Summary
Burada, birincil fare dopamin nöronlarında nöronal α-sinüklein birikimini incelemek için ayrıntılı bir protokol sıyoruz. Nöronlarda fosforial α-sinüklein agregaları önceden oluşan α-sinüklein fibrilleri ile indüklenir. İmmünfloresan etiketli hücrelerin otomatik görüntülemesi ve tarafsız görüntü analizi, bu sağlam protokolü α-sinüklein birikimini engelleyen ilaçların orta-yüksek iş akışı taraması için uygun hale getirilmiştir.
Abstract
Bu protokolün amacı primer dopamin nöronlarında α-sinüklein birikiminin sağlam ve tekrarlanabilir bir modelini oluşturmaktır. İmmünostaining ve tarafsız otomatik görüntü analizi ile birlikte, bu model nöronal kültürlerde α-sinüklein agregasyonu üzerinde ilaçların ve genetik manipülasyonların etkilerinin analizine olanak sağlar. Birincil orta beyin kültürleri iyi niyetli embriyonik dopamin nöronlar güvenilir bir kaynak sağlar. Bu protokolde, Parkinson hastalığının histopatolojisi olan Lewy cisimlerinin (LB), α-sinüklein önceden oluşmuş fibrillerin (PfFs) doğrudan nöronal kültür ortamına eklenmesiyle taklit edilir. Dopamin nöronların somasında endojen fosforiile α-sinüklein birikimi PFF ilavesi tarihinden 7 gün sonra immünboyama ile saptanır. İn vitro hücre kültürü koşulları, küçük moleküllü ilaçlar ve nörotrofik faktörler gibi α-sinüklein birikimini engelleyen tedavilerin uygulanması ve değerlendirilmesi ile genetik manipülasyon için lentivirüs vektörleri (örneğin CRISPR/Cas9 ile) için de uygundur. 96 kuyu plakalı nöronların culturing sağlamlık ve deneysel kurulumların gücünü artırır. Deney sonunda hücreler immünositokimya ve floresan mikroskopi görüntüleme için paraformaldehit ile sabitlenir. Multispektral floresan görüntüleri 96 kuyu plakasının otomatik mikroskopisi ile elde edilir. Bu veriler, tarafsız yüksek içerikli fenotip analizi için bir platform sağlayan özgür yazılım kullanımı ile (örn. kuyu başına fosfo-α-sinüklein içeren dopamin nöronlarının sayısının saygedilmesi) ölçülür. Primer dopamin nöronlarında fosforile α-sinüklein birikiminin PFF kaynaklı modellemesi, α-sinüklein inklüzumlarının oluşumu ve ortadan kaldırılmasına aracılık eden altta yatan mekanizmaları incelemek için güvenilir bir araç sağlar ve yüksek iş letimatif ilaç taraması ve hücresel fenotip analizi olanağı sağlar.
Introduction
Parkinson hastalığı (PH) substantia nigra orta beyin dopamin nöronların ölümü ile karakterize bir nörodejeneratif hastalıktır (SN), bazal gangliyonlar dopamin tonu sonraki kaybı, ve sonuç motor bozuklukları1,2. PH hastalarının beyinlerinde önemli bir histopatolojik özellik nöronal soma bulunan hücre içi protein / lipid agregalar, Lewy organları denir (LB), veya nöritler, Lewy nöritler (LN), topluca Lewy patoloji olarak bilinen3. Beyindeki Lewy patolojisi nöronal bağlantılar yoluyla patojenik faktörlerin yayılmasını andıran ilerleyen PH ile ilerleme kgörülmektedir. Bol Lewy patolojisi SN dopamin nöronlar ve nörodejenerasyon etkilenen diğer alanlarda hücrelerde bulunur4. Ancak, hastalığın ilerlemesi sırasında, yayılması ve protein agregasyonu başlangıcı her zaman nöronal ölüm ve nöronal ölüme Lewy patolojitam katkısı ile ilişkili değildir5.
LB ve LN'nin membranöz ve proteinayağ bileşenlerinden oluştuğu gösterilmiştir3. Eski membran parçaları, veziküler yapılar (muhtemelen lizozomlar ve otofazomlar) ve mitokondri3. İkincisi en az 300 farklı protein6oluşur. Spillantini ve ark.7 tarafından yapılan bir çalışmada Lewy patolojisinin ana protein bileşeninin α-sinüklein olduğu gösterilmiştir. Yüksek nöronlarda ifade, ve membran füzyon ve nörotransmitter salınımı ile bağlantılı, Lewy patolojiα-synüklein çoğunlukla yanlış katlanmış mevcuttur, amiloid fibril formu, bunların toplu Ser129 fosforlu olan (pS129-αsyn)4,8.
Daha da önemlisi, prion benzeri özellikleri nedeniyle, yanlış katlanmış α-sinüklein Lewy patoloji oluşumunda nedensel bir rol olabileceğini gösterilmiştir4. Yanlış katlanmış α-sinüklein prion benzeri özellikleri hem hastalardan orta beyin özleri ile gösterilmiştir hem de eksojen hazırlanmış α-sinüklein önceden bilgili fibriller (PfFs) kültür nöronlarda α-sinüklein agregaları neden ve in vivo9,10. PfFs dopamin nöronlarında α-sinüklein patolojiilerlemesini incelemek için güvenilir ve sağlam bir model mevcut. PfFs kültürlü birincil nöronlar uygulandığında veya hayvan beynine enjekte edildiğinde, onlar lewy patolojisinde görülen birçok özelliği özetleyen nöritler ve hücre soma11 α-sinüklein içeren inklüzatlar oluşumuna yol açar. Gözlenen inklütifler Triton X'te deterjan çözünmez, her yerde bulunan, amiloid spesifik boya Thioflavin S ile boyanmış ve Ser12911,,12'dehiperfosforilasyon α-sinüklein içerir. Daha da önemlisi, bu inklümenler α-sinüklein nakavt hayvanlarda oluşmaz11, endojen α-sinüklein onların oluşumunun bağımlılığı nı gösteren.
Bununla birlikte, insan LB'leri ve LN'leri son derece heterojen olduğu için PD hastalarında bulunan PFF kaynaklı inklüeleri ve Lewy patolojisini doğrudan karşılaştırmak zordur3. Lewy patolojisinin gözlenen heterojenliği oluşumun farklı aşamaları, farklı anatomik konum veya yanlış katlanmış α-sinüklein konformasyonundaki farklılıklardan kaynaklanabilir. Aynı faktörler PFF'ye bağlı pS129-αsyn pozitif dahil edilmeleri etkileyebilir. Nitekim, son zamanlarda primer nöronal kültürlerde PFF kaynaklı pS129-αsyn pozitif inklütifler yakından uzun kuluçka döneminden sonra LB benzeyen yapılara olgun olabilir patolojinin çok erken aşamalarında temsil gösterilmiştir12,13.
Lewy patoloji syanımı erken evre hastalık belirteçlerinden biri olarak kabul edilir gibi, PfFs ile yanlış katlanmış α-sinüklein modelleme ve birikimi ilaç gelişimi için değerlidir. Bu nedenle, toplama önleyici tedaviler durdurmak veya çok erken aşamalarında PH ilerlemesini yavaşlatmak için umut verici olabilir. Α-sinüklein birikimini yavaşlatmayı veya durdurmayı amaçlayan çeşitli klinik çalışmalar devam etmektedir14. Daha sonraki evre hastalar için, dopamin nöronal atalarının nakli daha iyi bir tedavi alternatifi olabilir15. Ancak, Lewy patoloji söküsü hasta beyinlerinin post-mortem analizi sırasında nakledilen embriyonik nöronlar belgelenmiştir16,17, Ayrıca α-synüklein birikimine karşı koruma ihtiyacını gösteren.
In vitro, α-sinüklein PFFs ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarında toplama neden olduğu bilinmektedir, ya da daha yaygın olarak, kemirgen birincil hipokampal veya kortikal nöronlarda. Bunların hiçbiri dopamin nöronlar10recapitulating yakındır. Bu nöronların Culturing in vitro18nöronların belirli sayıda yoğun kaplama gerektirir. Sınırlı malzeme (örneğin, birincil dopamin nöronlar) ile yüksek kaplama yoğunluğu elde etmek için, mikro ada kültürlenme yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Mikro ada kültür, hücreler başlangıçta orta küçük bir damla (genellikle birkaç mikrolitre) büyük bir kuyunun ortasında yüzey gerilimi tarafından bir arada tutulur18. Nöronlar takmak sonra, hücreler küçük kaplama alanında yüksek yoğunlukta sınırlı kalırken tüm kuyu orta ile doldurulur. Yüksek kaplama yoğunluğu elde ek olarak, mikro adalar da hücre yoğunluğu ve sağkalım varyasyonları sık olduğu kuyuların kenarlarına yakın kaplama önlemek. Mikro adalar genellikle nispeten büyük kuyular veya yemekler kullanılmaktadır; ancak, mikro adalarda orta beyin nöronal kültürlerin kurulması 96 iyi plaka biçiminde orta-yüksek-iş gücü ile iyi niyetli dopamin nöronlarda Lewy patoloji çalışma sağlar. Bu nöronlar ile in vitro deneyler bize glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör keşfetmek için izin (GDNF), hangi in vitro ve in vivo olgun dopamin nöronların sağkalımını teşvik19,20,21,22 ve aynı zamanda dopamin nöronlarda α-sinüklein agregalarının oluşumunu önler23. İnsan hasta kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı dopamin nöronlar, insan kökeni ve in vitro daha uzun sağkalım süresi nedeniyle daha doğru bir model oluşturmaktadır. Ancak, insan nöronlarında α-sinüklein patolojisinin indüksiyonu birden fazla ay sonra, fare embriyonik nöronlarda bir hafta ile karşılaştırıldığında, ve/veya birden fazla stresle karşılaştırıldığında (örn. α-sinüklein aşırı ekspresyonu ve PfF'lerin kombinasyonu)24,25. Buna ek olarak, insan dopamin nöronların bakımı birincil embriyonik nöronlar ile karşılaştırıldığında daha pahalı ve zahmetli, aslında yüksek iş gücü uygulamalarında kullanımını sınırlayan.
Ayrıca, birincil dopamin nöronal kültürler genetik olarak değiştirilebilir (örneğin, CRISPR/Cas9 ile) ve / veya farmakolojik ajanlar ile tedaviedilebilir 23. Moleküler yol diseksiyonu ve ilaç kütüphanesi taraması gibi uygulamalar için hızlı ve tekrarlanabilir bir platform oluştururlar. Bu kültürlerden sınırlı malzeme elde edilse de, küçük boyutlu genomik/proteomik analizler yapmak mümkündür. Primer nöronların 96 iyi formatında culturing immünositokimya ve floresan mikroskopi teknikleri için daha iyidir, yüksek içerikli fenotip analizi takip. 96 kuyu plakasının otomatik görüntülemesinden elde edilen multispektral floresan görüntüleri nicel sonuçlara dönüştürülebilir (örn. kuyu başına LB içeren nöronların sayısı). Bu tür analizler CellProfiler26,27gibi özgür yazılımile yapılabilir. Genel olarak, 96 kuyu plakalı birincil embriyonik orta beyin kültürleri yüksek verimli fenotip tarama fırsatı ile dopamin nöronlar ve α-sinüklein toplama çalışma için sağlam ve verimli bir platform sağlar.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Finlandiya Ulusal Hayvan Deneyleri Kurulu tarafından onaylandı ve bilimsel amaçlariçin kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa mevzuatına göre gerçekleştirildi.
1. Hazırlık
- DMEM/F12 ile tamamlanan %0.46 D-glukoz, %1 L-glutamin, %1 N2, %0.2 primocin ile dopamin nöron ortası (DPM) hazırlayın. Malzemeleri karıştırdıktan sonra DPM'yi süzün. DPM'yi 4 °C'de saklayın ve her aliquot'u sadece bir kez ısıtın.
NOT: Dopamin nöronlarında α-sinüklein birikimini azaltacağı için DPM GDNF içermemelidir23. - Son derece hidrofobik silikonlu cam pipetler hazırlayın, bu nedenle yüzeye eki ve embriyonik nöronların ilk işleme sırasında hücre kaybı en aza indirerek.
- 1 L distile suya 10 mL silikonlaştırıcı sıvı ekleyin ve 2 L'lik bir kapta karıştırarak karıştırın. Cam pipetleri silikon çözeltiye batırılmış 15 dk bekletin.
- Pipetleri 3-5x distile suyla durulayın. Pipetleri oda sıcaklığında (RT) veya 1-2 saat boyunca 100-120 °C ısıtılmış steril alanda kurutarak kurutmayı hızlandırın.
- Pipetleri mühürlü bir otoklav torbasında standart otoklavlama ile sterilize edin.
- Poli-L-ornitin (PO) şeffaf dipleri ile kaplı 96 kuyu plakaları, kenarların yan etkilerinden kaçınmak için plakanın kenarlarında en az bir sıra/sütun kuyu bırakarak, 96 kuyu plakasının orta kuyularına 60°L PO çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Kaplamalı plakayı gece boyunca 4 °C'de veya RT'de 4 saat tutun.
- Hücreleri kaplamadan önce, PO'yu tamamen aspire edin ve hücreleri 1x PBS'nin 100 μL'si ile üç kez yıkayın. Kuyulardan 1x PBS aspire edin ve tam kurutma için plakanın kapağını açık tutun.
NOT: Kullanılmış PO'ları toplamak ve yeniden kullanmak için filtrelemek mümkündür. Bu, aynı PO çözümü için iki kez tekrarlanabilir. - Daha önce kaplanmış kuyulara 50 μL DPM ekleyin. 100 μL plastik ucu ile kuyulardan DPM aspire ve aynı anda her kuyunun çevresinde kaplama kaldırmak için dairesel hareketlerle kuyunun alt çizik. Po kaplı bir ada kuyunun ortasında kalacak.
- Bir laminar başlık altında, mikro adalar oluşturmak için her kaplamalı adanın ortasına DPM 10 μL ekleyin.
NOT: DPM kaplı mikro adalar ile bir plaka hücrelerin izolasyonsırasında 1-2 saat laminar akış kaputu altında tutulabilir.
2. E13.5 fare embriyolarından ventral orta beyin tabanının izolasyonu
NOT: Orta beyin zemin diseksiyonu adımları için Şekil 1'e bakın.
- Diseksiyondan önce, 10 cm'lik Petri kabını Dulbecco'nun tamponuyla doldurun ve buzda tutun.
- Kurumun yönergelerine göre bir E13.5 hamile kadın fare ötenazi. Fareyi sırtüstü yaslaştırın ve ön gövdeye %70 etanol püskürtün. Forseps ile rahim üzerinde deri kaldırın ve rahim ortaya çıkarmak için cerrahi makas ile bir kesi yapmak.
- Dikkatle rahim çıkarın ve buz üzerinde önceden hazırlanmış Petri çanak içine yerleştirin.
- RT laminar başlık altında cerrahi makas kullanarak, dikkatle rahim embriyoları kaldırın. Embriyolardan gelen tüm plasental kalıntılarını büşerlerle çıkarın ve Onları Dulbecco'nun tamponuyla dolu 10 cm'lik yeni bir Petri kabına yerleştirin.
- Diseksiyon forceps veya iğneler kullanarak, Şekil 1Asiyah oklar ile işaretlenmiş yerlerden başın arka dörtte kesti. Kesilen parçayı embriyonun geri kalanından uzağa götürün (Şekil 1B).
- Kesilen parçanın arkasını gözlemciye(Şekil 1C)yerleştirin ve kaudalden kranial'e yavaşça kesin (Şekil 1D). Kranial açıklığın 0,5 mm altından Şekil 1E'degösterilen 2 mm2-3 mm2'lik bir bölge kesin.
- Boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüp içinde ventral orta beyin zemin (Şekil 1Fbakınız) toplayın. Mikrosantrifüj tüpünü tüm orta beyin katları toplanana kadar buzüzerinde tutun.
NOT: Alternatif olarak, orta beyin zeminleri tüm embriyo beyinlerinin diseksiyonu sonra 1 mL mikropipet ile toplanabilir.
Şekil 1: E13.5 fare embriyosu orta beyin tabanının diseksiyonu. (A) Başın arka mahallesindeki kesme yerleri siyah oklar ve beyaz kesik çizgilerle işaretlenir. (B) Parça embriyonun geri kalanından çıkarıldı. Kaldırılan parça daire içine alınır. (C) Parça 90° döndürüldü ve arkadaki gözlemciye doğru çevrildi. (D) Parça siyah oklardan, kaudaldan kranial (beyaz kesikli çizgi ile işaretlenmiş) açıldı. (E) Açıklığın 0,5 mm-1 mm altından 2 mm2-4 mm2 bölge kesildi (siyah çizgilerle işaretlendi). (F) Ventral orta beyin zemin izole edildi (siyah kesikli kare ile işaretlenmiş). Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. 96 iyi plaka formatında E13.5 fare embriyolarından birincil embriyonik orta beyin kültürleri oluşturulması
- Aynı 1,5 mL tüpteki tüm embriyolardan orta beyin katlarının toplanmasından sonra, dulbecco'nun tamponunu çıkarın ve doku parçalarını 500 μL Ca2+ile üç er kez yıkayın, Mg2+-ücretsiz Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS).
- HBSS'yi çıkarın ve tüpe %0,5 tripsin 500 μL ekleyin. 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
- Kuluçka sırasında, 37 °C'de 1,5 mL ılık fetal sığır serumu (FBS), FBS'ye 30 μL DNase I ekleyin ve karıştırın. Ayrıca, silikonlu cam pipetin ucunu ateşle parlata. Deliğin keskin kenarları olmadığından ve 1 mL mikropipet ucuyla aynı boyutta olduğundan emin olun.
NOT: Alternatif olarak, triturasyon için düşük yapışma 1 mL mikropipet ucu kullanılabilir. Ancak, silikoncam pipetler en iyi sonuçları vermek gibi görünüyor. - Adım 3.2'deki kuluçka süresi biter bitmez, kısmen sindirilmiş dokuya FBS/DNase karışımının 500 μL'sini ekleyin. FBS/trypsin karışımındaki dokuyu triturate etmek için cam pipet kullanın. Dokular küçük, zar zor görünen parçacıklar halinde ayrışana kadar üçleme. Triturasyon sırasında kabarcıklar kaçının.
- Kalan parçacıklar yerçekimi ile mikrocentrifuge tüp altında çökelti sağlar. Alttaki çökelti borulama olmadan, boş bir 15 mL konik polipropilen tüp içine supernatant toplamak.
- FBS/DNase I adım 3.3 'ten seyreltin (98:2) 1.000 μL HBSS ile FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) elde edin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın. Mikrosantrifüj tüpündeki artık parçacıklara yeni karışımın 1.000 μL'sini ekleyin. Tekrar triturate ve adım 3.5 tekrarlayın.
- Tüm FBS/DNase-I/HBSS'yi (49:1:50) kullanmak için önceki adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Bir kez tüm supernatant 15 mL tüp içinde toplanır (adımlar 3.5, 3.7, ve 3.8), supernatant aşağı spin için bir masa üstü santrifüj kullanın (~ 3 mL) at 100 x g, için 5 dk. Altpeleted hücreleri dokunmadan supernatant çıkarın.
- Hücre peletini tüpe 2 mL DPM ekleyerek yıkayın ve g 5 dk.
NOT: Kültürlü nöronlar için her zaman taze, ısıtılmış DPM kullanın. Yıkama adımları için DPM'nin taze olması gerekmez, ancak 37 °C'ye önceden ısıtılmalıdır. - Hücreleri taze, sıcak DPM ile seyreltin ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Seyreltme için DPM miktarı doku diseksiyonu için kullanılan embriyo ların sayısına bağlıdır. Örneğin, on embriyodan elde edilen hücreleri seyreltmek için 150 μL DPM kullanın.
- DPM'deki 10 μL'lik hücreyi mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 10 μL %0,4 Trypan mavisi lekesi ile karıştırın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı (yani Trypan mavi negatif) hücreleri sayın.
NOT: Kuyu başına ~ 1.000 dopamin nöronlar elde etmek için iyi başına kaplama için 30.000 hücreleri kullanın. Hücre yoğunluğu 6 μL başına ~30.000 hücreden yüksekse, tohumlama hacmi 6 μL'den az olmayacak şekilde kaplamadan önce hücreleri DPM ile daha da seyreltin. - Kuyuların dibine dokunmadan, DPM'yi 1.6 adımda oluşturulan mikro adalardan çıkarın.
- Her kuyuda tekrarlanabilir hücre yoğunluğu elde etmek için, kuyuyu kaplamadan önce hücreleri nazik pipetleme ile karıştırın. 1-10 μL mikropipet ile, her eski mikro adanın yerine, kuyunun ortasına 6 μL hücre ekleyin.
- Nöronal kültürleri içeren kuyulardan buharlaşmayı en aza indirmek için plakanın kenarlarındaki boş kuyuları 150 μL su veya 1x PBS ile doldurun. Plakayı 37 °C'de bir kuluçka makinesinde, %5 CO2'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- 1 saat sonra, kuvözden plakayı çıkarın, hücrelerle birlikte her kuyuya 100 μL DPM ekleyin ve kuvöze geri yerleştirin.
- Kaplamadan iki gün sonra (gün in vitro 2 veya DIV2), 25 μL çıkarın ve son ortam hacmini 150 μL'ye çıkarmak ve buharlaşmayı mümkün olduğunca önlemek için 75 μL taze DPM ekleyin.
- Ortamın yarısını div5'te taze DPM ile değiştirin (örn. 75 μL çıkarın ve 75°L taze DPM ekleyin). DIV5'ten sonra herhangi bir ortam değişikliği gerçekleştirmeyin.
4. Primer embriyonik dopamin nöronlarında α-sinüklein agregalarının önceden bilgili fibriller ile tohumlama ile indüksiyonu
PfFs elde etme ve doğrulama protokolleri titizlikle açıklanan ve birkaç son yayınlarda tartışıldı11,28,29,30. PFFs ile herhangi bir çalışma sonrasında, laminar başlık veya% 1 SDS ile PFFs temas olabilir herhangi bir ekipman temiz, sonra% 70 etanol31ile .
- Deneyden önce, PFF'leri 1x PBS ile 100 μg/mL'lik son konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş PFF'leri mikrosantrifüj tüplerde, su banyosu 4 °C'de 10 döngü, 30 s ON/30 s OFF için soğutma ile yüksek güçte bir banyo sonicator ile sonicate.
NOT: Fibrillerin ~ 50 nm uzunluğunda parçalar oluşturmak için düzgün sonicated olması önemlidir. Sonicated PFFs boyutu doğrudan iletim elektron mikroskop görüntüleri Ile ölçülebilir PfFs olarak Patterson ve ark.30tarafından açıklandığı gibi boyanmış . Sonication yüksek güçlü banyo sonicator yukarıda açıklandığı gibi elde edilebilir. Alternatif olarak, bir ucu sonicatorkullanılabilir 30. Sonicated PFFs birden fazla donma / erime döngüleri önlemek için küçük aliquots -80 °C'de saklanabilir. - DIV8'de, kuyudaki 150 μL'lik ortama kuyu başına 100 g/mL'lik 3,75 μL PFF'yi ekleyerek 2,5 g/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. Kontrol grubu için aynı miktarda 1x PBS kullanın.
- 1x PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve aliquotları -20 °C'de saklayın. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
NOT: PFA toksiktir; hazırlık sırasında maske ve eldiven takın, her zaman laminar başlık altında çalışın ve tüm katı ve sıvı PFA atıklarını kurumun talimatlarına göre atın.- 1 L'lik bir kapta 1x PBS'nin 500 mL'si sıcak. Damar bir karıştırma çubuğu koyun ve bir ısıtma fonksiyonu ile bir manyetik karıştırıcı üzerine gemi koymak. Çözeltiyi sıcak tutarken kaynamayı önlemek için sıcaklığı 40-60 °C arasında ayarlayın.
- Tek kullanımlık plastik ölçüm kabında kaputun altında 20 g PFA tozu ölçün. Dikkatle, 1x PBS ile dolu kap içine PFA tozu ekleyin. Çözeltiyi karıştırmaya başlayın.
- Çözeltiye 200°L 5 M sodyum hidroksit ekleyin ve PFA tamamen eriyene kadar ~15 dakika karıştırmaya devam edin.
- Çözelti homojen göründükten sonra, pH'ı ~7'ye dengelemek için 168 μL 5 M hidrojen klorür ekleyin. tek kullanımlık renk sabitp gösterge şeritleri ile pH kontrol edin.
- Kabı ısıtıcıdan çıkarın ve RT'ye kadar soğumasını bekleyin. Kullanmadan önce RT'deki aliquotları eritin ve daha sonra yeniden donma.
- DIV15'te, boru lama ile tüm ortamları kuyulardan çıkarın. Hücreleri onarmak için her kuyuya %4 PFA'nın 50 000'ini ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra PFA'yı kuyulardan çıkarın ve hücreleri yıkamak için her kuyuya 100 μL 1x PBS ekleyin. 1x PBS çıkarın ve 2x daha fazla yıkayın.
- Kurumasını önlemek için her kuyuda 100 μL 1x PBS bırakın. İmmünokimya yapılana kadar plakayı 4 °C'de saklayın.
5. 96 iyi plakalı primer embriyonik dopamin nöronların immünofloresan boyama ve otomatik görüntüleme
- 1x PBS'yi çıkarın ve iyi başına %0,2 Triton X-100 (PBST) ekleyerek ve RT'de 15 dakika kuluçkaya yatarak hücreleri permeabilize edin.
- PBST'yi çıkarın ve PBST'ye her %5'lik normal at serumu (NHS) ekleyin. Spesifik olmayan antijen aktivitesini engellemek için RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- PBST'de primer antikorları %5'te TH ve pS129-αsyn (1:2,000) karşı seyreltin. Her kuyuya 50 μL seyreltilmiş antikor ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Antikorları çıkarın ve hücreleri yıkamak için her kuyuya 100 μL 1x PBS ekleyin. 1x PBS çıkarın ve 2x yıkama tekrarlayın.
- Floresan moleküllerin beyazlatma önlemek için, minimum ışık koşullarında çalışmaya başlayın. PBST'de ikincil floresan etiketli antikorları (1:400) seyreltin. Her kuyuya 50 μL seyreltilmiş antikor ekleyin ve 1 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
- Antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri yıkamak için her kuyuya 100 μL 1x PBS ekleyin. 1x PBS çıkarın ve 2x yıkama tekrarlayın.
- 1x PBS çıkarın, 200 ng /mL 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) iyi başına 50 μL ekleyin kültürlü hücrelerin çekirdekleri leke ve 10 dakika boyunca RT inkübat.
- Hücreleri her biri 5 dakika boyunca 1x PBS 100 μL ile 3x yıkayın. Son yıkamadan sonra her kuyuda 100 μL 1x PBS saklayın. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.
- Görüntü birincil embriyonik dopamin nöronlar 96 iyi bir görünüm plaka ile yüksek içerikli plaka tarayıcı (Malzemeler Tablosubakınız) 10x hedefi ile donatılmış.
- Plaka türü, üretici, boyut, kuyular arasındaki mesafe nin yanı sıra orta nın türü ve miktarı gibi 96 kuyu plakasının özelliklerine göre ayarları ayarlayın.
- Mikro bir adadaki tüm hücreleri kapsayacak şekilde kuyunun görüntüleme alanını seçin. Otofokus'u ayarlamak için iyi bir örnek seçin. İlk odak noktasını DAPI'ye dayandırın.
- Kontrol kuyularında boyama yoğunluğuna bağlı olarak, her floresan kanal için satın alma süresini kalibre edin. Parametreleri, PFF-tedavi edilen kontrol kuyularında pS129-αsyn agregalarını hücre somasında barındıran dopamin hücrelerini açıkça ayırt ederek pS129-αsyn pozitif ve pS129-αsyn negatif hücrelerin kesin olarak sayısallaştırılmasını sağlayacak şekilde ayarlayın.
NOT: PFF içermeyen kuyularda pS129-αsyn için herhangi bir boyama olmamalıdır; bu nedenle, bu kuyular pS129-αsyn yoğunluğunu ayarlamak için negatif kontrol olarak kullanılabilir. - İmmünfloresan boyama ile tüm kanallar için aynı anda 10x hedefi ile seçilen tüm kuyuları tam olarak aynı parametrelerle görüntüleyin.
- İsteğe bağlı olarak, pS129-αsyn-pozitif inklüzasyon sayısındaki değişikliklerin, pS129-αsynsyn'in fosforilasyoninin inhibisyonu veya defosforilasyondan ziyade protein birikimindeki azalmayı yansıttığını doğrulamak için, kuyuların bir alt kümesinde α-sinüklein dahil edilmesini etiketlayın.
- PS129-αsyn antikoryerine α-sinüklein filament antikor (1:2,000) ile tekrar adım 5.3. Lekeli α-sinüklein adım 5.13'te olduğu gibi görüntüleyin.
6. Yüksek içerikli görüntü analizi
NOT: Bu adım açık erişim yazılımı CellProfiler sürüm 3.15 ve CellProfiler Analyst sürüm 2.2.1 ile gerçekleştirilir. 27,32. Ancak, bazı deneyimlerle, benzer görüntü analizi ardışık hatları farklı bir sürüm veya benzer bir yazılım olarak ayarlanabilir. Ayrıntılı bir açıklama için lütfen yazılım sayfasına bakın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- CellProfiler ve CellProfiler Analyst yazılımLarını indirin ve yükleyin.
- CellProfiler'ı açın. Dosya yı seçin| İthalat| Dosyadan pipeline ve sağlanan örnek ardışık TH_LB_V1.cpipe dosyası (Ek Dosyalarbakınız) yükleyin.
NOT: Örnek ardışık hatlar, edinilen görüntülerin özelliklerine ve görüntü edinme platformuna bağlı olarak belirli ayarlamalar gerektirir. Example_Imagesyazılımın ilk deneme sürümü için kullanılabilir. - Görüntüleri Görüntüler modülünesürükleyerek analiz edilecek yükler. Yüklenen klasörden yalnızca resim dosyalarını seçmek için filtre seçeneklerini kullanın.
- Görüntü dosyası adından iyi, görüş alanı ve kanal bilgilerini ayıklamak için Meta veri modülünü kullanın. Büyüteç simgesine tıklayın ve dosya adlarından Plaka, Görüntüleme Sitesi ve Kanal bilgilerini ayıklamak için düzenli ifade girin.
NOT: Düzenli ifade plaka mikroskobun dosya adlandırma kuralına bağlıdır. Büyüteç yanındaki soru işaretini tıklatmak sözdiziminin ayrıntılarını sağlar. - NamesAndTypes modülü altında, DAPI, TH ve pS129-αsyn boyama(varsayılan kanallar 1, 2ve 3)için doğru kanal numaralarını seçin. Gruplar modülünde "Hayır "seçeneğini belirleyin.
- Görüntü dosyası adından iyi, görüş alanı ve kanal bilgilerini ayıklamak için Meta veri modülünü kullanın. Büyüteç simgesine tıklayın ve dosya adlarından Plaka, Görüntüleme Sitesi ve Kanal bilgilerini ayıklamak için düzenli ifade girin.
- Hücre soma TH boyama kullanarak dopamin nöronlar segmente identifyPrimaryObjects modülleri kullanın.
NOT: Belirli değerler, plakaların nasıl boyandığını ve görüntülenene bağlı olarak ilk optimizasyonu gerektirir. Sonraki plakalar benzer şekilde işlenirse, hiçbir veya en az ek ayarlamalar gerekli olacaktır. - TH ve DAPI kanallarından floresan yoğunluk bilgileri elde etmek için MeasureObjectIntensity modüllerini kullanın.
- Segment dopamin nöronların boyut ve şekil özelliklerini ölçmek için MeasureObjectSizeShape modüllerini kullanın.
- Segmente dopamin nöronlarından TH kanalındaki doku özelliği bilgilerini ölçmek için MeasureTexture modüllerini kullanın.
- Ölçümleri veritabanına kaydetmek için ExportToDatabase modüllerini kullanın.
- Deneme adlandırma şemasına göre veritabanı dosyasını adlandır (örn. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Veritabanı dosyası için Çıktı Klasörü'nü seçin. Veritabanı dosyası birkaç gigabayt büyük olabilir ve tercihen görüntü dosyalarının üst klasörüne kaydedilmelidir.
- CellProfiler Analisti'ni açın ve adım 6.8'de oluşturulan V1_THCells.properties dosyasını seçin. Açık Araçlar| Sınıflandırıcı.
- Parçalı hücreleri iki kategoriye ayırın: pozitif (yani, doğru şekilde parçalanmış dopamin nöron hücre cisimleri) ve negatif (yani, segmentasyon ve boyama yapıları) Bkz. Şekil 2A ve 2B.
- Getirilen hücre sayısını 50 rasgele hücreye ayarlayın ve Getir'i tıklatın (bu, adım 6.4'te bölümlenen hücrelerin görüntülerini yükler). Her kutudaki en az 30 hücreyi pencerenin altındaki ilgili depo kutusuna sürükleyerek sıralayın. Gerektiğinde daha fazla hücre getirin.
- Açılan menüde 50 max kuralıyla Hızlı Nazik Güçlendirme'yi kullanın'ı seçin ve Train'etıklayın.
- 50 50 pozitif hücreye "Getir" i ayarlayın ve sınıflandırıcıya göre TH pozitif hücreleri almak için Getir tuşuna basın (Şekil 2A). Eğitimli sınıflandırıcının kalitesini değerlendirmek için elde edilen sonucu kullanın.
- 6.10.1-6.10.3 adımlarını yineleyin, sonuçlar tatmin edici olana kadar sınıflandırıcıyı eğitmek için yeni örnek hücreler ekler.
- Gelişmiş| Kuralları edin... ve yeni bir pencerede tüm metni seçin(Ctrl+a) ve not defterine (Ctrl-c) kopyalayın (Ctrl-v). TH_rules.txt dosyasıolarak kaydedin.
NOT: Nöronal kültürün yoğunluğuna ve boyama ve görüntüleme kalitesine bağlı olarak, bu adım gerekli olmayabilir, çünkü 6.4'te parametreleri yüksek doğrulukta sadece TH pozitif hücreleri segmente etmek mümkün olabilir. Bu durumda, tüm bir TH_LB_V1.cpipe çalışması gerekli değildir ve IdentifyPrimaryObjects modüllerinin doğru parametreleri TH_LB_V2.cpipe'dakiilgili modüle doğrudan konulmalıdır.
Şekil 2: Dapi, TH ve pS129-αsyn immünoresansa dayalı CellProfiler Analyst yazılımı ile dopamin nöronlarının ve pS129-αsyn pozitif dopamin nöronların sayısallaştırılması. (A) Pozitif hazneden th hücreleri, görüntüde seçilen ilk hücrede küçük bir kare ile işaretlenmiş DAPI boyama (mavi) ve soma'da çevreleyen TH boyama (gri) esas alınarak seçilmiştir. (B) Hücre dışı eserler negatif hazneye yerleştirilmiştir. (C) pS129-αsyn pozitif TH nöronların, görüntüde seçilen ilk hücrede küçük bir kare ile işaretlenmiş pS129-αsyn boyama (kırmızı) geniş dahil edilmesine göre seçilmiştir, çekirdekleri çevreleyen veya soma hücresinde. (D) Bu tür pS129-αsyn dahil imi olmayan TH hücreleri negatif hazneye yerleştirildi. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- CellProfiler'ı açın ve Dosya'yı seçin| İthalat| Dosyadan boru hattı ve yük TH_LB_V2.cpipe dosyası. Adımları 6.3-6.7'yi yineleyin. Boru hattının bu kısmı TH_LB_V1.cpipe ile aynı olmalıdır.
- Daha fazla analiz için yalnızca gerçek TH pozitif hücreleri geçirmek için FilterObjects modüllerini kullanın.
- Seç filtreleme modunu Kurallar'aayarlayın. Kurallar veya sınıflayıcı dosya adı adım 6.10.5 oluşturulan TH_rules.txt dosyasını seçin.
- TH pozitif hücreleri sol alt pencereye sıralanmışsa Sınıf numarası alanını 1 olarak ayarlayın.
- pS129-αsyn kanalından floresan yoğunluk bilgilerini elde etmek için MeasureObjectIntensity modüllerini kullanın.
- Filtre uygulanmış hücrelerden TH kanalındaki doku özelliği bilgilerini ölçmek için MeasureTexture modüllerini kullanın.
- Filtre uygulanmış hücrelerin boyut ve şekil özelliklerini ölçmek için MeasureObjectSizeShape modüllerini kullanın.
- Ölçümleri veritabanına kaydetmek için ExportToDatabase modüllerini kullanın.
- Veritabanı dosyanızı deneme adlandırma şemanızla göre adlandırın (örn. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Veritabanı dosyası için çıktı klasörünü seçin.
- CellProfiler Analisti'ni açın ve V2_THpos.properties dosyalarını seçin.
- Parçalı hücreleri iki kategoriye ayırın – pS129-αsyn pozitif ve pS129-αsyn negatif hücreler (Şekil 2C,D).
- Getirilen hücre sayısını 50 rasgele hücreye ayarlayın ve Getir'i tıklatın (bu, adım 4'te bölümlenmiş hücrelerin görüntülerini yükler). Her kutudaki en az 30 hücreyi pencerenin altındaki ilgili depo kutusuna sürükleyerek sıralayın.
- Açılan menüde, 50 max kuralı veya Random Forest sınıflandırıcısıyla Hızlı Nazik Artırma yı kullan'ı seçin. Tren'etıklayın.
- 50 50 pozitif hücreye "Getir" i ayarlayın ve pS129-αsyn pozitif hücreleri sınıflandırıcıya göre almak için Getir tuşuna basın (Şekil 2C). 50 50 negatif hücreye "Getir" i ayarlayın ve pS129-αsyn negatif hücreleri sınıflandırıcıya göre almak için Getir tuşuna basın (Şekil 2D). Eğitimli sınıflandırıcının kalitesini değerlendirin.
- 6.17.2-6.17.4 adımlarını yineleyin ve sonuçlar tatmin edici olana kadar sınıflayıcıyı eğitmek için yeni örnek hücreler ekler.
- Her kuyudaki pS129-αsyn pozitif ve negatif dopamin nöronlarının sayısını özetleyen sonuç tablosunu almak için Tüm puana tıklayın.
Representative Results
Kaplamadan birkaç gün sonra (DIV1–DIV3), kültürlü hücrelerin sağlığını ve homojen dağılımını ve bu koşulların tekdüzeliğini tektek olarak değerlendirmek için parlak alan mikroskobu yapıldı (Şekil 3). Kültürlü orta beyin hücreleri kaplamadan önce oluşturulan mikro ada içinde homojen bir şekilde yayıldı (Şekil 3A,B). Primer nöronlar homojen bir şekilde kaplanmış zemine yerleşmiş ve nöronal projeksiyonlar oluşturmuştur(Şekil 3B). Kuyuda küçük bir hücre yığını (çapı 150 μm'den küçük) gözlendi ve örnek olarak gösterilmiştir (Şekil 3C).
Şekil 3: Kaplamadan birkaç gün sonra (örneğin, DIV3), primer orta beyin kültürlerinin durumu parlak alan mikroskobu ile gözlendi. (A) Yaklaşık 1 mm kuyu çevresinden PO çizilme (siyah oklarla gösterilmiştir) tarafından oluşturulan yaklaşık 4,4 mm (beyaz oklarla gösterilen) yaklaşık yarıçapı ile PO kaplı mikro ada içinde kuyunun ortasına yayılmış kültürlü hücreler. (B) Kültürlenmiş primer nöronlar homojen bir şekilde bölge içinde yayılmış ve nöronal projeksiyonlar (kırmızı ok başları ile işaretlenmiş) gözlenmiştir. (C) Çapı 150 μm'den küçük olan bir hücre yığını mavi ok uçları ile işaretlenir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Birincil fare orta beyin kültürleri anti-TH ve anti-pS129-αsyn antikorları ile immünostained edildi ve 15 gün in vitro sonra otomatik bir mikroskop ile görüntülendi. Kaplanmış mikro adalar kuyuların ortasındaki hücrelerin bağlanması için sınırlı alan sağlar (Şekil 4A,B). TH belirteci ile immünojen olarak etiketlenmiş dopamin nöronlar mikro adanın etrafına monolayer olarak yayıldı, birbirinden ayrıldı, herhangi bir kümelenme olmadan (Şekil 4A' ve 4B').
Şekil 4: DIV15'te, PFF tedavisi olan veya olmayan her mikro adadan 800-1000 dopamin hücresi ölçüldü. Anti-TH ve anti-pS129-αsyn antikorları ile immonustained embriyonik orta beyin kültürlerinin temsili görüntüler. (A, A', A'') PFF tedavisi olmadan kontrol hücreleri. (B, B', B'') PFF ile tedavi edilen pS129-αsyn dahil edilen hücreler. (C) Araç (kontrol), PfFs veya 50 ng/mL GDNF ile pffs ile tedavi kuyularda TH-pozitif hücre numaralarının sayısallaştırılması. (D) Araç (kontrol), PfF'ler veya 50 ng/mL GDNF ile tedavi edilen TH-pozitif hücrelerdeki pS129-αsyn agregalarının ölçülmesi. Rasgele blok tasarımı ANOVA ile istatistiksel anlamlılık hesaplanmıştır. **p < 0.01, n = 4 ayrı plaka (biyolojik çoğaltma), her biri tedavi grubu başına 3-6 kuyu (teknik tekrarlar). Ölçek çubukları = Aiçin 300 μm , B; A için50 μm, B'; A''için 25 m, B''. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
PFF tedavisi olmayan kültürlerde pS129- αsyn sinyali(Şekil 4Ave 4A')yokken, α-sinüklein PFF'leri ile tedavi edilen kültürlerde pS129-αsyn pozitif inklütifler(Şekil 4B' ve 4B')gelişmiştir. 7 gün boyunca in vitro PFF tedavisi, diğer deney gruplarına göre TH-pozitif nöronların sayısında önemli bir azalmaya neden olmadı(Şekil 4C). PFF ile tedavi edilen kültürlerde pS129-αsyn pozitif TH-pozitif dopamin nöronlarının ~%40'ı vardı. Pozitif kontrol ile tedavi, GDNF, pS129-αsyn pozitif eklemeler ile TH-pozitif dopamin nöronların yüzdesi azaltılmış (Şekil 4D, Ayrıca ek Dosyalarham veri ve örnek görüntülere bakın ).
Ek Dosyalar: CellProfiler ve CellAnalyst yazılım paketleri, örnek görüntüler ve Şekil 4E, Fiçin ham veriler ile yüksek içerikli görüntü analizi için örnek boru hatları . (1-9) Example_Images. Bu görüntüleri ImageJ veya CellProfiler ile açın. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Adımlar 6.2-6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Adımlar 6.11-6.18) Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
PS129-αsyn'in önemli bir bileşeni olan Lewy patolojisinin yayılması, PH'nin histopatolojik bir özelliğidir. Ancak, pS129-αsyn agregasyonunun dopamin nöronların ölümüne nasıl katkıda bulunduğunun mekanistik bir anlayışının hala kurulması gerekir. Hastalığın farklı aşamalarında hastalardan beyin örnekleri üzerinde insan postmortem çalışmalarda kanıtlar yanı sıra nakledilen fetal nöronlar pS129-αsyn pozitif dahil gözlem kuvvetle hücreler arasında Lewy patoloji yayılmasını göstermektedir16,17,33. Sonuç olarak, pS129-αsyn prion benzeri yayılması son α-sinüklein PFFs kullanılarak recapitulated oldu9,10. Özellikle dopamin nöronlarında pS129-αsyn yayma ve birikiminin sağlam, uygun maliyetli ve nispeten yüksek veya orta ölçekli bir modelinin oluşturulması, bu süreci değiştiren yeni tedaviler ve bileşikler için yapılan araştırmayı önemli ölçüde hızlandırabilir.
Dopamin nöronların kaybı PH motor semptomların ana nedeni olduğundan ve bu hücreler birçok benzersiz özelliklere sahip2,34,35, dopamin nöronlarda pS129-αsyn prion benzeri yayılmasını modelleme çevirisel açıdan modelin en alakalı türüdür. 4 kuyu plakaları ve yarı otomatik nicelleştirme üzerinde embriyonik orta beyin nöronların mikro ada kültürleri kullanan protokoller daha önce tarif edilmiştir18. Burada açıklanan protokol 96 kuyu plakasına uyarlanmış ve mikro adaların daha az zahmetli bir şekilde hazırlanmasını sağlayarak, deneyimli bir araştırmacı nın her biri 60 kuyu içeren dört plakanın hazırlanmasına olanak sağlamaktadır. 96 iyi plakalı dopamin nöronlarının culturing düşük miktarlarda ilaç test sağlar ve lentivirus vektörleri ile yüksek transdüksiyon oranları sağlar. Daha karmaşık deneyler yapmak için farklı tedavileri birleştirmek de mümkündür.
Herhangi bir tedavi (PFF dahil) uygulamadan önce, kültür kalitesi parlak alan mikroskobu ile kontrol edilmelidir. Eğer mikroskopi sistemi ısıtma lı bir CO2 haznesini kullanmıyorsa, birincil fare dopamin nöronları hassas ve kolay stresli olduğundan hücreler kuvöz dışında birkaç dakikadan fazla tutulmamalıdır. Aynı nedenle ilk görüntülemenin 24 saat kuluçkadan sonra (DIV1-DIV3 arasında) yapılması önerilmektedir. Hücreler mevcut hücre organları ile canlı ve homojen mikro ada içinde yayıldı görünmelidir. Birincil nöronlar PO kaplı zemin üzerinde yerleşmiş olurdu ve nöronal projeksiyonlar kurmaya başladı. Triturasyon işlemi düzgün yapılmazsa veya kaplama yoğunluğu nun önerilenden daha yüksek olması durumunda oluşabilecek küçük hücre kümelerini (yani çapı 150-200 μm'den küçük) gözlemlemek mümkündür. Bu küçük kümeler, kuyu başına birkaçtan fazla ve/veya daha büyük olmadıkça deneyi etkilemez. Kümelenmiş hücreler görüntü analizi sırasında immünohistokimyasal belirteçleri ve tek tek hücreleri tanımlamak için çok zor olun. Bu dikkatli kaplama, triturating ve kaplama yoğunluğu kontrol ederek bu tür kümeleri önlemek için esastır. Bu koşulların tekdüzeliği belirli kuyularda gözlemlenemiyorsa, deneyde bu kusurlu kuyuları dahil etmeyin. Bu tür dışlama herhangi bir tedavilerin yürütülmesinden önce yapılmalıdır.
Ayrıca, 96 kuyu plakasının kullanımı boyama işlemleri sırasında kullanışlı çok kanallı pipet kullanımına ve otomatik plaka mikroskopları ile doğrudan görselleştirmeye olanak sağlar ve iş buzun daha da artmasına olanak sağlar. Yüksek içerikli görüntüleme platformlarından elde edilen verilerin analizi için otomatik görüntü niceliği kullanımı vazgeçilmezdir. Her deneyden elde edilen binlerce görüntüyü işleme yeteneğine ek olarak, tüm tedavi gruplarının tarafsız ve özdeş nicelemesini sağlar. Görüntü analizi için önerilen iş akışı, dopamin nöronların segmente edilmesi, denetimli makine öğrenimi ile doğru şekilde parçalanmış hücrelerin filtrelenmesi ve daha sonra fenotiplerin (pS129-αsyn pozitif ve pS129-αsyn negatif) ölçülmesi gibi basit ilkelere dayanmaktadır. Bu görev için birkaç farklı yaklaşımlar öngörülebilse de, yüksek kaplama yoğunluğu, dopamin nöronlarının çeşitli şekilleri ve güçlü lekeli nöritlerin varlığı nedeniyle makine öğrenimi ile segmentasyonkombinasyonunun dopamin kültürleri için en sağlam olanı olduğunu gördük. Önerilen görüntü analizi algoritması CellProfiler ve CellProfiler Analisti, açık kaynak, serbestçe kullanılabilir yüksek içerikli görüntü analizi yazılımı26,27uygulanmıştır. Algoritma, açık kaynak (örneğin, ImageJ/FIJI, KNIME) veya tescilli diğer görüntü analiz yazılımları ile de uygulanabilir. Ancak, deneyimlerimize göre bu genellikle kullanım kolaylığı için özelleştirme yetenekleri feda ve bu nedenle karmaşık analizlerde iyi performans olmayabilir. CellProfiler ve CellProfiler Analyst yazılım paketlerinin, önemli sayıda uygulanan algoritmayı birleştirerek, iş akışını tasarlamada aşırı esnekliği ve yüksek içerikli görüntüleme verilerinin aynı anda işlenmesi ve verimli bir şekilde işlenmesi yle özellikle güvenilir sonuçlar verdiğini gördük.
Açıklanan protokol aynı zamanda diğer nöronal popülasyonların belirteçleri (örneğin, DAT, GAD67, 5-HT vb.) ve protein agregaları (örn. fospo-Tau, ubiquitin) gibi farklı antikorlarla immünboyama ile karakterize diğer hücresel fenotiplerin nicelleştirilmesi için de uyarlanabilir. Birden fazla floresan belirteçler de birden fazla fenotip ayırt etmek için kombine edilebilir (örneğin, olgunlaşma farklı aşamalarında dahil hücreleri). Birden fazla fenotiplerin otomatik sınıflandırılması da sadece ölçüm adımları için ek belirteçleri immünofloresan görüntüleri içeren bir kanal ekleyerek ve birden fazla kutu içine hücreleri sıralama tarafından açıklanan görüntü analizi boru hatları nda uygulanması kolay olmalıdır. Aynı anda birden fazla belirteç kullanımı, ancak, immünboyama ve görüntüleme koşullarının optimizasyonu gerektirir. Ayrıca, immünoresans görüntülemede daha iyi kalite için, floresan mikroskop için açıkça tasarlanmış özel siyah duvarlı 96 kuyu plakalarının kullanılması tavsiye edilir. Ancak, bunlar standart hücre kültürü plakaları çok daha pahalı olabilir, hangi bizim protokolaçıklanan analiz için yeterlidir.
Kullanılan PfF'lerin türü ve kalitesi deneylerin sonucu için çok önemlidir. PfF'ler hem tahkikatın sağlamlığını hem de sonuçların yorumlanmasını etkileyebilir. Hazırlık koşulları PfFs tohumlama verimliliğini etkileyebilir ve, gerçekten, Farklı fizyolojik özelliklere sahip PFF "suşları"bildirilmiştir 36. Bununla birlikte, PfFs hazırlanması ve doğrulanması bu makalenin kapsamı dışında dır ve çeşitliyayınlarda 11,28,,29,30açıklanmıştır. Hazırlık protokolüne ek olarak, pffs α-sinüklein kökeni türleri (örneğin, fare, insan) ve yabani tip veya mutasyona uğramış protein kullanımı (örneğin, insan A53T α-sinüklein), belirli deneysel koşullara bağlı olarak düşünülmelidir. PfFs tarafından pS129-αsyn birikimiin indüksiyonunun kültürün yaşına bağlı olduğu gösterilmiştir (örn. in vitro gün), daha olgun kültürler daha belirgin indüksiyon gösteren11. Bu muhtemelen daha olgun kültürlerde nöronal bağlantıların artan sayıda kaynaklanmaktadır, ve α-sinüklein protein düzeylerinin artması. Elimizde, DIV8'de PFF'ler ile tedavi en sağlam sonuçları verdi, dopamin nöron soma pS129-αsyn belirgin birikimi ile, nöronal sağkalım ödün değil. Açıklanan protokol, endojen α-sinüklein agregasyonuna yol açan erken olayları değiştiren tedavileri incelemek için uygundur, çünkü pS129-αsyn pozitif inklüzyonları nispeten erken bir zaman noktasında, PFF'lerle aşılamadan 7 gün sonra ölçeriz. Bu noktada, intrazomal inklütifler hücrelerin önemli bir bölümünde mevcuttur ve pff kaynaklı hücre ölümü gözlenmezken immünboyama ile kolayca ayırt edilebilir, sonuçların yorumlanması basitleştirilmesi. Daha da önemlisi, PFF kaynaklı inklütiflerin morfolojisi ve bileşimi zaman içinde değişebildiği için12,,13, açıklanan protokol, prensipte, daha sonraki zaman noktalarında fiksasyon ve immünboyama ile daha olgun inklütifleri incelemek üzere değiştirilebilir. Ancak, 15 günden daha uzun süre kültürdopamin nöronlar tutmak aşırı bakım gerektirir, ve hücrelerin PFF aşısı bağımsız hayatta başarısız nedeniyle ek varyasyon neden olabilir. Ayrıca, daha genişletilmiş kültürler uyuşturucu tedavi programlarını karmaşıklaştırmıştır. Birçok bileşikler hücre kültürü orta sınırlı veya kötü karakterize istikrar var, ve orta tam değişimi dopamin kültürlerinin hayatta kalma ödün ler, çünkü bir ilacın ikmal önemsiz değildir.
Ser129'da α-sinüklein fosforilasyon sürekli α-sinüklein toplama PFF tabanlı modellerde rapor edilir ve Tioflavin S, ubiquitin veya konformasyona özgü antikorlar11,,12gibi yanlış katlama ve toplama belirteçleri ile kolokalize. Elimizde, pS129-αsyn için immünboyama da en düşük arka plan ile güçlü sinyal verir ve analiz etmek için en basit, birden fazla tedavi tarandığında sağlam sonuçlar veren. Daha da önemlisi, pS129-αsyn antikor ile immünboyama hücre dışında kalan PfFs tespit etmez, önemli ölçüde arka plan azaltarak. Ancak, Ser129 fosforilasyon muhtemelen α-sinüklein yanlış katlama ile bağlantılı ilk süreçlerden biri olduğunu hatırlamak önemlidir ve belirli koşullar altında farklı düzenlenmiş olabilir. Bu nedenle pS129-αsyn üzerinde olumlu etkiler gösteren bulgular diğer belirteçler tarafından doğrulanmalıdır.
İstatistiksel analiz, deneysel tasarıma uygun olarak uyarlanmalıdır. En az üç bağımsız biyolojik kopyada (yani ayrı birincil nöronal kültürlerde) deneyler yapmak esastır. Bu çoğaltmalar farklı plakalar üzerine kaplanmış ve bağımsız olarak tedavi edilmelidir. Farklı deneysel plakalar için veri eşleştirmesini dikkate almak için rasgele blok tasarımı ANOVA37 ile farklı plakalar üzerindeki kopyalardan elde edilen verileri analiz ediyoruz.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Prof. Kelvin Luk'a α-sinüklein PFF'leri, conjung Zheng'i nöronal hücreleri kurduğu ve ektiği için cömert hediyesi için ve Helsinki Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü'ndeki Işık Mikroskobu Birimi'ne immünolekeli hücreleri görüntülemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Business Finland (Finlandiya Yenilik Fonu Ajansı), Finlandiya Akademisi #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Vakfı ve Maj Farmakoloji Enstitüsü, PAS, Polonya yasal fonları.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
