰 플레이트의 중간 우물에 추가하여 투명 하의96개의 웰 플레이트를 코팅하여, 가장자리 효과를 피하기 위해 플레이트 가장자리에 우물의 적어도 하나의 행/컬럼을 남깁니다. 코팅 된 플레이트를 RT에서 4 ° C 또는 4 h로 밤새 보관하십시오.
- 세포를 도금하기 전에 PO를 완전히 흡인하고 1x PBS의 100 μL로 세 번 씻어 낸다. 우물에서 1x PBS를 흡인하고 완전한 건조를 위해 플레이트 뚜껑을 열어 두십시오.
참고: 사용된 PO를 수집하고 재사용하기 위해 필터링할 수 있습니다. 동일한 PO 용액에 대해 두 번 반복될 수 있습니다. - DPM의 50 μL을 이전에 코팅된 우물에 추가합니다. 100 μL 플라스틱 팁으로 우물에서 DPM을 흡인하고 동시에 각 우물의 둘레에서 코팅을 제거하기 위해 원형 움직임으로 우물의 바닥을 긁습니다. 포 코팅 섬은 우물의 중간에 남아있을 것입니다.
- 라미나르 후드 아래에 는 코팅된 각 섬의 한가운데에 10 μL의 DPM을 추가하여 마이크로 섬을 만듭니다.
참고: DPM으로 덮인 마이크로 섬이 있는 플레이트는 세포의 격리 중에 1-2시간 동안 라미나르 흐름 후드 아래에 보관할 수 있습니다.
2. E13.5 마우스 배아에서 복부 중뇌 바닥의 격리
참고: 중간뇌 바닥 해부 단계의 그림 1을 참조하십시오.
- 해부 전에 10cm 페트리 접시에 덜벡코의 버퍼를 채우고 얼음 위에 보관하십시오.
- 기관의 지침에 따라 E13.5 임신 한 여성 마우스를 안락사시하십시오. 마우스를 등에 평평하게 놓고 전방 바디를 70%에탄올로 뿌립니다. 포셉으로 자궁 위에 피부를 들어 올리고 자궁을 드러내기 위해 외과 가위로 절개를합니다.
- 조심스럽게 자궁을 제거하고 얼음에 이전에 준비 된 페트리 접시에 배치합니다.
- RT의 라미나르 후드 아래의 외과 가위를 사용하여 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거하십시오. 포셉으로 배아의 모든 태반 잔류물을 제거하고 덜벡코의 완충물로 채워진 새로운 10cm 페트리 접시에 넣습니다.
- 해부 집게 또는 바늘을 사용하여 그림 1A에서검은 화살표로 표시된 장소에서 머리의 뒷분기를 차단합니다. 배아의 나머지 부분에서 잘라낸 조각을 가져 가라(도 1B).
- 절단 된 조각의 후방을 관찰자(그림 1C)를향해 놓고 부드럽게 caudal에서 두개골(그림 1D)로열어 자릅니다. 두개골 개구부 아래 0.5mm에서 도 1E에표시된 2mm2~3mm2 영역을 잘라냅니다.
- 빈 1.5 mL 마이크로 센실리후지 튜브에서 복부 중뇌 바닥 (그림 1F참조)을 수집합니다. 모든 중뇌 바닥이 수집 될 때까지 얼음에 미세 원심 분리튜브를 유지합니다.
참고: 또는, 중뇌 바닥은 모든 배아 뇌의 해부 후 1mL 마이크로 파이프로 수집할 수 있습니다.
그림 1: E13.5 마우스 배아로부터 중뇌 층의 해부. (A)헤드의 뒷부분에 있는 절단 위치는 검은 화살과 흰색 파선으로 표시됩니다. (B)조각은 배아의 나머지 부분에서 제거되었다. 제거된 조각이 동그라미가 됩니다. (C)조각은 관찰자를 향해 후방을 직면하기 위해 90 ° 설정되었습니다. (D)조각은 흰색 대시 라인으로 표시)에서 두개골에, 검은 화살표에서 열렸다. (E)개구부 아래 0.5mm-1mm에서 2mm2~4mm2리전지절단(검은색 선표시).2 (F)복부 중뇌 바닥은 고립되었다 (검은 대시 사각형으로 표시). 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 96 개의 잘 플레이트 형식으로 E13.5 마우스 배아에서 1 차 배아 중뇌 배양 확립
- 동일한 1.5mL 튜브의 모든 배아에서 중뇌 바닥의 수집 후, 잔류 덜벡코의 버퍼를 제거하고 Ca2 +,Mg2 +- 무료 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 500 μL로 조직 조각을 세 번 세척합니다.
- HBSS를 제거하고 튜브에 0.5 % 트립신의 500 μL을 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션 하는 동안, 37°C에서 태아 소 혈청 (FBS)의 따뜻한 1.5 mL, FBS에 DNase I의 30 μL을 추가하고 혼합합니다. 또한 실리콘 유리 파이펫의 끝을 불광택. 구멍에 날카로운 모서리가 없고 1mL 마이크로피펫 팁과 동일한 크기인지 확인합니다.
참고: 대안으로, 낮은 접착력 1 mL 마이크로피펫 팁은 트리튜션에 사용할 수 있습니다. 그러나 실리콘 유리 파이펫은 최상의 결과를 제공하는 것 같습니다. - 3.2 단계의 인큐베이션이 끝나는 즉시 부분적으로 소화된 조직에 FBS/DNase 믹스의 500 μL을 추가합니다. 유리 파이펫을 사용하여 FBS/트립신 믹스의 조직을 세리눕시다. 조직이 거의 보이지 않는 작은 입자로 해리될 때까지 세트리튜트합니다. 트리튜션 중에 거품을 피하십시오.
- 남은 입자가 중력에 의해 미세 원심분리기 튜브의 바닥에 침전시키도록 합니다. 하단에 침전물을 파이프하지 않고, 빈 15 mL 원추형 폴리 프로필렌 튜브로 상체를 수집합니다.
- FBS/DNase I를 3.3(98:2)에서 1,000μL의 HBSS로 희석하여 FBS/DNase-I/HBSS(49:1:50)를 얻습니다. 위아래로 파이프를 통해 섞는다. 마이크로센심분리기 튜브의 남은 입자에 새 믹스의 1,000 μL을 추가합니다. 다시 세리트리트하고 3.5단계를 반복합니다.
- 모든 FBS/DNase-I/HBSS(49:1:50)를 사용하려면 이전 단계를 다시 한 번 반복합니다.
- 모든 상체가 15mL 튜브(3.5, 3.7 및 3.8단계에서) 내부에 수집되면 탁상 원심분리기를 사용하여 100 x g에서상퍼(~3mL)를 5분 동안 바닥에 닿지 않고 상환을 제거합니다.
- 튜브에 DPM 2mL을 추가하여 셀 펠릿을 세척하고 5 분 동안 100 x g에서 아래로 회전하십시오.
참고: 항상 배양 뉴런에 신선하고 따뜻하게 DPM을 사용합니다. 세척 단계의 경우 DPM은 신선할 필요는 없지만 37 °C로 예온해야합니다. - 신선하고 따뜻한 DPM으로 세포를 희석시키고 마이크로 센심 분리기 튜브로 옮기십시오. 희석을 위한 DPM의 양은 조직 해부에 사용되는 배아의 수에 달려 있습니다. 예를 들면, 10개의 태아에게서 얻은 세포를 희석하기 위하여 DPM의 150 μL를 이용합니다.
- DPM에 있는 세포의 10 μL을 마이크로원심분리기 튜브로 옮기. 0.4% 트라이판 블루 얼룩의 10 μL로 섞는다. 혈전계 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 라이브(예: Trypan blue negative) 셀을 계산합니다.
참고: 잘 당 도금에 대 한 30,000 세포를 사용 하 여 ~1,000 잘 당 도파민 뉴런을 얻을 수 있습니다. 세포 밀도가 6 μL당 ~30,000 세포보다 높은 경우, 도금 전에 DPM으로 세포를 더 희석하여 파종 부피가 6 μL 미만이 되도록 합니다. - 우물의 바닥을 만지지 않고 1.6 단계에서 생성 된 마이크로 섬에서 DPM을 제거하십시오.
- 각 우물에서 재현 가능한 세포 밀도를 얻기 위해, 우물에서 도금하기 전에 부드러운 파이펫팅으로 세포를 혼합. 1-10 μL 마이크로파이프를 사용하여 각 이전 마이크로 섬의 위치에 우물 중앙에 6 μL의 셀을 추가합니다.
- 150μL의 물 또는 1x PBS로 플레이트 가장자리의 빈 우물을 채우고 신경 배양을 포함하는 우물에서 증발을 최소화합니다. 플레이트를 37°C에서 인큐베이터에 배양하고, 1h에 대해 5%CO2를 배양한다.
- 1 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 세포와 함께 각 우물에 DPM의 100 μL을 추가하고 인큐베이터에 다시 놓습니다.
- 도금 후 이틀 (시험관 내 2 일, 또는 DIV2) 25 μL을 제거하고 150 μL에 최종 미디어 볼륨을 가지고 가능한 한 증발을 방지하기 위해 신선한 DPM의 75 μL을 추가합니다.
- DIV5에서 신선한 DPM(즉, 75 μL을 제거하고 75 μL 신선한 DPM을 추가)으로 매체의 절반을 교환합니다. DIV5 이후에는 미디어 변경 내용을 수행하지 마십시오.
4. 미리 형성된 섬유물로 파종하여 1차 배아 도파민 뉴런에서 α-synuclein 골재의 유도
PFF의 획득 및 검증을 위한 프로토콜은 최근 간행물11,28,,29,,30에서꼼꼼하게 설명되고 논의되었다., PFF와 함께 작업 한 후, 라미나르 후드 또는 1 % SDS와 PFFs에 연락 했을 수 있습니다 모든 장비를 청소, 다음 70% 에탄올31.
- 실험에 앞서 PFF를 1x PBS로 희석하여 100 μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 10 사이클, 30 s ON /30 S OFF에 대한 4 ° C에서 냉각 물 목욕 냉각과 높은 전력에서 목욕 초음파 처리기와 마이크로 센트 심분리기 튜브에서 희석 된 PFF를 초음파 처리합니다.
참고: 피브릴은 ~50nm 길이의 파편을 생성하기 위해 제대로 초음파 처리되는 것이 중요합니다. 초음파 처리된 PFF의 크기는 패터슨 외30에의해 설명된 바와 같이 염색된 PFFs의 전송 전자 현미경 이미지로부터 직접 측정될 수 있다. 초음파 처리는 고전력 목욕 초음파 처리기에서 위에서 설명한 바와 같이 달성 될 수있다. 또는 팁 초음파 처리기는30을사용할 수 있습니다. 초음파 처리된 PFF는 다중 동결/해동 사이클을 피하기 위해 작은 알리쿼트에 -80°C로 저장할 수 있습니다. - DIV8에서는 우물에 있는 150 μl/mL에 잘 100 μg/mL의 3.75 μL을 추가하여 최종 농도인 2.5 μg/mL에 첨가한다. 대조군에 대해 동일한 양의 1배 PBS를 사용합니다.
- 1x PBS에서 4% 파라포름데히드(PFA)를 준비하고 알리쿼트를 -20°C에 저장한다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르십시오.
참고: PFA는 독성; 준비 중에 마스크와 장갑을 착용하고 라미나르 후드 아래에서 항상 작업하고 기관의 지시에 따라 모든 고체 및 액체 PFA 폐기물을 처리하십시오.- 1 L 용기에 1 x PBS의 따뜻한 500 mL. 용기에 교반 바를 넣고 가열 기능을 갖춘 마그네틱 교반기위에 용기를 놓습니다. 용액을 따뜻하게 유지하면서 끓는 것을 방지하기 위해 40~60°C 사이의 온도를 조정합니다.
- 일회용 플라스틱 측정 용기에 후드 아래 PFA 분말 20 g을 측정합니다. 조심스럽게, 1배 PBS로 채워진 용기에 PFA 분말을 넣습니다. 용액을 교반하기 시작합니다.
- 5M 나트륨 의 200 μL을 용액에 넣고 PFA가 완전히 녹을 때까지 ~ 15 분 동안 계속 저어줍니다.
- 용액이 균일하게 나타나면, 5M 수소 염화수소의 168 μL을 추가하여 pH를 ~7로 균형을 이룬다. 일회용 색상 고정 pH 표시기 스트립으로 pH를 확인합니다.
- 히터에서 용기를 제거하고 RT로 냉각할 수 있습니다. 사용 전에 RT에서 알리오트를 해동하고 나중에 다시 고정하지 마십시오.
- DIV15에서 파이펫팅으로 우물에서 모든 미디어를 제거합니다. 각 우물에 4% PFA의 50 μL을 추가하여 세포를 고치고 RT에서 20 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 우물에서 PFA를 제거하고 세포를 세척하기 위해 각 웰에 1x PBS의 100 μL을 추가합니다. PBS 1x을 제거하고 2배 더 씻으시면 됩니다.
- 건조를 피하기 위해 각 우물에 1x PBS의 100 μL을 둡니다. 면역 화학이 수행 될 때까지 4 °C에서 플레이트를 저장합니다.
5. 96 웰 플레이트에서 1 차적인 배아 도파민 뉴런의 면역 형광 염색 및 자동화 된 이미징
- PBS(PBST)에 0.2% 트리톤 X-100의 100 μL을 추가하고 15분 동안 RT에서 배양하여 1배의 PBS를 제거하고 세포를 투과화한다.
- PBST를 제거하고 PBST에 잘 당 5% 일반 말 혈청(NHS)의 50 μL을 추가합니다. 특이하지 않은 항원 활성을 차단하려면 RT에서 1h에 대해 배양하십시오.
- PBST에서 TH 및 pS129-αsyn(1:2,000)에 대한 1차 항체를 희석시 5% NHS에서 희석한다. 각 우물에 희석 된 항체의 50 μL을 추가하고 4 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 항체를 제거하고 세포를 세척하기 위해 각 웰에 1x PBS의 100 μL을 추가합니다. PBS 1x을 제거하고 2배 의 세척을 반복합니다.
- 형광 분자의 표백을 방지하기 위해 최소 조명 조건에서 작업을 시작합니다. PBST에서 이차 형광으로 표시된 항체(1:400)를 희석시켰다. 희석된 항체 50μL을 각 우물에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 항체 용액을 제거하고 세포를 세척하기 위해 각 웰에 1x PBS의 100 μL을 추가합니다. PBS 1x을 제거하고 2배 의 세척을 반복합니다.
- 1x PBS를 제거하고, 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)의 50 μL을 추가하여 배양 된 세포의 핵을 염색하고 10 분 동안 RT에서 배양하십시오.
- 셀 을 3x에 1x PBS1x PBS로 각각 5 분 동안 세척하십시오. 마지막 세척 후 각 1x PBS의 100 μL을 보관하십시오. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 이미징이 될 때까지 4 °C에 보관하십시오.
- 이미지 1 차배 도파민 뉴런에 있는 96 개의 잘 보기 플레이트에 고함량 플레이트 스캐너 (재료의 표참조) 10 배 목표를 장착.
- 플레이트 타입, 제조사, 크기, 웰 사이의 거리, 배지의 종류 및 양과 같은 96 웰 플레이트의 사양에 따라 설정을 조정합니다.
- 마이크로 섬의 모든 세포를 커버할 우물의 이미징 영역을 선택합니다. 자동 초점을 조정하기 위해 예제를 잘 선택합니다. DAPI에 초기 포커스를 기준으로 합니다.
- 제어 우물의 염색 강도에 따라 각 형광 채널의 획득 시간을 보정합니다. PFF 처리된 대조군 우물에서 pS129-αsyn 골재를 세포 소마에 품고 있는 도파민 세포를 명확하게 구별할 수 있도록 파라미터를 조정하여 pS129-αsyn 양성 및 pS129-αsyn 음성 세포의 명확한 정량화를 가능하게 한다.
참고: PFF를 포함하지 않는 우물은 pS129-αsyn에 대한 염색이 없어야 합니다. 따라서 이러한 웰은 pS129-αsyn 강도를 조정하기 위한 음수 제어로 사용될 수 있다. - 정확히 동일한 매개 변수로 염색된 면역 형광이 있는 모든 채널에 대해 10배 목표를 가진 모든 선택된 우물을 이미지합니다.
- 선택적으로, 라벨 α-synuclein 포함은 필라멘트 α-synuclein에 특이적인 항체를 가진 우물의 하위 집합에 포함되어 pS129-αsyn-positive 포함의 수의 변화가 pS129-αsyn-α의 인산화 또는 탈포시프릴화의 억제보다는 단백질 축적의 감소를 반영한다는 것을 확인한다.
- 반복 단계 5.3 대체 pS129-αsyn 항체α-시뉴클레인 필라멘트 항체 (1:2,000). 5.13 단계에서와 같이 염색된 집합체 α-synuclein을 이미지한다.
6. 고함량 이미지 분석
참고: 이 단계는 오픈 액세스 소프트웨어 CellProfiler 버전 3.15 및 셀 프로파일러 분석가 버전 2.2.1로 수행됩니다. 27,32. 그러나 몇 가지 경험을 통해 유사한 이미지 분석 파이프라인을 다른 버전 또는 유사한 소프트웨어로 설정할 수 있습니다. 자세한 설명은 소프트웨어 페이지를 참조하십시오(자료 표참조).
- 셀 프로파일러 및 셀 프로파일러 분석가 소프트웨어를 다운로드하고 설치합니다.
- 셀 프로파일러를 엽니다. 파일 선택 | 가져오기 | 파일에서 파이프라인을 하고 제공된 예제 파이프라인을 TH_LB_V1 로드합니다(추가 파일참조).
참고: 예제 파이프라인은 획득한 이미지및 이미지 수집 플랫폼의 속성에 따라 특정 조정이 필요합니다. Example_Images소프트웨어의 초기 평가판에 사용할 수 있습니다. - 이미지를 이미지 모듈로드래그하여 분석할 이미지를 로드합니다. 필터 옵션을 사용하여 로드된 폴더에서 이미지 파일만 선택합니다.
- 메타데이터 모듈을 사용하여 이미지 파일 이름에서 잘 추출하고 시야및 채널 정보를 추출합니다. 돋보기 기호를 클릭하고 파일 이름에서 플레이트, 음, 이미징 사이트 및 채널 정보를 추출하기 위해 일반 식을 입력합니다.
참고: 정규 식은 플레이트 현미경의 파일 명명 규칙에 따라 달라집니다. 돋보기 옆에 물음표를 클릭하면 구문에 대한 세부 정보가 표시됩니다. - NameAndType 모듈에서 DAPI, TH 및 pS129-αsyn 염색(기본채널 1, 2및 3)에대한 올바른 채널 번호를 선택합니다. 그룹 모듈에서 "아니오"를 선택합니다.
- 메타데이터 모듈을 사용하여 이미지 파일 이름에서 잘 추출하고 시야및 채널 정보를 추출합니다. 돋보기 기호를 클릭하고 파일 이름에서 플레이트, 음, 이미징 사이트 및 채널 정보를 추출하기 위해 일반 식을 입력합니다.
- 세포 소마의 TH 염색을 사용하여 도파민 뉴런을 분할하기 위해 기본 개체 식별 모듈을 사용합니다.
참고: 특정 값은 플레이트가 염색되고 이미지화되는 방법에 따라 초기 최적화가 필요합니다. 후속 플레이트가 유사하게 처리되는 경우 추가 조정이 필요하지 않습니다. - MeasureObjectIntensity 모듈을 사용하여 TH 및 DAPI 채널에서 형광 강도 정보를 수집합니다.
- 측정오브젝트사이즈셰이프 모듈을 사용하여 세그먼트 도파민 뉴런의 크기와 모양 기능을 측정합니다.
- MeasureTexture 모듈을 사용하여 분할된 도파민 뉴런의 TH 채널의 텍스처 피처 정보를 측정합니다.
- 내보내기데이터베이스 모듈을 사용하여 측정값을 데이터베이스에 저장합니다.
- 실험 명명 스키마에 따라 데이터베이스 파일의 이름을 지정합니다(예: ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). 데이터베이스 파일에 대한 출력 폴더를 선택합니다. 데이터베이스 파일은 여러 기가바이트가 클 수 있으며 이미지 파일의 상위 폴더에 바람직하게저장되어야 합니다.
- CellProfiler 분석가를 열고 6.8 단계에서 만든 V1_THCells.properties 파일을 선택합니다. 개방형 도구 | 분류합니다.
- 분할된 세포를 두 가지 범주로 정렬합니다: 양수(즉, 올바르게 분할된 도파민 뉴런 세포 체) 및 음수(즉, 세분화 및 염색 아티팩트)는 그림 2A 및 2B를참조하십시오.
- 가져온 셀 수를 50개의 임의 셀로 설정하고 가져오기를 클릭합니다(이 로드된 셀의 이미지는 6.4단계에서 분할됩니다). 창 하단의 해당 저장소로 드래그하여 각 저장소에 적어도 30개의 셀을 정렬합니다. 필요에 따라 더 많은 셀을 가져옵니다.
- 드롭다운 메뉴에서 50 최대 규칙으로 빠른 부드러운 부스팅을 사용하고 기차를클릭하십시오.
- "50개의 양수 세포로가져오기"를설정하고, 분류기(그림2A)에따라 TH 양성 세포를 얻기 위해 가져오기를 누릅니다. 얻은 결과를 사용하여 숙련된 분류자의 품질을 평가합니다.
- 반복 단계 6.10.1-6.10.3, 결과가 만족 할 때까지 분류자 훈련을위한 새로운 예제 셀을 추가.
- 고급 선택 | 규칙 편집... 새 창에서 모든 텍스트(Ctrl+a)를 선택하고 메모장(Ctrl-v)에 복사합니다. Ctrl+aCtrl-cCtrl-v TH_rules.txt 파일로 저장합니다.
참고: 신경 배양의 밀도와 염색 및 이미징의 품질에 따라 이 단계는 6.4 단계에서 파라미터를 설정하여 TH 양성 세포만 높은 정확도로 분할할 수 있으므로 필요하지 않을 수 있습니다. 이 경우 전체 TH_LB_V1.cpipe 실행이 필요하지 않으며, 식별 기본 개체 모듈의 올바른 매개 변수를 TH_LB_V2.cpipe의해당 모듈에 직접 넣어야 합니다.
도 2: DAPI, TH 및 pS129-αsyn 면역 불피를 기반으로 하는 CellProfiler 분석가 소프트웨어로 도파민 뉴런 및 pS129-αsyn 양성 도파민 뉴런의 정량화. (A)양성 빈내의 TH 세포는 소마에서 영상 및 주변 TH 염색(gray)에서 선택된 첫 번째 세포에서 작은 사각형으로 표시된 DAPI 염색(blue)을 기반으로 선택되었다. (B)비세포 유물은 음의 쓰레기통에 배치되었다. (C)pS129-αsyn 양성 TH 뉴런은 영상에서 선택된 첫 번째 세포에서 작은 사각형으로 표시된 pS129-αsyn 염색(red)을 크게 포함하는 것에 기초하여, 핵또는 세포 소마에서 선택되었다. (D)이러한 pS129-αsyn 포함이 없는 TH 세포는 음수 빈에 배치되었다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 셀 프로파일러를 열고 파일 을 선택 | 가져오기 | 파일 및 로드 TH_LB_V2.cpipe 파일의 파이프라인입니다. 6.3-6.7 단계를 반복합니다. 파이프라인의 이 부분은 TH_LB_V1.cpipe와 동일해야 합니다.
- FilterObjects 모듈을 사용하여 추가 분석을 위해 TRUE TH 양수 셀만 전달합니다.
- 선택 필터링 모드를 규칙에 설정합니다. 규칙 또는 분류자 파일 이름은 6.10.5 단계에서 만든 TH_rules.txt 파일을 선택합니다.
- TH 양수 셀이 왼쪽 아래 창으로 정렬된 경우 클래스 번호 필드를 1로 설정합니다.
- 측정오브젝트강도 모듈을 사용하여 pS129-αsyn 채널에서 형광 강도 정보를 수집합니다.
- MeasureTexture 모듈을 사용하여 필터링된 셀의 TH 채널의 텍스처 피쳐 정보를 측정합니다.
- 측정오브젝트사이즈셰이프 모듈을 사용하여 여과된 셀의 크기와 형상 기능을 측정합니다.
- 내보내기데이터베이스 모듈을 사용하여 측정값을 데이터베이스에 저장합니다.
- 실험 명명 스키마(예: ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db)를 사용하여 데이터베이스 파일을 이름 지정합니다. 데이터베이스 파일에 대한 출력 폴더를 선택합니다.
- 셀 프로파일러 분석가를 열고 V2_THpos.properties 파일을 선택합니다.
- 세분화된 세포를 pS129-αsyn 양성 및 pS129-αsyn 음수세포(도 2C,D)로정렬합니다.
- 가져온 셀 수를 50개의 임의 셀로 설정하고 가져오기를 클릭합니다(4단계에서 분할된 셀의 이미지가 로드됩니다). 창 하단의 해당 저장소로 드래그하여 각 저장소에 적어도 30개의 셀을 정렬합니다.
- 드롭다운 메뉴에서 최대 50개의 max 최대 규칙 또는 무작위 포리스트 분류기로 빠른 젠틀 리스팅 사용(선택)을 선택합니다. 기차를클릭합니다.
- "가져오기"를 50개의 양양성 세포로설정하고 가져오기를 눌러 분류기(그림2C)에따라 pS129-αsyn 양성 세포를 얻습니다. "가져오기"를 50개의 음의 세포로설정하고 가져오기를 눌러 분류기(그림2D)에따라 pS129-αsyn 음수 세포를 가져옵니다. 숙련된 분류자의 품질을 평가합니다.
- 반복 단계 6.17.2-6.17.4, 결과 만족 될 때까지 분류를 훈련하는 새로운 예제 셀을 추가.
- 점수 모두를 클릭하여 각 웰에서 pS129-αsyn 양성 및 음수 도파민 뉴런의 수를 요약한 결과 표를 얻습니다.
Representative Results
도금 후 며칠 후 (DIV1-DIV3), 밝은 필드 현미경 검사법은 개별 우물에서 이러한 조건의 건강과 균질 확산을 평가하기 위해 수행되었다(그림 3). 배양 된 중뇌 세포는 도금 전에 생성 된 마이크로 섬 내에서 균질하게 퍼졌다(도3A,B). 1차 뉴런은 코팅된 땅에 균질하게 정착하고 확립된 뉴런 프로젝션(도3B)을확립하였다. 작은 덩어리의 세포(직경150 μm보다 작은 직경)가 우물에서 관찰되고 예를들어(도 3C)으로나타났다.
그림 3: 도금 후 며칠 후 (예를 들어, DIV3), 1 차적인 중뇌 배양의 상태는 밝은 필드 현미경으로 관찰되었습니다. (A)배양된 세포는 PO 코팅 된 마이크로 섬 내에서 우물의 중간에 걸쳐 퍼져 있으며 약 1mm 의 우물 둘레에서 PO를 긁적으로써 생성 된 4.4 mm (흰색 화살표로 표시됨). (B)배양 된 1 차신경은 지역 내에서 균질하게 퍼지고 뉴런 프로젝션 (빨간 화살촉으로 표시)이 관찰되었다. (C)직경이 150μm보다 작은 세포 덩어리는 파란색 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1차 마우스 중뇌 배양은 항체 및 항-pS129-αsyn 항체로 면역염색되었고 15일 후에 자동 현미경으로 생체외에서 심상화되었다. 코팅 된 마이크로 섬은 우물의 중간에 세포의 부착을위한 제한된 영역을 제공(도 4A,B). TH 마커로 표기된 도파민 뉴런은 덩어리없이 서로 분리된 단층으로 마이크로 섬 주위에 퍼졌다(도4A'및 4B).
그림 4: DIV15에서, 800-1,000 도파민 세포는 PFF 처리의 유무에 관계없이 각 마이크로 섬에서 정량화되었다. 항TH 및 항-pS129-αsyn 항체로 접종된 배아 중뇌 배양의 대표적인 이미지. (A, A', A') PFF 처리 없이 세포를 제어합니다. (B, B', B') pS129-αsyn 내재를 가진 PFF 처리된 세포. (C)50 ng/mL GDNF를 가진 차량(control), PFF 또는 PFF로 처리된 우물에서 TH 양성 셀 수의 정량화. (D)50 ng/mL GDNF를 가진 차량(control), PFF 또는 PFF로 처리된 TH 양성 세포에서 pS129-αsyn 골재의 정량화. 통계적 유의성은 무작위 블록 설계 ANOVA로 계산되었다. **p & 0.01, n = 4 개의 개별 플레이트 (생물학적 복제), 치료 그룹 당 3-6 우물 (기술적 반복). 스케일 바 = A, B용300 μm; A용50 μm, B'; A', B'에대한 B’’25 μm . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PFF 처리가 없는 배양물에는 pS129-αsyn 신호(도4A'및 4A')가없었지만, α-synuclein PfFs로 처리된 배양은 pS129-αsynsyn 양성 포함(도Figure 4A4B') 및’ 4B')를개발하였다.Figure 4B 시험관 내 PFF 치료는 7일 동안 다른 실험군(도4C)에비해 TH 양성 뉴런의 수에 현저한 감소를 일으키지 않았다. PFF 처리 배양은 pS129-αsyn 양성 TH 양성 도파민 뉴런의 ~40%의 인구를 가졌다. 양성 대조군, GDNF를 통한 치료는 pS129-αsyn 양성 포함을 가진 TH 양성 도파민 뉴런의 비율을 감소시켰습니다(도4D, 보충 파일내의원시 데이터 및 예제 이미지 참조).
보충 파일: CellProfiler 및 CellAnalyst 소프트웨어 패키지, 예제 이미지 및 그림 4E, F용원시 데이터를 사용하여 고함량 이미지 분석을 위한 예제 파이프라인을 예로 들 수 있습니다. (1~9)Example_Images. ImageJ 또는 CellProfiler로 이러한 이미지를 엽니다. (10)Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11)TH_LB_V1.cpipe (단계 6.2-6.8),(12)TH_LB_V2.cpipe (단계 6.11-6.18) 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
pS129-αsyn이 주요 성분인 Lewy 병리학을 확산시키는 것은 PD의 조직병리학적 특징입니다. 그러나, pS129-αsyn 집계도 도파민 뉴런의 죽음에 기여하는 방법의 기계적인 이해는 아직도 확립되어야 합니다. 이식된 태아 뉴런에서 pS129-αsyn 양성 포함의 관찰뿐만 아니라 질병의 다른 단계에서 환자로부터 뇌 샘플에 대한 인간 사후 연구에서 증거는 세포16,,17,33사이의 Lewy 병리학의확산을강력하게 시사한다. 따라서, pS129-αsyn의 프리온형 확산은 최근 α-시뉴클레인 PFFs9,,10을사용하여 회수되었다. 특히 도파민 뉴런에서 pS129-αsyn 확산 및 축적의 견고하고 비용 효율적이며 상대적으로 높은 또는 중간 처리량 모델을 확립하면 이 과정을 수정하는 새로운 치료법 및 화합물에 대한 검색 속도가 상당히 빨라질 수 있습니다.
도파민 뉴런의 손실은 PD에서 운동 증상의 주요 원인이기 때문에 이러한 세포는 많은 고유 한특성을가지고2,34,,35,도파민 뉴런에서 pS129-αsyn의 프리온 같은 확산의 모델링은 번역 관점에서 모델의 가장 관련성이 유형이다. 배아 중뇌 뉴런의 마이크로 섬 배양을 활용하는 프로토콜은 4개의 웰 플레이트및 반자동 정량화에 대해 이전에18개에설명되었다. 여기에 설명 된 프로토콜은 96 개의 우물 판에 적응하고 마이크로 섬의 덜 힘든 준비를 제공하므로 숙련 된 연구원이 한 근무 일 동안 각각 60 개의 우물을 포함하는 최대 4 개의 플레이트를 준비할 수 있습니다. 96 웰 플레이트에서 도파민 뉴런을 배양하면 더 적은 양으로 약물을 테스트할 수 있으며 렌티바이러스 벡터로 높은 트랜스듀션 속도를 가능하게 합니다. 또한 더 복잡한 실험을 수행하기 위해 다른 치료법을 결합할 수도 있습니다.
어떤 처리를 적용하기 전에 (PFF를 포함하여), 배양의 질은 밝은 필드 현미경 검사법으로 확인되어야 합니다. 현미경 시스템이 가열된 CO2 챔버를 활용하지 않는 경우, 1차 마우스 도파민 뉴런이 섬세하고 쉽게 스트레스를 받고 있기 때문에 세포는 몇 분 이상 인큐베이터 외부에 보관해서는 안 된다. 같은 이유로, 첫 번째 이미징은 24 h의 잠복식 후에 수행되어야한다는 것이 좋습니다 (DIV1-DIV3 사이). 세포는 현재 세포 체와 동질적으로 마이크로 섬 내부에 확산 살아 있는 것으로 나타납니다. 1 차적인 뉴런은 PO 코팅 된 땅에 정착하고 신경 투영을 확립하기 시작했을 것입니다. 트리튜션 공정이 제대로 이루어지지 않거나 도금 밀도가 권장보다 높으면 형성될 수 있는 작은 덩어리(즉, 150-200 μm 보다 작은 직경)를 관찰할 수 있다. 이 작은 덩어리는 잘 및 / 또는 더 크지 않는 한 실험에 영향을 미치지 않을 것입니다. 응집 세포는 이미지 분석 중에 면역 히스토케미컬 마커 및 개별 세포를 식별하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 신중한 코팅, 삼중화 및 도금 밀도 를 제어하여 이러한 덩어리를 피하는 것이 필수적입니다. 이러한 조건의 균일성이 특정 우물에서 관찰할 수 없는 경우, 실험에 이러한 결함이 있는 우물을 포함하지 않는다. 이러한 배제는 모든 치료법을 실행하기 전에 수행해야합니다.
또한 96개의 웰 플레이트를 사용하면 스테인링 절차 와 자동 플레이트 현미경으로 직접 시각화하는 동안 편리한 멀티채널 파이펫 사용을 가능하게 하며, 처리량을 더욱 증가시합니다. 고콘텐츠 이미징 플랫폼의 데이터를 분석하는 데 는 자동화된 이미지 정량화의 활용이 필수적입니다. 각 실험에서 얻은 수천 개의 이미지를 처리하는 기능 외에도 모든 치료 그룹의 편견없고 동일한 정량화를 보장합니다. 이미지 분석을 위해 제안된 워크플로우는 도파민 뉴런을 분할하고, 감독된 기계 학습에 의해 올바르게 분할된 세포를 필터링하고, 표현형(pS129-αsyn 양성 및 pS129-αsyn 음성)의 정량화, 감독된 기계 학습에 의해 다시 정량화하는 간단한 원리를 기반으로 합니다. 비록이 작업에 대 한 몇 가지 다른 접근 을 구상 할 수 있습니다., 우리는 높은 도금 밀도도 도파민 문화에 대 한 가장 강력한 기계 학습세분화의 조합을 발견 했다, 도파민 뉴런의 다양 한 모양, 그리고 강하게 스테인드 neurites의 존재. 제안된 이미지 분석 알고리즘은 CellProfiler 및 CellProfiler 분석가, 오픈 소스, 자유롭게 사용할 수 있는 고함량 이미지 분석소프트웨어(26,27)에서27구현되었다. 이 알고리즘은 오픈 소스(예: ImageJ/FIJI, KNIME) 또는 독점 적인 다른 이미지 분석 소프트웨어로 구현될 수도 있습니다. 그러나 우리의 경험에서 이러한 종종 사용 편의를 위해 사용자 지정 기능을 희생, 따라서 복잡 한 분석에서 잘 수행 하지 않을 수 있습니다. CellProfiler 및 CellProfiler 분석가 소프트웨어 패키지는 구현된 알고리즘의 상당수, 워크플로우 설계에 대한 극도의 유연성, 고콘텐츠 이미징 데이터의 동시에 처리 및 효율적으로 처리함으로써 특히 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것으로 나타났습니다.
상기 기재된 프로토콜은 또한 다른 신경 집단(예를 들어, DAT, GAD67, 5-HT 등)과 단백질 응집체(예를 들어, 인포타우, 유비퀴틴)의 마커와 같은 다른 항체를 가진 면역스테인링을 특징으로 하는 다른 세포 표현형의 정량화를 위해 적응될 수 있었다. 다중 형광 마커는 또한 다중 표현형을 구별하기 위하여 결합될 수 있었습니다 (예를 들면, 성숙의 다른 단계에서 포함되는 세포). 다중 표현형의 자동화된 분류는 또한 측정 단계에 추가 마커의 면역 형광 이미지를 포함하는 채널을 추가하고 세포를 여러 쓰레기통으로 분류함으로써 설명된 이미지 분석 파이프라인에서 구현하기 쉬워야 합니다. 동시에 여러 마커의 활용은 면역 염색 및 이미징 조건의 최적화를 필요로 한다. 또한 면역 형광 이미징의 더 나은 품질을 위해 형광 현미경을 위해 명시적으로 설계된 특수 검은 벽 96 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 이들은 우리의 프로토콜에 기술된 분석을 위해 충분한 표준 세포 배양 판 보다는 상당히 더 비쌀 수 있습니다.
활용된 PFF의 유형과 품질은 실험 결과에 매우 중요합니다. PFF는 분석의 견고성과 결과의 해석에 영향을 줄 수 있습니다. 준비 조건은 PFFs의 파종 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 실제로, 다른 생리적 특성을 가진 PFF "균주"가36보고되었습니다. 그럼에도 불구하고, PfF의 준비 및 검증은이 문서의 범위를 넘어 여러 간행물(11,,28,,29,,30)에설명되었습니다. 제제 프로토콜 이외에, PFFs(예를 들어, 마우스, 인간)에서 α-synuclein의 기원종 및 야생 형 또는 돌연변이 단백질의 사용(예를 들어, 인간 A53T α-synuclein)은 특정 실험 조건에 따라 고려되어야 한다. PFF에 의한 pS129-αsyn 축적의 유도는 배양연령(즉, 체외에서일)에 의존하는 것으로 나타났으며, 더 성숙한 배양은 더 뚜렷한유도(11)를나타냈다. 이것은 아마 더 성숙한 배양에 있는 신경 연결의 증가한 수 때문이고, 증가한 α-synuclein 단백질 수준. 우리의 손에, DIV8에서 PFFs와 치료는 가장 강력한 결과 준, 도파민 뉴런 소마에 pS129-αsyn의 뚜렷한 축적, 신경 생존을 손상 하지 않는 동안. 설명된 프로토콜은 PS129-αsyn 양성 포함을 비교적 초기 시점에서 정량화하기 때문에, PFF를 접종한 후 7일 후에 내인성 α-synuclein의 응집으로 이어지는 초기 이벤트를 수정하는 치료에 적합합니다. 이 시점에서, 내혈 포함은 세포의 상당한 분수에 존재하고 PFF 유도 세포 사멸이 관찰되지 않는 동안 면역 염색에 의해 쉽게 구별 될 수있다, 결과의 해석을 단순화. 중요한 것은, PFF 유도 포함의 형태 및 조성물이시간이지남에 따라 변경될 수 있기때문에,13,기재된 프로토콜은 원칙적으로, 나중에 고정 및 면역스테인팅에 의해 보다 성숙한 포함을 연구하도록 수정될 수 있다. 그러나, 보다 더 이상 문화에 도파민 뉴런을 유지 15 일 극단적인 치료를 필요로, PFF 접종에서 독립적으로 살아남지 못하는 세포 때문에 추가 변화를 유도할 수 있습니다. 추가적으로, 더 확장된 문화는 약 처리 일정을 복잡하게 합니다. 많은 화합물은 세포 배양 배지의 안정성을 제한하거나 제대로 특성화하지 않으며, 약물의 보충은 중간의 완전한 교환이 도파민 배양의 생존을 손상시키기 때문에 사소한 것이 아니다.
Ser129에서 α-synuclein의 인산화는 Α-synuclein 집계의 PFF 기반 모델에서 일관되게 보고되고 티오플라빈 S, 유비퀴틴 또는 형태 특이적 항체11,,12와같은 오접및 응집의 마커와 공존한다. 우리 손에는 pS129-αsyn용 면역 염색은 가장 낮은 배경을 가진 가장 강력한 신호를 제공하며 분석하기가 가장 간단하여 여러 치료법을 선별할 때 강력한 결과를 제공합니다. 중요한 것은, pS129-αsyn 항체를 가진 면역 염색은 세포 외부에 남아 있는 PFF를 검출하지 않으며, 배경을 현저하게 감소시킵니다. 그러나, Ser129 인산화는 아마 α-synuclein의 잘못 접기와 연결된 초기 프로세스 중 하나이며 특정 조건하에서 다르게 조절될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, pS129-αsyn에 긍정적인 영향을 보이는 모든 사실 인정은 다른 마커에 의해 확인되어야 한다.
통계 분석은 실험 설계에 따라 조정되어야 합니다. 적어도 3개의 독립적인 생물학 복제에서 실험을 수행하는 것이 필수적입니다 (즉, 별도의 1차 신경 배양). 이러한 복제는 다른 플레이트에 도금되고 독립적으로 처리되어야 합니다. 우리는 다른 실험 판에 대한 데이터의 페어링을 고려하기 위해 무작위 블록 디자인 ANOVA37과 다른 플레이트에 복제에서 얻은 데이터를 분석합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
켈빈 루크 교수님, 신경세포를 확립하고 배양한 콘중 정 교수, 면역염색세포를 이미징하기 위한 헬싱키 생명공학연구소의 광현미경검사부에 감사드립니다. 이 작품은 비즈니스 핀란드 (핀란드 혁신기금 기관), 핀란드 #309489 아카데미, #293392, #319195 3i-재생의 보조금에 의해 지원되었다; 시그리드 주셀리우스 재단, 그리고 약리학의 Maj 연구소의 법정 기금, PAS, 폴란드.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
