Summary
هنا, نقدم بروتوكول مفصل لدراسة تراكم العصبية α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين الماوس الأولية. يتم حث مجاميع α-synuclein الفوسفورية في الخلايا العصبية مع تشكيلها قبل تشكيل α-synuclein فيبريلات. التصوير الآلي للخلايا التي تحمل اسم مناعيا وتحليل الصور غير متحيزة جعل هذا البروتوكول قوية مناسبة للفرز متوسط إلى عالي الإنتاجية من الأدوية التي تمنع تراكم α-synuclein.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج قوي ومستنسخ من تراكم α-synuclein في الخلايا العصبية الأولية. جنبا إلى جنب مع المناعة وتحليل الصور الآلي غير متحيزة, هذا النموذج يسمح لتحليل آثار المخدرات والتلاعب الجيني على تجميع α-synuclein في الثقافات العصبية. الثقافات الأولية في منتصف الفقرات توفير مصدر موثوق به من الخلايا العصبية الدوبامين الجنينية حسن النية. في هذا البروتوكول ، يتم محاكاة علم الأنسجة المميز لمرض باركنسون ، أجسام ليوي (LB) ، بإضافة α-synuclein pre-synuclein fibrils (PFFs) مباشرة إلى وسائط الثقافة العصبية. يتم الكشف عن تراكم الفوسفورية الذاتية α-synuclein في سوما من الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق المناعة بالفعل في 7 أيام بعد إضافة PFF. ظروف زراعة الخلايا في المختبر مناسبة أيضاً لتطبيق وتقييم العلاجات التي تمنع تراكم α-سينوكلين، مثل أدوية الجزيئات الصغيرة والعوامل العصبية، وكذلك ناقلات فيروس العدس للتلاعب الجيني (على سبيل المثال، مع CRISPR/Cas9). زراعة الخلايا العصبية في 96 لوحات جيدا يزيد من قوة وقوة الاجهزة التجريبية. في نهاية التجربة ، يتم تثبيت الخلايا مع ما قبل الشكل للكيمياء المناعية والتصوير المجهري للفلوريس. يتم الحصول على صور الفلورس المتعدد الأطياف عن طريق المجهر الآلي لـ 96 لوحة من الآبار. يتم تحديد كمية هذه البيانات (على سبيل المثال، عد عدد الخلايا العصبية التي تحتوي على الدوبامين phospho-α-synuclein في البئر) مع استخدام البرمجيات الحرة التي توفر منصة لتحليل النمط الظاهري عالي المحتوى غير المتحيزة. PFF التي يسببها النمذجة من الفوسفورية α-synuclein تراكم في الخلايا العصبية الدوبامين الأولية يوفر أداة موثوقة لدراسة الآليات الأساسية الوساطة تشكيل والقضاء على إدراجات α-synuclein, مع فرصة لفحص المخدرات عالية الإنتاجية وتحليل الظاهري الخلوية.
Introduction
مرض باركنسون (PD) هو اضطراب عصبي يتميز بوفاة الخلايا العصبية الدوبامين في منتصف القرن في النيغرا substantia (SN) ، وفقدان لاحق لنبرة الدوبامين في العقد القاعدية ، وما يترتب على ذلك من ضعفات حركية1،2. وهناك سمة الهدولوجية الرئيسية في أدمغة مرضى PD هي البروتين داخل الخلايا / مجاميع الدهون الموجودة في سوما الخلايا العصبية، وتسمى أجسام ليوي (LB)، أو في نيوريت، Lewy neurites (LN)، والمعروفة مجتمعة باسم علم الأمراض ليوي3. يبدو أن علم الأمراض الليو في الدماغ يتقدم مع تقدم PD يشبه انتشار العوامل المسببة للأمراض من خلال الاتصالات العصبية. تم العثور على وفرة علم الأمراض ليوي في الخلايا العصبية الدوبامين في SN والخلايا في مناطق أخرى تتأثر بالانكاد العصبي4. ومع ذلك ، أثناء تطور المرض ، وانتشار وبداية تراكم البروتين لا ترتبط دائما مع الموت العصبي والمساهمة الدقيقة من علم الأمراض ليوي في وفاة الخلايا العصبية لا يزال غير واضح5.
وقد ثبت LB وLN أن تتكون من مكونات membranous والبروتينية3. الأول هي شظايا الغشاء، والهياكل الحويظة (ربما lysosomes و autophagosomes) والميتوكوندريا3. هذا الأخير يتكون من ما لا يقل عن 300 بروتينات مختلفة6. أظهرت دراسة مميزة أجراها Spillantini وآخرون7 أن المكون الرئيسي للبروتين في علم الأمراض الليو هو α-synuclein. أعرب عن ذلك في الخلايا العصبية، ويرتبط مع الانصهار الغشاء والافراج عن الناقل العصبي، α-synuclein في علم الأمراض ليوي موجود في الغالب في شكل مغلوط، فيبرويل اميلويد، الجزء الأكبر منها هو الفوسفور في Ser129 (pS129-αsyn)4،,8.
الأهم من ذلك، كما ثبت أنه نظرا لخصائصه مثل بريون، misfolded α-synuclein قد يكون لها دور السبب في تشكيل علم الأمراض ليوي4. وقد أظهرت خصائص مثل البريون من α-synuclein misfolded مع كل من مستخلصات منتصف البراين من المرضى وإعداد exogenousously α-synuclein فيبريلس preformed (PFFs) للحث على α-synuclein مجاميع في الخلايا العصبية في الثقافة وفي vivo9,10. PFFs تقديم نموذج موثوق بها وقوية لدراسة تطور علم الأمراض α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين. عندما يتم تطبيق PFFs على الخلايا العصبية الأولية المستزرعة أو حقنها في دماغ الحيوان ، فإنها تؤدي إلى تكوين تضمينات تحتوي على α-synuclein في نيوريت وسوماالخلية 11 التي تُلخِص العديد من الميزات التي شوهدت في علم الأمراض اللويلي. إدراجات لوحظ هي المنظفات غير قابلة للذوبان في تريتون X، في كل مكان، ملطخة صبغة الأميلويد محددة Thioflavin S، وتحتوي على α-synuclein hyperphosphorylated في Ser12911،12. الأهم من ذلك، هذه التضمينات لا تتشكل في α-سينوكلين خروج المغلوب الحيوانات11، مما يدل على الاعتماد على تشكيلها على α-synuclein الذاتية.
ومع ذلك، فمن الصعب أن تقارن مباشرة إدراجات الناجمة عن PFF وعلم الأمراض ليوي وجدت في مرضى PD لأن LBs الإنسان وLNs غير متجانسة للغاية3. قد يكون سبب عدم تجانس علم Lewy Lewy المُلاحظ هو مراحل مختلفة من التكوين أو الموقع التشريحي المختلف أو الاختلافات في تكوين α-synuclein المُختَلَف بشكل خاطئ، مما يؤدي إلى بدء عملية التجميع. قد تؤثر نفس العوامل على التضمينات الإيجابية PS129-αsyn الناتجة عن PFF. في الواقع، في الآونة الأخيرة ثبت أن PFF التي يسببها PS129-αsyn إدراج إيجابية في الثقافات العصبية الأولية تمثل المراحل المبكرة جدا من الأمراض التي يمكن أن تنضج إلى هياكل تشبه بشكل وثيق LB بعد فترة حضانة طويلة12،13.
النمذجة في وقت مبكر من الانتشار وتراكم α-synuclein مغلوطة مع PFFs قيمة لتطوير المخدرات، كما يعتبر انتشار علم الأمراض ليوي واحدة من علامات المرض في مرحلة مبكرة. لذلك، قد تكون العلاجات الوقائية التجميعية واعدة لوقف أو إبطاء تطور PD في المراحل المبكرة جدًا. العديد من التجارب السريرية التي تهدف إلى إبطاء أو وقف تراكم α-synuclein جارية14. للمرضى في مرحلة لاحقة, زرع السلف العصبية الدوبامين يمكن أن يكون أفضل علاج بديل15. ومع ذلك ، تم توثيق علم الأمراض Lewy في الخلايا العصبية الجنينية المزروعة خلال تحليل ما بعد الوفاة لأدمغة المرضى PD16،17، مما يشير أيضًا إلى الحاجة إلى الحماية ضد تراكم α-synuclein.
في المختبر، ومن المعروف α-synuclein PFFs للحث على التجميع في خطوط الخلايا الخالدة، أو أكثر شيوعا، في الحصون الأساسية القوارض أو الخلايا العصبية القشرية. لا أحد من هذه هي قريبة من تلخيص الخلايا العصبية الدوبامين10. زراعة هذه الخلايا العصبية يتطلب الطلاء الكثيفة من أعداد معينة من الخلايا العصبية في المختبر18. لتحقيق كثافة عالية الطلاء مع المواد المحدودة (على سبيل المثال، الخلايا العصبية الدوبامين الأولية)، ويستخدم عادة طريقة زراعة جزيرة صغيرة. في زراعة جزيرة صغيرة، مطلية في البداية الخلايا في قطرة صغيرة من المتوسطة (عادة ما تكون صغيرة قليلة) أبقى معا من قبل التوتر السطحي في وسط بئر كبير18. بعد إرفاق الخلايا العصبية ، يتم تعبئة البئر بأكمله مع الوسط في حين أن الخلايا تظل محصورة في كثافة عالية في منطقة الطلاء الصغيرة. وبالإضافة إلى تحقيق كثافة عالية في الطلاء، تمنع الجزر الصغيرة أيضاً الطلاء بالقرب من حواف الآبار، حيث تكثر الاختلافات في كثافة الخلايا والبقاء على قيد الحياة. وغالبا ما تستخدم الجزر الصغيرة في آبار أو أطباق كبيرة نسبيا؛ ومع ذلك، إنشاء الثقافات العصبية midbrain في الجزر الصغيرة في 96 شكل لوحة جيدا تمكن من دراسة علم الأمراض ليوي في الخلايا العصبية الدوبامين حسن النية مع طاقة متوسطة إلى عالية الإنتاجية. في التجارب المختبرية مع هذه الخلايا العصبية سمح لنا لاكتشاف الخلية الدبقية المشتقة من عامل العصبية (GDNF)، الذي يعزز بقاء الخلايا العصبية الناضجة في المختبر وفي الجسم الحي19،20،21،22 ويمنع أيضا تشكيل مجاميع α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين23. الإنسان المريض الناجم عن الخلايا العصبية الدوبامين المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة تشكل نموذجا أكثر دقة بسبب أصلها البشري والبقاء على قيد الحياة أطول في المختبر. ومع ذلك ، لوحظ تحريض أمراض α-synuclein في الخلايا العصبية البشرية بعد عدة أشهر ، مقارنة بأسبوع في الخلايا العصبية الجنينية الماوس ، و / أو مع الضغوطات المتعددة (على سبيل المثال ، مزيج من α-synuclein overexpression و PFFs)24،25. وبالإضافة إلى ذلك, صيانة الخلايا العصبية الدوبامين الإنسان هو أكثر تكلفة وشاقة بالمقارنة مع الخلايا العصبية الجنينية الأولية, الحد أساسا استخدامها في تطبيقات عالية الإنتاجية.
وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل الثقافات العصبية الدوبامين الأولية وراثيا (على سبيل المثال، مع CRISPR/Cas9) و / أو تعامل مع العوامل الدوائية23. وهي تشكل منصة سريعة وقابلة للاستنساخ لتطبيقات مثل تشريح المسار الجزيئي وفحص مكتبة الأدوية. وعلى الرغم من أنه يمكن الحصول على مواد محدودة من هذه الثقافات، فإنه لا يزال من الممكن إجراء تحليلات صغيرة الحجم للجينوم/البروتوميات. زراعة الخلايا العصبية الأولية في 96 شكل جيدا هو أفضل لتقنيات المناعة والمجهر الفلورسي، تليها تحليل النمط الظاهري عالية المحتوى. ويمكن تحويل الصور الفلورية متعددة الأطياف المستمدة من التصوير الآلي لـ 96 لوحة بئر إلى نتائج كمية (على سبيل المثال، عدد الخلايا العصبية المحتوية على الـ LB في البئر). ويمكن إجراء مثل هذه التحليلات مع البرمجيات الحرة، مثل CellProfiler26،27. عموما، الثقافات المتوسطة الجنينية الأولية مطلية في 96 لوحات جيدا توفير منصة قوية وفعالة لدراسة الخلايا العصبية الدوبامين وتجميع α-synuclein مع فرصة لفحص النمط الظاهري عالية الإنتاجية.
Protocol
وقد وافق المجلس الوطني الفنلندي للتجارب على الحيوانات على جميع التجارب على الحيوانات، وأجريت وفقا للتشريع الأوروبي المتعلق بحماية الحيوانات المستخدمة في الأغراض العلمية.
1- الإعداد
- إعداد الدوبامين وسط الخلايا العصبية (DPM) مع 0.46٪ د-الجلوكوز, 1% L-الجلوتامين, 1% N2, 0.2% بريموسين, أكملت مع DMEM/F12. تصفية DPM بعد خلط المكونات. تخزين DPM في 4 °C ودافئة كل aliquot مرة واحدة فقط.
ملاحظة: يجب أن لا تحتوي DPM GDNF، كما أنها سوف تقلل من تراكم α-سينوكلين في الخلايا العصبية23. - تحضير الماصات الزجاجية السيليكونية التي هي مبيدة للماء للغاية، وبالتالي تقليل المرفق إلى السطح وفقدان الخلايا أثناء التعامل الأولي مع الخلايا العصبية الجنينية.
- إضافة 10 مل من السائل السيليكون إلى 1 لتر من الماء المقطر ويخلط عن طريق تحريك في وعاء 2 L. اتركي الماصات الزجاجية مغمورة في محلول السيليكون لمدة 15 دقيقة.
- شطف الماصات 3-5x مع الماء المقطر. جففي الماصات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT) أو لمدة 1-2 ساعة عند مساحة مُعقمة ساخنة 100-120 درجة مئوية لتسريع التجفيف.
- تعقيم الماصات عن طريق autoclaving القياسية في كيس أوتوكلاف مختومة.
- إعداد بولي-L-ornithine (PO) المغلفة 96 لوحات جيدا مع قيعان شفافة عن طريق إضافة 60 ميكرولتر من حل PO في الآبار الوسطى من لوحة 96 جيدا لاستخدامها في البذر من الخلايا العصبية، وترك صف واحد على الأقل / عمود من الآبار في حواف لوحة لتجنب آثار حافة. حافظ على اللوحة المطلية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أو 4 ساعات في RT.
- قبل طلاء الخلايا، يُشعّر بو تماماً ويغسل الخلايا ثلاث مرات بـ 100 ميكرولتر من 1x PBS. استلهم 1x PBS من الآبار وإبقاء غطاء اللوحة مفتوحًا للتجفيف الكامل.
ملاحظة: من الممكن تجميع البريد المستخدم وتصفية لإعادة استخدامها. يمكن تكرار ذلك مرتين بالنسبة لنفس حل PO. - أضف 50 ميكرولتر من DPM إلى الآبار المغلفة سابقًا. استلهم DPM من الآبار مع طرف بلاستيكي 100 ميكرولتر وفي نفس الوقت خدش الجزء السفلي من البئر مع حركات دائرية لإزالة الطلاء في محيط كل بئر. وتبقى جزيرة مغلفة بـ PO في وسط البئر.
- تحت غطاء محرك السيارة، إضافة 10 ميكرولتر من DPM إلى وسط كل جزيرة المغلفة لإنشاء الجزر الصغيرة.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بلوحة مع جزر صغيرة مغطاة DPM تحت غطاء تدفق الفارني لمدة 1-2 ساعة أثناء عزل الخلايا.
2. عزل الطابق منتصف منتصف البطن من الأجنة الماوس E13.5
ملاحظة: الرجوع إلى الشكل 1 لخطوات تشريح أرضية منتصف القرن.
- قبل تشريح، ملء طبق بيتري 10 سم مع العازلة Dulbecco والاحتفاظ بها على الجليد.
- القتل الرحيم الماوس الإناث الحوامل E13.5 وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة. ضع مسطحة الماوس على ظهره ورذاذ الجسم الأمامي مع الإيثانول 70٪. ارفع الجلد فوق الرحم بالملقط واصنع شقًا بمقص جراحي لفضح الرحم.
- إزالة بعناية الرحم ووضعها في طبق بيتري أعدت سابقا على الجليد.
- باستخدام مقص جراحي تحت غطاء الرأس في RT، قم بإزالة الأجنة بعناية من الرحم. إزالة جميع بقايا المشيمة من الأجنة مع ملقط ووضعها في طبق جديد بيتري 10 سم مليئة العازلة دولبيككو.
- باستخدام ملقط تشريح أو الإبر، وقطع hindquarter من الرأس من الأماكن التي تحمل علامة السهام السوداء في الشكل 1A. خذ قطعة قطع بعيدا عن بقية الجنين (الشكل 1B).
- ضع الجزء الخلفي من قطعة القطع نحو المراقب (الشكل 1C) وقطعها بلطف مفتوحة من السد إلى الجمجمة (الشكل 1D). من 0.5 مم تحت فتحة الجمجمة، وقطع 2 مم2-3 مم2 منطقة، كما هو موضح في الشكل 1E.
- جمع الطابق منتصف منتصف البطن (انظر الشكل 1F)في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge فارغة. الحفاظ على أنبوب microcentrifuge على الجليد حتى يتم جمع جميع الأرضيات في منتصف الفقرات فيه.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن جمع أرضيات منتصف القرنية مع ميكروبيبت 1 مل بعد تشريح جميع أدمغة الجنين.
الشكل 1: تشريح أرضية منتصف القرن من جنين الفأر E13.5. (أ) يتم وضع علامة على مواقع القطع في الـ hindquarter من الرأس بسهام سوداء وخطوط بيضاء متقطعة. (ب) تم إزالة القطعة من بقية الجنين. القطعة التي تمت إزالتها محاطة بدائرة. (C) تحولت قطعة 90 درجة لمواجهة الخلفية نحو المراقب. (D) تم فتح القطعة من الأسهم السوداء، من الكودال إلى الجمجمة (مع وضع علامة بخط أبيض متقطع). (E) من 0.5 مم إلى 1 مم تحت الفتحة، تم قطع منطقة 2 مم2-4 مم 2 (مع وضع علامات على خطوط سوداء). (F) تم عزل أرضية منتصف البطن (مع وضع علامة بمربع أسود متقطع). أشرطة المقياس = 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. تأسيس الثقافات الأولية في منتصف الجنين من الأجنة الماوس E13.5 في 96 شكل لوحة جيدا
- بعد جمع أرضيات منتصف القرن من جميع الأجنة في نفس أنبوب 1.5 مل، وإزالة العازلة Dulbecco المتبقية وغسل قطع الأنسجة ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من كاليفورنيا2+، Mg2 +خالية هانك حل الملح المتوازن (HBSS).
- إزالة HBSS وإضافة 500 μL من 0.5٪ التربسين إلى الأنبوب. احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أثناء الحضانة، دافئ 1.5 مل من مصل الأبقار الجنين (FBS) في 37 درجة مئوية، إضافة 30 ميكرولتر من DNase I إلى FBS، ومزيج. أيضا، النار البولندية غيض من ماصة زجاجية سيليكونية. تأكد من أن الثقب لا يحتوي على حواف حادة ويقاس حجم طرف ميكروبليت 1 مل.
ملاحظة: كبديل، يمكن استخدام طرف التصاق منخفض 1 مل ميكروبليت للتاثير. ومع ذلك، يبدو أن الماصات الزجاجية السيليكونية تعطي أفضل النتائج. - بمجرد انتهاء الحضانة في الخطوة 3.2، أضف 500 ميكرولتر من مزيج FBS/DNase إلى الأنسجة المهضومة جزئيًا. استخدام ماصة الزجاج لtriturate الأنسجة في مزيج FBS / التربسين. تُعيد التورّت حتى تتفكك الأنسجة إلى جزيئات صغيرة بالكاد مرئية. تجنب الفقاعات أثناء التثلال.
- دع الجسيمات المتبقية تترسب في قاع أنبوب الطرد الدقيق عن طريق الجاذبية. دون pipetting الترسب في الجزء السفلي، وجمع افرا في أنبوب خاوي خاوي 15 مل مخروطية.
- تخفيف FBS / DNase الأول من الخطوة 3.3 (98:2) مع 1000 μL من HBSS للحصول على FBS / DNase - I / HBSS (49:1:50). مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. أضف 1000 ميكرولتر من المزيج الجديد إلى جزيئات بقايا في أنبوب microcentrifuge. إعادة التورات مرة أخرى وتكرار الخطوة 3.5.
- كرر الخطوة السابقة مرة أخرى لاستخدام كافة FBS/DNase I/HBSS (49:1:50).
- مرة واحدة يتم جمع كل من فوق أنبوب داخل 15 مل (من الخطوات 3.5، 3.7، و 3.8)، واستخدام جهاز طرد مركزي الطاولة لتدور أسفل supernatant (~ 3 مل) في 100 × ز،لمدة 5 دقائق. إزالة ناظر دون لمس الخلايا بيليه في الجزء السفلي.
- غسل بيليه الخلية بإضافة 2 مل من DPM إلى الأنبوب وتدور عليه في 100 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة عظمى وتكرار الغسيل 2x لتقليل الحطام في الخلايا بيليه.
ملاحظة: دائما استخدام الطازجة، DPM ساخنة للخلايا العصبية مثقف. بالنسبة لخطوات الغسيل ، لا يجب أن تكون DPM طازجة ، ولكن يجب أن تكون مُحذرة مسبقًا إلى 37 درجة مئوية. - تخفيف الخلايا مع الطازجة، دافئ DPM ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge. تعتمد كمية DPM لتخفيفها على عدد الأجنة المستخدمة في تشريح الأنسجة. على سبيل المثال، استخدم 150 ميكرولتر من DPM لتمييع الخلايا التي تم الحصول عليها من عشرة أجنة.
- نقل 10 ميكرولتر من الخلايا في DPM إلى أنبوب microcentrifuge. امزجها مع 10 ميكرولتر من 0.4% من البقعة الزرقاء Trypan. عد حية (أي، Trypan الأزرق السلبية) الخلايا باستخدام قياس الهيموزيت أو عداد خلية الآلي.
ملاحظة: استخدام 30,000 الخلايا للطلاء في بئر للحصول على ~ 1,000 الخلايا العصبية الدوبامين في بئر. إذا كانت كثافة الخلية أعلى من ~ 30000 خلية لكل 6 ميكرولتر، قم بزيادة تخفيف الخلايا مع DPM قبل الطلاء بحيث لا يقل حجم البذر عن 6 ميكرولتر. - دون لمس الجزء السفلي من الآبار، وإزالة DPM من الجزر الصغيرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.6.
- من أجل الحصول على كثافة الخلايا المستنسخة في كل بئر ، اخلط الخلايا عن طريق الأنابيب اللطيفة قبل الطلاء في البئر. مع ميكروب صغير 1-10 ميكرولتر، أضف 6 ميكرولتر من الخلايا إلى وسط البئر، في موقع كل جزيرة صغيرة سابقة.
- ملء الآبار الفارغة على حواف لوحة مع 150 ميكرولتر من الماء أو 1X برنامج تلفزيوني لتقليل التبخر من الآبار التي تحتوي على الثقافات العصبية. احتضان لوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 ل 1 ساعة.
- بعد 1 ساعة، وإزالة لوحة من الحاضنة، إضافة 100 ميكرولتر من DPM في كل بئر مع الخلايا ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
- بعد يومين من الطلاء (يوم في المختبر 2، أو DIV2)، قم بإزالة 25 ميكرولتر وأضف 75 ميكرولتر من DPM الطازجة لإضفاء حجم الوسائط النهائي على 150 ميكرولتر وتجنب التبخر قدر الإمكان.
- قم بـتدّيل نصف الوسيط مع DPM الطازج (أي، إزالة 75 ميكرولتر وإضافة 75 ميكرولتر DPM جديدة) في DIV5. لا تقم بإجراء أية تغييرات الوسائط بعد DIV5.
4. التعريفي من مجاميع α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية عن طريق البذر مع الفيبريلات preformed
وقد تم وصف بروتوكولات للحصول على والتحقق من PFFs بدقة ومناقشتها في العديد من المنشورات الأخيرة11,28,29,30. بعد أي عمل مع PFFs، قم بتنظيف غطاء الرأس أو أي معدات قد تكون اتصلت بفلف إف إف مع 1% من بيانات السلامة، ثم مع 70% إيثانول31.
- قبل التجربة، تمييع PFFs مع 1x PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكروغرام/مل. سونيكات PFFs المخفف في أنابيب microcentrifuge مع sonicator حمام في الطاقة العالية مع تبريد حمام الماء في 4 درجة مئوية لمدة 10 دورات، 30 ق ON / 30 ق قبالة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تكون sonicated ال fibrils بشكل صحيح لتوليد شظايا ~ 50 نانومتر طويلة. حجم PFFs سونيكاتيد يمكن قياسها مباشرة من نقل صور المجهر الإلكتروني من PFFs ملطخة كما وصفها باترسونوآخرون. يمكن تحقيق سونيكيشن كما هو موضح أعلاه في صوتة حمام عالية الطاقة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام sonicator تلميح30. يمكن تخزين PFFs Sonicated في -80 درجة مئوية في aliquots الصغيرة لتجنب دورات تجميد / ذوبان متعددة. - في DIV8، يضاف 3.75 ميكرولتر من 100 ميكروغرام/مل من PFFs لكل بئر إلى 150 ميكرولتر من المتوسط في البئر إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكروغرام/مل. استخدم نفس المقدار من 1x PBS لمجموعة التحكم.
- إعداد 4٪ شبهformaldehyde (PFA) في 1x PBS وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية. للقيام بذلك، اتبع الخطوات التالية.
ملاحظة: PFA هو السامة; ارتداء قناع وقفازات أثناء التحضير، والعمل دائما تحت غطاء محرك السيارة، والتخلص من جميع النفايات PFA الصلبة والسائلة وفقا لتوجيهات المؤسسة.- دافئة 500 مل من 1X PBS في وعاء 1 لتر. وضع شريط اثارة في السفينة ووضع السفينة على مُنقل مغناطيسي مع وظيفة التدفئة. ضبط درجة الحرارة بين 40-60 درجة مئوية لمنع الغليان مع الحفاظ على الحل دافئ.
- قياس 20 غرام من مسحوق PFA تحت غطاء محرك السيارة في حاوية قياس البلاستيك المتاح. بعناية، إضافة مسحوق PFA في السفينة مليئة 1X PBS. ابدأ بإثارة الحل.
- إضافة 200 ميكرولتر من 5 M هيدروكسيد الصوديوم في الحل والاستمرار في اثارة لمدة 15 دقيقة ~، حتى PFA يذوب تماما.
- بعد الحل يبدو متجانسا، إضافة 168 ميكرولتر من كلوريد الهيدروجين 5 م لتحقيق التوازن بين pH إلى ~ 7. تحقق من pH مع شرائط مؤشر pH ثابتة اللون القابل للتصرف.
- إزالة السفينة من سخان والسماح لها أن تبرد إلى RT. تصفية الحل و aliquot للتخزين في -20 درجة مئوية. ذوبان aliquots في RT قبل استخدام ولا refreeze بعد ذلك.
- على DIV15، إزالة جميع وسائل الإعلام من الآبار عن طريق الأنابيب. إضافة 50 μL من 4٪ PFA إلى كل بئر لإصلاح الخلايا واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. بعد الحضانة إزالة PFA من الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر لغسل الخلايا. إزالة 1X برنامج تلفزيوني وغسل 2X أكثر.
- اترك 100 ميكرولتر من 1x PBS في كل بئر لتجنب التجفيف. تخزين لوحة في 4 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ المناعة.
5. تلوين المناعية والتصوير الآلي للخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية في 96 لوحات جيدا
- إزالة 1X PBS و Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 0.2٪ تريتون X-100 في PBS (PBST) في البئر والاحتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
- إزالة PBST وإضافة 50 ميكرولتر من 5٪ مصل الحصان العادي (NHS) في بئر إلى PBST. لمنع نشاط المستضد غير المحدد، احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية ضد TH و pS129-αsyn (1:2,000) في 5٪ NHS في PBST. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة لكل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر لغسل الخلايا. إزالة 1x PBS وتكرار الغسيل 2x.
- لمنع تبييض جزيئات الفلورسنت، ابدأ العمل في ظل ظروف الإضاءة الدنيا. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المسماة الفلورسنت (1:400) في PBST. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر واحتضان في RT لمدة 1 ساعة.
- إزالة حل الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر لغسل الخلايا. إزالة 1x PBS وتكرار الغسيل 2x.
- إزالة 1X برنامج تلفزيوني، إضافة 50 ميكرولتر من 200 نانوغرام/مل 4'، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في بئر لطخة نوى الخلايا المستزرعة واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
- غسل الخلايا 3x مع 100 μL من 1X PBS لمدة 5 دقائق لكل من. احتفظ بـ 100 ميكرولتر من 1x PBS في كل بئر بعد الغسيل الأخير. غطي الطبق بورق الألومنيوم واحفظه عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.
- صورة الخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية في لوحة عرض جيدا 96 مع ماسح لوحة عالية المحتوى (انظر جدول المواد)مزودة هدف 10x.
- ضبط الإعدادات بناء على مواصفات لوحة 96 جيدا، مثل نوع لوحة، الشركة المصنعة، حجم، المسافة بين الآبار، وكذلك نوع وكمية المتوسطة.
- حدد منطقة التصوير في البئر لتغطية جميع الخلايا في جزيرة صغيرة. اختر مثالاً جيداً لضبط التركيز البؤري التلقائي. إسناد التركيز الأولي على DAPI.
- معايرة وقت الاقتناء لكل قناة فلورية، بناءً على شدة تلطيخ الآبار المتحكمة. ضبط المعلمات بحيث في PFF- التعامل مع آبار التحكم يمكن للمرء أن يميز بوضوح خلايا الدوبامين التي تؤوي مجاميع pS129-αsyn في الخلية سوما السماح لا لبس فيه من الكم pS129-αsyn إيجابية وpS129-αsyn الخلايا السلبية.
ملاحظة: يجب أن لا يكون لدى الآبار التي لا تحتوي على PFFs أي تلطيخ pS129-αsyn; ولذلك، يمكن استخدام هذه الآبار كتحكم سلبي لضبط شدة pS129-αsyn. - صورة جميع الآبار المختارة مع هدف 10x في وقت واحد لجميع القنوات مع لطخة المناعة مع نفس المعلمات بالضبط.
- اختياريا، التسمية α-synuclein إدراج في مجموعة فرعية من الآبار مع الأجسام المضادة محددة لالخيوط α-سينوكلين لتأكيد أن التغيرات في عدد من إدراج pS129-αsyn إيجابية تعكس الانخفاض في تراكم البروتين بدلا من تثبيط الفسفور أو dephosphorylation pS129-αsyn.
- كرر الخطوة 5.3 استبدال pS129-αsyn الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة α-synuclein (1:2,000). صورة المصبون تجميع α-synuclein كما هو الحال في الخطوة 5.13.
6. تحليل الصور عالية المحتوى
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة مع برنامج الوصول المفتوح CellProfiler الإصدار 3.15 و محلل CellProfiler الإصدار 2.2.1. 27,32. ومع ذلك ، مع بعض الخبرة ، يمكن تعيين خطوط أنابيب تحليل الصور المماثلة في إصدار مختلف أو برامج مماثلة. يرجى الرجوع إلى صفحة البرنامج للحصول على شرح مفصل (انظر جدول المواد).
- تحميل وتثبيت CellProfiler و CellProfiler محلل البرمجيات.
- فتح CellProfiler. تحديد ملف| استيراد| خط أنابيب من الملف وتحميل خط أنابيب المثال المقدمة، TH_LB_V1.cpipe ملف (انظر الملفات التكميلية).
ملاحظة: تتطلب خطوط الأنابيب المثال تعديلات معينة استناداً إلى خصائص الصور المكتسبة ومنصة الحصول على الصورة. Example_Imagesيمكن استخدامها في التجربة الأولية للبرنامج. - تحميل الصور ليتم تحليلها عن طريق سحبها إلى وحدة الصور. استخدم خيارات التصفية لتحديد ملفات الصور فقط من المجلد الذي تم تحميله.
- استخدم وحدة بيانات التعريف لاستخراج معلومات ملف الصورة بشكل جيد ومجال الرؤية والقناة. انقر على رمز العدسة المكبرة وأدخل التعبير العادي لاستخراج لوحة، حسنا، موقع التصوير ومعلومات القناة من أسماء الملفات.
ملاحظة: سوف يعتمد التعبير العادي على اصطلاح تسمية الملف من مجهر لوحة. يؤدي النقر فوق علامة الاستفهام إلى جانب العدسة المكبرة إلى توفير تفاصيل عن بناء الجملة. - ضمن الوحدة النمطية NamesAndTypes، حدد أرقام القنوات الصحيحة لـ DAPI و TH و pS129-αsyn(القنوات الافتراضية 1 و2 و3). في وحدة المجموعات، حدد"لا".
- استخدم وحدة بيانات التعريف لاستخراج معلومات ملف الصورة بشكل جيد ومجال الرؤية والقناة. انقر على رمز العدسة المكبرة وأدخل التعبير العادي لاستخراج لوحة، حسنا، موقع التصوير ومعلومات القناة من أسماء الملفات.
- استخدام وحدات IdentifyPrimaryObjects لشريحة الخلايا العصبية الدوبامين باستخدام تلطيخ TH من سوما الخلية.
ملاحظة: تتطلب قيم معينة التحسين الأولي استناداً إلى كيفية لطخة اللوحات وصورتها. وإذا جهزت اللوحات اللاحقة على نحو مماثل، لا حاجة إلى أي تعديلات أخرى أو إلى حد أدنى. - استخدم وحدة MeasureObjectIntensity للحصول على معلومات كثافة الفلوريسين من قنوات TH و DAPI.
- استخدام MeasureObjectSizeShape وحدة لقياس حجم وشكل ملامح الجزء الدوبامين الخلايا العصبية.
- استخدام MeasureTexture وحدة لقياس معلومات ميزة الملمس من قناة TH من الخلايا العصبية الدوبامين مجزأة.
- استخدام وحدة نمطية ExportToDatabase لحفظ القياسات في قاعدة البيانات.
- اسم ملف قاعدة البيانات وفقا لمخطط تسمية التجربة (على سبيل المثال، ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). حدد إخراج مجلد لملف قاعدة البيانات. يمكن أن يكون ملف قاعدة البيانات عدة غيغابايت كبيرة وينبغي حفظها ويفضل في المجلد الأصل لملفات الصورة.
- فتح محلل CellProfiler وحدد ملف V1_THCells.خصائص التي تم إنشاؤها في الخطوة 6.8. فتح أدوات| المصنف.
- فرز الخلايا المجزأة إلى فئتين: إيجابية (أي، تقسيم بشكل صحيح الدوبامين الخلايا العصبية الهيئات) والسلبية (أي، تجزئة وتلطيخ التحف) انظر الشكل 2A و 2B.
- تعيين عدد الخلايا التي تم جلبها إلى 50 خلايا عشوائية وانقر فوق إحضار (هذا تحميل صور الخلايا مقطعة في الخطوة 6.4). قم بفرز 30 خلية على الأقل في كل سلة عن طريق سحبها إلى الحاوية المقابلة في أسفل الإطار. جلب المزيد من الخلايا حسب الضرورة.
- في القائمة المنسدلة حدد استخدام التعزيز السريع اللطيف مع 50 قواعد كحد أقصى وانقر على تدريب.
- تعيين "جلب" إلى 50 الخلايا الإيجابية واضغط جلب للحصول على الخلايا الإيجابية TH وفقا للمصنف (الشكل 2A). استخدم النتيجة التي تم الحصول عليها لتقييم جودة المصنف المدرب.
- كرر الخطوات 6.10.1-6.10.3، إضافة خلايا جديدة مثال لتدريب المصنف حتى تكون النتائج مرضية.
- تحديد خيارات متقدمة| تحرير القواعد... وفي إطار جديد حدد كل النص (Ctrl + a) ونسخها (Ctrl-c) إلى المفكرة (Ctrl-v). حفظ كملف TH_rules.txt.
ملاحظة: اعتماداً على كثافة الثقافة العصبية وجودة تلطيخ والتصوير، قد لا تكون هذه الخطوة ضرورية، كما أنه قد يكون من الممكن تعيين معلمات في الخطوة 6.4 إلى تجزئة الخلايا الإيجابية TH فقط مع دقة عالية. إذا كانت هذه هي الحالة، تشغيل TH_LB_V1.cpipe كامل غير ضروري، ويجب وضع المعلمات الصحيحة من وحدات IdentifyPrimaryObjects مباشرة في الوحدة النمطية المقابلة في TH_LB_V2.cpipe.
الشكل 2: القياس الكمي للخلايا العصبية الدوبامين و pS129-αsyn الخلايا العصبية الدوبامين إيجابية مع CellProfiler محلل البرمجيات على أساس DAPI, TH, وpS129-αsyn immunofluorescence. (أ) تم اختيار خلايا TH في سلة إيجابية بناء على تلطيخ DAPI (الأزرق) مع علامة مربع صغير في الخلية الأولى المحددة في الصورة وTH المحيطة تلطيخ (رمادي) في سوما. (ب) تم وضع القطع الأثرية غير الخلوية في سلة المهملات السلبية. (C) pS129-αsyn الخلايا العصبية TH إيجابية تم اختيارها على أساس إدراج كبير من pS129-αsyn تلطيخ (أحمر) ملحوظ مع مربع صغير في الخلية الأولى المختارة في الصورة، المحيطة النوى أو في soma الخلية. (D) تم وضع الخلايا TH دون مثل هذه pS129-αsyn إدراج في سلة السلبية. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- فتح CellProfiler وحدد ملف| استيراد| خط أنابيب من ملف وتحميل ملف TH_LB_V2.cpipe. كرر الخطوات 6.3-6.7. يجب أن يكون هذا الجزء من خط الأنابيب مطابقًا TH_LB_V1.cpipe.
- استخدام وحدة تصفيةObjects لتمرير الخلايا الإيجابية TH صحيح فقط لمزيد من التحليل.
- تعيين وضع التصفية لتحديد إلى القواعد. في قواعد أو اسم ملف مصنف حدد الملف TH_rules.txt تم إنشاؤه في الخطوة 6.10.5.
- تعيين حقل رقم الفئة إلى 1 إذا تم فرز الخلايا الإيجابية TH إلى أسفل الإطار الأيسر.
- استخدام MeasureObjectIntensity وحدة للحصول على معلومات كثافة الفلوريسين من قناة pS129-αsyn.
- استخدام وحدة MeasureTexture لقياس معلومات ميزة مادة من قناة TH من الخلايا المصفاة.
- استخدام MeasureObjectSizeShape وحدة لقياس حجم وشكل ملامح الخلايا المصفاة.
- استخدام وحدة نمطية ExportToDatabase لحفظ القياسات في قاعدة البيانات.
- اسم ملف قاعدة البيانات وفقا لمخطط تسمية التجربة (على سبيل المثال، ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). حدد مجلد الإخراج لملف قاعدة البيانات.
- افتح محلل CellProfiler وحدد ملف V2_THpos.خصائص.
- فرز الخلايا المجزأة إلى فئتين – pS129-αsyn إيجابية وpS129-αsyn الخلايا السلبية(الشكل 2C,D).
- تعيين عدد الخلايا التي تم جلبها إلى 50 خلايا عشوائية وانقر فوق إحضار (هذا تحميل صور الخلايا مجزأة في الخطوة 4). قم بفرز 30 خلية على الأقل في كل سلة عن طريق سحبها إلى الحاوية المقابلة في أسفل الإطار.
- في القائمة المنسدلة، حدد استخدام التعزيز السريع اللطيف مع 50 قاعدة كحد أقصى أو مصنفات الغابة العشوائية. انقر فوق تدريب.
- تعيين "جلب" إلى 50 الخلايا الإيجابية واضغط على جلب للحصول على pS129-αsyn الخلايا الإيجابية وفقا للتصنيف (الشكل 2C). تعيين "جلب" إلى 50 الخلايا السلبية واضغط على جلب للحصول على الخلايا السلبية pS129-αsyn وفقا للتصنيف (الشكل 2D). تقييم جودة المصنف المدرب.
- كرر الخطوات 6.17.2-6.17.4، إضافة خلايا جديدة مثال لتدريب المصنف حتى تكون النتائج مرضية.
- انقر فوق نقاط جميع للحصول على نتائج الجدول تلخيص عدد pS129-αsyn الخلايا العصبية الدوبامين إيجابية وسلبية في كل بئر.
Representative Results
بعد أيام قليلة من الطلاء (DIV1-DIV3)، تم إجراء المجهر في المجال الساطع لتقييم الصحة والانتشار المتجانس للخلايا المستزرعة، والتوحيد في هذه الظروف في الآبار الفردية (الشكل 3). انتشرت الخلايا المتوسطة المستزرعة بشكل متجانس داخل الجزيرة الصغيرة التي تم إنشاؤها قبل الطلاء (الشكل 3A،B). وكانت الخلايا العصبية الأولية استقرت على الأرض المغلفة متجانسة والإسقاطات العصبية المنشأة (الشكل 3B). وقد لوحظت كتلة صغيرة من الخلايا (قطر أصغر من 150 ميكرومتر) في البئر، وظهرت كمثال(الشكل 3C).
الشكل 3: بعد أيام قليلة من الطلاء (على سبيل المثال، DIV3)، لوحظت حالة الثقافات المتوسطة الأولية مع المجهر في الميدان الساطع. (أ)الخلايا المستزرعة تنتشر في منتصف البئر داخل جزيرة صغيرة مغلفة بـ PO مع دائرة نصف قطرها 4.4 مم تقريبًا (تظهر بسهام بيضاء) تم إنشاؤها بواسطة خدش PO من محيط بئر 1 مم تقريبًا (يظهر بالسهام السوداء). (ب)الخلايا العصبية الأولية المستزرعة تنتشر بشكل متجانس داخل المنطقة ولوحظت الإسقاطات العصبية (مع وضع علامة مع رؤوس السهام الحمراء). (C) تم وضع علامة على كتلة خلية بقطر أصغر من 150 ميكرومتر برؤوس ازرق. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كانت الثقافات الأولية للماوس منتصف القرن المثبطة بالمناعة مع الأجسام المضادة المضادة TH و PS129-αsyn وصورها مع المجهر الآلي بعد 15 يومًا في المختبر. قدمت الجزر الصغيرة المغلفة منطقة محظورة لمرفق الخلايا في وسط الآبار (الشكل 4A,B). وانتشرت الخلايا العصبية الدوبامين مناعي مع علامة TH حول جزيرة صغيرة في أحادية الطبقة، وفصلها عن بعضها البعض، دون أي تكتل(الشكل 4A' و 4B ').
الشكل 4: في DIV15، تم تحديد كمية 800-1000 خلايا الدوبامين من كل جزيرة صغيرة، مع أو بدون العلاج PFF. صور تمثيلية لثقافات منتصف القرنية الجنينية غير ملوثة بالأجسام المضادة TH و مضادة pS129-αsyn. (أ، أ'، '') السيطرة على الخلايا دون العلاج PFF. (ب، ب'، ب'') PFF- الخلايا المعالجة مع PS129-αsyn إدراج. (C)القياس الكمي لأعداد الخلايا الإيجابية TH في الآبار المعالجة بالمركبات (التحكم) أو PFFs أو PFFs مع 50 نانوغرام/مل GDNF. (D)القياس الكمي للمجاميع pS129-αsyn في الخلايا الإيجابية TH تعامل مع السيارة (التحكم)، PFFs، أو PFFs مع 50 نانوغرام / مل GDNF. تم حساب الأهمية الإحصائية مع تصميم كتلة عشوائية ANOVA. **p < 0.01, n = 4 لوحات فردية (المضاعفة البيولوجية), كل منها مع 3-6 آبار لكل مجموعة معالجة (تكرارات فنية). أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر لـ Aو B; 50 ميكرومتر لـ A'و B 25 ميكرومتر لـ A'، B'. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في حين أن الثقافات دون علاج PFF لم يكن لديها أي إشارة pS129- αsyn(الشكل 4A' و 4A')،الثقافات تعامل مع α-synuclein PFFs وضعت pS129-αsyn إدراجات إيجابية(الشكل 4B' و 4B'). في المختبر PFF العلاج لمدة 7 أيام لا يسبب أي انخفاض كبير في أعداد الخلايا العصبية TH إيجابية، مقارنة مع المجموعات التجريبية الأخرى(الشكل 4C). الثقافات المعالجة PFF كان سكانها ~ 40% من pS129-αsyn إيجابية TH-الخلايا العصبية الدوبامين إيجابية. العلاج مع السيطرة الإيجابية, GDNF, خفضت النسبة المئوية للخلايا العصبية الدوبامين إيجابية TH مع شوائب إيجابية pS129-αsyn (الشكل 4D, انظر أيضا البيانات الخام والصور المثال في الملفات التكميلية).
الملفات التكميلية: مثال على خطوط الأنابيب لتحليل الصور ذات المحتوى العالي مع CellProfiler وحزم برامج CellAnalyst، والصور على سبيل المثال، والبيانات الخام لـ Figure 4E، F. (1-9)Example_Images. افتح هذه الصور باستخدام ImageJ أو CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (الخطوات 6.2-6.8)،(12) TH_LB_V2.cpipe (الخطوات 6.11-6.18) الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
انتشار علم الأمراض ليوي، والتي pS129-αsyn هو المكون الرئيسي، هو السمة المميزة الهدولوجية من PD. وقف أو إبطاء تراكم pS129-αsyn تجميعها قد تبطئ انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين وتطور ألفا سينوكلين. ومع ذلك, فهم ميكانيكي لكيفية pS129-αsyn التجميع يساهم في زوال الخلايا العصبية الدوبامين لا يزال يتعين أن تنشأ. الأدلة من الدراسات بعد الوفاة البشرية على عينات الدماغ من المرضى في مراحل مختلفة من المرض، فضلا عن مراقبة إدراج PS129-αsyn الإيجابية في الخلايا العصبية الجنينية المزروعة يوحي بقوة انتشار علم الأمراض ليوي بين الخلايا16,17,33. وبالتالي، فإن انتشار pS129-αsyn الشبيه بريون تم تلخيصه مؤخرًا باستخدام PFFs α-synuclein9،10. إنشاء قوية, فعالة من حيث التكلفة, نسبيا عالية أو متوسطة الإنتاجية نموذج من PS129-αsyn انتشار وتراكم, على وجه التحديد في الخلايا العصبية الدوبامين, يمكن أن تسرع إلى حد كبير في البحث عن العلاجات الجديدة والمركبات تعديل هذه العملية.
لأن فقدان الخلايا العصبية الدوبامين هو السبب الرئيسي للاعراض الحركية في PD وهذه الخلايا تمتلك العديد من الخصائص الفريدة2,34,35, النمذجة من انتشار مثل بريون pS129-αsyn في الخلايا العصبية الدوبامين هو النوع الأكثر صلة من نموذج من منظور الترجمة. وقد وصفت البروتوكولات التي تستخدم الثقافات الجزرية الصغيرة من الخلايا العصبية في منتصف القرنية الجنينية على 4 لوحات جيدا وتكميم نصف آلي سابقا18. تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا مع 96 صفيحة بئر ويوفر إعدادًا أقل جهدًا للجزر الصغيرة ، مما يسمح بإعداد ما يصل إلى أربع لوحات تحتوي على 60 بئرًا لكل بئر من قبل باحث متمرس خلال يوم عمل واحد. زراعة الخلايا العصبية الدوبامين في 96 لوحات جيدا يسمح لاختبار المخدرات بكميات أقل وتمكن من معدلات تحويل عالية مع ناقلات فيروس العدس. من الممكن أيضًا الجمع بين العلاجات المختلفة لإجراء تجارب أكثر تعقيدًا.
قبل تطبيق أي علاجات (بما في ذلك PFFs)، يجب التحقق من جودة الاستزراع باستخدام المجهر مشرق المجال. إذا كان نظام المجهر لا يستخدم غرفة CO2 مع التدفئة، وينبغي عدم الاحتفاظ الخلايا خارج الحاضنة لأكثر من بضع دقائق، وذلك لأن الخلايا العصبية الرئيسية الدوبامين الماوس حساسة وشدد بسهولة. لنفس السبب، ينصح بأن التصوير الأول يجب أن يتم بعد 24 ساعة من الحضانة (بين DIV1-DIV3). وينبغي أن تظهر الخلايا على قيد الحياة مع الهيئات الخلية الحالية وتنتشر بشكل متجانس داخل الجزيرة الصغيرة. كانت الخلايا العصبية الأولية قد استقرت على الأرض المغلفة PO وبدأت في إنشاء إسقاطات عصبية. من الممكن ملاحظة كتلة صغيرة من الخلايا (أي قطر أصغر من 150-200 ميكرومتر) التي يمكن تشكيلها إذا لم يتم إجراء عملية التثابت بشكل صحيح أو كانت كثافة الطلاء أعلى من الموصى بها. هذه الكتل الصغيرة لن تؤثر على التجربة، إلا إذا كانت أكثر من عدد قليل في البئر و / أو أكبر. الخلايا المتجمعة تجعل من الصعب جدا تحديد علامات المناعة الكيميائية والخلايا الفردية أثناء تحليل الصورة. فمن الضروري تجنب مثل هذه الكتل عن طريق طلاء دقيق، triturating، والسيطرة على كثافة الطلاء. وإذا تعذر ملاحظة اتساق هذه الظروف في بعض الآبار، فلا تدرج هذه الآبار المعيبة في التجربة. وينبغي أن يتم هذا الاستبعاد قبل تنفيذ أي علاجات.
وعلاوة على ذلك، فإن استخدام 96 لوحة من الآبار يسمح باستخدام الماصات المتعددة القنوات أثناء إجراءات التلطيخ والتصور المباشر مع المجاهر التلقائية للصفائح، مما يزيد من الإنتاجية. ولا غنى عن استخدام القياس الآلي للصورة لتحليل البيانات من منصات التصوير عالية المحتوى. بالإضافة إلى القدرة على معالجة آلاف الصور التي تم الحصول عليها من كل تجربة ، فإنه يضمن تحديدًا كميًا غير متحيزًا مطابقًا لجميع مجموعات العلاج. ويستند سير العمل المقترح لتحليل الصورة على مبادئ بسيطة من تقسيم الخلايا العصبية الدوبامين, تصفية الخلايا المجزأة بشكل صحيح عن طريق التعلم الآلي تحت إشراف, وبعد ذلك quantification من الأنماط الظاهرية (pS129-αsyn إيجابية وpS129-αsyn السلبية), مرة أخرى من خلال التعلم الآلي تحت إشراف. على الرغم من أن العديد من النهج المختلفة لهذه المهمة يمكن تصورها, لقد وجدنا مزيج من تجزئة مع التعلم الآلي لتكون أقوى لثقافات الدوبامين بسبب كثافة الطلاء عالية, الأشكال المتنوعة من الخلايا العصبية الدوبامين, ووجود نيوريت ملطخة بقوة. تم تنفيذ خوارزمية تحليل الصور المقترحة في CellProfiler و CellProfiler المحلل ، مفتوحة المصدر ، متاحة بحرية عالية المحتوى صورة تحليل البرمجيات26،27. ويمكن أيضا تنفيذ الخوارزمية مع برامج أخرى لتحليل الصور، إما مفتوحة المصدر (مثل ImageJ/FIJI، KNIME) أو الملكية. ومع ذلك ، في تجربتنا هذه غالبا ما تضحي قدرات التخصيص لسهولة الاستخدام ، وبالتالي قد لا يكون أداء جيدا في التحليلات المعقدة. لقد وجدنا أن CellProfiler و CellProfiler محلل حزم البرامج تعطي نتائج موثوق بها بشكل خاص من خلال الجمع بين عدد كبير من الخوارزميات المنفذة ، والمرونة القصوى في تصميم سير العمل ، والتعامل مع البيانات ذات المحتوى العالي ومعالجتها بكفاءة.
ويمكن أيضاً تكييف البروتوكول الموصوف لتحديد كميّة الأنماط الظاهرية الخلوية الأخرى التي تتميز بالمناعة مع الأجسام المضادة المختلفة، مثل علامات مجموعات الخلايا العصبية الأخرى (مثل DAT و GAD67 و5-HT إلخ) ومجاميع البروتين (مثل فوسبو تاو، أوبيكيتين). ويمكن أيضاً الجمع بين عدة علامات فلورية للتمييز بين أنماط ظاهرية متعددة (على سبيل المثال، الخلايا التي تحتوي على اضمائر في مراحل مختلفة من النضج). وينبغي أيضا أن يكون من السهل تنفيذ التصنيف الآلي للعلامات الظاهرية المتعددة في خطوط أنابيب تحليل الصور الموصوفة بمجرد إضافة قناة تحتوي على صور مناعية لعلامات إضافية إلى خطوات القياس وفرز الخلايا في صناديق متعددة. ومع ذلك، فإن استخدام علامات متعددة في الوقت نفسه يتطلب تحسين ظروف الكبت المناعي والتصوير. بالإضافة إلى ذلك، لتحسين جودة التصوير المناعي، ينصح باستخدام خاص أسود الجدران 96 لوحات جيدا مصممة خصيصا للمجهر الفلورسنت. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه أكثر تكلفة بكثير من لوحات ثقافة الخلية القياسية، والتي تكون كافية للتحليل الموضح في بروتوكول لدينا.
إن نوع ونوعية PFFs المستخدمة أمران حاسمان بالنسبة لنتائج التجارب. PFFs يمكن أن تؤثر على كل من قوة من المقايسة وتفسير النتائج. وقد تؤثر ظروف التحضير على كفاءة البذر من PFFs ، وبالفعل ، PFF "سلالات" مع خصائص فسيولوجية مختلفة وقد تم الإبلاغ عن36. ومع ذلك، فإن إعداد PFFs والتحقق من صحتها خارج نطاق هذه المقالة وقد تم وصفها في العديد من المنشورات11و28و29و30. وبالإضافة إلى بروتوكول الإعداد، ينبغي النظر في أنواع منشأ α-synuclein في PFFs (مثل الفأر والإنسان) واستخدام النوع البري أو البروتين المتحول (مثل الإنسان A53T α-synuclein) حسب الظروف التجريبية الخاصة. وقد تبين أن تحريض تراكم pS129-αsyn من قبل PFFs يعتمد على عمر الثقافة (أي أيام في المختبر) ، مع ثقافات أكثر نضجا تظهر التعريفي أكثر وضوحا11. وربما يرجع ذلك إلى زيادة عدد الاتصالات العصبية في الثقافات الأكثر نضجا، وزيادة مستويات البروتين α-synuclein. في أيدينا, أعطى العلاج مع PFFs في DIV8 النتائج الأكثر قوة, مع تراكم واضح من pS129-αsyn في السوما الخلايا العصبية الدوبامين, في حين لا المساس البقاء على قيد الحياة العصبية. البروتوكول الموصوف مناسب تمامًا لدراسة العلاجات التي تعدل الأحداث المبكرة مما يؤدي إلى تجميع α-synuclein الذاتية لأننا نقوم بقياس التضمينات الإيجابية pS129-αsyn في وقت مبكر نسبيًا ، بعد 7 أيام من التطعيم مع PFFs. في هذه المرحلة، تكون التضمينات داخل الجسم موجودة في جزء كبير من الخلايا ويمكن تمييزها بسهولة عن طريق الكبت المناعي في حين لا يلاحظ موت الخلايا الناجم عن PFF، مما يبسط تفسير النتائج. الأهم من ذلك، كما يمكن أن تتغير مورفولوجيا وتكوين إدراجات الناجمة عن PFF مع مرور الوقت12،13، البروتوكول الموصوف ، من حيث المبدأ ، يمكن تعديلها لدراسة إدراج أكثر نضجا عن طريق التثبيت والمناعة في وقت لاحق من النقاط. ومع ذلك, الحفاظ على الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافة لفترة أطول من 15 يوما يتطلب عناية بالغة, وقد تحفز على الاختلاف إضافية بسبب فشل الخلايا في البقاء على قيد الحياة بشكل مستقل عن التطعيم PFF. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافات الأكثر توسعاً تعقد جداول العلاج من المخدرات. العديد من المركبات محدودة أو لا تتميز بشكل سيئ الاستقرار في خلية ثقافة المتوسطة، وتجديد المخدرات ليست تافهة لأن التبادل الكامل للوسط يعرض للخطر بقاء الثقافات الدوبامين.
يتم الإبلاغ عن استقلاب α-synuclein في Ser129 باستمرار في نماذج مستندة إلى PFF من تجميع α-synuclein وتجميل مع علامات من الطي والتجميع مثل ثيوفلافين S، أو ubiquitin، أو الأجسام المضادة للتكين11،12. في أيدينا، والمناعة لpS129-αsyn يعطي أيضا أقوى إشارة مع أدنى الخلفية والأكثر مباشرة لتحليل، وإعطاء نتائج قوية عندما يتم فحص علاجات متعددة. الأهم من ذلك، لا يكشف الكبت المناعي بالأجسام المضادة pS129-αsyn PFFs التي تبقى خارج الخلايا، مما يقلل بشكل كبير من الخلفية. ومع ذلك، من المهم أن نتذكر أن Ser129 الفوسفور هو على الأرجح واحدة من العمليات الأولى المرتبطة باختلال α-synuclein وقد يتم تنظيمها بشكل مختلف في ظل ظروف محددة. ولذلك، ينبغي تأكيد أي نتائج تظهر آثار إيجابية على pS129-αsyn من قبل علامات أخرى.
وينبغي أن يصمم التحليل الإحصائي وفقا للتصميم التجريبي. من الضروري إجراء التجارب في ما لا يقل عن ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة (أي، ثقافات الخلايا العصبية الأولية المنفصلة). وينبغي أن تكون مطلية هذه النسخ المتماثلة على لوحات مختلفة وتعامل بشكل مستقل. نحلل البيانات التي تم الحصول عليها من النسخ المتماثلة على لوحات مختلفة مع تصميم كتلة عشوائية ANOVA37 لتأخذ في الاعتبار الاقتران من البيانات للوحات تجريبية مختلفة.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور كلفن لوك على هديته السخية من PFFs α-synuclein، وكونجونغ تشنغ لإنشاء واستزراع الخلايا العصبية، ووحدة المجهر الخفيف في معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي، للتصوير الخلايا المناعية. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من 3i-التجديد من قبل الأعمال التجارية فنلندا (وكالة التمويل الفنلندية للابتكار) ، أكاديمية فنلندا #309489 ، #293392 ، #319195؛ مؤسسة سيغريد جوسيليوس، والصناديق القانونية للمعهد الرائد لعلم الأدوية، PAS، بولندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
