Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для изучения нейронального накопления в первичных нейронах допамина мыши. Фосфорилированные агрегаты синаклеин в нейронах индуцируются с предварительно сформированными фибриллами с синуклеином. Автоматизированная визуализация иммунофлуоресцентов, маркированных клетками, и объективный анализ изображений делают этот надежный протокол подходящим для скрининга средней и высокой пропускной способности препаратов, которые препятствуют накоплению синуклеина.
Abstract
Целью этого протокола является создание надежной и воспроизводимой модели накопления в первичных допаминовых нейронах. В сочетании с иммуносетяционным и непредвзятым автоматизированным анализом изображений, эта модель позволяет анализировать влияние лекарств и генетических манипуляций на агрегацию в нейронных культурах. Первичные культуры среднего мозга обеспечивают надежный источник добросовестных эмбриональных нейронов допамина. В этом протоколе, отличительной чертой гистопатологии болезни Паркинсона, Lewy органов (LB), имитируется добавлением к-синуклеин предварительно сформированных фибрилл (PFFs) непосредственно нейронных средств культуры. Накопление эндогенного фосфорилированного синауклеина в соме дофаминовых нейронов обнаруживается путем иммуносхеи уже через 7 дней после добавления PFF. Условия культуры клеток in vitro также подходят для применения и оценки методов лечения, предотвращающих накопление синаклеина, таких как небольшие молекулярные препараты и нейротрофические факторы, а также лентивирусные векторы для генетических манипуляций (например, с CRISPR/Cas9). Культивирование нейронов в 96 пластин скважин увеличивает надежность и мощность экспериментальных установок. В конце эксперимента клетки фиксируются параформальдегидом для иммуноцитохимии и флуоресценции микроскопии. Многоспектральные изображения флуоресценции получены с помощью автоматизированной микроскопии 96 пластин скважины. Эти данные количественно (например, подсчет количества фосфо-синуклеин-содержащих дофаминовых нейронов на скважину) с использованием свободного программного обеспечения, которое обеспечивает платформу для беспристрастного анализа фенотипа высокого содержания. PFF-индуцированное моделирование фосфорилированного накопления в первичных нейронах допамина обеспечивает надежный инструмент для изучения основных механизмов посредничества формирования и ликвидации включения в синаклеин, с возможностью для высокопроизводительного скрининга наркотиков и клеточного анализа фенотипа.
Introduction
Болезнь Паркинсона (PD) является нейродегенеративным расстройством характеризуется смертью среднего мозга допамина нейронов в substantia nigra (SN), последующая потеря тон допамина в базальных ганглиев, и последующие нарушения двигателя1,2. Основными гистопатологическими особенностью в мозге пациентов PD являются внутриклеточные белковые/липидные агрегаты, найденные в нейрональных сомах, называемых телами Леви (LB), или в невритах, Льюи невриты (LN), коллективно известный как патология Леви3. Патология Lewy в мозге кажется, что развивает с выдвигая PD напоминая распространение патогенных факторов через соединения нейронов. Обильные патологии Льюи находится в дофаминовых нейронов в SN и клеток в других областях, пострадавших от нейродегенерации4. Однако, во время прогрессирования заболевания, распространения и начала агрегации белка не всегда коррелируют с нейронной смерти и точный вклад патологии Леви к нейрональной смерти до сих пор неясно5.
Было показано, что LB и LN состоят из мембранных и белковых компонентов3. Первыми являются мембранные фрагменты, везикулярные структуры (возможно, лизосомы и аутофагосомы) и митохондрии3. Последний состоит не менее чем из 300 различных белков6. Отличительное исследование Spillantini et al.7 показало, что основным белковым компонентом патологии Леви является з-синуклеин. Высоко выраженный в нейронах, и связаны с мембранного синтеза и нейромедиатора релиз, З-синуклеин в патологии Леви присутствует в основном в неправильно, амилоидной фибрилевой форме, основная часть которых фосфорилированных на Ser129 (pS129-syn)4,8.
Важно отметить, что было также продемонстрировано, что из-за его прионоподобные свойства, неправильно сложенный з-синуклеин может иметь причинную роль в формировании патологии Леви4. Прион-подобные свойства неправильно сложенных q-synuclein были показаны как с экстрактами среднего мозга от пациентов, так и с экзогенно подготовленными к-синуклеин преформированных фибрилл (PFFs), чтобы вызвать агрегаты в нейронах в культуре и in vivo9,10. ПФФы представляют надежную и надежную модель для изучения прогрессирования синуклейской патологии в дофаминовых нейронах. Когда ПФФы применяются к культивируемым первичным нейронам или вводят в мозг животного, они приводят к образованию синуклеин-содержащих включений в неврит и клеточной соме11, которые резюмируют многие особенности, наблюдаемые в патологии Лью. Наблюдаемые включения моющих средств нерастворимы в Triton X, вездесущие, окрашенные с амилоидной специфической красителя Thioflavin S, и содержат гиперфосфорилированный в Ser12911,12. Важно отметить, что эти включения не образуются в з-синуклеин нокаут животных11, что свидетельствует о зависимости их формирования на эндогенных з-синуклеин.
Тем не менее, трудно напрямую сравнить PFF-индуцированных включений и патологии Леви найти у пациентов PD, потому что человек LBs и LNs очень неоднородные3. Наблюдаемая неоднородность патологии Леви может быть вызвана различными стадиями формирования, разным анатомическим расположением или различиями в конформации неправильно сложенных синаклеев, инициирующего процесс агрегации. Те же факторы могут повлиять на PFF-индуцированных pS129-зин положительных включений. Действительно, недавно было продемонстрировано, что PFF-индуцированных pS129-Зин положительные включения в первичных нейронных культур представляют собой очень ранние стадии патологии, которые могут созреть до структур, очень напоминающих LB после длительного инкубационного периода12,13.
Моделирование раннего распространения и накопления неправильно сложенных с помощью ПФФ является ценным для разработки лекарств, так как распространение патологии Леви считается одним из маркеров заболевания на ранней стадии. Таким образом, агрегации-профилактического лечения может быть перспективным для остановки или замедления прогрессирования PD на очень ранних стадиях. Несколько клинических испытаний, направленных на замедление или прекращение накопления синауклеина, продолжаются14. Для пациентов более поздней стадии, трансплантация допамина нейрональных прародителей может быть лучшей альтернативой лечения15. Тем не менее, патология Лью была задокументирована в пересаженных эмбриональных нейронов во время посмертного анализа PD пациента мозга16,17, также указывает на необходимость защиты от накопления синуклеин.
В пробирке, С-synuclein PFFs, как известно, вызывают агрегацию в увековеченных клеточных линий, или чаще, в грызунов первичных гиппокампа или корковых нейронов. Ни один из них близки к перепросмотру допамина нейронов10. Культивирование этих нейронов требует плотного покрытия определенного количества нейронов in vitro18. Для достижения высокой плотности покрытия с ограниченным материалом (например, первичных нейронов допамина), микро-остров культивирования метод обычно используется. В культивирование микро-острова, клетки первоначально покрыны в небольшой капле среднего (обычно несколько микролитров) хранятся вместе поверхностным натяжком в середине большого колодца18. После того, как нейроны прикрепляются, весь колодец заполняется средой, в то время как клетки остаются ограниченными при высокой плотности в небольшой области покрытия. В дополнение к достижению высокой плотности покрытия, микро-острова также предотвратить покрытие вблизи краев скважин, где изменения в плотности клеток и выживания являются частыми. Микро-острова часто используются в относительно больших колодцах или посуде; Однако, устанавливать midbrain нейрональные культуры в микро-островах в формате плиты 96 well позволяет изучение патологии Lewy в добросовестных нейронах допамина с medium-to-high-through-мощностью. Эксперименты в пробирке с этими нейронами позволили нам обнаружить глиальные клеточные нейротрофический фактор (GDNF), который способствует выживанию зрелых дофаминовых нейронов in vitro и in vivo19,20,21,22, а также предотвращает образование агрегатов в допаминовых нейронах23., Человеческие пациент-индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные дофаминовые нейроны представляют собой более точную модель из-за их человеческого происхождения и больше времени выживания в пробирке. Тем не менее, индукция патологии з-синуклеин в человеческих нейронах наблюдается после нескольких месяцев, по сравнению с неделей в эмбриональных нейронах мыши, и / или с несколькими стрессорами (например, сочетание переэкспрессии и ПФФ)24,25. Кроме того, поддержание нейронов допамина человека является более дорогостоящим и трудоемким по сравнению с первичными эмбриональными нейронами, существенно ограничивая их использование в высокопроизводительных приложениях.
Кроме того, первичные нейронные культуры допамина могут быть генетически модифицированы (например, с CRISPR/Cas9) и/или лечиться фармакологическими агентами23. Они представляют собой быструю и воспроизводимую платформу для таких приложений, как вскрытие молекулярных путей и скрининг библиотеки наркотиков. Несмотря на то, что ограниченный материал может быть получен из этих культур, все еще можно провести небольшой размер геномики / протеомики анализ. Культирование первичных нейронов в формате 96 хорошо лучше для иммуноцитохимии и методов флуоресценции микроскопии, а затем анализ фенотипа высокого содержания. Многоспектральные изображения флуоресценции, полученные в результате автоматической визуализации 96 пластин скважин, могут быть преобразованы в количественные результаты (например, количество LB-содержащих нейронов на колодец). Такие анализы можно сделать со свободными программами, такими как CellProfiler26,27. В целом, первичные эмбриональные культуры среднего брайна, покрынные в 96 пластинах скважин, обеспечивают надежную и эффективную платформу для изучения дофаминовых нейронов и агрегации с высокопроизводительным фенотипом.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Финским национальным советом по экспериментам на животных и проводились в соответствии с европейским законодательством о защите животных, используемых в научных целях.
1. Подготовка
- Подготовка допамина нейронов среды (DPM) с 0,46% D-глюкозы, 1% L-глютамин, 1% N2, 0,2% примоцин, завершена с DMEM / F12. Фильтр DPM после смешивания ингредиентов. Храните ДПМ при 4 градусов по Цельсию и согрейте каждую аликот только один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: DPM не должен содержать GDNF, так как это уменьшит накопление синуклеина в дофаминовых нейронах23. - Подготовка силиконовых стеклянных пипеток, которые являются чрезвычайно гидрофобными, тем самым минимизируя привязанность к поверхности и потерю клеток во время первоначального обращения эмбриональных нейронов.
- Добавьте 10 мл силиконизирующей жидкости в 1 л дистиллированной воды и смешайте, помешивая в сосуде 2 л. Оставьте стеклянные пипетки погруженными в силиконовый раствор на 15 минут.
- Промыть пипетки 3-5x дистиллированной водой. Высушите пипетки на ночь при комнатной температуре (RT) или в течение 1-2 ч при температуре 100-120 градусов по Цельсию, нагретого стерильного пространства, чтобы ускорить высыхание.
- Стерилизовать пипетки стандартными автоклавами в запечатанном автоклавном пакете.
- Подготовка поли-L-орнитин (PO) покрытием 96 хорошо пластин с прозрачным дном, добавив 60 МЛ PO решение в средних колодцев 96 хорошо пластины, которые будут использоваться для посева нейронов, оставляя по крайней мере один ряд / колонка скважин по краям пластины, чтобы избежать эффекта края. Держите покрытие пластины на ночь на 4 кк или 4 ч на RT.
- Перед покрытием клеток, аспирировать PO полностью и мыть клетки трижды с 100 мл 1x PBS. Откройте 1x PBS из колодцев и держите крышку пластины открытой для полной сушки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно собрать использованный PO и отфильтровать его для повторного использования. Это может быть повторено дважды для одного и того же решения PO. - Добавьте 50 МЛ ДПМ к ранее покрытым скважинам. Отстраните ДПМ из скважин пластиковым наконечником 100 МЛ и одновременно поцарапайте дно скважины круговыми движениями, чтобы снять покрытие по периметру каждой скважины. Остров с покрытием PO останется в центре колодца.
- Под ламинарным капюшоном добавьте 10 МЛ ДПМ к середине каждого острова с покрытием, чтобы создать микро-острова.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина с микро-островами, покрытыми DPM, может храниться под капотом ламинаного потока на 1-2 ч во время изоляции клеток.
2. Изоляция полового вентрабина из эмбрионов мыши E13.5
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рисунку 1 для шагов вскрытия пола среднегонюю мозг.
- Перед вскрытием заполните 10-сантиметровую чашку Петри буфером Дульбекко и держите ее на льду.
- Euthanize E13.5 беременных женщин мыши в соответствии с руководящими принципами учреждения. Поместите мышь плашмя на спину и спрей переднего тела с 70% этанола. Поднимите кожу над утробой с щипцами и сделать разрез с хирургическими ножницами, чтобы разоблачить матки.
- Аккуратно удалите матку и поместите ее в ранее приготовленную чашку Петри на льду.
- Используя хирургические ножницы под ламинарным капюшоном в RT, тщательно удаляйте эмбрионы из матки. Удалите все плацентарные остатки из эмбрионов с щипцами и поместите их в новую 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную буфером Дульбекко.
- Используя щипцы или иглы, отрежьте заднюю часть головы от мест, отмеченных черными стрелками на рисунке 1A. Возьмите вырезанный кусок от остальной части эмбриона (Рисунок 1B).
- Поместите заднюю часть разреза к наблюдателю(Рисунок 1C) и аккуратно разрежьте его от хвостовой до черепной (Рисунок 1D). От 0,5 мм ниже черепного отверстия, вырезать 2 мм2-3 мм2 области, показано на рисунке 1E.
- Соберите пол брюшного среднего мозга (см. рисунок 1F)в пустой 1,5 мл микроцентрифуги трубки. Держите трубку микроцентрифуги на льду до тех пор, пока в ней не будут собраны все полы среднегорового крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, полы среднего мозга могут быть собраны с 1 ML микропипетт после вскрытия всех эмбрионов мозга.
Рисунок 1: Вскрытие пола среднего мозга из эмбриона мыши E13.5. (A) Резка места на задней части головы отмечены черными стрелками и белыми пунктирными линиями. (B)Кусок был удален из остальной части эмбриона. Удаленный кусок обведен. (C) Кусок был повернут на 90 " к задней к наблюдателю. (D) Кусок был открыт от черных стрел, от хвоста до черепного (отмечены белой пунктирной линии). (E) От 0,5 мм -1 мм ниже открытия, 2 мм2-4 мм2 области был сокращен (отмечен черными линиями). (F) Вентральный пол среднего живота был изолирован (отмечен черным пунктирной площади). Масштабные батончики 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
3. Создание первичных эмбриональных культур среднего мозга из эмбрионов мыши E13.5 в формате 96 хорошо пластины
- После сбора середины пониек из всех эмбрионов в той же трубке 1,5 мл, удалить остаточный буфер Dulbecco и мыть части ткани трижды с 500 л Ca2 ",Mg2"-бесплатно Хэнка balanced Соляной раствор (HBSS).
- Снимите HBSS и добавьте в трубку 500 л пробепсина на 0,5%. Инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
- Во время инкубации, тепло 1,5 мл сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS) при 37 градусов по Цельсию, добавить 30 мл DNase I в FBS, и перемешать. Кроме того, огонь-пол кончик силиконового стекла пипетки. Убедитесь, что отверстие не имеет острых краев и примерно такого же размера, как 1 mL micropipette отзыв.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, низкая адгеция 1 mL микропипетт отзыв может быть использован для тритурации. Тем не менее, силиконовые стеклянные пипетки, кажется, дают лучшие результаты. - Как только инкубация в шаге 3.2 заканчивается, добавьте 500 мл смеси FBS/DNase в частично переваренную ткань. Используйте стеклянный пипетки, чтобы тритурировать ткани в смеси FBS/трипсина. Тритурировать до тех пор, пока ткани разъединяют на крошечные, едва заметные частицы. Избегайте пузырьков во время тритурации.
- Пусть оставшиеся частицы осаждают в нижней части трубки микроцентрифуги под действием силы тяжести. Не пропуская осадка внизу, соберите супернатанта в пустую коническую полипропиленовую трубку 15 мЛ.
- Разбавить FBS/DNase I от шага 3.3 (98:2) с 1000 мл HBSS для получения FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Смешайте по пипетки вверх и вниз. Добавьте 1000 мл новой смеси в оставшиеся частицы в трубке микроцентрифуги. Снова снова и повторите шаг 3.5.
- Повторите предыдущий шаг еще раз, чтобы использовать все FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
- После того, как все супернатант собирается внутри 15 мЛ трубки (от шагов 3,5, 3,7 и 3,8), используйте столешницу центрифуг, чтобы вращаться вниз супернатант (3 мл) на 100 х г, за 5 мин. Удалите супернатант, не касаясь гранулированных клеток внизу.
- Вымойте гранулы клетки, добавив 2 мл ДПМ в трубку и спина его вниз на 100 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторить стирку 2x, чтобы свести к минимуму мусор в гранулированных клетках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежие, разогретые DPM для культивируемых нейронов. Для стирки шаги, DPM не должны быть свежими, но должны быть предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию. - Разбавить клетки свежим, теплым ДПМ и перенесите их в микроцентрифугую трубку. Количество ДПМ для разбавления зависит от количества эмбрионов, используемых для вскрытия тканей. Например, используйте 150 МЛ ДПМ для разбавления клеток, полученных из десяти эмбрионов.
- Передача 10 мл клеток в ДПМ в трубку микроцентрифуги. Смешайте их с 10 мл 0,4% трипан синий пятно. Граф жить (т.е., Трипан синий отрицательный) клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 30000 клеток для покрытия на хорошо, чтобы получить 1000 дофаминовых нейронов на колодец. Если плотность клеток выше, чем 30 000 клеток на 6 мл, еще разбавляйте клетки DPM перед покрытием, чтобы объем посева не превышал 6 мл. - Не касаясь дна скважин, удалите ДПМ с микроимегов, созданных на шаге 1.6.
- Для того, чтобы получить воспроизводимую плотность клеток в каждом колодце, смешайте клетки по нежной трубе до покрытия в колодце. С микропиеттой 1-10 МЛ добавьте 6 мл клеток к середине колодца, в расположении каждого бывшего микро-острова.
- Заполните пустые колодцы по краям плиты 150 мл воды или 1x PBS, чтобы свести к минимуму испарение из колодцев, содержащих нейронные культуры. Инкубировать пластину в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 на 1 ч.
- После 1 ч, удалить пластину из инкубатора, добавить 100 МЛ ДПМ в каждый колодец с клетками и поместите его обратно в инкубатор.
- Через два дня после покрытия (день in vitro 2, или DIV2), удалите 25 МЛ и добавьте 75 МЛ свежего ДПМ, чтобы довести окончательный объем носителя до 150 МЛ и как можно больше избежать испарения.
- Обменяйте половину среды свежим DPM (т.е. удалите 75 МЛ и добавьте 75 зл свежего DPM) на DIV5. Не выполняйте никаких изменений в носителях после DIV5.
4. Индукция агрегатов q-synuclein в первичных эмбриональных нейронах допамина путем посева с преформированной фибриллями
Протоколы для получения и проверки ПФФ были тщательно описаны и обсуждены в нескольких недавних публикациях11,28,29,30. После любой работы с PFFs, очистить ламинар капот или любое оборудование, которое, возможно, связался с PFFs с 1% SDS, то с 70% этанола31.
- Перед экспериментом разбавлять ПФФ 1x PBS до конечной концентрации 100 мкг/мл. Sonicate разбавленных PFFs в микроцентрифуга труб с ванной sonicator на высокой мощности с водяной ванной охлаждения при 4 градусов по Цельсию в течение 10 циклов, 30 с ON/30 с OFF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы фибриллы были должным образом sonicated для генерации фрагментов 50 нм в длину. Размер sonicated PFFs может быть измерен непосредственно из передачи электронного микроскопа изображения PFFs окрашенных как описано Паттерсон идр. Sonication может быть достигнуто, как описано выше в высокой мощности ванны sonicator. Кроме того, наконечник sonicator может быть использован30. Sonicated PFFs можно хранить при -80 градусов по Цельсию в небольших aliquots, чтобы избежать нескольких циклов замораживания / оттаивания. - На DIV8 добавьте 3,75 мкл 100 мкг/мл ПФФ на скважину к 150 МЛ среды в скважине до конечной концентрации 2,5 мкг/мл. Используйте то же количество 1x PBS для контрольной группы.
- Приготовьте 4% параформальдегида (ПФА) в 1x PBS и храните aliquots при -20 градусов по Цельсию. Чтобы сделать это, следуйте инструкциям ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: PFA является токсичным; носить маску и перчатки во время подготовки, работать всегда под ламинар капюшоном, и утилизировать все твердые и жидкие отходы PFA в соответствии с указаниями учреждения.- Теплый 500 мл 1x PBS в 1 Л судна. Положите бар перемешать в сосуде и положить сосуд на магнитный мешалка с функцией нагрева. Отрегулируйте температуру между 40-60 градусами по Цельсию, чтобы предотвратить кипение, сохраняя при этом раствор теплым.
- Измерьте 20 г порошка PFA под капотом в одноразовом пластиковом измерительном контейнере. Аккуратно добавьте порошок PFA в сосуд, наполненный 1x PBS. Начните перемешивать раствор.
- Добавьте 200 мл гидроксида натрия 5 М в раствор и продолжайте помешивать в течение 15 минут, пока PFA полностью не растворится.
- После того, как раствор кажется однородным, добавьте 168 мл 5 М хлорида водорода, чтобы сбалансировать рН до 7 евро. Проверьте рН с одноразовыми цветными фиксированными полосками индикатора рН.
- Снимите сосуд с нагревателя и дайте ему остыть до RT. Фильтр раствора и aliquot для хранения при -20 градусов по Цельсию. Оттепель aliquots на RT перед использованием и не заморозить потом.
- На DIV15, удалить все средства массовой информации из скважин по трубе. Добавьте 50 МЛ 4% PFA к каждому колодцу, чтобы исправить клетки и инкубировать в течение 20 минут в RT. После инкубации удалите ПФА из колодцев и добавьте 100 мл 1x PBS к каждому колодцу, чтобы вымыть клетки. Удалите 1x PBS и мыть 2x больше.
- Оставьте 100 МЛ 1x PBS в каждом колодце, чтобы избежать высыхания. Храните тарелку при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока не будет выполнена иммунохимия.
5. Иммунофлуоресцентное окрашивание и автоматизированная визуализация первичных эмбриональных дофаминовых нейронов в 96 пластинах скважин
- Удалите 1x PBS и пермякнуть клетки, добавив 100 мл 0,2% Triton X-100 в PBS (PBST) за колодец и инкубации на RT в течение 15 мин.
- Удалите PBST и добавьте 50 МЛ 5% обычной сыворотки лошади (NHS) в колодец к PBST. Чтобы заблокировать неспецифическую активность антигена, инкубировать на RT за 1 ч.
- Разбавить первичные антитела против TH и pS129-Зин (1:2,000) в 5% ГСЗ в PBST. Добавьте 50 мл разбавленных антител к каждому колодцу и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Удалите антитела и добавьте 100 мл 1x PBS к каждому колодцу, чтобы вымыть клетки. Удалите 1x PBS и повторите стирку 2x.
- Чтобы предотвратить обесцвечивание флуоресцентных молекул, начните работать при минимальных условиях освещения. Разбавить вторичные флуоресцентно помеченные антитела (1:400) в PBST. Добавьте 50 МЛ разбавленных антител к каждому колодцу и инкубировать в RT за 1 ч.
- Удалите раствор антитела и добавьте 100 МЛ 1x PBS к каждому колодцу, чтобы вымыть клетки. Удалите 1x PBS и повторите стирку 2x.
- Удалите 1x PBS, добавьте 50 мл 200 нг/мл 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в колодец, чтобы окрашивать ядра культивируемых клеток и инкубировать на RT в течение 10 минут.
- Вымойте клетки 3x с 100 мл 1x PBS в течение 5 минут каждый. Держите 100 мл 1x PBS в каждом колодце после последней стирки. Накройте пластину алюминиевой фольгой и храните ее при 4 градусах Цельсия до визуализации.
- Изображение первичных эмбриональных нейронов допамина в 96 хорошо просматривать пластины с высоким содержанием пластины сканера (см. Таблица материалов) оснащен 10x цели.
- Отрегулируйте настройки на основе спецификаций 96 пластины скважины, таких как тип пластины, производитель, размер, расстояние между скважинами, а также тип и количество средних.
- Выберите область визуализации скважины, чтобы охватить все клетки на микро-острове. Выберите пример хорошо, чтобы настроить автофокус. Исходя из первоначального фокуса на DAPI.
- Калибровать время приобретения для каждого флуоресцентного канала, исходя из интенсивности окрашивания в контрольные скважины. Отрегулируйте параметры так, что в ППХ-обработанных контрольных скважинах можно четко различать дофаминовые клетки, укрывающие агрегаты pS129-syn в клеточном соме, позволяющие однозначно количественно оценивать pS129-'syn положительные и pS129-syn отрицательные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уэллс, которые не содержат PFFs не должны иметь каких-либо окрашивания для pS129-Syn; таким образом, эти скважины могут быть использованы в качестве отрицательного контроля для корректировки интенсивности pS129-зин. - Изображение всех выбранных скважин с 10x цели одновременно для всех каналов с иммунофлуоресценцией окрашивания с точно такими же параметрами.
- Дополнительно, этикетка з-синуклеин включений в подмножестве скважин с антителами, специфическими для нитевидных з-синуклеин, чтобы подтвердить, что изменения в количестве pS129-зин-положительные включения отражают снижение накопления белка, а не ингибирование фосфорилирования или дефосфорилирования pS129-зин.
- Повторите шаг 5.3, заменяющий антитела pS129-syn с антителами нити к-синуклеин (1:2,000). Изображение окрашенных агрегированных q-synuclein как в шаге 5.13.
6. Анализ изображений с высоким содержанием
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется с открытым доступом программного обеспечения CellProfiler версии 3.15 и CellProfiler Аналитик версия 2.2.1. 27,32. Однако, имея некоторый опыт, аналогичные конвейеры анализа изображений могут быть установлены в другой версии или аналогичном программном обеспечении. Пожалуйста, обратитесь к странице программного обеспечения для подробного объяснения (см. Таблицу Материалов).
- Скачать и установить программное обеспечение CellProfiler и CellProfiler Analyst.
- Откройте CellProfiler. Выберите файл Импорт Трубопровод из файла и загрузки примера трубопровода при условии, TH_LB_V1.cpipe файл (см. Дополнительные файлы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример конвейеров потребует конкретных корректировок в зависимости от свойств приобретенных изображений и платформы для приобретения изображений. Example_Imagesмогут быть использованы для первоначального испытания программного обеспечения. - Загрузите изображения для анализа, перетащив их в модуль Изображений. Используйте параметры фильтра, чтобы выбрать только файлы изображений из загруженной папки.
- Используйте модуль Metadata для извлечения ну, поля зрения и информации о канале из имени файла изображения. Нажмите на символ увеличительного стекла и введите регулярное выражение, чтобы извлечь плиты, Ну, Imaging сайта и канала информации из файлов имена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярное выражение будет зависеть от конвенции именования файлов микроскопа пластины. Нажатие вопросительного знака рядом с увеличительным стеклом предоставит подробную информацию о синтаксисе. - Под модулем NamesAndTypes выберите правильные номера каналов для DAPI, TH и pS129-syn окрашивания(каналы по умолчанию 1, 2и 3). В модуле Групп выберите "Нет".
- Используйте модуль Metadata для извлечения ну, поля зрения и информации о канале из имени файла изображения. Нажмите на символ увеличительного стекла и введите регулярное выражение, чтобы извлечь плиты, Ну, Imaging сайта и канала информации из файлов имена.
- Используйте определяемые модули IdentifyPrimaryObjects для сегмента дофаминовых нейронов с помощью TH окрашивания клеточной сомы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные значения потребуют первоначальной оптимизации в зависимости от того, как пластины окрашены и изображены. Если последующие пластины обрабатываются аналогичным образом, не требуется никаких или минимальных дальнейших корректировок. - Используйте модуль MeasureObjectIntensity для получения информации об интенсивности флуоресценции от каналов TH и DAPI.
- Используйте модуль MeasureObjectSizeShape для измерения размера и формы особенностей сегментных нейронов допамина.
- Используйте модуль MeasureTexture для измерения текстуры особенность информации из канала TH из сегментированных нейронов допамина.
- Используйте модуль ExportToDatabase для сохранения измерений в базе данных.
- Файл базы данных имен в соответствии с схемой именования эксперимента (например, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Выберите выходной фолдер для файла базы данных. Файл базы данных может быть большим количеством гигабайт и должен быть сохранен предпочтительно в родительской папке файлов изображений.
- Откройте аналитика CellProfiler и выберите файл V1_THCells.свойства, созданный на шаге 6.8. Открытые инструменты Классификатор.
- Сортировать сегментированные клетки на две категории: положительные (т.е. правильно сегментированные органы допамина нейронных клеток) и отрицательные (т.е. сегментации и окрашивания артефактов) Смотрите рисунок 2A и 2B.
- Установите количество извлеченных ячеек до 50 случайных ячеек и нажмите Fetch (это загружает изображения ячеек, сегментированных в шаге 6.4). Сортировать по крайней мере 30 ячеек в каждом ячейке, перетащив их в соответствующий ячейку в нижней части окна. При необходимости принесите больше ячеек.
- В выпадающее меню выберите используйте Fast Gentle Boosting с 50 максимальными правилами и нажмите Train.
- Установите"Fetch"до 50 положительных клеток и нажмите Fetch, чтобы получить TH положительные клетки в соответствии с классификатором(рисунок 2A). Используйте полученный результат для оценки качества обученного классификатора.
- Повторите шаги 6.10.1-6.10.3, добавив новые ячейки примера для тренировки классификатора до тех пор, пока результаты не удовлетворительны.
- Выберите Расширенный Правила редактирования... и в новом окне выберите весь текст (Ctrl)и скопировать его (Ctrl-c) для блокнота (Ctrl-v). Сохранить как TH_rules.txt файл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от плотности нейронной культуры и качества окрашивания и визуализации, этот шаг может быть не необходимым, так как можно было бы установить параметры в шаге 6.4 сегментировать только TH положительные клетки с высокой точностью. В этом случае не требуется целый TH_LB_V1.cpipe, а правильные параметры модулей IdentifyPrimaryObjects должны быть помещены непосредственно в соответствующий модуль в TH_LB_V2.cpipe.
Рисунок 2: Количественная оценка нейронов допамина и pS129-зин положительных нейронов допамина с CellProfiler Аналитик программного обеспечения на основе DAPI, TH, и pS129-зин иммунофлюоресценции. ()TH клетки в положительном бен были выбраны на основе DAPI окрашивания (синий) отмечен небольшой квадрат на первой ячейке, выбранной на изображении и окружающих TH окрашивания (серый) на сома. (B)Неклеточные артефакты были помещены в отрицательную корзину. (C) pS129-Зин положительные TH нейроны были выбраны на основе большого включения pS129-зин окрашивания (красный) отмечен небольшой квадрат на первой клетке, выбранной на изображении, окружающих ядра или в клеточной соме. (D) TH клетки без таких pS129-syn включений были помещены в отрицательный бен. Масштабные батончики ю 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
- Откройте CellProfiler и выберите файл Импорт Конвейер из файла и загрузки TH_LB_V2.cpipe файл. Повторите шаги 6.3-6.7. Эта часть трубопровода должна быть идентична TH_LB_V1.cpipe.
- Используйте модуль FilterObjects, чтобы пройти только истинные положительные ячейки TH для дальнейшего анализа.
- Установите режим фильтрации в Правила. В Правилах или названии файла классификатора выберите файл TH_rules.txt, созданный в шаге 6.10.5.
- Установите поле номер класса до 1, если положительные ячейки TH были отсортированы в левом нижнем окне.
- Используйте модуль MeasureObjectIntensity для получения информации об интенсивности флуоресценции с канала pS129-зин.
- Используйте модуль MeasureTexture для измерения информации о текстуре из канала TH из отфильтрованных ячеек.
- Используйте модуль MeasureObjectSizeShape для измерения размера и формы функций фильтрованных ячеек.
- Используйте модуль ExportToDatabase для сохранения измерений в базе данных.
- Файл базы данных имен соответственно с схемой именования эксперимента (например, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Выберите выходная папка для файла базы данных.
- Откройте аналитика CellProfiler и выберите файл V2_THpos.свойства.
- Сортировать сегментированные ячейки на две категории - pS129-syn положительные и pS129-syn отрицательных клеток (Рисунок 2C,D).
- Установите количество извлеченных ячеек до 50 случайных ячеек и нажмите Fetch (это загружает изображения ячеек, сегментированных в шаге 4). Сортировать по крайней мере 30 ячеек в каждом ячейке, перетащив их в соответствующий ячейку в нижней части окна.
- В выпадающего меню выберите «Быстрое нежное повышение» с 50 максимальными правилами или классификаторами Random Forest. Нажмите Поезд.
- Установите"Fetch" до 50 положительных клеток и нажмите Fetch, чтобы получить pS129-Syn положительные клетки в соответствии с классификатором(Рисунок 2C). Установите"Fetch" до 50 отрицательных клеток и нажмите Fetch, чтобы получить pS129-syn отрицательных клеток в соответствии с классификатором(Рисунок 2D). Оцените качество обученного классификатора.
- Повторите шаги 6.17.2-6.17.4, добавив новые ячейки примера для тренировки классификатора до тех пор, пока результаты не удовлетворительны.
- Нажмите Оценка Все, чтобы получить результаты таблицы резюме число pS129-зин положительных и отрицательных нейронов допамина в каждом колодце.
Representative Results
Через несколько дней после покрытия (DIV1-DIV3) была проведена микроскопия яркого поля для оценки здоровья и однородного распространения культивируемых клеток, а также единообразия этих условий в отдельных скважинах(рисунок 3). Культурные клетки среднего мозга были равномерно распространены в пределах микро-острова, созданного до покрытия(Рисунок 3A,B). Первичные нейроны поселились на покрытием земли однородно и установленных нейронных проекций (Рисунок 3B). Небольшой скопление клеток (диаметр меньше 150 мкм) наблюдалось на скважине и показано в качестве примера(рисунок 3C).
Рисунок 3: Через несколько дней после покрытия (например, DIV3), состояние первичных культур среднего мозга наблюдалось с ярко-полевой микроскопией. (A) Культурные клетки распространяются посередине колодца в пределах микро-острова с po-покрытием с приблизительным радиусом 4,4 мм (показано белыми стрелками), созданным путем царапин PO примерно из 1 мм по периметру скважины (показано черными стрелками). (B) Культурные первичные нейроны однородно распространились в пределах области и нейронных проекций (отмечены красными наконечниками стрел) наблюдались. (C) Комок клетки диаметром менее 150 мкм отмечен синими наконечниками стрел. Масштабные батончики ю 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Культуры среднего мозга первичной мыши были иммунобрированны с анти-TH и анти-pS129-зин антитела и изображения с автоматизированным микроскопом после 15 дней в пробирке. Покрытые микро-острова предоставили ограниченную зону для крепления клеток в середине скважин(рисунок 4A,B). Допамин нейронов иммуномаркированных с маркером TH были распространены вокруг микро-острова в монослой, отделены друг от друга, без каких-либо слипания (Рисунок 4Aи 4B ').
Рисунок 4: В DIV15, 800-1000 дофаминовых клеток были количественно с каждого микро-острова, с или без лечения PFF. Репрезентативные изображения эмбриональных культур среднего мозга, запятнанные анти-TH и анти-pS129-Зин антителами. (A, A', A'') Контрольные клетки без лечения PFF. (B, B', B'') PFF-обработанные клетки с pS129-Зин включений. (C) Количественная оценка TH-положительных чисел клеток в скважинах, обработанных транспортным средством (контроль), PFFs, или PFFs с 50 нг/mL GDNF. (D) Количественная оценка агрегатов pS129-зин в TH-положительных клетках, обработанных транспортным средством (контроль), PFFs, или PFFs с 50 нг/mL GDNF. Статистическая значимость была рассчитана с помощью случайного дизайна блока ANOVA. Зп Зтт; 0,01, n и 4 отдельных пластин (биологические репликации), каждая из которых имеет по 3-6 скважин на группу обработки (технические повторы). Масштабные батончики ю 300 мкм для A, B; 50 мкм для A', B'; 25 мкм для A'', B '. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
В то время как культуры без лечения PFF не было каких-либо pS129- Зин сигнала(Рисунок 4A'и 4A '),культур, обработанных с S-synuclein PFFs разработаны pS129-Syn положительные включения (Рисунок 4B'и 4B '). In vitro PFF лечение в течение 7 дней не вызывает какого-либо значительного снижения числа TH-положительных нейронов, по сравнению с другими экспериментальными группами(Рисунок 4C). PFF-обработанных культур было население 40% от pS129-зин положительные TH-положительные нейроны допамина. Лечение с положительным контролем, GDNF, снижение процента TH-положительных нейронов допамина с pS129-Syn положительных включений (Рисунок 4D, см. также необработанные данные и пример изображения в дополнительных файлов).
Дополнительные файлы: Пример трубопроводов для анализа изображений с высоким содержанием изображения с cellProfiler и пакетами программного обеспечения CellAnalyst, примерами изображений и необработанными данными для рисунка 4E, F. (1-9) Example_Images. Откройте эти изображения с помощью ImageJ или CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Шаги 6.2-6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Шаги 6.11-6.18) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Discussion
Распространение патологии Льюи, из которых pS129-зин является основным компонентом, является гистопатологической отличительной чертой PD. Остановка или замедление накопления агрегированных pS129-зин может замедлить дегенерацию нейронов допамина и прогрессирование альфа-синуклеинопатии. Тем не менее, механистическое понимание того, как агрегация pS129-syn способствует кончине дофаминовых нейронов еще предстоит установить. Доказательства из человеческих посмертных исследований на образцы мозга у пациентов на разных стадияхзаболевания,а также наблюдения pS129-Зин положительное включение в пересаженных нейронов плода сильно предполагает распространение патологии Льюи между клетками16,17,33. Следовательно, прион-как распространение pS129-Syn был недавно перепроверяется с помощью С-synuclein PFFs9,10. Создание надежной, рентабельной и относительно высокой или средней пропускной модели распространения и накопления pS129-syn, особенно в дофаминовых нейронах, может значительно ускорить поиск новых методов лечения и соединений, изменяющих этот процесс.
Потому что потеря допамина нейронов является основной причиной двигательных симптомов в PD и эти клетки обладают многими уникальными свойствами2,34,35, моделирование прион-как распространение pS129-'syn в допамина нейронов является наиболее актуальным типом модели с трансляционной точки зрения. Протоколы с использованием микро-островных культур эмбриональных нейронов среднего мозга на 4 пластины колодца и полуавтоматической количественной оценки были описаны ранее18. Протокол, описанный здесь, был адаптирован к 96 плитам скважины и обеспечивает менее трудоемкую подготовку микроресутов, что позволяет подготовить до четырех плит, содержащих по 60 скважин каждый опытным исследователем в течение одного рабочего дня. Культивирование нейронов допамина в 96 пластин скважинах позволяет тестировать лекарства в меньших количествах и обеспечивает высокую скорость трансдукции с лентивирусными векторами. Также можно сочетать различные методы лечения для выполнения более сложных экспериментов.
Перед применением любых процедур (в том числе ПФФ), качество культивирования следует проверить с помощью ярко-полевой микроскопии. Если система микроскопии не использует камеру CO2 с нагреванием, клетки не должны храниться за пределами инкубатора более чем на пару минут, потому что первичные нейроны допамина мыши деликатны и легко подчеркнул. По той же причине, рекомендуется сделать первое изображение после 24 ч инкубации (между DIV1-DIV3). Клетки должны казаться живыми с настоящими клеточными телами и однородно распространяться внутри микро-острова. Первичные нейроны поселились бы на земле с покрытием PO и начали устанавливать нейронные проекции. Можно наблюдать небольшой скопление клеток (т.е. диаметр меньше 150-200 мкм), которые могут быть сформированы, если процесс тритурации не выполнен должным образом или плотность покрытия выше рекомендованной. Эти небольшие скопления не повлияет на эксперимент, если они не более чем на несколько за колодец и / или больше. В ходе анализа изображений клеток, в результате анализа изображений, имохистохимические маркеры и отдельные клетки очень затрудняют выявление иммуногистохимических маркеров и отдельных клеток. Важно избегать таких комков путем тщательного покрытия, тритурации и контроля плотности покрытия. Если единообразие этих условий не может наблюдаться на определенных скважинах, не включайте эти дефектные скважины в эксперимент. Такое исключение должно быть сделано до проведения каких-либо процедур.
Кроме того, использование 96 пластин скважин позволяет удобно использовать многоканальный пипетки во время процедур окрашивания и прямой визуализации с помощью автоматических пластинных микроскопов, что еще больше увеличивает пропускную способность. Использование автоматизированной количественной оценки изображений необходимо для анализа данных с платформ изображений с высоким содержанием изображения. В дополнение к возможности обработки тысяч изображений, полученных от каждого эксперимента, он обеспечивает беспристрастную, идентичную количественную оценку всех групп лечения. Рабочий процесс, предложенный для анализа изображений, основан на простых принципах сегментации дофаминовых нейронов, фильтрации правильно сегментированных клеток путем контролируемого машинного обучения, а затем количественной оценки фенотипов (pS129-syn положительных и pS129-syn отрицательных), опять же путем контролируемого машинного обучения. Хотя несколько различных подходов для этой задачи могут быть предусмотрены, мы обнаружили, сочетание сегментации с машинным обучением, чтобы быть наиболее надежным для допамина культур из-за высокой плотности покрытия, разнообразные формы дофамин нейронов, и наличие сильно окрашенных невритов. Предлагаемый алгоритм анализа изображений был реализован в CellProfiler и CellProfiler Analyst, с открытым исходным кодом, свободно доступном программном обеспечении для анализа изображений с высоким содержанием26,,27. Алгоритм может быть также реализован с другим программным обеспечением для анализа изображений, либо с открытым исходным кодом (например, ImageJ/FIJI, KNIME), либо несвободным. Тем не менее, по нашему опыту, эти часто жертвуют возможностями настройки для простоты использования, и, следовательно, не может работать хорошо в сложных анализов. Мы обнаружили, что пакеты программного обеспечения CellProfiler и CellProfiler Analyst дают особенно надежные результаты, сочетая значительное количество реализованных алгоритмов, чрезвычайную гибкость в разработке рабочего процесса, а также одновременное обращение и эффективную обработку данных изображений с высоким содержанием.
Описанный протокол также может быть адаптирован для количественной оценки других клеточных фенотипов, характеризующихся иммуносхозированием с различными антителами, такими как маркеры других нейронных популяций (например, DAT, GAD67, 5-HT и т.д.) и белковые агрегаты (например, фоспо-Тау, убиквитин). Несколько флуоресцентных маркеров можно также объединить для различения нескольких фенотипов (например, клеток с включениями на разных стадиях созревания). Автоматизированная классификация нескольких фенотипов также должна быть легко реализована в описанных трубопроводах анализа изображений, просто добавив канал, содержащий иммунофлуоресцентные изображения дополнительных маркеров для измерения шагов и сортировки ячеек в несколько бункеров. Однако использование нескольких маркеров одновременно потребует оптимизации иммуносубийства и визуализации. Кроме того, для лучшего качества в иммунофлуоресценции изображений, использование специальных черностенных 96 пластин хорошо явно предназначен для флуоресцентного микроскопа рекомендуется. Тем не менее, они могут быть значительно дороже, чем стандартные пластины клеточной культуры, которые достаточны для анализа, описанного в нашем протоколе.
Тип и качество используемых ПФФ имеют решающее значение для результатов экспериментов. PFFs могут как влиять на надежность анализа, так и на интерпретацию результатов. Условия подготовки могут повлиять на эффективность посева ПФФ и, действительно, PFF "деформации" с различными физиологическими свойствами были зарегистрированы36. Тем не менее, подготовка и проверка ПФФ выходят за рамки данной статьи и были описаны в нескольких публикациях11,28,29,30. В дополнение к протоколу подготовки, виды происхождения з-синуклеина в ПФФАх (например, мышь, человек) и использование дикого типа или мутировавшего белка (например, человека A53T и синуклеин) должны быть рассмотрены, в зависимости от конкретных экспериментальных условий. Индукция накопления pS129-зин ПФФ было показано, что зависит от возраста культуры (т.е. дней в пробирке), с более зрелыми культурами, показывающими более выраженную индукцию11. Это, вероятно, связано с увеличением числа нейронных связей в более зрелых культур, а также увеличение уровня белка к-синуклеин. В наших руках, лечение ПФФ на DIV8 дал самые надежные результаты, с выраженным накоплением pS129-зин в допамина нейрон сома, не ставя под угрозу выживание нейронов. Описанный протокол хорошо подходит для изучения методов лечения, изменяющих ранние события, ведущие к агрегации эндогенных синуклеин, потому что мы количественно pS129-syn положительных включений в относительно ранний момент времени, 7 дней после прививки с PFFs. В настоящее время, внутрисомные включения присутствуют в значительной части клеток и могут быть легко различимы по иммуносхеи, в то время как не PFF-индуцированной клеточной смерти наблюдается, упрощая интерпретацию результатов. Важно отметить, что, как морфология и состав PFF-индуцированных включений может меняться с течениемвремени 12,13, описанный протокол может, в принципе, быть изменены для изучения более зрелых включений фиксации и иммуносуляции в более поздние точки времени. Однако, сохраняя дофамин нейронов в культуре более 15 дней требует крайней внимательности, и может вызвать дополнительные изменения из-за клеток не в состоянии выжить независимо от прививки PFF. Кроме того, более расширенные культуры усложняют графики лечения наркомании. Многие соединения имеют ограниченную или не плохо характеризуется стабильность в среде клеточной культуры, и пополнение препарата не тривиально, потому что полный обмен среды ставит под угрозу выживание культур допамина.
Фосфорилирование й-синуклеина на Ser129 постоянно сообщается в PFF-моделях агрегации и колокалиона с маркерами неправильного сворачивания и агрегации, таких как Тиофлавин S, убиквитин, или конформации конкретных антител11,12. В наших руках, иммуносу предпосылки для pS129-syn также дает самый сильный сигнал с самым низким фоном и наиболее прост для того чтобы проанализировать, давая надежные результаты когда множественные обработки экранированы. Важно отметить, что иммуносулятивная с антителами pS129-syn не обнаруживает ПФФ, которые остаются вне клеток, значительно уменьшая фон. Тем не менее, важно помнить, что фосфорилирование Ser129, вероятно, является одним из самых ранних процессов, связанных с неправильное сворачивание с синуклеина и может быть по-разному регулируется при определенных условиях. Таким образом, любые выводы, которые показывают положительное влияние на pS129-зин должны быть подтверждены другими маркерами.
Статистический анализ должен быть соответствующим образом адаптирован к экспериментальному проектированию. Важно проводить эксперименты по крайней мере в трех независимых биологических репликациях (т.е. отдельных первичных нейрональных культурах). Эти репликации должны быть покрыты на разных пластинах и рассматривать самостоятельно. Мы анализируем данные, полученные из репликаций на различных пластинах со случайным дизайном блока ANOVA37, чтобы учесть сопряжение данных для различных экспериментальных пластин.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Келвина Лука за его щедрый дар ПФФ «Синжуклеин», Конджунг Чжэн за создание и культивирование нейронных клеток, и подразделение световой микроскопии в Институте биотехнологии Хельсинкского университета, для визуализации иммунооптональных клеток. Эта работа была поддержана грантами от 3i-Regeneration компанией Business Finland (Финское агентство по финансированию инноваций), Академией Финляндии #309489, #293392, #319195; Фонд Сигрид Джуселиус и уставные фонды Института фармакологии Май, ПАС, Польша.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
