Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello robusto e riproducibile di accumulo di sivinucleina nei neuroni primari della dopamina. Combinato con l'immunostaining e l'analisi automatizzata imparziale dell'immagine, questo modello consente l'analisi degli effetti dei farmaci e delle manipolazioni genetiche sull'aggregazione di sisnucleina nelle colture neuronali. Le colture primarie di midbrain forniscono una fonte affidabile di neuroni della dopamina embrionale in buona fede. In questo protocollo, il segno distintivo dell'istopatologia del morbo di Parkinson, le corpi di Lewy (LB), è imitato dall'aggiunta di fibrille preformate (FPF) direttamente ai mezzi di coltura neuronale. L'accumulo di fosforeoee endogeno nel soma dei neuroni della dopamina viene rilevato mediante immunostaining già a 7 giorni dopo l'aggiunta di PFF. Le condizioni di coltura delle cellule in vitro sono adatte anche per l'applicazione e la valutazione di trattamenti che prevengono l'accumulo di sinucleina, come farmaci di piccole molecole e fattori neurotrofici, nonché vettori di lentivirus per la manipolazione genetica (ad esempio, con CRISPR/Cas9). Coltivare i neuroni in 96 piastre di pozzo aumenta la robustezza e la potenza delle configurazioni sperimentali. Alla fine dell'esperimento, le cellule sono fissate con paraformaldeide per l'immunocitochimica e l'imaging della microscopia a fluorescenza. Le immagini a fluorescenza multispettrale sono ottenute tramite microscopia automatizzata di 96 lastre di pozzo. Questi dati sono quantificati (ad esempio, contando il numero di neuroni della dopamina contenenti fosforo-sinucleina per bene) con l'uso di software libero che fornisce una piattaforma per l'analisi imparziale del fenotipo ad alto contenuto. La modellazione indotta dal PFF dell'accumulo di fosfore-sinucleina nei neuroni primari della dopamina fornisce uno strumento affidabile per studiare i meccanismi sottostanti che mediano la formazione e l'eliminazione delle inclusioni di sinunucleina, con l'opportunità di screening farmacologico ad alto rendimento e analisi del fenotipo cellulare.
Introduction
Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla morte dei neuroni della dopamina midbrain nella sostanziale nigra (SN), successiva perdita di tono della dopamina nei gangli basali e conseguenti disturbi motori1,2. Una caratteristica istopatologica importante nel cervello dei pazienti affetti da PD sono gli aggregati intracellulari di proteine/lipidi trovati nel soma neuronale, chiamato corpi Lewy (LB), o nei neuriti, neuriti di Lewy (LN), collettivamente noti come patologia Lewy3. La patologia lewy nel cervello sembra progredire con l'avanzamento della PD simile alla diffusione di fattori patogeni attraverso connessioni neuronali. Abbondante patologia Lewy si trova nei neuroni della dopamina nel SN e le cellule in altre aree colpite da neurodegenerazione4. Tuttavia, durante la progressione della malattia, la diffusione e l'insorgenza dell'aggregazione proteica non sempre sono correlate alla morte neuronale e l'esatto contributo della patologia lewy alla morte neuronale non è ancora chiaro5.
LB e LN erano stati indicati per essere costituiti da componenti membranosi e proteici3. I primi sono frammenti di membrana, strutture vescicolari (forse lisosomi e autofanosomi) e mitocondri3. Quest'ultimo è costituito da almeno 300 diverse proteine6. Uno studio di Spillantini et al.7 ha dimostrato che la principale componente proteica della patologia di Lewy è la sinucleina. Altamente espresso nei neuroni, e collegato con la fusione della membrana e il rilascio del neurotrasmettitore, la z-sinucleina nella patologia di Lewy è presente per lo più in forma di fibrilla mile ariamiide, la maggior parte dei quali è fosforolato a Ser129 (pS129- ssyn)4,8.
È importante sottolineare che, a causa delle sue proprietà simili a prioni, le funzioni di synucleina piegate in modo improprio potrebbero avere un ruolo causale nella formazione patologica di Lewy4. Le proprietà prion-like di misfolded synuclein sono state mostrate con estratti midbrain da pazienti e fibrille preformate di tipo sisianone (PfF) preparate in modo corretto per indurre aggregati di sinucleina in neuroni in coltura e in vivo9,10. I PFF presentano un modello affidabile e robusto per studiare la progressione della patologia di sinucleina z nei neuroni della dopamina. Quando i PfF vengono applicati ai neuroni primari coltivati o iniettati nel cervello animale, portano alla formazione di inclusioni contenenti z-sinucleina nei neuriti e nel soma cellulare11 che ricapitolano molte caratteristiche osservate nella patologia di Lewy. Le inclusioni osservate sono detergenti insolubili nel Tritone X, ubiquitinated, macchiate con la colorante specifica amiloide Thioflavin S e contengono iperfosforoslato a z-synuclein a Ser12911,12. È importante sottolineare che queste inclusioni non si formano negli animali da urlo di tipo11di synucleina , indicando la dipendenza della loro formazione sulla sinucleina endogena.
Tuttavia, è difficile confrontare direttamente le inclusioni indotte da PFF e la patologia Lewy riscontrata nei pazienti affetti da PD perché le LB e le LN umane sono altamente eterogenee3. L'eterogeneità osservata della patologia lewy potrebbe essere causata da diverse fasi della formazione, da diverse posizioni anatomiche o da differenze nella conformazione di misfolded z-sinucleina che iniziano il processo di aggregazione. Gli stessi fattori potrebbero influenzare le inclusioni positive di pS129-syn indotta da PFF. Infatti, recentemente è stato dimostrato che le inclusioni positive pS129-syn indotte da PFF nelle colture neuronali primarie rappresentano fasi molto iniziali della patologia che possono maturare in strutture molto simili a LB dopo un periodo di incubazione prolungato12,13.
Modellare la diffusione precoce e l'accumulo di errori di tipo synucleina con i PFF è prezioso per lo sviluppo di farmaci, poiché la diffusione della patologia di Lewy è considerata uno dei marcatori della malattia in fase iniziale. Pertanto, i trattamenti di prevenzione delle aggregazioni possono essere promettenti per fermare o rallentare la progressione della PD nelle fasi molto precoce. Sono in corso diversi studi clinici volti a rallentare o fermare l'accumulo di sinucleina14. Per i pazienti in fase successiva, il trapianto di progenitori neuronali della dopamina può essere una migliore alternativa di trattamento15. Tuttavia, la patologia Lewy è stata documentata nei neuroni embrionali trapiantati durante l'analisi post-mortem dei cervelli dei pazienti della PD16,17, indicando anche la necessità di protezione contro l'accumulo di sinucleina.
In vitro, i PFF di sivinucleina sono noti per indurre l'aggregazione in linee cellulari immortalate, o più comunemente, nei neuroni ippocampali primari roditori o corticali. Nessuno di questi sono vicini a ricapitolare i neuroni della dopamina10. Coltivare questi neuroni richiede placcatura densa di alcuni numeri di neuroni in vitro18. Per ottenere un'elevata densità di placcatura con materiale limitato (ad esempio, neuroni primari della dopamina), il metodo di coltura micro isola è comunemente utilizzato. Nel microisolato, le cellule sono inizialmente placcate in una piccola goccia di media (di solito alcuni microlitri) tenute insieme dalla tensione superficiale nel mezzo di un grande pozzo18. Dopo che i neuroni si attaccano, l'intero pozzo viene riempito con il mezzo mentre le cellule rimangono confinate ad alta densità nella piccola area di placcatura. Oltre ad ottenere un'elevata densità di placcatura, le micro isole impediscono anche la placcatura vicino ai bordi dei pozze, dove le variazioni nella densità cellulare e nella sopravvivenza sono frequenti. Le micro isole sono spesso utilizzate in pozzi o piatti relativamente grandi; tuttavia, stabilire colture neuronali midbrain in microisole in 96 formato ben piastra consente lo studio della patologia di Lewy in neuroni della dopamina in buona fede con potenza di medio-alto rendimento. Gli esperimenti in vitro con questi neuroni ci hanno permesso di scoprire il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF), che promuove la sopravvivenza dei neuroni della dopamina maturi in vitro e in vivo19,20,21,22e impedisce anche la formazione di aggregati di sibita nella dopamina23.22 I neuroni della dopamina derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dal paziente umano costituiscono un modello più accurato a causa della loro origine umana e del più lungo tempo di sopravvivenza in vitro. Tuttavia, l'induzione della patologia di sinucleina nei neuroni umani è osservata dopo più mesi, rispetto a una settimana nei neuroni embrionali del topo e/o con più fattori di stress (ad esempio, combinazione di sovraespressione di synucleina e PFF)24,25. Inoltre, il mantenimento dei neuroni della dopamina umana è più costoso e laborioso rispetto ai neuroni embrionali primari, limitando essenzialmente il loro uso in applicazioni ad alta velocità.
Inoltre, le colture neuronali primarie della dopamina possono essere geneticamente modificate (ad esempio, con CRISPR/Cas9) e/o trattate con agenti farmacologici23. Costituiscono una piattaforma veloce e riproducibile per applicazioni come la dissezione delle vie molecolari e lo screening della libreria dei farmaci. Anche se da queste colture è possibile ottenere materiale limitato, è ancora possibile condurre analisi genomiche/proteomiche di piccole dimensioni. Coltivare i neuroni primari in 96 benno è meglio per le tecniche di immunocitochimica e microscopia a fluorescenza, seguita da analisi fenotipo ad alto contenuto. Le immagini a fluorescenza multispettrale derivate dall'imaging automatizzato di 96 lastre di pozzo possono essere convertite in risultati quantitativi (ad esempio, il numero di neuroni contenenti LB per pozzo). Tali analisi possono essere eseguite con software libero, come CellProfiler26,27. Nel complesso, le colture primarie di midbrain embrionali placcate in 96 placche di pozzo forniscono una piattaforma robusta ed efficiente per studiare i neuroni della dopamina e l'aggregazione di sinucleina con l'opportunità di screening del fenotipo ad alto rendimento.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Consiglio nazionale finlandese per gli esperimenti sugli animali e sono stati effettuati secondo la legislazione europea sulla protezione degli animali utilizzati per scopi scientifici.
1. Preparazione
- Preparare il neurone della dopamina medio (DPM) con 0.46% D-glucose, 1% L-glutamina, 1% N2, 0.2% primocin, completato con DMEM/F12. Filtrare il DPM dopo aver miscelato gli ingredienti. Archiviare DPM a 4 gradi centigradi e riscaldarla una sola volta.
NOTA: DPM non deve contenere GDNF, in quanto ridurrà l'accumulo di sinucleina a z nei neuroni della dopamina23. - Preparare pipette di vetro siliconizzato che sono estremamente idrofobiche, riducendo così al minimo l'attaccamento alla superficie e la perdita di cellule durante la manipolazione iniziale dei neuroni embrionali.
- Aggiungere 10 mL di liquido di siliconizzazione a 1 L di acqua distillata e mescolare mescolando in un recipiente da 2 L. Lasciare le pipette di vetro immerse nella soluzione di siliconizzazione per 15 min.
- Sciacquare le pipette 3-5x con acqua distillata. Asciugare le pipette durante la notte a temperatura ambiente (RT) o per 1-2 h a 100-120 gradi centigradi riscaldato spazio sterile per accelerare l'essiccazione.
- Sterilizzare le pipette da autoclaving standard in un sacchetto di autoclave sigillato.
- Preparare la poli-L-ornitea (PO) rivestita 96 lastre di pozzo con fondo trasparente aggiungendo 60 -L di soluzione PO nei pozzi centrali della piastra 96 da utilizzare per la semina dei neuroni, lasciando almeno una fila / colonna di pozzi ai bordi della piastra per evitare effetti di bordo. Conservare la piastra rivestita per una notte a 4 o 4 h a RT.
- Prima di placcare le cellule, aspirare completamente PO e lavare le cellule tre volte con 100 .L di 1x PBS. Aspirate 1x PBS dai pozzi e tenere il coperchio della piastra aperto per l'essiccazione completa.
NOTA: è possibile raccogliere l'ordine fornitore utilizzato e filtrarlo per il riutilizzo. Questo può essere ripetuto due volte per la stessa soluzione PO. - Aggiungere 50 l of DPM ai pozze rivestiti in precedenza. Aspirare DPM dai pozzi con una punta di plastica 100 l e contemporaneamente graffiare il fondo del pozzo con movimenti circolari per rimuovere il rivestimento al perimetro di ogni pozzo. Un'isola rivestita di PO rimarrà nel mezzo del pozzo.
- Sotto un cofano laminare, aggiungere 10 L di DPM al centro di ogni isola rivestita per creare micro isole.
NOTA: una piastra con micro isole coperte da DPM può essere tenuta sotto il cofano a flusso laminare per 1-2 h durante l'isolamento delle cellule.
2. Isolamento del metà cerebrale ventrale dagli embrioni di topo E13.5
NOTA: Fare riferimento alla figura 1 per i passaggi di dissezione del pavimento midbrain.
- Prima della dissezione, riempire un piatto Petri di 10 cm con il tampone di Dulbecco e tenerlo sul ghiaccio.
- Eutanasia un topo femmina incinta E13.5 secondo le linee guida dell'istituzione. Posizionare il mouse piatto sulla schiena e spruzzare il corpo anteriore con 70% di etanolo. Sollevare la pelle sopra l'utero con pinze e fare un'incisione con forbici chirurgiche per esporre l'utero.
- Rimuovere con cura l'utero e metterlo nel piatto Petri precedentemente preparato sul ghiaccio.
- Utilizzando forbici chirurgiche sotto il cofano laminare a RT, rimuovere con attenzione gli embrioni dall'utero. Togliere tutti i residui placentari dagli embrioni con le pinze e metterli in un nuovo piatto Petri di 10 cm riempito con il tampone di Dulbecco.
- Utilizzando pinze o aghi di dissezione, tagliare il quarto posteriore della testa dai luoghi contrassegnati con frecce nere in Figura 1A. Togliere il pezzo tagliato lontano dal resto dell'embrione (Figura 1B).
- Posizionare il posteriore del pezzo tagliato verso l'osservatore (Figura 1C) e tagliarlo delicatamente aperto da caudala a cranio (Figura 1D). Da 0,5 mm sotto l'apertura cranica, tagliare una regione 2 mm2–3 mm2, illustrata nella Figura 1E.
- Raccogliere il pavimento del midbrain ventrale (vedi Figura 1F) in un tubo di microcentrifuga vuoto da 1,5 mL. Mantenere il tubo di microcentrifuga sul ghiaccio fino a quando tutti i pavimenti del midbrain sono raccolti in esso.
NOTA: In alternativa, i pavimenti midbrain possono essere raccolti con una micropipetta da 1 mL dopo la dissezione di tutti i cervelli embrionali.
Figura 1: Dissezione del piano midbrain dall'embrione di topo E13.5. (A) Le posizioni di taglio sul quarto posteriore della testa sono contrassegnate da frecce nere e linee tratteggiate bianche. (B) Il pezzo è stato rimosso dal resto dell'embrione. Il pezzo rimosso è cerchiato. (C) Il pezzo è stato trasformato di 90 gradi per affrontare il posteriore verso l'osservatore. (D) Il pezzo è stato aperto dalle frecce nere, da caudala a craniale (contrassegnato con linea tratteggiata bianca). (E) Da 0,5 mm –1 mm sotto l'apertura, la regione 2 mm2–4 mm2 è stata tagliata (contrassegnata con linee nere). (F) Il pavimento del midbrain ventrale è stato isolato (contrassegnato con quadrato tratteggiato nero). Barre di scala - 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Stabilire colture primarie di midbrain embrionali da embrioni di tono E13.5 in formato 96
- Dopo la raccolta dei pavimenti a media encefamica di tutti gli embrioni nello stesso tubo da 1,5 mL, rimuovere il buffer residuo di Dulbecco e lavare i pezzi di tessuto tre volte con 500 -L di Ca2 oTm2 -free Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Rimuovere l'HBSS e aggiungere al tubo 500 . Incubarlo a 37 gradi centigradi per 30 min.
- Durante l'incubazione, scaldare 1,5 mL di siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi, aggiungere 30 -L di DNase I all'FBS e mescolare. Inoltre, lucidare la punta di una pipetta di vetro siliconizzato. Assicurarsi che il foro non abbia bordi taglienti e che si tratti di circa le stesse dimensioni di una punta di micropipetta da 1 mL.
NOTA: In alternativa, per la triturazione può essere utilizzata una punta micropipetta a 2 mL a bassa adesione. Tuttavia, pipette di vetro siliconizzato sembrano dare i migliori risultati. - Non appena termina l'incubazione al punto 3.2, aggiungere 500 -L del mix FBS/DNase al tessuto parzialmente digerito. Utilizzare la pipetta di vetro per triturare il tessuto nel mix FBS/trypsin. Triturate fino a quando i tessuti non si dissociano in minuscole particelle appena visibili. Evitare le bolle durante la triturazione.
- Lasciare che le particelle rimaste precipitino nella parte inferiore del tubo di microcentrizzazione per gravità. Senza pipettare il precipitato sul fondo, raccogliere il supernatante in un tubo di polipropilene conico vuoto da 15 mL.
- Diluire FBS/DNase I dal passo 3.3 (98:2) con 1.000 L di HBSS per ottenere FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Mescolare pipetting su e giù. Aggiungere 1.000 l del nuovo mix alle particelle rimaste nel tubo di microcentrifuga. Triturare di nuovo e ripetere il passaggio 3.5.
- Ripetere il passaggio precedente ancora una volta per utilizzare tutti FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
- Una volta che tutto il supernatante è raccolto all'interno del tubo da 15 mL (dai passi 3.5, 3.7, e 3.8), utilizzare una centrifuga da tavolo per girare verso il basso il supernatante (3 mL) a 100 x g, per 5 min. Rimuovere il supernatante senza toccare le cellule pellettate in basso.
- Lavare il pellet cellulare aggiungendo 2 mL di DPM al tubo e ruotarlo verso il basso a 100 x g per 5 min.
NOTA: Utilizzare sempre DPM fresco e riscaldato per i neuroni coltivati. Per le fasi di lavaggio, DPM non deve essere fresco, ma deve essere preriscaldato a 37 . - Diluire le cellule con DPM fresco e caldo e trasferirle in un tubo di microcentrismo. La quantità di DPM per la diluizione dipende dal numero di embrioni utilizzati per la dissezione dei tessuti. Ad esempio, utilizzare 150 l of DPM per diluire le cellule ottenute da dieci embrioni.
- Trasferire 10 celle in DPM in un tubo di microcentrifuga. Mescolarli con 10 -L di 0,4% di macchia blu Trypan. Contare le cellule live (cioè Trypan blu negativo) utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
NOTA: Utilizzare 30.000 cellule per placcatura per bene per ottenere i neuroni della dopamina 1.000 dollari per bene. Se la densità delle celle è superiore a 30.000 celle per 6 once, diluire ulteriormente le celle con DPM prima della placcatura in modo che il volume di semina non sia inferiore a 6. - Senza toccare il fondo dei pozzi, rimuovere il DPM dalle micro isole create al passaggio 1.6.
- Al fine di ottenere densità cellulare riproducibile ad ogni pozzo, mescolare le cellule da pipettatura delicata prima di placcatura nel pozzo. Con una micropipetta da 1 a 10 lun, aggiungete 6 celle al centro del pozzo, nella posizione di ciascuna ex microisola.
- Riempire i pozzetti vuoti ai bordi della piastra con 150 gradi di acqua o 1x PBS per ridurre al minimo l'evaporazione dai pozzi contenenti colture neuronali. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 1 h.
- Dopo 1 h, togliere la piastra dall'incubatrice, aggiungere 100 L di DPM in ogni pozzo con le cellule e riposizionarla nell'incubatrice.
- Due giorni dopo la placcatura (giorno in vitro 2, o DIV2), rimuovere 25 L e aggiungere 75 l di DPM fresco per portare il volume del supporto finale a 150 l ed evitare l'evaporazione il più possibile.
- Scambiare metà del supporto con DPM fresco (cioè, rimuovere 75 L e aggiungere 75 l-l DPM fresco) a DIV5. Non eseguire alcuna modifica del supporto dopo DIV5.
4. Induzione di aggregati di sinucleina a seminata nei neuroni primari della dopamina embrionale mediante semina con fibrille preformate
I protocolli per l'ottenimento e la convalida dei PfF erano stati meticolosamente descritti e discussi in diverse pubblicazioni recenti11,28,29,30.30 Dopo qualsiasi lavoro con i PFF, pulire il cofano laminare o qualsiasi apparecchiatura che potrebbe aver contattato i PFF con 1% SDS, quindi con 70% etanolo31.
- Prima dell'esperimento, diluire i PFF con 1x PBS ad una concentrazione finale di 100 g/mL. Sonicare i PFF diluiti in tubi di microcentrifuga con un sonicatore da bagno ad alta potenza con raffreddamento del bagno d'acqua a 4 gradi centigradi per 10 cicli, 30 s ON/30 s OFF.
NOTA: È fondamentale che le fibrille siano correttamente sonicate per generare frammenti lunghi 50 nm. Le dimensioni dei PFF sonorizzati possono essere misurate direttamente dalle immagini al microscopio elettronico di trasmissione dei PFF macchiati come descritto da Patterson et al.30. Sonicazione può essere raggiunta come descritto sopra in un sonicatore bagno ad alta potenza. In alternativa, un sonicatore punta può essere utilizzato30. I PFF sonicati possono essere immagazzinati a -80 gradi centigradi in piccole aliquote per evitare più cicli di congelamento/scongelamento. - Su DIV8, aggiungere 3,75 luna di 100 g/mL di PFF per bene al 150 l di media nel pozzo ad una concentrazione finale di 2,5 g/mL. Utilizzare la stessa quantità di 1x PBS per il gruppo di controlli.
- Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS e conservare l'aliquota a -20 gradi centigradi. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.
NOTA: il PFA è tossico; indossare una maschera e guanti durante la preparazione, lavorare sempre sotto un cofano laminare e smaltire tutti i rifiuti PFA solidi e liquidi secondo le indicazioni dell'istituto.- Caldo 500 mL di 1x PBS in un recipiente da 1 L. Mettere una barra di agitazione nel recipiente e mettere il recipiente su un agitatore magnetico con una funzione di riscaldamento. Regolare la temperatura tra i 40 e i 60 gradi centigradi per evitare l'ebollizione mantenendo la soluzione calda.
- Misurare 20 g di polvere di PFA sotto il cofano in un contenitore di misura in plastica usa e getta. Aggiungere con attenzione la polvere di PFA nel recipiente riempito con 1x PBS. Iniziare a mescolare la soluzione.
- Aggiungere nella soluzione 200 lun di idrossido di sodio di 5 M e continuare a mescolare per 15 min, fino a quando il PFA non si scioglie completamente.
- Dopo che la soluzione appare omogenea, aggiungere 168 - L di 5 M di cloruro di idrogeno per bilanciare il pH a 7 dollari. Controllare il pH con strisce indicatore di pH monouso fissate al colore.
- Togliere il recipiente dal riscaldatore e lasciarlo raffreddare fino a RT. Filtrare la soluzione e per l'accumulo di aliquote a -20 gradi centigradi. Scongelare le aliquote a RT prima dell'uso e non ricongelare in seguito.
- Su DIV15, rimuovere tutti i supporti dai pozzi tramite pipettaggio. Aggiungere 50 -L di 4% PFA ad ogni pozzo per fissare le cellule e incubare per 20 min a RT. Dopo l'incubazione rimuovere l'APIs dai pozze e aggiungere 100 -L di 1x PBS ad ogni pozzo per lavare le cellule. Rimuovere 1x PBS e lavare 2volte di più.
- Lasciare 100 l un valore di 1x PBS in ogni pozzo per evitare l'essiccazione. Conservare la piastra a 4 gradi centigradi fino a quando non viene eseguita l'immunochimica.
5. Colorazione immunofluorescente e imaging automatico dei neuroni primari embrionali della dopamina in 96 placche di pozzo
- Rimuovere 1x PBS e permeabilizzare le celle aggiungendo 100 -L di 0,2% Triton X-100 in PBS (PBST) per pozzo e incubando a RT per 15 min.
- Rimuovere PBST e aggiungere al PBST 5% siero di cavallo normale (NHS) per bene. Per bloccare l'attività non specifica dell'antigene, incubare a RT per 1 h.
- Diluire gli anticorpi primari contro TH e pS129-zsyn (1:2,000) nel 5% NHS in PBST. Aggiungete 50 l di anticorpi diluiti ad ogni pozzo e incubate pernottamento a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere gli anticorpi e aggiungere 100 luna di 1x PBS ad ogni pozzo per lavare le cellule. Rimuovere 1x PBS e ripetere il lavaggio 2x.
- Per evitare lo sbiancamento delle molecole fluorescenti, iniziare a lavorare in condizioni di luce minima. Diluire gli anticorpi fluorescenti secondari (1:400) in PBST. Aggiungere 50 l di anticorpi diluiti ad ogni pozzo e incubare a RT per 1 ora.
- Rimuovere la soluzione anticorpale e aggiungere 100 lof1 PBS ad ogni pozzo per lavare le cellule. Rimuovere 1x PBS e ripetere il lavaggio 2x.
- Rimuovere 1x PBS, aggiungere 50 - L of 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per bene per macchiare i nuclei delle cellule coltivate e incubare a RT per 10 min.
- Lavare le cellule 3x con 100 x L di 1x PBS per 5 min ciascuno. Conservare 100 l 1x PBS in ogni pozzo dopo l'ultimo lavaggio. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e conservarla a 4 gradi centigradi fino all'imaging.
- Immagine neuroni della dopamina embrionale primaria in una piastra di 96 ben vista con uno scanner piatto ad alto contenuto (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo 10x.
- Regolare le impostazioni in base alle specifiche della piastra 96 pozzo, come il tipo di piastra, produttore, dimensione, distanza tra i pozze, così come il tipo e la quantità di mezzo.
- Selezionare l'area di imaging del pozzo per coprire tutte le cellule di una micro isola. Scegliere un esempio bene per regolare la messa a fuoco automatica. Basare l'attenzione iniziale su DAPI.
- Calibrare il tempo di acquisizione per ogni canale fluorescente, in base all'intensità della colorazione nei pozze di controllo. Regolare i parametri in modo che nei pozzi di controllo trattati con PFF si possa distinguere chiaramente le cellule della dopamina che ospitano aggregati di pS129-zsyn nel soma cellulare consentendo una quantificazione inequivocabile delle cellule negative pS129-syn positive e pS129-zsyn.
NOTA: I pozzi che non contengono PFF non devono avere alcuna colorazione per pS129-'syn; pertanto, questi pozzi possono essere utilizzati come controllo negativo per regolare l'intensità di pS129- syn. - Immagina contemporaneamente tutti i pozze selezionate con un obiettivo 10x per tutti i canali con colorazione immunofluorescenza con esattamente gli stessi parametri.
- Facoltativamente, etichettare le inclusioni di sintebina in un sottoinsieme dei pozzi con anticorpi specifici per filamentosi z-sinucleina per confermare che i cambiamenti nel numero di inclusioni di pS129-ssyn-positive riflettono la riduzione dell'accumulo di proteine piuttosto che l'inibizione della fosforilazione o della depforolalazione di pS129-'syn.
- Ripetere il passaggio 5.3 sostituendo l'anticorpo pS129-zsyn con l'anticorpo del filamento di tipo synuclein (1:2,000). Immaginare la silnucleina di tipo siliata macchiata come nel punto 5.13.
6. Analisi delle immagini ad alto contenuto
NOTA: questo passaggio viene eseguito con il software di accesso aperto CellProfiler versione 3.15 e CellProfiler Analyst versione 2.2.1. 27,32. Tuttavia, con una certa esperienza, le pipeline di analisi delle immagini analoghe potrebbero essere impostate in una versione diversa o in un software simile. Si prega di fare riferimento alla pagina del software per una spiegazione dettagliata (vedere Tabella dei materiali).
- Scaricare e installare il software CellProfiler e CellProfiler Analyst.
- Aprire CellProfiler. Seleziona file Proprietà Import Pipeline from file e caricare la pipeline di esempio fornita, TH_LB_V1.cpipe file (vedere i file supplementari).
NOTA: le pipeline di esempio richiederanno regolazioni specifiche a seconda delle proprietà delle immagini acquisite e della piattaforma di acquisizione delle immagini. Example_Imagespuò essere utilizzato per la prova iniziale del software. - Caricare le immagini da analizzare trascinandole nel modulo Immagini. Utilizzare le opzioni di filtro per selezionare solo i file di immagine dalla cartella caricata.
- Utilizzare il modulo Metadati per estrarre bene, campo visivo e informazioni sul canale dal nome del file di immagine. Fare clic sul simbolo della lente di ingrandimento e immettere un'espressione regolare per estrarre le informazioni su platea, pozzo, sito di imaging e canale dai nomi dei file.
NOTA: l'espressione regolare dipenderà dalla convenzione di denominazione dei file del microscopio a piastre. Facendo clic sul punto interrogativo accanto alla lente di ingrandimento verranno forniti i dettagli della sintassi. - Nel modulo NamesAndTypes selezionare i numeri di canale corretti per la colorazione DAPI, TH e pS129 - syn(canali predefiniti 1, 2e 3). Nel modulo Gruppi, selezionare "No".
- Utilizzare il modulo Metadati per estrarre bene, campo visivo e informazioni sul canale dal nome del file di immagine. Fare clic sul simbolo della lente di ingrandimento e immettere un'espressione regolare per estrarre le informazioni su platea, pozzo, sito di imaging e canale dai nomi dei file.
- Utilizzare i moduli IdentifyPrimaryObjects per segmentare i neuroni della dopamina utilizzando TH colorazione del soma cellulare.
NOTA: valori specifici richiederanno l'ottimizzazione iniziale in base alla modalità di colorazione e immagine delle lastre. Se le targhe successive vengono trattate in modo analogo, non sono necessari ulteriori aggiustamenti o modifiche minime. - Utilizzare il modulo MeasureObjectIntensity per acquisire informazioni sull'intensità della fluorescenza dai canali TH e DAPI.
- Utilizzare il modulo MeasureObjectSizeShape per misurare le caratteristiche di dimensioni e forma dei neuroni della dopamina del segmento.
- Utilizzare il modulo MeasureTexture per misurare le informazioni sulle funzionalità di trama dal canale TH dai neuroni della dopamina segmentati.
- Utilizzare il modulo ExportToDatabase per salvare le misurazioni nel database.
- Assegnare un nome al file di database in base allo schema di denominazione dell'esperimento (ad esempio, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Selezionare Cartella di output per il file di database. Il file di database può essere di diversi gigabyte e deve essere salvato preferibilmente nella cartella padre dei file di immagine.
- Aprire CellProfiler Analyst e selezionare il file V1_THCells.properties creato al passaggio 6.8. Aprire Gli strumenti Classificatore.
- Ordinare le celle segmentate in due categorie: positivo (cioè, corpi cellulari del neurone della dopamina segmentati correttamente) e negativo (ad esempio, elementi di segmentazione e colorazione) Vedere figura 2A e 2B.
- Impostare il numero di celle recuperate su 50 celle casuali e fare clic su Recupera (carica le immagini delle celle segmentate nel passaggio 6.4). Ordinare almeno 30 celle in ogni raccoglitore trascinandole nel contenitore corrispondente nella parte inferiore della finestra. Recuperare più celle in base alle esigenze.
- Nel menu a discesa selezionare Usa potenziamento delicato veloce con 50 regole massime e fare clic su Alleva.
- Impostare " Fetch "su 50 celle positive e premere Fetch per ottenere TH celle positive in base al classificatore (Figura 2A). Utilizzare il risultato ottenuto per valutare la qualità del classificatore addestrato.
- Ripetere i passaggi da 6.10.1– 6.10.3, aggiungendo nuove celle di esempio per il training del classificatore fino a quando i risultati non sono soddisfacenti.
- Selezionare Avanzate Modifica regole... e in una nuova finestra selezionare tutto il testo (Ctrl - a) e copiarlo (Ctrl-c) nel blocco note (Ctrl-v). Salvare come file TH_rules.txt.
NOTA: A seconda della densità della coltura neuronale e della qualità della colorazione e dell'imaging, questo passaggio potrebbe non essere necessario, in quanto potrebbe essere possibile impostare i parametri nel passaggio 6.4 per segmentare solo le celle positive TH con alta precisione. In questo caso, non è necessaria un'intera esecuzione TH_LB_V1.cpipe e i parametri corretti dei moduli IdentifyPrimaryObjects devono essere inseriti direttamente nel modulo corrispondente in TH_LB_V2.cpipe.
Figura 2: Quantificazione dei neuroni della dopamina e pS129- syn neuroni della dopamina positiva con CellProfiler Analyst software basato su DAPI, TH, e pS129- ssyn immunofluorescenza. (A) Le celle TH nel contenitore positivo sono state selezionate in base alla colorazione DAPI (blu) contrassegnata con un piccolo quadrato nella prima cella selezionata in corrispondenza dell'immagine e la colorazione TH circostante (grigio) a soma. (B) Gli artefatti non cellulari sono stati collocati nel contenitore negativo. SonoCstati selezionati i neuroni pS129-syn positivi TH sulla base di una grande inclusione di colorazione pS129-zsyn (rosso) contrassegnata con un piccolo quadrato nella prima cella selezionata all'immagine, che circonda i nuclei o il soma cellulare. (D) Le cellule TH senza tali inclusioni di pS129-syn sono state collocate nel bidone negativo. Barre della scala: 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Aprire CellProfiler e selezionare File Proprietà Import Pipeline dal file e caricare TH_LB_V2 file.cpipe. Ripetere i passaggi da 6.3–6.7. Questa parte della conduttura deve essere identica a TH_LB_V1.cpipe.
- Utilizzare il modulo FilterObjects per passare solo vere celle positive TH per un'ulteriore analisi.
- Impostare la modalità di filtro di selezione su Regole. In Regole o nome file classificatore selezionare il file TH_rules.txt creato nel passaggio 6.10.5.
- Impostare il campo Numero classe su 1 se le celle positive TH sono state ordinate in basso a sinistra.
- Utilizzare il modulo MeasureObjectIntensity per acquisire informazioni sull'intensità della fluorescenza dal canale pS129-.
- Usare il modulo MeasureTexture per misurare le informazioni sulle feature di trama dal canale TH dalle celle filtrate.
- Usare il modulo MeasureObjectSizeShape per misurare le dimensioni e le caratteristiche delle forme delle celle filtrate.
- Utilizzare il modulo ExportToDatabase per salvare le misurazioni nel database.
- Assegnare un nome al file di database con lo schema di denominazione dell'esperimento (ad esempio, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Selezionare la cartella di output per il file di database.
- Aprire CellProfiler Analyst e selezionare V2_THpos.properties file.
- Ordinare le celle segmentate in due categorie: pS129-syn positivo e pS129-zsyn negative (Figura 2C,D).
- Impostare il numero di celle recuperate su 50 celle casuali e fare clic su Recupera (carica le immagini delle celle segmentate nel passaggio 4). Ordinare almeno 30 celle in ogni raccoglitore trascinandole nel contenitore corrispondente nella parte inferiore della finestra.
- Nel menu a discesa, seleziona Usa potenziamento rapido con un incremento rapido con 50 regole massime o Classificatori foresta casuale. Fare clic su Treno.
- Impostare " Fetch "su 50 celle positive e premere Fetch per ottenere le celle positive pS129-ssyn in base al classificatore (Figura 2C). Impostare " Fetch "su 50 celle negative e premere Fetch per ottenere le celle negative pS129-zsyn in base al classificatore (Figura 2D). Valutare la qualità del classificatore con training.
- Ripetere i passaggi da 6.17.2– 6.17.4, aggiungendo nuove celle di esempio per eseguire il training del classificatore fino a quando i risultati non sono soddisfacenti.
- Fare clic su Score All per ottenere risultati tabella riassumendo il numero di pS129- ssyn neuroni della dopamina positivi e negativi in ogni bene.
Representative Results
Pochi giorni dopo la placcatura (DIV1-DIV3), la microscopia a campo luminoso è stata fatta per valutare la salute e la diffusione omogenea delle cellule coltivate e l'uniformità di queste condizioni nei singoli pozzi (Figura 3). Le cellule cerebrali cerebrali coltivate si sono diffuse omogeneamente all'interno della microisola creata prima della placcatura (Figura 3A,B). I neuroni primari si erano stabilizzati sul terreno rivestito in modo omogeneo e avevano stabilito proiezioni neuronali (Figura 3B). Un piccolo gruppo di cellule (diametro inferiore a 150 m) è stato osservato al pozzo e mostrato come esempio (Figura 3C).
Figura 3: Pochi giorni dopo la placcatura (ad esempio, DIV3), le condizioni delle colture primarie del midbrain sono state osservate con la microscopia a campo luminoso. (A) Le cellule coltivate si diffondono nel mezzo del pozzo all'interno dell'isola micro rivestita di PO con un raggio approssimativo di 4,4 mm (mostrato con frecce bianche) creato grattando PO da circa 1 mm ben perimetrale (mostrato con frecce nere). (B) I neuroni primari coltivati si diffondono omogeneamente all'interno dell'area e sono state osservate proiezioni neuronali (contrassegnate con punte di freccia rossa). (C) Un grumo di cellule con un diametro inferiore a 150 m è contrassegnato con punte di freccia blu. Barre della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le colture primarie del midbrain sono state immunostainse con anticorpi anti-TH e anti-pS129-zsyn e immagini con un microscopio automatizzato dopo 15 giorni in vitro. Micro isole rivestite fornito area limitata per l'attaccamento delle cellule nel mezzo di pozzi (Figura 4A,B). I neuroni della dopamina immunoetichettati con il marcatore TH si sono diffusi intorno all'isola in un monostrato, separati l'uno dall'altro, senza alcun agglomeramento (Figura 4A' e 4B').
Figura 4: A DIV15, 800-1.000 cellule della dopamina sono state quantificate da ogni micro isola, con o senza trattamento PFF. Immagini rappresentative di colture embrionali di midbrain immonutuate con anticorpi anti-TH e anti-pS129-zsyn. (A, A', A'') Controllare le cellule senza trattamento PFF. (B, B', B'') Cellule trattate con PFF con inclusioni di pS129-. (C) Quantificazione dei numeri di cellule TH-positivi in pozzi trattati con veicolo (controllo), PFF o PFF con 50 ng/mL GDNF. (D) Quantificazione degli aggregati di pS129-zsyn in cellule TH-positive trattate con veicolo (controllo), PFF o PFF con 50 ng/mL GDNF. La rilevanza statistica è stata calcolata con la progettazione casuale del blocco ANOVA. < 0,01, n - 4 piastre individuali (repliche biologiche), ognuna con 3-6 pozzi per gruppo di trattamento (ripetizioni tecniche). Barre di scala : 300 m per A, B; 50 m per A', B'; 25 m per A'', B''. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Mentre le colture senza trattamento PFF non avevano alcun segnale pS129- ssyn(Figura 4A' e 4A''),colture trattateFigure 4Bcon PFF 4B’’a z-sinucleina hanno sviluppato pS129- .’ Il trattamento PFF in vitro per 7 giorni non ha causato alcuna diminuzione significativa del numero di neuroni TH-positivi, rispetto ad altri gruppi sperimentali (Figura 4C). Le colture trattate con PFF avevano una popolazione del 40% dei neuroni della dopamina positivi di pFF129- . Il trattamento con controllo positivo, GDNF, ha ridotto la percentuale di neuroni della dopamina TH-positivi con inclusioni positive pS129-zsyn (Figura 4D, vedere anche i dati grezzi e le immagini di esempio nei file supplementari).
File supplementari: Pipeline di esempio per l'analisi delle immagini ad alto contenuto con CellProfiler e i pacchetti software CellAnalyst, immagini di esempio e dati non elaborati per Figura 4E, F. (1-9) Example_Images. Aprire queste immagini con ImageJ o CellProfiler.Open these images with ImageJ or CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Steps 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Steps 6.11–6.18) Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
La diffusione della patologia lewy, di cui il pS129-ssyn è un elemento costituente principale, è un segno distintivo istopatologico della PD. L'arresto o il rallentamento dell'accumulo di pS129-syn aggregati può rallentare la degenerazione dei neuroni della dopamina e la progressione della alfa-sinucleinopatia. Tuttavia, una comprensione meccanicistica di come l'aggregazione di pS129-ssyn contribuisce alla scomparsa dei neuroni della dopamina deve ancora essere stabilita. Le evidenze di studi postmortem umani su campioni cerebrali da pazienti in diversi stadi della malattia, nonché l'osservazione dell'inclusione positiva di pS129-zsyn nei neuroni fetali trapiantati suggeriscono fortemente la diffusione della patologia lewy tra le cellule16,17,33. Di conseguenza, la diffusione di pS129-ssyn è stata recentemente ricapitolata utilizzando FPF9,,10. La creazione di un modello robusto, conveniente, e relativamente ad alta o media velocità di diffusione e accumulo di pS129-zsyn, in particolare nei neuroni della dopamina, può accelerare notevolmente la ricerca di nuovi trattamenti e composti che modificano questo processo.
Perché la perdita di neuroni della dopamina è la causa principale dei sintomi motori nella PD e queste cellule possiedono molte proprietà uniche2,34,35, modellazione della diffusione prion-like di pS129- ssyn nei neuroni della dopamina è il tipo più rilevante di modello dal punto di vista traslazionale. I protocolli che utilizzano micro colture di isole di neuroni midbrain embrionali su 4 placche e quantificazioni semiautomatiche sono stati descritti in precedenza18. Il protocollo qui descritto è stato adattato a 96 lastre di pozzo e fornisce una preparazione meno laboriosa di micro isole, consentendo la preparazione di un massimo di quattro piastre contenenti 60 pozze ciascuna da un ricercatore esperto durante una giornata lavorativa. Coltura di neuroni della dopamina in 96 piastre bene consente di testare i farmaci a quantità inferiori e consente alti tassi di trasduzione con vettori lentivirus. È anche possibile combinare diversi trattamenti per eseguire esperimenti più complessi.
Prima di applicare qualsiasi trattamento (compresi i PFF), la qualità della coltura deve essere verificata con la microscopia a campo luminoso. Se il sistema di microscopia non utilizza una camera di CO2 con riscaldamento, le cellule non devono essere tenute al di fuori dell'incubatrice per più di un paio di minuti, perché i neuroni primari della dopamina del topo sono delicati e facilmente stressati. Per lo stesso motivo, si consiglia di fare la prima imaging dopo 24 h di incubazione (tra DIV1-DIV3). Le cellule dovrebbero sembrare vive con i corpi cellulari presenti e si diffondono omogeneamente all'interno della micro isola. I neuroni primari si sarebbero stabilizzati sul terreno rivestito di PO e hanno iniziato a stabilire proiezioni neuronali. È possibile osservare piccoli grumi di cellule (cioè diametro inferiore a 150-200 m) che possono essere formate se il processo di triturazione non viene eseguito correttamente o la densità di placcatura è superiore a quella raccomandata. Questi piccoli grumi non influenzerebbero l'esperimento, a meno che non siano più di pochi per bene e / o più grande. Le cellule raggruppate rendono molto difficile identificare i marcatori immunoistochimici e le singole cellule durante l'analisi dell'immagine. È essenziale evitare tali grumi mediante un'attenta rivestimento, trituratura e controllo della densità di placcatura. Se l'uniformità di queste condizioni non può essere osservata in alcuni pozzi, non includere questi pozzi difettosi nell'esperimento. Tale esclusione dovrebbe essere effettuata prima dell'esecuzione di qualsiasi trattamento.
Inoltre, l'utilizzo di 96 lastre di pozzo consente un comodo uso di pipette multicanale durante le procedure di colorazione e la visualizzazione diretta con microscopi a piastre automatiche, aumentando ulteriormente la produttività. L'utilizzo della quantificazione automatica delle immagini è indispensabile per l'analisi dei dati provenienti da piattaforme di imaging ad alto contenuto. Oltre alla capacità di elaborare migliaia di immagini ottenute da ogni esperimento, garantisce una quantificazione imparziale e identica di tutti i gruppi di trattamento. Il flusso di lavoro proposto per l'analisi dell'immagine si basa su semplici principi di segmentazione dei neuroni della dopamina, filtraggio delle cellule segmentate correttamente mediante l'apprendimento automatico supervisionato e successivamente la quantificazione dei fenotipi (pS129-syn positivo e pS129-'syn negativo), sempre dall'apprendimento automatico supervisionato. Anche se diversi approcci diversi per questo compito possono essere immaginati, abbiamo trovato la combinazione di segmentazione con l'apprendimento automatico per essere il più robusto per le colture di dopamina a causa di alta densità di placcatura, le diverse forme di neuroni della dopamina, e la presenza di neuriti fortemente macchiati. L'algoritmo di analisi delle immagini proposto è stato implementato in CellProfiler e CellProfiler Analyst, open source, software di analisi delle immagini ad alto contenuto liberamente disponibile26,27. L'algoritmo potrebbe anche essere implementato con altri software di analisi delle immagini, sia open source (ad esempio, ImageJ/FIJI, KNIME) o proprietario. Tuttavia, nella nostra esperienza queste funzionalità di personalizzazione spesso sacrificano per facilità d'uso, e quindi potrebbero non funzionare bene in analisi complicate. Abbiamo scoperto che i pacchetti software CellProfiler e CellProfiler Analyst forniscono risultati particolarmente affidabili combinando un numero considerevole di algoritmi implementati, estrema flessibilità nella progettazione del flusso di lavoro e la gestione simultanea e l'elaborazione efficiente dei dati di imaging ad alto contenuto.
Il protocollo descritto potrebbe anche essere adattato per la quantificazione di altri fenotipi cellulari caratterizzati dall'immunostaining con diversi anticorpi, come marcatori di altre popolazioni neuronali (ad esempio, DAT, GAD67, 5-HT ecc.) e aggregati proteici (ad esempio, fospo-Tau, ubiquitina). Più marcatori fluorescenti potrebbero anche essere combinati per distinguere fenotipi multipli (ad esempio, cellule con inclusioni in diverse fasi di maturazione). La classificazione automatizzata di fenotipi multipli dovrebbe anche essere facile da implementare nelle pipeline di analisi delle immagini descritte semplicemente aggiungendo un canale contenente immagini immunofluorescenti di marcatori aggiuntivi per le fasi di misurazione e l'ordinamento delle cellule in più contenitori. L'utilizzo di più marcatori contemporaneamente richiederebbe tuttavia l'ottimizzazione delle condizioni di immunostaining e imaging. Inoltre, per una migliore qualità nell'imaging immunofluorescenza, si raccomanda l'uso di speciali piastre da 96 pozze con pareti nere esplicitamente progettate per il microscopio fluorescente. Tuttavia, questi possono essere notevolmente più costosi rispetto alle piastre di coltura cellulare standard, che sono sufficienti per l'analisi descritta nel nostro protocollo.
Il tipo e la qualità dei PFF utilizzati sono fondamentali per il risultato degli esperimenti. I PFF possono influire sia sulla robustezza del saggio che sull'interpretazione dei risultati. Le condizioni di preparazione potrebbero influenzare l'efficienza di seeding dei PFF e, in effetti, sono stati segnalati "ceppi" Di PFF con diverse proprietà fisiologiche36. Ciò nonostante, la preparazione e la convalida dei PFF esulano dall'ambito di questo articolo e sono state descritte in diverse pubblicazioni11,28,29,30. Oltre al protocollo di preparazione, la specie di origine della sinucleina di synucleina nei PFF (ad esempio, topo, umano) e l'uso di proteine di tipo selvatico o mutate (ad esempio, a53T umano - sinucleina) devono essere considerate, a seconda delle particolari condizioni sperimentali. L'induzione dell'accumulo di pS129-ssyn da parte dei PFF è risultata dipendere dall'età della coltura (cioè, giorni in vitro), con colture più mature che mostrano un'induzione più pronunciata11. Ciò è probabilmente dovuto all'aumento del numero di connessioni neuronali in colture più mature, e all'aumento dei livelli di proteine di sionucleina. Nelle nostre mani, il trattamento con PfF a DIV8 ha dato i risultati più robusti, con un accumulo pronunciato di pS129- ssyn nel soma del neurone della dopamina, pur non compromettendo la sopravvivenza neuronale. Il protocollo descritto è adatto allo studio di trattamenti che modificano i primi eventi che portano all'aggregazione di endogenine z-sinucleina perché quantifichiamo le inclusioni positive di pS129-zsyn in un momento relativamente precoce, 7 giorni dopo l'inoculazione con i PFF. A questo punto, le inclusioni intrasomiche sono presenti in una frazione significativa di cellule e possono essere facilmente distinte dall'immunostaining mentre non si osserva la morte cellulare indotta dal PFF, semplificando l'interpretazione dei risultati. È importante sottolineare che, poiché la morfologia e la composizione delle inclusioni indotte da PFF possono cambiare nel tempo12,,13, il protocollo descritto potrebbe, in linea di principio, essere modificato per studiare inclusioni più mature per fissazione e immunostaining nei punti successivi. Tuttavia, mantenere i neuroni della dopamina in coltura per più di 15 giorni richiede estrema cura, e potrebbe indurre ulteriore variazione a causa di cellule che non riescono a sopravvivere indipendentemente dall'inoculazione PFF. Inoltre, colture più estese complicano i programmi di trattamento farmacologico. Molti composti hanno limitato o non mal caratterizzato stabilità nel mezzo di coltura cellulare, e il rifornimento di un farmaco non è banale perché lo scambio completo di mezzo compromette la sopravvivenza delle culture della dopamina.
La fosforolante della synucleina a Ser129 è costantemente riportata nei modelli basati sul PFF dell'aggregazione z-sinucleina e colocalizza con marcatori di misfolding e aggregazione come Thioflavin S, ubiquitina o anticorpi specifici della conformazione11,12. Nelle nostre mani, l'immunostaining per pS129-zsyn dà anche il segnale più forte con lo sfondo più basso ed è più semplice da analizzare, dando risultati robusti quando più trattamenti vengono sottoposti a screening. È importante sottolineare che l'immunostaining con anticorpo pS129-ssyn non rileva i PFF che rimangono al di fuori delle cellule, riducendo significativamente lo sfondo. Tuttavia, è importante ricordare che la fosfororylazione Ser129 è probabilmente uno dei primi processi collegati al misfolding di synuclein e potrebbe essere regolata in modo diverso in condizioni specifiche. Pertanto, tutti i risultati che mostrano effetti positivi su pS129-ssyn dovrebbero essere confermati da altri marcatori.
L'analisi statistica dovrebbe essere adattata in base alla progettazione sperimentale. È essenziale effettuare esperimenti in almeno tre repliche biologiche indipendenti (cioè colture neuronali primarie separate). Queste repliche devono essere placcate su piastre diverse e trattate in modo indipendente. Analizziamo i dati ottenuti da repliche su diverse piastre con design a blocchi casuali ANOVA37 per tener conto dell'abbinamento dei dati per diverse piastre sperimentali.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Prof. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da 3i-Rigeneration da parte di Business Finland (Agenzia finlandese di finanziamento per l'innovazione), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Fondazione Sigrid Juselius e i fondi statutari dell'Istituto Maj di Farmacologia, PAS, Polonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
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