Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudiar la acumulación de sinucleína neuronal en las neuronas primarias de dopamina de ratón. Los agregados de sinucleína fosforilada en las neuronas se inducen con fibrillas preformadas de sinucleína. Las imágenes automatizadas de células etiquetadas inmunofluorescentemente y análisis de imágenes imparciales hacen que este protocolo robusto sea adecuado para el cribado de rendimiento medio-alto de fármacos que inhiben la acumulación de sinucleína.
Abstract
El objetivo de este protocolo es establecer un modelo robusto y reproducible de la acumulación de sinucleína en las neuronas primarias de dopamina. Combinado con la inmunostaining y el análisis automatizado de imágenes imparcial, este modelo permite el análisis de los efectos de los fármacos y manipulaciones genéticas en la agregación de sinucleína en cultivos neuronales. Cultivos primarios de cerebro medio proporcionan una fuente confiable de neuronas de dopamina embrionaria de buena fe. En este protocolo, la histopatología distintiva de la enfermedad de Parkinson, los cuerpos de Lewy (LB), se imita por la adición de fibrillas preformadas de sinucleína (PFF) directamente a los medios de cultivo neuronales. La acumulación de fosforilado endógeno -sinucleína en el soma de las neuronas de dopamina se detecta mediante inmunotenchación ya a los 7 días después de la adición de PFF. Las condiciones de cultivo celular in vitro también son adecuadas para la aplicación y evaluación de tratamientos que impiden la acumulación de sinucleína, como fármacos de moléculas pequeñas y factores neurotróficos, así como vectores de lentivirus para la manipulación genética (por ejemplo, con CRISPR/Cas9). El cultivo de las neuronas en 96 placas de pozo aumenta la robustez y la potencia de las configuraciones experimentales. Al final del experimento, las células se fijan con paraformaldehído para inmunocitoquímica y imágenes de microscopía de fluorescencia. Las imágenes de fluorescencia multiespectral se obtienen mediante microscopía automatizada de 96 placas de pozo. Estos datos se cuantifican (por ejemplo, contando el número de neuronas de dopamina que contienen fosfo- - sinucleína por pozo) con el uso de software libre que proporciona una plataforma para el análisis imparcial de fenotipo de alto contenido. El modelado inducido por PFF de la acumulación de fosforilada -sinucleína en las neuronas primarias de dopamina proporciona una herramienta confiable para estudiar los mecanismos subyacentes que median la formación y eliminación de las inclusiones de sinucleína, con la oportunidad de detección de fármacos de alto rendimiento y análisis de fenotipos celulares.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la muerte de las neuronas de dopamina de cerebro medio en la sustancia nigra (SN), posterior pérdida del tono de dopamina en los ganglios basales, y consecuentes deficiencias motoras1,2. Una característica histopatológica importante en el cerebro de los pacientes con DP son los agregados de proteínas/lípidos intracelulares que se encuentran en el soma neuronal, llamados cuerpos de Lewy (LB), o en neuritas, Neuritas de Lewy (LN), conocidas colectivamente como patología lewy3. La patología de Lewy en el cerebro parece progresar con el avance de la DP que se asemeja a la propagación de factores patógenos a través de conexiones neuronales. Abundante patología Lewy se encuentra en las neuronas de dopamina en el SN y células en otras áreas afectadas por la neurodegeneración4. Sin embargo, durante la progresión de la enfermedad, la propagación y la aparición de la agregación de proteínas no siempre se correlacionan con la muerte neuronal y la contribución exacta de la patología de Lewy a la muerte neuronal sigue sin estar clara5.
Se ha demostrado que LB y LN consisten en componentes membranosos y proteicos3. Los primeros son fragmentos de membrana, estructuras vesiculares (posiblemente lisosomas y autofagosomas) y mitocondrias3. Este último consta de al menos 300 proteínas diferentes6. Un estudio distintivo de Spillantini et al.7 demostró que el principal componente proteico de la patología de Lewy es la sinucleína. Muy expresado en las neuronas, y vinculado con la fusión de membrana y la liberación de neurotransmisores, la sinucleína en la patología de Lewy está presente principalmente en forma desdoplete, fibrina amiloide, la mayor parte de la cual se fosforila en Ser129 (pS129-'syn)4,8.
Es importante destacar que también se demostró que debido a sus propiedades similares a los priones, la sinucleína desdobada podría tener un papel causal en la formación de patología de Lewy4. Las propiedades similares a los priones de la sinucleína con un plegón se mostraron con tanto extractos de cerebro medio de los pacientes como con fibrillas preformadas de sinucleína preparadas exógenamente (PFF) para inducir agregados de sinucleína en las neuronas en el cultivo e in vivo9,,10. Los PFF presentan un modelo fiable y robusto para estudiar la progresión de la patología de la sinucleína en las neuronas de dopamina. Cuando los PFF se aplican a las neuronas primarias cultivadas o se inyectan en el cerebro animal, conducen a la formación de inclusiones que contienen sinucleína en neuritas y soma celular11 que recapitulan muchas características vistas en la patología de Lewy. Las inclusiones observadas son detergente-insolubles en Tritón X, ubiquitinadas, manchadas con el tinte específico amiloide Thioflan S, y contienen -sinucleína hiperfosforilada en Ser12911,12. Es importante destacar que estas inclusiones no se forman en los animales knockout de la sinucleína11, lo que indica la dependencia de su formación en endógenos de la sinucleína.
Sin embargo, es difícil comparar directamente las inclusiones inducidas por PFF y la patología de Lewy que se encuentra en pacientes con DP porque los LB y LN humanos son altamente heterogéneos3. La heterogeneidad observada de la patología de Lewy puede ser causada por diferentes etapas de la formación, diferente ubicación anatómica, o diferencias en la conformación de la sinucleína mal pleida iniciando el proceso de agregación. Los mismos factores podrían influir en las inclusiones positivas de pS129-'syn inducidas por PFF. De hecho, recientemente se demostró que las inclusiones positivas de pS129-'syn inducidas por PFF en cultivos neuronales primarios representan etapas muy tempranas de la patología que pueden madurar a estructuras que se asemejan mucho a la LB después del período de incubación prolongado12,,13.
Modelar la propagación temprana y la acumulación de sinucleína con PFF con pfnúngicas es valioso para el desarrollo de fármacos, ya que la propagación de la patología de Lewy se considera uno de los marcadores de la enfermedad en etapa temprana. Por lo tanto, los tratamientos preventivos de agregación pueden ser prometedores para detener o ralentizar la progresión de la DP en etapas muy tempranas. Varios ensayos clínicos destinados a ralentizar o detener la acumulación de sinucleína están en curso14. Para pacientes en etapa posterior, el trasplante de progenitores neuronales de dopamina puede ser una mejor alternativa de tratamiento15. Sin embargo, la patología de Lewy se documentó en neuronas embrionarias trasplantadas durante el análisis post mortem de los cerebros de pacientes con DP16,,17, lo que también indica la necesidad de protección contra la acumulación de sinucleína.
Se sabe que los PFF in vitro de la sinucleína inducen la agregación en líneas celulares inmortalizadas, o más comúnmente, en neuronas corticales o hipocampales primarias de roedores. Ninguno de estos están cerca de recapitular las neuronas de dopamina10. Cultivar estas neuronas requiere un revestimiento denso de cierto número de neuronas in vitro18. Para lograr una alta densidad de chapado con material limitado (por ejemplo, neuronas primarias de dopamina), el método de cultivo de microisla se utiliza comúnmente. En el cultivo de microismís, las células se chapan inicialmente en una pequeña gota de medio (generalmente unos pocos microlitros) mantenidas juntas por la tensión superficial en medio de un pozo grande18. Después de que las neuronas se unen, todo el pozo se llena con el medio mientras que las células permanecen confinadas a alta densidad en el área de chapado pequeño. Además de lograr una alta densidad de chapado, las micro islas también evitan el revestimiento cerca de los bordes de los pozos, donde las variaciones en la densidad celular y la supervivencia son frecuentes. Las micro islas se utilizan a menudo en pozos o platos relativamente grandes; sin embargo, el establecimiento de cultivos neuronales de cerebro medio en micro islas en formato de placa de 96 pozos permite el estudio de la patología de Lewy en neuronas de dopamina de buena fe con potencia de rendimiento medio a alto. Los experimentos in vitro con estas neuronas nos permitieron descubrir el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), que promueve la supervivencia de las neuronas maduras de dopamina in vitro e in vivo19,,20,,21,,22 y también previene la formación de agregados de sinucleína en las neuronas de dopamina23. Las neuronas de dopamina derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el paciente humano constituyen un modelo más preciso debido a su origen humano y un tiempo de supervivencia más largo in vitro. Sin embargo, la inducción de la patología de la sinucleína en las neuronas humanas se observa después de varios meses, en comparación con una semana en las neuronas embrionarias de ratón, y / o con múltiples factores de estrés (por ejemplo, combinación de sobreexpresión de sinucleína y PFF)24,25. Además, el mantenimiento de las neuronas de dopamina humana es más costoso y laborioso en comparación con las neuronas embrionarias primarias, esencialmente limitando su uso en aplicaciones de alto rendimiento.
Además, los cultivos neuronales primarios de dopamina pueden ser modificados genéticamente (por ejemplo, con CRISPR/Cas9) y/o tratarse con agentes farmacológicos23. Constituyen una plataforma rápida y reproducible para aplicaciones como la disección de vías moleculares y el cribado de bibliotecas de fármacos. A pesar de que se puede obtener material limitado de estos cultivos, todavía es posible realizar análisis genómicos/proteómicos de pequeño tamaño. Cultivar neuronas primarias en formato 96 bien es mejor para las técnicas de microscopía de inmunocitoquímica y fluorescencia, seguido de análisis de fenotipo de alto contenido. Las imágenes de fluorescencia multiespectral derivadas de imágenes automatizadas de 96 placas de pozo se pueden convertir en resultados cuantitativos (por ejemplo, el número de neuronas que contienen LB por pozo). Dichos análisis se pueden realizar con software libre, como CellProfiler26,,27. En general, los cultivos de cerebro medio embrionario primarios en 96 placas de pozo proporcionan una plataforma robusta y eficiente para estudiar las neuronas de dopamina y la agregación de sinucleína con la oportunidad de detección de fenotipos de alto rendimiento.
Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Junta Nacional finlandesa de experimentos con animales y se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación europea sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos.
1. Preparación
- Preparar medio de neurona de dopamina (DPM) con 0.46% D-glucosa, 1% L-glutamina, 1% N2, 0.2% primocina, completado con DMEM/F12. Filtre el DPM después de mezclar los ingredientes. Almacene EL DPM a 4 oC y caliente cada alícuota una sola vez.
NOTA: DPM no debe contener GDNF, ya que reducirá la acumulación de sinucleína en las neuronas de dopamina23. - Preparar pipetas de vidrio siliconizadas que sean extremadamente hidrófobas, minimizando así la fijación a la superficie y la pérdida de células durante el manejo inicial de las neuronas embrionarias.
- Añadir 10 ml de líquido de silicio a 1 L de agua destilada y mezclar revolviendo en un recipiente de 2 L. Deje las pipetas de vidrio sumergidas en la solución de silicona durante 15 minutos.
- Enjuague las pipetas 3-5x con agua destilada. Secar las pipetas durante la noche a temperatura ambiente (RT) o durante 1–2 h a 100-120 oC de espacio estéril calentado para acelerar el secado.
- Esterilice las pipetas mediante autoclave estándar en una bolsa de autoclave sellada.
- Preparar placas de poli-L-ornitina (PO) recubiertas de 96 po con fondos transparentes añadiendo 60 ml de solución de PO en los pozos medios de la placa de 96 pozos que se utilizará para la siembra de las neuronas, dejando al menos una fila / columna de pozos en los bordes de la placa para evitar efectos de borde. Mantenga la placa recubierta durante la noche a 4 oC o 4 h en RT.
- Antes de enchapar las células, aspirar PO completamente y lavar las células tres veces con 100 l de 1x PBS. Aspirar 1x PBS de los pozos y mantener la tapa de la placa abierta para un secado completo.
NOTA: Es posible recoger el PO usado y filtrarlo para su reutilización. Esto se puede repetir dos veces para la misma solución de PO. - Agregue 50 l de DPM a los pozos previamente recubiertos. Aspirar DPM de los pozos con una punta de plástico de 100 s y arañar simultáneamente la parte inferior del pozo con movimientos circulares para eliminar el recubrimiento en el perímetro de cada pozo. Una isla recubierta de PO permanecerá en el medio del pozo.
- Bajo una capucha laminar, agregue 10 l de DPM al centro de cada isla recubierta para crear micro islas.
NOTA: Una placa con micro islas cubiertas por DPM se puede mantener bajo el capó de flujo laminar durante 1-2 h durante el aislamiento de las células.
2. Aislamiento del suelo de cerebro medio ventral de embriones de ratón E13.5
NOTA: Consulte la Figura 1 para conocer los pasos de disección del piso del cerebro medio.
- Antes de la disección, llene un plato de Petri de 10 cm con el tampón de Dulbecco y manténgalo en hielo.
- Eutanasia un ratón hembra embarazada E13.5 de acuerdo con las pautas de la institución. Coloque el ratón plano sobre su espalda y rocíe el cuerpo anterior con 70% de etanol. Levante la piel por encima del útero con fórceps y haga una incisión con tijeras quirúrgicas para exponer el útero.
- Retire cuidadosamente el útero y colóquelo en el plato de Petri previamente preparado sobre hielo.
- Usando tijeras quirúrgicas debajo de la capucha laminar en RT, retire cuidadosamente los embriones del útero. Retire todos los residuos placentarios de los embriones con fórceps y colóquelos en un nuevo plato de Petri de 10 cm lleno de tampón de Dulbecco.
- Usando fórceps o agujas de disección, corte el cuarto trasero de la cabeza de los lugares marcados con flechas negras en la Figura 1A. Saque la pieza cortada del resto del embrión(Figura 1B).
- Coloque la parte posterior de la pieza cortada hacia el observador (Figura 1C) y córtela suavemente de caudal a craneal (Figura 1D). A partir de 0,5 mm por debajo de la abertura craneal, corte una regiónde 2mm 2–3 mm 2, que se muestra en la Figura 1E.
- Recoger el suelo del cerebro medio ventral (ver Figura 1F) en un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 ml. Mantenga el tubo de microcentrífuga sobre hielo hasta que todos los pisos de cerebro medio se recojan en él.
NOTA: Alternativamente, los pisos de cerebro medio se pueden recoger con una micropipeta de 1 ml después de la disección de todos los cerebros embrionarios.
Figura 1: Disección del suelo de cerebro medio del embrión de ratón E13.5. (A) Las ubicaciones de corte en el cuarto trasero de la cabeza están marcadas con flechas negras y líneas blancas discontinuas. (B) La pieza fue retirada del resto del embrión. La pieza eliminada está en círculo. (C) La pieza se giró 90o para mirar hacia la parte posterior hacia el observador. (D) La pieza se abrió desde las flechas negras, de caudal a craneal (marcada con línea blanca discontinua). (E) Desde 0,5 mm-1 mm por debajo de la abertura, se cortó la regiónde 2mm 2–4 mm 2 (marcada con líneas negras). (F) El suelo del cerebro medio ventral estaba aislado (marcado con cuadrado discontinuo negro). Barras de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Establecimiento de cultivos primarios embrionarios de cerebro medio a partir de embriones de ratón E13.5 en formato de placa de 96 pozos
- Después de la recolección de pisos de cerebro medio de todos los embriones en el mismo tubo de 1,5 ml, retire el tampón residual de Dulbecco y lave las piezas de tejido tres veces con 500 l de Ca2 +, Mg2+-libre Hank's Liquidd Salt Solution (HBSS).
- Retire el HBSS y añada 500 l de 0,5% de trippsina al tubo. Incubarlo a 37oC durante 30 min.
- Durante la incubación, calentar 1,5 ml de suero bovino fetal (FBS) a 37 oC, añadir 30 oC de DNase I al FBS y mezclar. Además, pula la punta de una pipeta de vidrio siliconizado. Asegúrese de que el agujero no tiene bordes afilados y es de alrededor del mismo tamaño que una punta de micropipeta de 1 ml.
NOTA: Como alternativa, se puede utilizar una punta de micropipeta de 1 ml de baja adherencia para la trituración. Sin embargo, las pipetas de vidrio siliconizado parecen dar los mejores resultados. - Tan pronto como termine la incubación en el paso 3.2, agregue 500 l de la mezcla FBS/DNase al tejido parcialmente digerido. Utilice la pipeta de vidrio para triturar el tejido en la mezcla FBS/trypsin. Triturar hasta que los tejidos se disocian en partículas diminutas, apenas visibles. Evite las burbujas durante la trituración.
- Deje que las partículas sobrantes se precipiten en la parte inferior del tubo de microcentrífuga por gravedad. Sin pipetear el precipitado en la parte inferior, recoger el sobrenadante en un tubo de polipropileno cónico vacío de 15 ml.
- Diluir FBS/DNase I del paso 3.3 (98:2) con 1.000 l de HBSS para obtener FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Mezclar en pipeteando arriba y abajo. Añadir 1.000 l de la nueva mezcla a las partículas sobrantes en el tubo de microcentrífuga. Triturar de nuevo y repetir el paso 3.5.
- Repita el paso anterior una vez más para utilizar todo FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
- Una vez que todo el sobrenadante se recoge dentro del tubo de 15 ml (de los pasos 3.5, 3.7 y 3.8), utilice una centrífuga de mesa para girar hacia abajo el sobrenadante (3 ml) a 100 x g,durante 5 min. Retire el sobrenadante sin tocar las células peletadas en la parte inferior.
- Lavar el pellet celular añadiendo 2 ml de DPM al tubo y girar hacia abajo a 100 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y repita el lavado 2x para minimizar los residuos en las células peletadas.
NOTA: Utilice siempre DPM fresco y calentado para las neuronas cultivadas. Para los pasos de lavado, DPM no tiene que ser fresco, pero debe estar precalificado a 37 oC. - Diluir las células con DPM fresco y caliente y transferirlas a un tubo de microcentrífuga. La cantidad de DPM para la dilución depende del número de embriones utilizados para la disección de tejidos. Por ejemplo, utilice 150 l de DPM para diluir las células obtenidas de diez embriones.
- Transfiera 10 l de células en DPM a un tubo de microcentrífuga. Mézclalos con 10 l de 0,4% de tinción azul de Trippan. Cuente las células vivas (es decir, las células negativas azules de Trypan) utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado.
NOTA: Utilice 30.000 células para el chapado por pozo para obtener 1.000 neuronas de dopamina por pozo. Si la densidad de la célula es superior a 30.000 celdas por 6 l, diluya aún más las celdas con DPM antes del encote para que el volumen de siembra no sea inferior a 6 l. - Sin tocar la parte inferior de los pozos, quite el DPM de las micro islas creadas en el paso 1.6.
- Con el fin de obtener la densidad celular reproducible en cada pozo, mezclar las células por pipeteo suave antes de encoger en el pozo. Con una micropipeta de 1-10 l, agregue 6 l de células al centro del pozo, en la ubicación de cada antigua micro isla.
- Llene los pozos vacíos en los bordes de la placa con 150 l de agua o 1 pbS para minimizar la evaporación de los pozos que contienen cultivos neuronales. Incubar la placa en una incubadora a 37oC, 5% CO2 durante 1 h.
- Después de 1 h, retire la placa de la incubadora, agregue 100 l de DPM en cada pocóculo con las células y colóquela de nuevo en la incubadora.
- Dos días después del enchapado (día in vitro 2, o DIV2), retire 25 l y agregue 75 l de DPM fresco para llevar el volumen final del soporte a 150 l y evitar la evaporación tanto como sea posible.
- Intercambie la mitad del medio con DPM fresco (es decir, quite 75 l y agregue 75 ml de DPM fresco) en el DIV5. No realice ningún cambio de medios después de DIV5.
4. Inducción de agregados de sinucleína en las neuronas primarias de dopamina embrionaria mediante la siembra con fibrillas preformadas
Los protocolos para la obtención y validación de FMF se han descrito y discutido meticulosamente en varias publicaciones recientes11,28,29,30. Después de cualquier trabajo con PFF, limpie la campana laminar o cualquier equipo que pueda haber contactado con los PFF con 1% SDS, luego con 70% etanol31.
- Antes del experimento, diluir los PFF con 1x PBS a una concentración final de 100 g/ml. Sonicar los PFF diluidos en tubos de microcentrífuga con un sonicador de baño a alta potencia con refrigeración de baño de agua a 4 oC durante 10 ciclos, 30 s ON/30 s OFF.
NOTA: Es fundamental que las fibrillas se sonicen correctamente para generar fragmentos de 50 nm de largo. El tamaño de los FMF sonicados se puede medir directamente a partir de imágenes de microscopio electrónico de transmisión de PFF manchados como se describe en Patterson et al.30. La sonicación se puede lograr como se describió anteriormente en un sonicador de baño de alta potencia. Alternativamente, un sonicador de punta se puede utilizar30. Los PFF sonicados se pueden almacenar a -80 oC en pequeñas alícuotas para evitar múltiples ciclos de congelación/descongelación. - En el DIV8, añada 3,75 l de 100 g/ml de FMF por poero a los 150 l de medio en el pozo a una concentración final de 2,5 g/ml. Utilice la misma cantidad de 1x PBS para el grupo de control.
- Preparar un 4% de paraformaldehído (PFA) en 1 pbS PBS y almacenar las alícuotas a -20 oC. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.
NOTA: PFA es tóxico; use una máscara y guantes durante la preparación, trabaje siempre bajo una capucha laminar y deseche todos los residuos de PFA sólidos y líquidos de acuerdo con las instrucciones de la institución.- Caliente 500 mL de 1x PBS en un recipiente de 1 L. Coloque una barra de agitación en el recipiente y coloque el recipiente en un agitador magnético con una función de calentamiento. Ajuste la temperatura entre 40–60 oC para evitar que se hierva mientras mantiene la solución caliente.
- Mida 20 g de polvo PFA bajo el capó en un recipiente de medición de plástico desechable. Agregue cuidadosamente el polvo PFA en el recipiente lleno de 1x PBS. Comience a agitar la solución.
- Añadir 200 l de hidróxido de sodio de 5 M en la solución y continuar revolviendo durante 15 min, hasta que el PFA se disuelva por completo.
- Después de que la solución parezca homogénea, agregue 168 l de cloruro de hidrógeno de 5 M para equilibrar el pH a 7. Compruebe el pH con tiras indicadoras de pH fijadas en color desechables.
- Retire el recipiente del calentador y deje que se enfríe a RT. Filtrar la solución y aliquot para su almacenamiento a -20 oC. Descongelar las alícuotas en RT antes del uso y no volver a congelar después.
- En DIV15, elimine todos los medios de los pozos pipeteando. Añadir 50 l de 4% de PFA a cada pocód siguiente para fijar las células e incubar durante 20 min en RT. Después de la incubación, retire la PFA de los pomos y agregue 100 l de 1x PBS a cada pocóptil para lavar las células. Retire 1x PBS y lave 2 veces más.
- Dejar 100 l de 1x PBS en cada pocómo para evitar el secado. Conservar la placa a 4oC hasta que se realice inmunoquímica.
5. Tinción inmunofluorescente e imágenes automatizadas de neuronas primarias de dopamina embrionaria en 96 placas de pozo
- Retire 1x PBS y permeabilice las células añadiendo 100 l de 0.2% Tritón X-100 en PBS (PBST) por pozo e incubando a RT durante 15 min.
- Retire el PBST y agregue 50 l de 5% de suero de caballo normal (NHS) por pozo al PBST. Para bloquear la actividad inespecífica del antígeno, incubar en RT durante 1 h.
- Diluir los anticuerpos primarios contra th y pS129-'yn (1:2,000) en 5% NHS en PBST. Añadir 50 l de anticuerpos diluidos a cada pozo e incubar durante la noche a 4oC.
- Retire los anticuerpos y agregue 100 l de 1x PBS a cada pocól para lavar las células. Retire 1x PBS y repita el lavado 2x.
- Para evitar el blanqueo de moléculas fluorescentes, comience a trabajar en condiciones de luz mínimas. Diluir los anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente (1:400) en PBST. Añadir 50 l de anticuerpos diluidos a cada pocóteo e incubar a RT durante 1 h.
- Retire la solución de anticuerpos y agregue 100 l de 1x PBS a cada pocól para lavar las células. Retire 1x PBS y repita el lavado 2x.
- Retire 1x PBS, agregue 50 l de 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per well para manchar los núcleos de las células cultivadas e incubar en RT durante 10 min.
- Lavar las células 3x con 100 l de 1x PBS durante 5 min cada una. Conservar 100 l de 1x PBS en cada pocótela después del último lavado. Cubra la placa con papel de aluminio y guárdela a 4 oC hasta que se haga imágenes.
- Imagen de neuronas de dopamina embrionaria primaria en una placa de visión de 96 pozos con un escáner de placas de alto contenido (ver Tabla de materiales) equipado con un objetivo de 10x.
- Ajuste los ajustes en función de las especificaciones de la placa de 96 pozos, como el tipo de placa, fabricante, tamaño, distancia entre pozos, así como el tipo y la cantidad de medio.
- Seleccione el área de imágenes del pozo para cubrir todas las células de una micro isla. Elija un ejemplo bien para ajustar el enfoque automático. Base el enfoque inicial en DAPI.
- Calibrar el tiempo de adquisición para cada canal fluorescente, en función de la intensidad de la tinción en los pozos de control. Ajuste los parámetros de modo que en los pozos de control tratados con PFF se puedan distinguir claramente las células de dopamina que albergan agregados pS129-'yn en el soma celular, lo que permite la cuantificación inequívoca de las células positivas pS129-'syn y pS129-'syn.
NOTA: Los pozos que no contienen PFF no deben tener ninguna tinción para pS129-syn; por lo tanto, estos pozos se pueden utilizar como control negativo para ajustar la intensidad pS129-syn. - Imagen de todos los pozos seleccionados con un objetivo 10x simultáneamente para todos los canales con tinción de inmunofluorescencia con exactamente los mismos parámetros.
- Opcionalmente, etiquete las inclusiones de sinucleína en un subconjunto de los pocillos con anticuerpos específicos para la sinucleína filamentosa para confirmar que los cambios en el número de inclusiones pS129-'syn-n-positivos reflejan la reducción en la acumulación de proteínas en lugar de la inhibición de la fosforilación o la defosforilación de pS129-'syn.
- Repita el paso 5.3 sustituyendo el anticuerpo pS129-'synen por el anticuerpo de filamento de sinucleína (1:2.000). Imagen de la sinucleína agregada teñida como en el paso 5.13.
6. Análisis de imágenes de alto contenido
NOTA: Este paso se realiza con el software de acceso abierto CellProfiler versión 3.15 y CellProfiler Analyst versión 2.2.1. 27,32. Sin embargo, con cierta experiencia, las canalizaciones de análisis de imágenes análogas podrían establecerse en una versión diferente o software similar. Consulte la página del software para obtener una explicación detallada (consulte Tabla de materiales).
- Descargue e instale el software CellProfiler y CellProfiler Analyst.
- Abra CellProfiler. Seleccione Archivo . . . . . . . . . Importación ? Canalizar desde el archivo y cargar la canalización de ejemplo proporcionada, archivo TH_LB_V1.cpipe (consulte los archivos suplementarios).
NOTA: Las canalizaciones de ejemplo requerirán ajustes específicos en función de las propiedades de las imágenes adquiridas y de la plataforma de adquisición de imágenes. Example_Imagesse puede utilizar para la prueba inicial del software. - Cargue las imágenes que desea analizar arrastrándolas al módulo Imágenes. Utilice las opciones de filtro para seleccionar solo los archivos de imagen de la carpeta cargada.
- Utilice el módulo Metadatos para extraer información de pozo, campo de visión y canal del nombre del archivo de imagen. Haga clic en el símbolo de la lupa e introduzca la expresión regular para extraer la información de placa, pozo, sitio de imágenes y canal de los nombres de archivo.
NOTA: La expresión regular dependerá de la convención de nomenclatura de archivos del microscopio de placas. Al hacer clic en el signo de interrogación junto a la lupa, se proporcionarán detalles de la sintaxis. - En el módulo NamesAndTypes, seleccione los números de canal correctos para la tinción DAPI, TH y pS129--syn(canales predeterminados 1, 2y 3). En el módulo Grupos, seleccione"No".
- Utilice el módulo Metadatos para extraer información de pozo, campo de visión y canal del nombre del archivo de imagen. Haga clic en el símbolo de la lupa e introduzca la expresión regular para extraer la información de placa, pozo, sitio de imágenes y canal de los nombres de archivo.
- Utilice módulos IdentifyPrimaryObjects para segmentar las neuronas de dopamina utilizando la tinción TH del soma celular.
NOTA: Los valores específicos requerirán una optimización inicial en función de cómo seiñen y se muestran las placas. Si las placas posteriores se procesan de forma similar, no será necesario realizar ningún ajuste adicional o mínimo. - Utilice el módulo MeasureObjectIntensity para adquirir información sobre la intensidad de la fluorescencia de los canales TH y DAPI.
- Utilice el módulo MeasureObjectSizeShape para medir el tamaño y las características de las neuronas de dopamina de segmento.
- Utilice el módulo MeasureTexture para medir la información de la característica de textura del canal TH de las neuronas de dopamina segmentadas.
- Utilice el módulo ExportToDatabase para guardar las mediciones en la base de datos.
- Nombre del archivo de base de datos según el esquema de nomenclatura del experimento (por ejemplo, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Seleccione Carpeta de salida para el archivo de base de datos. El archivo de base de datos puede tener varios gigabytes de tamaño y debe guardarse preferentemente en la carpeta principal de los archivos de imagen.
- Abra CellProfiler Analyst y seleccione el archivo V1_THCells.properties creado en el paso 6.8. Herramientas abiertas ? Clasificador.
- Ordenar las células segmentadas en dos categorías: positivo (es decir, cuerpos celulares de neuronas de dopamina correctamente segmentados) y negativos (es decir, artefactos de segmentación y tinción) Ver Figura 2A y 2B.
- Establezca el número de celdas recuperadas en 50 celdas aleatorias y haga clic en Obtener (esto carga imágenes de las celdas segmentadas en el paso 6.4). Ordene al menos 30 celdas en cada bandeja arrastrándolas a la bandeja correspondiente en la parte inferior de la ventana. Obtenga más células según sea necesario.
- En el menú desplegable, seleccione Usar potenciador suave rápido con 50 reglas máximas y haga clic en Entrenar.
- Establezca"Fetch" en 50 celdas positivas y presione Fetch para obtener celdas TH positivas de acuerdo con el clasificador (Figura 2A). Utilice el resultado obtenido para evaluar la calidad del clasificador entrenado.
- Repita los pasos 6.10.1–6.10.3, agregando nuevas celdas de ejemplo para entrenar al clasificador hasta que los resultados sean satisfactorios.
- Seleccione Avanzado . Editar reglas... y en una nueva ventana seleccione todo el texto (Ctrl+a) y cópielo (Ctrl-c) al bloc de notas (Ctrl-v). Guardar como archivo TH_rules.txt.
NOTA: Dependiendo de la densidad del cultivo neuronal y la calidad de la tinción y la imagen, este paso puede no ser necesario, ya que podría ser posible establecer parámetros en el paso 6.4 para segmentar sólo las células TH positivas con alta precisión. Si este es el caso, no es necesario ejecutar todo un TH_LB_V1.cpipe y los parámetros correctos de los módulos IdentifyPrimaryObjects deben colocarse directamente en el módulo correspondiente en TH_LB_V2.cpipe.
Figura 2: Cuantificación de las neuronas de dopamina y pS129-'syn neuronas positivas de dopamina con el software CellProfiler Analyst basado en DAPI, TH, y pS129-'syn inmunofluorescencia. Las celdas TH deA)en el contenedor positivo se seleccionaron en función de la tinción DAPI (azul) marcada con un pequeño cuadrado en la primera celda seleccionada en la imagen y la tinción TH circundante (gris) en el soma. (B) Los artefactos no celdas se colocaron en la ubicación negativa. (C) pS129-'syn positivas TH neuronas fueron seleccionadas sobre la base de la gran inclusión de la tinción pS129-'syn (rojo) marcada con un pequeño cuadrado en la primera celda seleccionada en la imagen, rodeando los núcleos o en el soma celular. (D) Las células TH sin tales inclusiones pS129-'syn se colocaron en la bandeja negativa. Barras de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Abra CellProfiler y seleccione Archivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Importación ? Canalización desde archivo y cargar archivo TH_LB_V2.cpipe. Repita los pasos 6.3–6.7. Esta parte de la canalización debe ser idéntica a TH_LB_V1.cpipe.
- Utilice el módulo FilterObjects para pasar solo celdas positivas TH verdaderas para un análisis posterior.
- Establezca el modo de filtrado de selección en Reglas. En Reglas o nombre de archivo clasificador, seleccione el archivo TH_rules.txt creado en el paso 6.10.5.
- Establezca el campo Número de clase en 1 si las celdas positivas TH se ordenaron en la ventana inferior izquierda.
- Utilice el módulo MeasureObjectIntensity para adquirir información sobre la intensidad de la fluorescencia del canal pS129-syn.
- Utilice el módulo MeasureTexture para medir la información de la característica de textura del canal TH de las celdas filtradas.
- Utilice el módulo MeasureObjectSizeShape para medir el tamaño y las entidades de forma de las celdas filtradas.
- Utilice el módulo ExportToDatabase para guardar las mediciones en la base de datos.
- Nombre del archivo de base de datos en consecuencia con el esquema de nomenclatura del experimento (por ejemplo, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Seleccione la carpeta de salida para el archivo de base de datos.
- Abra CellProfiler Analyst y seleccione V2_THpos.properties.
- Ordenar las celdas segmentadas en dos categorías: pS129-'syn positive y pS129-'yn negative cells (Figura 2C,D).
- Establezca el número de celdas recuperadas en 50 celdas aleatorias y haga clic en Obtener (esto carga imágenes de celdas segmentadas en el paso 4). Ordene al menos 30 celdas en cada bandeja arrastrándolas a la bandeja correspondiente en la parte inferior de la ventana.
- En el menú desplegable, seleccione Usar potenciador suave rápido con 50 reglas máximas o clasificadores de bosque aleatorio. Haga clic en Entrenar.
- Establezca"Fetch" en 50 celdas positivas y presione Fetch para obtener las celdas positivas pS129-syn según clasificador (Figura 2C). Establezca"Fetch"en 50 celdas negativas y presione Fetch para obtener las celdas negativas pS129-syn de acuerdo con el clasificador (Figura 2D). Evalúe la calidad del clasificador entrenado.
- Repita los pasos 6.17.2–6.17.4, agregando nuevas celdas de ejemplo para entrenar al clasificador hasta que los resultados sean satisfactorios.
- Haga clic en Puntuar todo para obtener la tabla de resultados que resume el número de pS129-'syn positivas y negativas neuronas de dopamina en cada pozo.
Representative Results
Unos días después del revestimiento (DIV1-DIV3), se realizó una microscopía de campo brillante para evaluar la salud y la propagación homogénea de las células cultivadas, y la uniformidad de estas condiciones en los pozos individuales (Figura 3). Las células de cerebro medio cultivadas se esparcieron homogéneamente dentro de la micro isla creada antes del revestimiento (Figura 3A,B). Las neuronas primarias se habían asentado en el suelo recubierto de forma homogénea y las proyecciones neuronales establecidas(Figura 3B). En el pozo se observó un pequeño grupo de células (diámetro inferior a 150 m) que se mostró como ejemplo(Figura 3C).
Figura 3: Pocos días después del revestimiento (por ejemplo, DIV3), se observó la condición de los cultivos primarios de cerebro medio con microscopía de campo brillante. (A) Células cultivadas esparcidas por el centro del pozo dentro de la micro isla recubierta de PO con un radio aproximado de 4,4 mm (mostrado con flechas blancas) creadas mediante la rayación de PO desde aproximadamente 1 mm del perímetro del pozo (mostrado con flechas negras). (B) Se observaron neuronas primarias cultivadas que se propagan homogéneamente dentro del área y proyecciones neuronales (marcadas con puntas de flecha rojas). (C) Un grupo de celdas con un diámetro inferior a 150 m está marcado con puntas de flecha azules. Barras de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los cultivos primarios de ratón de cerebro medio fueron inmunotendidos con anticuerpos anti-TH y anti-pS129-'syn y se trataron con un microscopio automatizado después de 15 días in vitro. Las micro islas recubiertas proporcionaron área restringida para la unión de células en el medio de los pozos(Figura 4A,B). Las neuronas de dopamina inmunoeticionadas con marcador TH se esparcieron alrededor de la micro isla en una monocapa, separadas entre sí, sin ningún aglutinamiento (Figura 4A' y 4B').
Figura 4: En DIV15, 800–1,000 células de dopamina se cuantificaron de cada micro isla, con o sin tratamiento PFF. Imágenes representativas de cultivos embrionarios de cerebro medio inmonustenidos con anticuerpos anti-TH y anti-pS129-syn. (A, A', A'') Células de control sin tratamiento con PFF. (B, B', B'') Células tratadas con PFF con inclusiones pS129-'syn. (C) Cuantificación de números de células TH-positivas en pozos tratados con vehículo (control), PFF o PFF con GDNF de 50 ng/ml. (D) Cuantificación de los agregados pS129-'syn en células TH positivas tratadas con vehículo (control), PFF o PFF con GDNF de 50 ng/ml. La significancia estadística se calculó con el diseño de bloque aleatorio ANOVA. **p < 0,01, n a 4 placas individuales (réplicas biológicas), cada una con 3-6 pozos por grupo de tratamiento (repeticiones técnicas). Barras de escala á 300 m para A, B; 50 m para A', B'; 25 m para A'', B''. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Si bien los cultivos sin tratamiento con PFF no tenían ninguna señal pS129- syn (Figura 4A' y 4A'),los cultivos tratados con PFF de sinucleína desarrollaron inclusiones positivas pS129-syn (Figura 4B' y 4B'). El tratamiento in vitro de PFF durante 7 días no causó ninguna disminución significativa en el número de neuronas TH positivas, en comparación con otros grupos experimentales (Figura 4C). Los cultivos tratados con PFF tenían una población de -40% de las neuronas de dopamina TH positivas de pS129-'syn TH-positivas. El tratamiento con control positivo, GDNF, redujo el porcentaje de neuronas de dopamina TH-positivas con inclusiones positivas pS129-'syn (Figura 4D, ver también los datos sin procesar y las imágenes de ejemplo en los archivos suplementarios).
Archivos suplementarios: Ejemplo de canalizaciones para el análisis de imágenes de alto contenido con CellProfiler y los paquetes de software CellAnalyst, imágenes de ejemplo y datos sin procesar para la Figura 4E, F. (1-9) Example_Images. Abra estas imágenes con ImageJ o CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Pasos 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Pasos 6.11–6.18) Haga click aquí para descargar este archivo.
Discussion
La propagación de la patología de Lewy, de la cual la pS129-'yn es un componente importante, es un sello histopatológico de PD. Detener o ralentizar la acumulación de pS129-'min agregado puede ralentizar la degeneración de las neuronas de dopamina y la progresión de la alfa-sinucleinopatía. Sin embargo, una comprensión mecanicista de cómo la agregación pS129-'yn contribuye a la desaparición de las neuronas de dopamina todavía tiene que ser establecida. La evidencia de estudios postmortem humanos en muestras cerebrales de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad, así como la observación de la inclusión positiva de pS129-'syn en las neuronas fetales trasplantadas sugieren fuertemente la propagación de la patología de Lewy entre las células16,,17,,33. Por lo tanto, la propagación similar a un prión de pS129-'yn se recapitula recientementemedianteel uso de PFF de sinucleína 9,10. Establecer un modelo robusto, rentable y de rendimiento relativamente alto o medio de la propagación y acumulación de pS129-'yn, específicamente en las neuronas de dopamina, puede acelerar considerablemente la búsqueda de nuevos tratamientos y compuestos que modifiquen este proceso.
Debido a que la pérdida de neuronas de dopamina es la principal causa de los síntomas motores en la DP y estas células poseen muchas propiedades únicas2,34,35, modelado de la propagación prion-like de pS129-'syn en las neuronas de dopamina es el tipo más relevante de modelo desde la perspectiva traslacional. Los protocolos que utilizan cultivos de microinsulares de neuronas embrionarias de cerebro medio en 4 placas de pozos y cuantificación semiautomática se han descrito anteriormente18. El protocolo descrito aquí fue adaptado a 96 placas de pozo y proporciona una preparación menos laboriosa de las micro islas, lo que permite la preparación de hasta cuatro placas que contienen 60 pozos cada uno por un investigador experimentado durante una jornada laboral. El cultivo de neuronas de dopamina en 96 placas de pozo permite probar fármacos en cantidades más bajas y permite altas tasas de transducción con vectores de lentivirus. También es posible combinar diferentes tratamientos para realizar experimentos más complejos.
Antes de aplicar cualquier tratamiento (incluidos los F PFF), la calidad del cultivo debe comprobarse con microscopía de campo brillante. Si el sistema de microscopía no utiliza una cámara de CO2 con calentamiento, las células no deben mantenerse fuera de la incubadora durante más de un par de minutos, porque las neuronas primarias de dopamina del ratón son delicadas y fácilmente estresadas. Por la misma razón, se aconseja que la primera toma de imágenes debe hacerse después de 24 h de incubación (entre DIV1-DIV3). Las células deben parecer estar vivas con cuerpos celulares presentes y diseminadas homogéneamente dentro de la micro isla. Las neuronas primarias se habrían asentado en el suelo recubierto de PO y comenzaron a establecer proyecciones neuronales. Es posible observar pequeños grupos de células (es decir, diámetro inferior a 150–200 m) que se pueden formar si el proceso de trituración no se realiza correctamente o la densidad de chapado es mayor de lo recomendado. Estos pequeños grumos no afectarían el experimento, a menos que sean más de unos pocos por pozo y/o más. Las células agujeadas hacen que sea muy difícil identificar marcadores inmunohistoquímicos y células individuales durante el análisis de la imagen. Es esencial evitar tales grumos mediante un recubrimiento cuidadoso, trituración y control de la densidad de revestimiento. Si la uniformidad de estas condiciones no se puede observar en ciertos pozos, no incluya estos pozos defectuosos en el experimento. Dicha exclusión debe hacerse antes de la ejecución de cualquier tratamiento.
Además, la utilización de 96 placas de pozo permite un cómodo uso de pipetas multicanal durante los procedimientos de tinción y la visualización directa con microscopios automáticos de placas, aumentando aún más el rendimiento. La utilización de la cuantificación automatizada de imágenes es indispensable para el análisis de los datos de plataformas de imágenes de alto contenido. Además de la capacidad de procesar miles de imágenes obtenidas de cada experimento, garantiza una cuantificación idéntica e imparcial de todos los grupos de tratamiento. El flujo de trabajo propuesto para el análisis de imágenes se basa en principios simples de segmentación de neuronas de dopamina, filtrado de células correctamente segmentadas por aprendizaje automático supervisado, y posteriormente cuantificación de fenotipos (pS129-'syn positivo y pS129-'yn negativo), de nuevo por aprendizaje automático supervisado. Aunque se pueden imaginar varios enfoques diferentes para esta tarea, hemos encontrado la combinación de segmentación con aprendizaje automático para ser el más robusto para cultivos de dopamina debido a la alta densidad de chapado, las diversas formas de las neuronas de dopamina, y la presencia de neuritas fuertemente manchadas. El algoritmo de análisis de imágenes propuesto se implementó en CellProfiler y CellProfiler Analyst, de código abierto, software de análisis de imágenes de alto contenido disponible libremente26,,27. El algoritmo también podría implementarse con otro software de análisis de imágenes, ya sea de código abierto (por ejemplo, ImageJ/FIJI, KNIME) o propietario. Sin embargo, en nuestra experiencia, estos a menudo sacrifican las capacidades de personalización para facilitar su uso y, por lo tanto, podrían no funcionar bien en análisis complicados. Hemos descubierto que los paquetes de software CellProfiler y CellProfiler Analyst ofrecen resultados particularmente fiables al combinar un número sustancial de algoritmos implementados, flexibilidad extrema en el diseño del flujo de trabajo y, al mismo tiempo, el manejo y procesamiento eficiente de datos de imágenes de alto contenido.
El protocolo descrito también podría adaptarse para la cuantificación de otros fenotipos celulares caracterizados por inmunostaining con diferentes anticuerpos, como marcadores de otras poblaciones neuronales (por ejemplo, DAT, GAD67, 5-HT, etc.) y agregados de proteínas (por ejemplo, fospo-Tau, ubiquitina). Múltiples marcadores fluorescentes también podrían combinarse para distinguir múltiples fenotipos (por ejemplo, células con inclusiones en diferentes etapas de maduración). La clasificación automatizada de múltiples fenotipos también debe ser fácil de implementar en las canalizaciones de análisis de imágenes descritas simplemente agregando un canal que contenga imágenes inmunofluorescentes de marcadores adicionales a pasos de medición y clasificación de células en múltiples contenedores. Sin embargo, la utilización de múltiples marcadores al mismo tiempo requeriría la optimización de las condiciones de inmunosu manchado y de imagen. Además, para una mejor calidad en la toma de imágenes por inmunofluorescencia, se recomienda el uso de placas especiales de 96 pozos de paredes negras diseñadas explícitamente para el microscopio fluorescente. Sin embargo, estos pueden ser considerablemente más caros que las placas de cultivo celular estándar, que son suficientes para el análisis descrito en nuestro protocolo.
El tipo y la calidad de los PFF utilizados son fundamentales para el resultado de los experimentos. Tanto los FMF pueden afectar a la solidez del ensayo como a la interpretación de los resultados. Las condiciones de preparación pueden afectar a la eficiencia de siembra de los FFP y, de hecho, se han notificado "strains" PFF con diferentes propiedades fisiológicas36. No obstante, la preparación y validación de los FMF están fuera del alcance de este artículo y se han descrito en varias publicaciones11,28,29,30. Además del protocolo de preparación, se deben considerar las especies de origen de la sinucleína en los FMF (p. ej., ratón, humano) y el uso de proteínas silvestres o mutadas (por ejemplo, A53T-sinucleína humana), dependiendo de las condiciones experimentales particulares. Se demostró que la inducción de la acumulación de pS129-syn por FMF dependía de la edad del cultivo (es decir, días in vitro), con cultivos más maduros que muestran una inducción más pronunciada11. Esto es probablemente debido al aumento del número de conexiones neuronales en cultivos más maduros, y el aumento de los niveles de proteína de sinucleína. En nuestras manos, el tratamiento con PFF en DIV8 dio los resultados más robustos, con acumulación pronunciada de pS129-'yn en el soma de la neurona de dopamina, sin comprometer la supervivencia neuronal. El protocolo descrito es adecuado para los tratamientos de estudio que modifican los primeros eventos que conducen a la agregación de la sinucleína endógena, ya que cuantificamos las inclusiones positivas de pS129-'syn en un momento relativamente temprano, 7 días después de la inoculación con PFS. En este momento, las inclusiones intrasomales están presentes en una fracción significativa de las células y se pueden distinguir fácilmente por inmunosu mancha, mientras que no se observa la muerte celular inducida por PFF, simplificando la interpretación de los resultados. Es importante destacar que, dado que la morfología y la composición de las inclusiones inducidas por PFF pueden cambiar con el tiempo12,13, el protocolo descrito podría, en principio, modificarse para estudiar inclusiones más maduras mediante fijación e inmunosu mancha en puntos posteriores. Sin embargo, mantener las neuronas de dopamina en cultivo durante más de 15 días requiere cuidados extremos, y podría inducir variaciones adicionales debido a que las células no logran sobrevivir independientemente de la inoculación de PFF. Además, los cultivos más extendidos complican los horarios de tratamiento farmacológico. Muchos compuestos tienen estabilidad limitada o no mal caracterizada en el medio de cultivo celular, y la reposición de un medicamento no es trivial porque el intercambio completo de medio compromete la supervivencia de los cultivos de dopamina.
La fosforilación de la sinucleína en Ser129 se notifica de forma consistente en modelos basados en PFF de agregación de sinucleína y colocaciones con marcadores de desdoblamiento y agregación como Tioflavina S, ubiquitina o anticuerpos específicos de conformación11,,12. En nuestras manos, la inmunostaining para pS129-'yn también da la señal más fuerte con el fondo más bajo y es más fácil de analizar, dando resultados robustos cuando se examinan múltiples tratamientos. Es importante destacar que la inmunostaining con anticuerpos pS129--syn no detecta los PFF que permanecen fuera de las células, reduciendo significativamente el fondo. Sin embargo, es importante recordar que la fosforilación Ser129 es probablemente uno de los primeros procesos relacionados con el desdoblamiento de la sinucleína y podría estar regulada de manera diferente en condiciones específicas. Por lo tanto, cualquier hallazgo que muestre efectos positivos sobre pS129---yn debe ser confirmado por otros marcadores.
El análisis estadístico debe adaptarse de forma correspondiente al diseño experimental. Es esencial realizar experimentos en al menos tres réplicas biológicas independientes (es decir, cultivos neuronales primarios separados). Estas réplicas deben ser chapadas en diferentes placas y tratadas de forma independiente. Analizamos los datos obtenidos a partir de réplicas en diferentes placas con diseño de bloque aleatorio ANOVA37 para tener en cuenta el emparejamiento de datos para diferentes placas experimentales.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Prof. Kelvin Luk por su generoso don de PFF de sinucleína, Conjung Zheng por establecer y cultivar células neuronales, y la Unidad de Microscopía ligera del Instituto de Biotecnología de la Universidad de Helsinki para la toma de imágenes de células inmunodemintadas. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de 3i-Regeneration de Business Finland (Agencia finlandesa de financiación para la innovación), Academia de Finlandia #309489, #293392, #319195; Fundación Sigrid Juselius, y los fondos legales del Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
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