Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ללמוד על הצטברות עצבי-מערכת בהצטברות נוירונים לעכבר הראשי דופמין. מערכת זרחזת-מצרפים לאגרגטים בנוירונים מושרה במבנה טרום-ביצוע. הדמיה אוטומטית של תאים אימונוofluor, וניתוח תמונה משוחדת להפוך את הפרוטוקול הזה חזק מתאים הקרנת תפוקה בינונית עד גבוהה של תרופות המעזות α-הצטברות.
Abstract
המטרה של הפרוטוקול הזה היא להקים מודל חזק ומנוכל של α-synuclein הצטברות בנוירונים הראשי דופמין. מודל זה מאפשר ניתוח של השפעות תרופות ומניפולציות גנטיות בשילוב עם כתמים מגנטיים וניתוח תמונה אוטומטי משוחד, המאפשר לנתח את ההשפעות של הסמים והמניפולציות בתרבויות הנוירואליות. עיקרי תרבויות המוח באמצע לספק מקור מהימן של בתום הנוירונים דופמין עובריים. בפרוטוקול זה, ההיפרולוגיה של מחלת פרקינסון, הגוף הלוי (LB), מחקה את התוספת של α-סירוס במבנה מראש (PFFs) ישירות למדיית התרבות העצבית. הצטברות של זרחני אנדוגלי-מסינוקלאואין בסומה של הנוירונים דופמין מזוהה על ידי כתמים חיסוני כבר 7 ימים לאחר התוספת PFF. בתנאי תרבות תא מבחנה מתאימים גם היישום והערכה של טיפולים מניעת α-synuclein הצטברות, כגון תרופות מולקולה קטנה וגורמים neurotrophic, כמו גם וקטורים לטיפול גנטי (למשל, עם CRISPR/Cas9). מגביר את הנוירונים ב 96 צלחות היטב מגבירה את החוסן ואת העוצמה של הגדרות ניסיוני. בסוף הניסוי, התאים מתוקנים על ידי פאראפורמלדהיד לדימות מיקרוציטוכימיה והדמיה פלואורסצנטית. תמונות זריחה מרובת ספקטרליות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי של 96 צלחות היטב. נתונים אלה הם כימות (למשל, ספירת מספר של פוספאו-α-המערכת מכיל נוירונים מכילים דופמין לבאר) עם שימוש בתוכנה חופשית המספקת פלטפורמה לניתוח התוכן הגבוה משוחדת. Pff המושרה מידול של הצטברות של זרחזליום בהצטברות של דופמין העיקרי הנוירונים מספק כלי אמין כדי ללמוד את המנגנון הבסיסי תיווך היווצרות חיסול של α-synuclein הכללות, עם הזדמנות להקרנה גבוהה התפוקה התרופה הסלולר ניתוח.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה ניוונית ניווניות המאופיינת מותו של הנוירונים דופמין באמצע המוח ב החומר הרב (SN), בעקבות אובדן של הטון דופמין ב ganglia בסיס, והסוגר ליקויים מוטוריים1,2. תכונה histopathological העיקריים במוחם של חולי PD הן חלבון/ליפיד אגרגטים שנמצאו ב נוירואליות, המכונה הגופים הלוי (LB), או neurites, לורי neurites (LN), הידוע באופן קולקטיבי בשם לואין פתולוגיה3. הפתולוגיה של לואין במוח מופיעה כהתקדמות בקידום המשטרה הדומה להתפשטות גורמים פתוגניים באמצעות חיבורים עצביים. הפתולוגיה שופע לואין נמצא בנוירונים דופמין ב SN ו תאים באזורים אחרים מושפע נוירוניוון4. עם זאת, במהלך התקדמות המחלה, התפשטות והתפרצות של החלבון לא תמיד לתאם עם מוות עצבי והתרומה המדויקת של הפתולוגיה של לוני למוות עצבי עדיין לא ברור5.
LB ו-LN הוכחו כמורכבים של רכיבים קרומי ו פרוטטינואאוס3. הראשון הם שברי קרום, מבנים ומסגרות (אולי ליזוזומים ואוטומטיים) ו המיטו,3. האחרון מורכב של לפחות 300 חלבונים שונים6. מחקר בסימן ההיכר של הספינטוני ואח '7 הוכיח שרכיב החלבון העיקרי של ליני פתולוגיה הוא α-סינוקלימין. מבוטא באופן מאוד בנוירונים, ומקושרת עם פיוז'ן ממברנה ושחרור נוירוטרנסמיטר, α-synuclein ב-לולי פתולוגיה נמצא בעיקר ב misfolded, הטופס עמילואיד fibril ריל, בעיקר שהוא זרחנות ב Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
חשוב מכך, זה הוכח גם כי בשל תכונות prion כמו שלה, שגויה α-synuclein עשוי להיות תפקיד סיבתי במערך הפתולוגיה של לואין4. תכונות prion-כמו של misfolded α-synuclein הוצגו עם תמציות באמצע המוח מחולים ו אקסובאופן מוכן α-synuclein prebrils מראש (pffs) כדי לגרום α-סירוס אגרגטים בנוירונים בתרבות ב vivo9,10. PFFs להציג מודל אמין וחסון כדי ללמוד את ההתקדמות של α-synuclein פתולוגיה בנוירונים דופמין. כאשר PFFs מוחלים על הנוירונים הראשי תרבותית או מוזרק לתוך המוח בעלי חיים, הם מובילים להיווצרות α-synuclein המכיל הכללות ב neurites ו תא בסומה11 כי לכידה של תכונות רבות לראות הפתולוגיה של לולי. ההכללות שנצפו הן חומרי ניקוי ב טריטון X, אוביקוויטי, ויטראז ' את הצבע המסוים של העמילואיד, ומכילים α-סינונוקלאואין היפרזנות ב-Ser12911,12. חשוב לציין שההכללות האלה לא מיוצרות ב-α-סינונואין בעלי חיים בנוקאאוט, מצייניםאת התלות של המבנה שלהם על אנדוגני-סירוס.
עם זאת, קשה להשוות במישרין הכללות PFF המושרה ואת לוני פתולוגיה שנמצאו בחולים PD כי ליברות ו-LNs אדם הם הטרוגנית מאוד3. טרוגניות נצפו של הפתולוגיה של לואין עשוי להיגרם על ידי שלבים שונים של היווצרות, מיקום אנטומי שונה, או הבדלים ביצירת המערך של המערך המיקופל היוזם את תהליך הצבירה. אותם גורמים עשויים להשפיע PFF המושרה pS129-αsyn חיוביים הכללות. אכן, לאחרונה הוכח כי pff המושרה pS129-αsyn חיוביים הכללות בתרבויות נוירואליות העיקרי לייצג שלבים מוקדם מאוד של פתולוגיה כי יכול להבשיל מבנים דומים ליברות לאחר תקופת דגירה ממושכת12,13.
דוגמנות מוקדם התפשטות והצטברות של α מקופלת-synuclein עם PFFs הוא בעל ערך עבור פיתוח התרופה, כמו להתפשט הפתולוגיה של לולי נחשב לאחד מסמני המחלה בשלב מוקדם. לכן, מצבור טיפולים מניעתי עשוי להיות מבטיח לעצור או להאט את ההתקדמות של המשטרה בשלבים מוקדמים מאוד. מספר ניסויים קליניים שמטרתם להאט או לעצור α-הצטברות הסירוס מתמשך14. עבור חולים בשלב מאוחר יותר, השתלת דופמין עצבי ושלתי יכול להיות טיפול טוב יותר לחלופה15. עם זאת, מחלות הלוי תועד בנוירונים עובריים מושתלים במהלך ניתוח שלאחר המוות של מוחות החולה PD16,17, גם המציין את הצורך הגנה מפני α-synuclein הצטברות.
ב מבחנה, α-synuclein PFFs ידועים כדי לגרום לצבירה של קווי תאים הונצח, או יותר נפוץ, ב היפוקמאל ראשוני מכרסם או נוירונים בקליפת המוח. אף אחת מאלה לא קרובה להעליה של דופמין נוירונים10. הנוירונים האלה דורשים ציפוי צפוף של מספר מסוים של נוירונים בתוך מבחנה18. כדי להשיג צפיפות גבוהה ציפוי עם חומר מוגבל (g., הראשי דופמין נוירונים), שיטת מיקרו האי culturing הוא מנוצל בדרך כלל. במיקרו איילנד culturing, תאים מצופים בתחילה טיפה קטנה של בינוני (בדרך כלל כמה microliters יטר) שמרו יחד על ידי מתח פני השטח באמצע הבאר גדול18. לאחר שהנוירונים מתחברים, כל הבאר מלאה במדיום בעוד התאים נשארים מוגבלים בצפיפות גבוהה באזור הציפוי הקטן. בנוסף להשגת צפיפות גבוהה הציפוי, מיקרו איים גם למנוע ציפוי ליד הקצוות של בארות, שם וריאציות צפיפות התאים והישרדות הם תכופים. איי מיקרו מנוצלים לעתים קרובות בבארות או במנות גדולות יחסית; עם זאת, הקמת באמצע תרבויות עצבי המוח ב מיקרו איי ב 96 בפורמט צלחת הבאר מאפשר את המחקר של הפתולוגיה של לואין ב הנוירונים דופמין בתום בינוני עם כוח התפוקה בינונית-גבוהה. ניסויים מחוץ גופית עם הנוירונים האלה אפשרה לנו לגלות את התא גליה נגזר neurotrophic פקטור (gdnf), אשר מקדמת הישרדות של נוירונים דופמין בוגרת בתחום החוץ ובשנת vivo19,20,21,22 וגם מונע היווצרות α-synuclein אגרגטים ב דופמין נוירונים23. החולה האנושי המושרה pluripotent גזע מסוג הנוירונים דופמין מהווים מודל מדויק יותר בשל המוצא האנושי שלהם זמן הישרדות ארוך יותר מתורבת. עם זאת, אינדוקציה של α-synuclein פתולוגיה של האדם הנוירונים הוא נצפתה לאחר חודשים מרובים, לעומת שבוע בנוירונים עובריים העכבר, ו/או עם מספר משחצים (למשל, שילוב של α-synuclein יטוי overexpression)24,25. בנוסף, תחזוקה של נוירונים האדם דופמין הוא יקר יותר ומפרך כאשר לעומת נוירונים עובריים ראשוניים, למעשה להגביל את השימוש שלהם ביישומים תפוקה גבוהה.
עוד, תרבויות הראשי דופמין עצבי ניתן לשנות גנטית (למשל, עם CRISPR/Cas9) ו/או מטופלים עם סוכני תרופתי23. הם מהווים פלטפורמה מהירה ומתוכשל עבור יישומים כמו ניתוח מסלול מולקולרי והקרנת ספריית הסמים. אף על פי חומר מוגבל ניתן לקבל מן התרבויות האלה, זה עדיין אפשרי לבצע בגודל קטן גנומיקה/פרוטאומניקס ניתוחים. הנוירונים הראשי culturing ב 96 בפורמט טוב הוא טוב יותר עבור מיקרוציטוכימיה וטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטית, ואחריו בניתוח התוכן הגבוה. תמונות זריחה מרובת ספקטרליות נגזרות הדמיה אוטומטית של 96 לוחות היטב ניתן להמיר לתוצאות כמותי (למשל, מספר הנוירונים המכילים ליברות לכל טוב). ניתוח כזה יכול להיעשות עם תוכנה חופשית, כגון cellprofiler26,27. בסך הכל, תרבויות עובריים העיקרי באמצע מצופה ב-96 צלחות היטב לספק פלטפורמה חזקה ויעילה כדי לחקור את הנוירונים דופמין ו α-synuclein מצבור עם הזדמנות עבור התפוקה הגבוהה ביותר הקרנה.
Protocol
כל ניסויי החיות אושרו על ידי הוועד הלאומי הפיני של ניסויים בבעלי חיים ובוצעו על פי החקיקה האירופאית על הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות.
1. הכנה
- הכנת תא העצב דופמין בינונית (DPM) עם 0.46% D-גלוקוז, 1% L-גלוטמין, 1% N2, 0.2% primocin, הושלמה עם Dמאמ/F12. לסנן את DPM לאחר ערבוב את המרכיבים. אחסן DPM ב -4 ° c וחמם כל אחד בלבד פעם אחת בלבד.
הערה: DPM לא צריך להכיל GDNF, כפי שהוא להפחית α-synuclein הצטברות של דופמין נוירונים23. - הכינו את הידרופובי מזכוכית, כי הם מאוד hydrophobic, ובכך למזער את ההחזקה על פני השטח ואובדן של תאים במהלך הטיפול הראשוני של נוירונים עובריים.
- הוסיפו 10 מ ל של נוזל הסיליקונזציה ל-1 ל' של מים מזוקקים וערבבו על ידי ערבוב בספינה של 2 ל. השאירו את פיפטות הזכוכית. בתמיסה הסיליזזציה למשך 15 דקות
- לשטוף את הפיפטות 3 – 5x עם מים מזוקקים. יבש את הפיפטות לילה בטמפרטורת החדר (RT) או עבור 1 – 2 h ב 100-120 ° c מחומם מקום סטרילי כדי להאיץ את הייבוש.
- לחטא את הרטט באמצעות אוטוקלינג סטנדרטי בשקית אוטוקלב אטומה.
- היכונו פולי-L-אורתך (PO) מצופה 96 היטב צלחות עם תחתית שקוף על ידי הוספת 60 μL של הפתרון PO לתוך הבארות הביניים של 96 הצלחת היטב לשמש זריעה של הנוירונים, עוזב לפחות שורה אחת/עמודה של בארות בקצות הצלחת כדי למנוע תופעות הקצה. להשאיר את הצלחת מצופה לילה ב 4 ° צ' או 4 h ב RT.
- לפני ציפוי התאים, מטפי לחלוטין PO ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 100 μL של 1x PBS. מייבש 1 x PBS מבארות ולשמור את המכסה של הצלחת פתוח לייבוש מלאה.
הערה: ניתן לאסוף את השימוש ב-PO ולסנן אותו לשימוש חוזר. זה יכול לחזור פעמיים על אותו פתרון PO. - הוסף 50 μL של DPM לבארות מצופות בעבר. מוארות DPM מבארות עם עצה פלסטיק 100 μL ובמקביל לשרוט את החלק התחתון של הבאר עם תנועות מעגליות כדי להסיר את ציפוי בהיקף של כל באר. אי מצופה הדואר יישאר באמצע הבאר.
- תחת מכסה המנוע, להוסיף 10 μL של DPM באמצע כל אי מצופה ליצור איי מיקרו.
הערה: צלחת עם מיקרו איי מקורה DPM ניתן לשמור תחת כיסוי הזרם למינארי עבור 1 – 2 h במהלך בידוד של תאים.
2. בידוד של רצפת המוח הגחוני מ-13.5 מעוברי עכבר
הערה: התייחס לאיור 1 עבור צעדי החיתוך בקומת המוח.
- לפני הניתוח, למלא צלחת פטרי 10 ס"מ עם מאגר של Dulbecco ולשמור אותו על הקרח.
- המתת חסד E 13.5 עכבר נשי בהריון לפי ההנחיות של המוסד. מניחים את העכבר שטוח על גבו ולרסס את הגוף הקדמי עם 70% אתנול. הרם את העור מעל הרחם עם מלקחיים ולעשות חתך עם מספריים כירורגית כדי לחשוף את הרחם.
- בזהירות להסיר את הרחם ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי שהוכנו בעבר על קרח.
- באמצעות מספריים כירורגיים מתחת למכסה המנוע של RT, להסיר בזהירות את העוברים מן הרחם. הסר את כל שאריות הפלשים מן העוברים עם מלקחיים ומניחים אותם לתוך צלחת חדשה 10 ס מ פטרי ממולא מאגר של Dulbecco.
- באמצעות מלקחיים או מחטים לחיתוך, לחתוך את החלק הראשון של הראש מן המקומות מסומנים חצים שחורים באיור 1A. קחו את פיסת החתך הרחק משאר העובר (איור 1B).
- מניחים את החלק האחורי של פיסת חתך לכיוון המתבונן (איור 1C) ולחתוך בעדינות את זה פתוח מ caudal הגולגולת (איור 1c). מ 0.5 מ"מ מתחת לפתח הגולגולת, לחתוך 2 מ"מ2– 3 מ"מ2 אזור, המוצג באיור 1e.
- לאסוף את רצפת המוח באמצע מסלול (ראה איור 1F) בשפופרת מיקרוצנטריפוגה ריקה 1.5 mL. השאר את צינור המיקרוצנטריפוגה בקרח. עד שכל הקומות במוח נאספים בו
הערה: לחלופין, ניתן לאסוף את רצפת המוח התיכונה בעזרת מיקרופיפטה בעלת 1 מ ל לאחר הניתוח של כל המוחות העובר.
איור 1: חיתוך הרצפה מאמצע המוח מ-e 13.5 עכבר העובר. (א) מיקומי גזירה ברבע העורף של הראש מסומנים בחיצים שחורים ובקווים מקווקווים לבנים. (ב) הוצא החלק משאר העובר. החלק שהוסר מקיף. (ג) הכלי הפך 90 ° כדי להתמודד עם האחורי לכיוון המתבונן. (ד) היצירה נפתחה מן החצים השחורים, מ caudal אל הגולגולת (מסומן עם קו מקווקו לבן). (ה) מ 0.5 מ"מ – 1 מ"מ מתחת לפתח, את 2 מ"מ2– 4 מ"מ2 אזור נחתך (מסומן עם קווים שחורים). (ו) קומת המוח המוגיית מבודדת (מסומנת בריבוע שחור מקווקו). שינוי קנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
3. הקמת תרבויות המוח העובריים העיקרי מ-e 13.5 העכבר העוברים ב 96 בפורמט צלחת הבאר
- לאחר האוסף של רצפות מאמצע המוח מכל העוברים באותה שפופרת 1.5 mL, להסיר את המאגר של שיורית דולבקו ולשטוף את חתיכות הרקמה שלוש פעמים עם 500 μL של Ca2 +, Mg2 +-חינם האנק של תמיסת מלח מאוזנת (hbss).
- הסר HBSS והוסף 500 μL של 0.5% טריפסין לשפופרת. מודטה את זה ב 37 ° c עבור 30 דקות.
- במהלך הדגירה, חם 1.5 מ ל של סרום של שור עוברי (FBS) ב 37 ° c, להוסיף 30 μL של DNase אני כדי FBS, ולערבב. כמו כן, מלטש את קצה. הצינורות זכוכית הסיליקת ודא כי החור אין קצוות חדים והוא סביב באותו גודל כמו עצה מיקרופיפטה 1 mL.
הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בעצה מיקרופיציה נמוכה בעלת הדבקה של 1 מ"ל לצורך שימוש ב-trituration. למרות זאת, בעזרת פיפטות זכוכית. מעניקים את התוצאות הטובות ביותר - ברגע הדגירה בשלב 3.2 מסתיים, להוסיף 500 μL של שילוב FBS/DNase לרקמות מתעכל חלקית. השתמשו בפיפטה הזכוכית כדי לערבב את הרקמה בתערובת FBS/טריפסין. הטריטוראט עד שרקמות לא הפכו. לחלקיקים זעירים, בקושי נראים לעין להימנע בועות במהלך trituration.
- תנו לחלקיקים הנותרים להיקצב. בתחתית צינור המיקרו-צנטריפוגה בכוח הכבידה מבלי ללטף את הזרז בתחתית, לאסוף את הסופרנטאנט לתוך צינור ריק של פוליפרופילן 15 mL.
- לדלל FBS/DNase אני משלב 3.3 (98:2) עם 1,000 μL של HBSS כדי לקבל FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה. הוסף 1,000 μL של התערובת החדשה לשאריות החלקיקים בצינורית המיקרוצנטריפוגה. . וחזור על שלב 3.5
- חזור על השלב הקודם פעם נוספת כדי להשתמש בכל FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
- לאחר כל supernatant נאסף בתוך 15 mL (מתוך שלבים 3.5, 3.7, ו 3.8), השתמש צנטריפוגה שולחן כדי לסובב את supernatant (~ 3 mL) ב 100 x g, עבור 5 דקות. הסר את supernatant מבלי לגעת בתאי הפלטד בתחתית.
- לשטוף את הגלולה התא על ידי הוספת 2 מ ל של DPM לצינור ולסובב אותו למטה ב 100 x g עבור 5 דקות. הסר את supernatant ולחזור על הכביסה 2x כדי למזער את הפסולת בתאי הפלטד.
הערה: תמיד להשתמש טרי, החמם dpm עבור הנוירונים תרבותי. עבור שלבי הכביסה, DPM לא צריך להיות טרי, אבל צריך להתחמם עד 37 ° c. - לדלל את התאים עם DPM טרי, חם ולהעביר אותם צינור מיקרוצנטריפוגה. כמות DPM לדילול תלויה במספר העוברים המשמשים לניתוח רקמות. לדוגמה, השתמש ב-150 μL של DPM כדי לדלל את התאים שהושגו מעשרה עוברים.
- העבר 10 μL של תאים ב-DPM לשפופרת מיקרוצנטריפוגה. לערבב אותם עם 10 μL של 0.4% הכתם הכחול של טרימין. הרוזן חי (קרי, טריקון כחול שלילי) תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תאים אוטומטי.
הערה: השתמש 30,000 תאים עבור ציפוי לכל טוב כדי לקבל ~ 1,000 דופמין נוירונים בכל טוב. אם צפיפות התא גבוהה יותר ~ 30,000 תאים לכל 6 μL, עוד לדלל את התאים עם DPM לפני ציפוי כך נפח הזריעה הוא לא פחות מ 6 μL. - מבלי לגעת בתחתית הבארות, להסיר את DPM מן המיקרו איים שנוצרו בשלב 1.6.
- על מנת להשיג צפיפות תא מיויית בכל הבאר, לערבב את התאים על ידי ליטוף עדין לפני ציפוי בבאר. עם 1 – 10 μL מיקרופיפטה, להוסיף 6 μL של תאים באמצע הבאר, במיקום של כל אי מיקרו לשעבר.
- ממלאים את הבארות הריקות בקצות הצלחת עם 150 μL של מים או 1x PBS כדי למזער אידוי מן הבארות המכילות תרבויות נוירואליות. מודקת את הצלחת בחממה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 1 h.
- אחרי 1 h, להסיר את הצלחת מן החממה, להוסיף 100 μL של DPM לתוך כל טוב עם תאים ולמקם אותו בחזרה בחממה.
- יומיים לאחר ציפוי (היום בתוך מבחנה 2, או DIV2), להסיר 25 μL ולהוסיף 75 μL של החדש DPM כדי להביא את אמצעי התקשורת הסופי מדיה 150 μL ולהימנע אידוי ככל האפשר.
- Exchange מחצית המדיום עם DPM טרי (כלומר, להסיר 75 μL ולהוסיף 75 μL טרי DPM) ב DIV5. אל תבצע שינויי מדיה לאחר DIV5.
4. אינדוקציה של α-הסירוס אגרגטים בתוך הנוירונים מתחלקים הראשי דופמין על ידי זריעה עם מראש סיבים
פרוטוקולים להשגת ואלידציה של pffs תוארו בקפידה ונדונו במספר פרסומים אחרונים11,28,29,30. בעקבות כל עבודה עם PFFs, לנקות את המכסה המנוע או כל ציוד שיכול היה ליצור קשר עם PFFs עם 1% SDS, אז עם 70% אתנול31.
- לפני הניסוי, לדלל את PFFs עם 1x PBS לריכוז הסופי של 100 μg/mL. Sonicate PFFs מדולל בצינורות מיקרוצנטריפוגה עם אמבטיה sonicator בכוח גבוה עם אמבטיה מים קירור ב 4 ° c עבור 10 מחזורים, 30 s על/30 s OFF.
הערה: קריטי כי סיבים להיות כראוי sonicated כדי ליצור קטעים ~ 50 ננומטר ארוך. הגודל של sonicated PFFs ניתן למדוד ישירות מן השידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של PFFs מוכתם כפי שמתואר על ידי פטרסון ואח '30. Sonication ניתן להשיג כמתואר לעיל בsonicator אמבטיה גבוהה. לחילופין, sonicator טיפ ניתן להשתמש30. Sonicated PFFs ניתן לאחסן ב-80 ° c בעלי מחזור קטן כדי למנוע מחזורי הקפאה/הפשרה מרובים. - ב DIV8, להוסיף 3.75 μL של 100 μg/mL של PFFs לכל גם 150 μL של בינוני בבאר לריכוז הסופי של ה2.5 μg/mL. השתמש באותה כמות של 1x PBS עבור קבוצת הבקרה.
- הכינו 4% פאראפורמלדהיד (כיתה) ב-1x PBS ואחסן את הליבטים ב-20 ° c. לשם כך, בצע את השלבים שלהלן.
הערה: הכדורגלן רעיל; לחבוש מסכה וכפפות בזמן ההכנה, העבודה תמיד מתחת למכסה המנוע, ולהיפטר מפסולת התחתית המוצק והנוזלי בהתאם להנחיות המוסד.- חם 500 mL של 1x PBS בספינה 1 L. שים בר מהומה בכלי והניח את כלי הקיבול על מערבב מגנטי עם פונקצית חימום. כוונן את הטמפרטורה בין 40 ל-60 ° צ' כדי למנוע רתיחה תוך שמירה על הפתרון חם.
- מדידת 20 גרם של אבקת הג מתחת למכסה המנוע במיכל פלסטיק חד פעמי. בזהירות, הוסיפו את אבקת הג לתוך הכלי המלא ב-1x PBS. התחל לערבב את הפתרון.
- הוסף 200 μL של הידרוקסיד הנתרן של 5 M הידרוקסידי לתוך הפתרון ולהמשיך ערבוב של ~ 15 דקות, עד התחתית מתמוסס לחלוטין.
- לאחר שהפתרון מופיע הומוגנית, הוסף 168 μL של 5 מ' מימן כלוריד כדי לאזן את ה-pH ל ~ 7. בדוק את ה-pH עם מפצלי חד פעמי קבוע צבע pH.
- הסר את הכלי מן החימום ולאפשר לו להתקרר כדי RT. לסנן את הפתרון ואת סדרת מחלקים עבור אחסון ב-20 ° c. הפשרת הליפיטים ב-RT לפני השימוש ולא להקפיא מחדש לאחר מכן.
- ב DIV15, להסיר את כל המדיה מבארות ידי ליטוף. הוסף 50 μL של 4% כלפי מתחת לכל באר כדי לתקן את התאים ואת הדגירה עבור 20 דקות ב RT. לאחר הדגירה להסיר את התחתית מן הבארות ולהוסיף 100 μL של 1x PBS לכל טוב כדי לשטוף את התאים. הוצא את ה-PBS 1 x ושטוף 2x יותר.
- השאירו 100 μL של PBS 1x בכל באר כדי למנוע ייבוש. אחסן את הצלחת ב-4 ° צ' עד לביצוע הכימיה החיסונית.
5. מודלוןהכתמים והדמיה אוטומטית של הנוירונים מתחלקים הראשי דופמין ב 96 לוחות היטב
- הסר 1x PBS והחדיר את התאים על ידי הוספת 100 μL של 0.2% טריטון X-100 ב-PBS (PBST) לטוב ו דגירה ב RT עבור 15 דקות.
- הסר PBST והוסף 50 μL של 5% סרום לסוסים רגיל (בשנת בי) לכל היותר PBST. כדי לחסום את פעילות אנטיגן לא ספציפי, מודונטה ב RT עבור 1 h.
- לדלל את הנוגדנים העיקריים נגד TH ו-pS129-αsyn (1:2000) ב 5% בשנת PBST. הוסף 50 μL של נוגדנים מדולל לכל טוב ומארג לילה ב 4 ° c.
- הסר נוגדנים ולהוסיף 100 μL של 1x PBS לכל טוב כדי לשטוף את התאים. הסר 1x PBS וחזור על כביסה 2x.
- כדי למנוע הלבנת של מולקולות פלורסנט, להתחיל לעבוד תחת תנאי אור מינימלי. לדלל את הנוגדנים בעלי תווית משנית (1:400) ב PBST. הוסף 50 μL של נוגדנים מדולל לכל טוב ומארג ב RT עבור 1 h.
- הסר את פתרון נוגדן ולהוסיף 100 μL של 1x PBS לכל טוב כדי לשטוף את התאים. הסר 1x PBS וחזור על כביסה 2x.
- הסרת 1x PBS, להוסיף 50 μL של 200 ng/mL 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) לכל טוב להכתים את הגרעינים של תאים מתורבתים ו-הדגירה ב RT עבור 10 דקות.
- לשטוף את התאים 3x עם 100 μL של 1x PBS עבור 5 דקות כל אחד. שמור על 100 μL של 1x PBS בכל טוב לאחר השטיפה האחרונה. כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום ואחסנו אותה ב-4 ° צ' עד להדמיה.
- התמונה העיקריים דופמין מתחלקים הנוירונים ב 96 היטב להציג צלחת עם סורק הלוח תוכן גבוה (ראה טבלת חומרים) מצויד במטרה 10x.
- להתאים את ההגדרות בהתבסס על מפרטים של צלחת הבאר 96, כגון סוג צלחת, יצרן, גודל, מרחק בין בארות, כמו גם סוג וכמות של בינוני.
- בחר את אזור ההדמיה של הבאר כדי לכסות את כל התאים אי מיקרו. בחר דוגמה היטב כדי לכוונן את פוקוס אוטומטי. בסס את המיקוד ההתחלתי ב-DAPI.
- כיול את זמן הרכישה עבור כל ערוץ פלורסנט, בהתבסס על עוצמת ההכתמים בבארות הבקרה. להתאים את הפרמטרים כך ב PFF מטופלים בארות הבקרה אחד יכול בבירור להבחין בתאי דופמין מחסה אגרגטים pS129-αsyn בתא סומה המאפשר כימות חד משמעית של pS129-αsyn חיובי ו pS129 αsyn תאים שליליים.
הערה: בארות שאינן מכילות PFFs אינן אמורות לכלול כתמים עבור pS129-αsyn; לכן, בארות אלה יכולות לשמש כשליטה שלילית להתאמת עוצמת pS129-αsyn. - תמונה כל הבארות שנבחרו עם מטרה 10x בו זמנית עבור כל הערוצים עם מכתים הimmunofluorescence עם בדיוק את אותם פרמטרים.
- באופן אופציונלי, תווית α-synuclein הכללות בקבוצת משנה של הבארות עם נוגדנים ספציפיים עבור filamentous α-synuclein כדי לאשר שינויים במספר הכללות pS129-αsyn-חיוביים לשקף את הפחתת הצטברות חלבונים במקום עיכוב של זירחון או dephosphorylation של pS129-αsyn.
- חזור על שלב 5.3 החלפת pS129-αsyn נוגדן עם α-סירוס נוגדן פילנואין (1:2000). תמונה המוכתמים הצבורים-הסינואין כמו בשלב 5.13.
6. ניתוח תמונה באיכות גבוהה
הערה: שלב זה מבוצע עם התוכנה גישה פתוחה CellProfiler גירסה 3.15 ו CellProfiler אנליסט גירסה 2.2.1. 27,32. עם זאת, עם ניסיון מסוים, ניתן להגדיר את קווי הצינורות של ניתוח תמונה מקבילים בגירסה אחרת או בתוכנה דומה. נא עיין בדף התוכנה לקבלת הסבר מפורט (ראה טבלת חומרים).
- הורד והתקן את התוכנה מנתחת CellProfiler ו-CellProfiler.
- . פתח את מאבחן התאים בחר קובץ | ייבוא | צינור מהקובץ וטען את צינור הדוגמה המסופק, TH_LB_V1 קובץ cpipe (עיין בקבצים המשלימים).
הערה: צינורות הדוגמה ידרשו התאמות ספציפיות בהתאם למאפיינים של התמונות שנרכשו ולפלטפורמת רכישת התמונות. Example_Imagesיכול לשמש לניסוי הראשוני של התוכנה. - טען תמונות שנותחו על-ידי גרירתם למודול תמונות. השתמש באפשרויות סינון כדי לבחור קבצי תמונה בלבד מהתיקיה שנטענה.
- השתמש במודול מטא-נתונים כדי לחלץ היטב, שדה תצוגה ומידע אודות הערוץ מתוך שם קובץ התמונה. לחץ על סמל זכוכית מגדלת ולהזין ביטוי רגיל כדי לחלץ צלחת, ובכן, אתר הדמיה ומידע ערוץ משמות קבצים.
הערה: הביטוי הרגיל יהיה תלוי במוסכמות למתן שמות קבצים של מיקרוסקופ צלחות. לחיצה על סימן שאלה לצד זכוכית מגדלת תספק פרטים של התחביר. - תחת מודול Namesandtypes, בחר את מספרי הערוץ הנכונים עבור DAPI, TH ו-pS129-αsyn צביעת (ערוצי ברירת מחדל 1, 2, ו- 3). במודול קבוצות, בחר באפשרות "לא".
- השתמש במודול מטא-נתונים כדי לחלץ היטב, שדה תצוגה ומידע אודות הערוץ מתוך שם קובץ התמונה. לחץ על סמל זכוכית מגדלת ולהזין ביטוי רגיל כדי לחלץ צלחת, ובכן, אתר הדמיה ומידע ערוץ משמות קבצים.
- השתמש מודולים IdentifyPrimaryObjects כדי לפלח הנוירונים דופמין באמצעות הצביעת TH של התא סומה.
הערה: ערכים ספציפיים ידרשו מיטוב ראשוני בהתבסס על אופן המוככתם והדימות. אם לוחיות הרישוי העוקבות מעובדות באופן דומה, אין צורך בהתאמות נוספות או מינימליות. - השתמש במודול MeasureObjectIntensity כדי לרכוש מידע אינטנסיביות של קרינה מערוצי TH ו-dapi.
- השתמש מודול MeasureObjectSizeShape למדוד גודל וצורה תכונות של הנוירונים דופמין פלח.
- השתמש במודול MeasureTexture כדי למדוד מידע תכונת המרקם מערוץ TH מ נוירונים מקוטע דופמין.
- השתמש במודול מסדי נתונים עבור ייצוא כדי לשמור מדידות במסד נתונים.
- שם קובץ מסד נתונים בהתאם לסכימת מתן השמות של הניסוי (לדוגמה, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1. db). בחר תיקיית פלט עבור קובץ מסד הנתונים. קובץ מסד הנתונים יכול להיות מספר ג'יגה-בתים גדול ויש לשמור אותו רצוי בתיקיית האב של קבצי התמונה.
- פתח את אנליסט CellProfiler ובחר בקובץ V1_THCells. properties שנוצר בשלב 6.8. כלים פתוחים | . זה מסווג
- מיין תאים מקוטע לשתי קטגוריות: חיובי (כלומר, מקוטע בצורה נכונה תאים תא העצב הגוף) ושלילי (כלומר, פילוח וכתמים ממצאים) ראה איור 2A ו- 2a.
- להגדיר את מספר התאים שהביא ל 50 תאים אקראיים ולחץ להביא (זה טוען תמונות של התאים מחולק בשלב 6.4). מיין לפחות 30 תאים בכל סל על-ידי גרירתם אל הסל המתאים בתחתית החלון. הביאי עוד תאים לפי הצורך.
- בתפריט הנפתח בחר להשתמש בעדינות לשיפור מהיר עם 50 מקסימום כללים ולחץ על הרכבת.
- הגדר "הבא" ל- 50 תאים חיוביים ולחץ על הבא כדי לקבל את התאים החיוביים של TH לפי המסווג (איור 2a). השתמש בתוצאה המתקבלת כדי להעריך את האיכות של המסווג המיומן.
- חזור על שלבים 6.10.1-6.10.3 והוספת תאים לדוגמה חדשים להכשרת המסווג עד שהתוצאות יהיו משביעות רצון.
- בחר מתקדם | עריכת כללים. .. ובחלון חדש בחר את כל הטקסט (ctrl + a) והעתק אותו (ctrl-c) לפנקס רשימות (ctrl-v). שמור כקובץ TH_rules. txt.
הערה: בהתאם לצפיפות התרבות העצבית ולאיכות ההכתמים וההדמיה, ייתכן ששלב זה לא יהיה נחוץ, מאחר שייתכן שיהיה ניתן להגדיר פרמטרים בשלב 6.4 כדי לפלח רק את התאים החיוביים ה-TH עם דיוק גבוה. אם זהו המקרה, אין צורך בהפעלת TH_LB_V1 cpipe שלמה, והפרמטרים הנכונים של מודולי IdentifyPrimaryObjects צריכים להיות מכניסים ישירות למודול המתאים ב -TH_LB_V2. cpipe.
איור 2: קוונפיקציה של דופמין נוירונים ו-pS129-αsyn הנוירונים דופמין חיוביים עם CellProfiler התוכנה אנליסט מבוסס על DAPI, TH, ו pS129-αsyn immunofluorescence סנס. (א) תאים ב-bin החיובי נבחרו על בסיס מכתים dapi (כחול) המסומן בריבוע קטן בתא הראשון שנבחר בתמונה ובצביעת ה-TH המקיף (אפור) בסומה. (ב) פריטים שאינם בתאים הושמו בסל השלילי. (ג) pS129-ΑSYN חיוביים TH הנוירונים נבחרו מבוסס על הכללה גדולה של pS129-αsyn צביעת (אדום) מסומן עם ריבוע קטן בתא הראשון שנבחר בתמונה, המקיפים את גרעיני או בתא סומה. (D) תאים ללא הכללות pS129-αsyn כגון הונחו בסל השלילי. קנה מידה של סרגלים = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- פתח את CellProfiler ובחר קובץ | ייבוא | קו צינור מהקובץ וטען את הקובץ TH_LB_V2. cpipe . חזור על שלבים 6.3 – 6.7. חלק זה של הצינור צריך להיות זהה ל -TH_LB_V1. cpipe.
- השתמש במודול אובייקטי מסנן כדי להעביר תאים חיוביים מסוימים בלבד לצורך ניתוח נוסף.
- הגדיר select מצב סינון בחר לכללים. בכללים או בשם קובץ מסווג בחר בקובץ TH_rules. txt שנוצר בשלב 6.10.5.
- הגדר שדה מספר מחלקה ל- 1 אם תאים חיוביים של TH ממוינים לחלון השמאלי התחתון.
- השתמש במודול MeasureObjectIntensity כדי לרכוש מידע אינטנסיביות של קרינה מערוץ pS129-αsyn.
- השתמש במודול MeasureTexture כדי למדוד מידע של תכונת המרקם מערוץ TH מתאים מסוננים.
- השתמש במודול MeasureObjectSizeShape כדי למדוד את הגודל ואת תכונות הצורה של תאים מסוננים.
- השתמש במודול מסדי נתונים עבור ייצוא כדי לשמור מדידות במסד נתונים.
- שם קובץ מסד נתונים בהתאם לסכימת מתן השמות של הניסוי (לדוגמה, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2. db). בחר תיקיית פלט עבור קובץ מסד נתונים.
- פתח את אנליסט CellProfiler ובחר בקובץ V2_THpos. properties .
- מיין תאים מקוטעת לשתי קטגוריות – pS129-αsyn חיוביים וpS129-αsyn תאים שליליים (איור 2C,D).
- להגדיר את מספר התאים שהביא ל 50 תאים אקראיים ולחץ להביא (זה טוען תמונות של תאים מקוטע בשלב 4). מיין לפחות 30 תאים בכל סל על-ידי גרירתם אל הסל המתאים בתחתית החלון.
- בתפריט הנפתח , בחר באפשרות השתמש בעדינות בשיפור מהיר עם כללי 50 מקסימום או מסווג יער אקראי . לחץ על הרכבת.
- להגדיר "להביא" כדי 50 תאים חיוביים ולחץ להביא כדי לקבל pS129-Αsyn תאים חיוביים לפי מסווג (איור 2c). להגדיר "להביא" כדי 50 תאים שליליים ולחץ להביא כדי לקבל pS129-αsyn תאים שליליים לפי מסווג ( Fetch איור 2d). הערכת האיכות של המסווג המיומן.
- חזור על שלבים 6.17.2-6.17.4 והוספת תאים לדוגמה חדשים כדי להכשיר את המסווג עד שהתוצאות יהיו משביעות רצון.
- לחץ על כל הציון כדי לקבל את טבלת התוצאות המסכמת מספר של pS129-αsyn חיוביות דופמין שלילי ונוירונים בכל טוב.
Representative Results
כמה ימים לאחר הציפוי (DIV1-DIV3), נעשה מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להעריך את התפשטות הבריאות וההומוגנית של התאים המתורמים, ואחידות התנאים הללו בבארות הבודדות (איור 3). תאי מוח מיניים מתורבתים התפשטו באופן מוחי בתוך האי המיקרו שנוצר לפני ציפוי (איור 3 א,ב). נוירונים ראשוניים התיישבו על הקרקע מצופה הגון והקים התחזיות העצבי (איור 3B). גוש קטן של תאים (קוטר קטן יותר מ-150 μm) נצפתה בבאר והוצגה כדוגמה (איור 3C).
איור 3: כמה ימים לאחר הציפוי (למשל, DIV3), מצבם של תרבויות המוח המרכזי נצפו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. (א) תאים מתורבתים הפזורים באמצע הבאר בתוך אי מיקרו מצופה פו עם רדיוס משוער של 4.4 מ"מ (מוצג עם חצים לבנים) נוצר על ידי גירוד פו מ כ 1 מ"מ היקפית היטב (מוצגעם חצים שחורים). (ב) שנצפו הנוירונים העיקריים המתורבתים באופן מצער בתוך האזור והקרנות הנוירואליות (המסומנות בראשי חץ אדומים). (ג) גוש תא בעל קוטר קטן מ-150 יקרומטר מסומן עם ראשי חץ כחולים. קנה מידה של סרגלים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
העכבר הראשי באמצע תרבויות המוח היו חיסוני עם אנטי-TH ו anti-pS129-αsyn נוגדנים והתמונה עם מיקרוסקופ אוטומטי לאחר 15 ימים ב מבחנה. מצופה איי מיקרו האיים סיפק שטח מוגבל להחזקה של תאים באמצע בארות (איור 4A,B). דופמין נוירונים אימונויניום עם הסמן TH התפשטו סביב האי מיקרו במונאולייר, הופרדו זה מזה, ללא כל הסדר (איור 4A' ו 4a ').
איור 4: בשעה DIV15, 800 – 1000 התאים דופמין היו כמותית מכל אי מיקרו, עם או בלי טיפול PFF. תמונות מייצגות של תרבויות מייליות מעובריים עם נוגדנים אנטי-TH ואנטי pS129-αsyn. (A, A ',A ') בקרת תאים ללא טיפול PFF. (B, B ', B') תאים שטופלו PFF עם pS129-αsyn הכללות. (ג) כימות של מספרי תאים של TH-חיוביים בבארות שטופלו בכלי רכב (שליטה), pffs, או pffs עם 50 Ng/ML gdnf. (ד) כימות של אגרגטים pS129-αsyn בתאים ה-חיוביים שטופלו בכלי רכב (בקרה), pffs, או pffs עם 50 Ng/ML gdnf. מובהקות סטטיסטית חושבה עם עיצוב בלוק אקראי ANOVA. * * p < 0.01, n = 4 לוחות בודדים (משכפל ביולוגי), כל אחד עם 3-6 בארות לכל קבוצת טיפול (הטכני חוזר על עצמו). סרגלי קנה מידה= 300 יקרומטר עבור A, B; 50 יקרומטר עבור ', B '; 25 יקרומטר עבור '', B'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בעוד תרבויות ללא טיפול pff לא היה כל pS129-αsyn האות (איור 4a' ו 4a'), תרבויות שטופלו α-synuclein pff פיתח pS129-αsyn הכללות חיוביות (איור 4a' ו 4a'). בטיפול בלתי מתורבת במשך 7 ימים לא גרם לירידה משמעותית במספר הנוירונים החיוביים, בהשוואה לקבוצות נסיוניות אחרות (איור 4C). התרבויות PFF מטופלים היתה אוכלוסייה של ~ 40% של pS129-αsyn חיובית TH-חיוביות דופמין נוירונים. טיפול עם שליטה חיובית, GDNF, מופחתת את אחוז ה-TH-חיוביות דופמין נוירונים עם pS129-αsyn חיוביים הכללות (איור 4D, ראה גם את הנתונים הגולמיים ותמונות לדוגמה בקבצים המשלימים).
קבצים משלימים: קווי לדוגמה לניתוח תמונה באיכות גבוהה עם CellProfiler וחבילות התוכנה של Cellprofiler, תמונות לדוגמה ונתונים גולמיים עבור איור 4E, F. (1-9) Example_Images. פתח תמונות אלה באמצעות ImageJ או CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al. xlxs (11) TH_LB_V1. Cpipe (צעדים 6.2 – 6.8), (12) TH_LB_V2. cpipe (שלבים 6.11 – 6.18) אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הפצת לולי פתולוגיה, שpS129-αsyn היא מהווה מנהל מרכזי, הוא סימן ההיכר של המשטרה. הפסקת או האטה את הצטברות של pS129 צבור-αsyn עשוי להאט את הניוון של הנוירונים דופמין ואת ההתקדמות של אלפא-synucleinopathy. עם זאת, הבנה מכניסטית של איך הצבירה pS129-αsyn תורמת לפטירתו של הנוירונים דופמין עדיין יש להקים. ראיות של האדם מחקרים שלאחר המוות על דגימות המוח מחולים בשלבים שונים של המחלה, כמו גם התבוננות של pS129-αsyn חיוביים הכללה בנוירונים העוברי המושתלים מציע התפשטות לבני פתולוגיה בין תאים16,17,33. כתוצאה מכך, הפצת הpS129-αsyn לאחרונה התפשטה באמצעות α-syנוקלאופהוף9,10. הקמת חזק, חסכוני, ובאופן יחסי גבוהה או תפוקה בינונית מודל של pS129-αsyn התפשטות והצטברות, במיוחד בנוירונים דופמין, יכול במידה ניכרת להאיץ את החיפוש אחר טיפולים חדשניים תרכובות שינוי תהליך זה.
בגלל הפסד של הנוירונים דופמין הוא הגורם העיקרי של סימפטומים מוטוריים PD ותאים אלה בעלי מאפיינים ייחודיים רבים2,34,35, מידול של prion כמו הפצת pS129-αsyn בנוירונים דופמין הוא סוג הרלוונטי ביותר של מודל הפרספקטיבה translational. פרוטוקולים הניצול של תרבויות מיקרו אי של נוירונים באמצע המוח העובריים על 4 צלחות וחצי אוטומטי כבר תיאר בעבר18. הפרוטוקול המתואר כאן הותאם 96 לוחות היטב ומספק פחות הכנה מפרך של איי מיקרו, המאפשר הכנה של עד ארבע צלחות המכילות 60 בארות כל אחד על ידי חוקר מנוסה במהלך יום אחד. Culturing דופמין נוירונים ב 96 לוחות היטב מאפשר לבדוק תרופות בכמויות נמוכות יותר ומאפשר שיעורי התמרה גבוהה עם וקטורים העדשה. ניתן גם לשלב טיפולים שונים כדי לבצע ניסויים מורכבים יותר.
לפני החלת טיפולים (כולל PFFs), את איכות הculturing יש לבדוק עם מיקרוסקופ שדה בהיר. אם מערכת המיקרוסקופיה לא להשתמש בחדר CO2 עם חימום, התאים לא צריך להישמר מחוץ לחממה במשך יותר מכמה דקות, כי הנוירונים הראשי דופמין העכבר הם עדינים ובקלות לחוץ. מאותה סיבה, מומלץ כי ההדמיה הראשונה צריכה להיעשות לאחר 24 שעות של דגירה (בין DIV1-DIV3). התאים אמורים להיראות בחיים עם גוף התאים הנוכחי ולהתפשט באופן מאוד בתוך האי מיקרו. הנוירונים הראשיים היו מתיישבו על הקרקע מצופה פו והחל לבסס תחזיות עצבי. ניתן להבחין בגוש קטן של תאים (כלומר, קוטר קטן מ-150 – 200 μm) שניתן ליצור אם תהליך הטריטורציה אינו מתבצע כראוי או שצפיפות הציפוי גבוהה מהמומלץ. הגושים הקטנים האלה לא ישפיעו על הניסוי, אלא אם כן הם יותר ממעטים לפחות ו/או גדולים יותר. תאים בעלי מושג מאוד קשה לזהות סמנים אימונוהיסטוכימיה ותאים בודדים במהלך ניתוח תמונה. זה חיוני כדי למנוע גושים כאלה על ידי ציפוי זהיר, triturating, ושליטה צפיפות הציפוי. אם לא ניתן לצפות באחידות של התנאים הללו בבארות מסוימות, אל תכלול את הבארות הפגומות הללו בניסוי. הדרה זו צריכה להיעשות לפני הוצאתו להורג של כל הטיפולים.
יתר על כן, ניצול של 96 לוחות היטב מאפשר להשתמש בצינורות רב-ערוצי נוח במהלך הליכי מכתים והדמיה ישירה עם מיקרוסקופים לוחית אוטומטית, התפוקה גוברת יותר. הניצול של כימות התמונה האוטומטית הוא חיוני לניתוח הנתונים מפלטפורמות הדמיה של תוכן גבוה. בנוסף ליכולת לעבד אלפי תמונות שהתקבלו מכל ניסוי, היא מבטיחה כימות משוחדת וזהות של כל קבוצות הטיפול. זרימת העבודה המוצעת עבור ניתוח התמונה מבוססת על עקרונות פשוטים של הנוירונים דופמין הגדלת, סינון תאים מקוטע כראוי על ידי למידה מחשב מפוקח, ולאחר מכן כימות של פנוטיפים (pS129-αsyn חיוביים pS129-αsyn שלילי), שוב על ידי למידה מחשב מפוקח. למרות מספר גישות שונות עבור משימה זו ניתן לתאר, מצאנו את השילוב של פילוח עם למידה מחשב להיות חזק ביותר עבור תרבויות דופמין בשל צפיפות גבוהה ציפוי, צורות מגוונות של נוירונים דופמין, ואת הנוכחות של neurites מוכתם בחוזקה. האלגוריתם ניתוח תמונה המוצע יושם ב cellprofiler ו cellprofiler אנליסט, קוד פתוח, זמין באופן חופשי תוכנת ניתוח תמונה גבוהה26התוכנה 26,27. האלגוריתם יכול גם להיות מיושם עם תוכנה אחרת ניתוח תמונה, או קוד פתוח (למשל, ImageJ/פיג'י, KNIME) או קניינית. עם זאת, בניסיון שלנו אלה לעתים קרובות להקריב יכולות התאמה להקל על השימוש, ולכן אולי לא לבצע גם ניתוחים מסובכים. מצאנו כי CellProfiler ו-CellProfiler מנתחי התוכנה חבילות לתת תוצאות אמינות במיוחד על ידי שילוב של מספר משמעותי של אלגוריתמים מיושמים, גמישות קיצונית בעיצוב זרימת עבודה, ובמקביל טיפול ביעילות עיבוד של נתונים באיכות גבוהה הדמיה.
הפרוטוקול המתואר יכול גם להיות מותאם עבור כימות של פנוטיפים סלולריים אחרים המאופיינת הזדהות חיסונית עם נוגדנים שונים, כגון סמנים של אוכלוסיות נוירואליות אחרות (למשל, DAT, GAD67, 5-HT וכו ') ואגרגטים חלבון (g., פוספאו-טאו, אוביקוויב). סמני פלורסנט מרובים יכול גם להיות משולב כדי להבדיל פנוטיפים מרובים (למשל, תאים עם הכללות בשלבים שונים של ההבשלה). סיווג אוטומטי של פנוטיפים מרובים צריך גם להיות קל ליישם בצינורות ניתוח תמונה מתוארים על ידי הוספת רק ערוץ המכיל את התמונות immunofluorescent סמנים נוספים כדי מדידה צעדים ומיון תאים לתוך סלים מרובים. הניצול של סמנים מרובים באותו הזמן היה, עם זאת, מיטוב של תנאים חיסוני והדמיה. בנוסף, עבור איכות טובה יותר הדמיה immunofluorescence השימוש מיוחד שחור חומה 96 הצלחות המיועדים במפורש עבור מיקרוסקופ פלורסנט מומלץ. עם זאת, אלה יכולים להיות הרבה יותר יקר מאשר לוחות התרבות תאים סטנדרטיים, אשר מספיקים לניתוח המתואר בפרוטוקול שלנו.
סוג ואיכות של PFFs מנוצל הם קריטיים לתוצאות הניסויים. PFFs יכולים להשפיע על החוסן של האפשרות ואת הפרשנות של תוצאות. תנאי ההכנה עשויים להשפיע על היעילות של הזריעה של PFFs, ואכן, PFFS "זנים" עם תכונות פיזיולוגיות שונות דווחו36. עם זאת, ההכנה והאימות של pffs הם מעבר להיקף של מאמר זה ותוארו במספר פרסומים11,28,29,30. בנוסף לפרוטוקול ההכנה, מינים של מקור α-סירוס ב PFFs (למשל, עכבר, אדם) ואת השימוש של סוג פראי או חלבון מוטציה (למשל, A53T α האדם-synuclein) יש לשקול, בהתאם לתנאים ניסיוני מסוים. אינדוקציה של הצטברות pS129-αsyn על ידי PFFs הוכח להיות תלוי בגיל התרבות (כלומר, ימים בחוץ), עם תרבויות בוגרים יותר מראה אינדוקציה מבוטא יותר11. זה כנראה בגלל הגדלת מספר הקשרים העצביים בתרבויות בוגרות יותר, והגדילה α-synuclein ברמות החלבון. בידינו, הטיפול עם PFFs ב DIV8 נתן את התוצאות החזקות ביותר, עם הצטברות מבוטא של pS129-αsyn בבית העצב דופמין, בעוד לא להתפשר על הישרדות עצבית. הפרוטוקול המתואר הוא מתאים היטב ללמוד טיפולים שינוי אירועים מוקדמים המובילים לצבירה של הpS129-αsyn הכללות חיוביות בנקודת זמן מוקדמת יחסית, 7 ימים לאחר החיסון עם PFFs. בשלב זה, הכללות הפנימי נמצאים בשבריר משמעותית של תאים ניתן להבחין בקלות על ידי מכתים חיסוני בעוד לא המושרה PFF מוות התא הוא נצפתה, פישוט הפרשנות של התוצאות. חשוב מכך, כמו מורפולוגיה והרכב של הכללות pff המושרה יכול12להשתנות במשךהזמן 12,13, הפרוטוקול המתואר יכול, בעיקרון, להיות שונה כדי ללמוד הכללות בוגרות יותר על ידי קיבוע וכתמים חיסוני בזמן מאוחר יותר נקודות. עם זאת, שמירה על הנוירונים דופמין בתרבות במשך יותר מ 15 ימים דורש טיפול קיצוני, ועלול לגרום וריאציה נוספת בגלל התאים לא לשרוד באופן עצמאי מ-PFF החיסון. בנוסף, תרבויות מורחבות יותר מסבכים את לוחות הזמנים של טיפול בסמים. תרכובות רבות יש מוגבל או לא מאופיין ביציבות בינונית התרבות התא, ואת חידוש של תרופה אינה טריוויאלית משום חילופי בינוני של פשרות בינוניות הישרדות של תרבויות דופמין.
זירחון של α-סירוס ב-Ser129 מדווח בעקביות במודלים מבוססי pff של α-synuclein מצבור ומתוך לוקליזציה עם סמנים של שעוות ומצבור כגון thioflavin S, אוביקוויצין, או בעלי מבנה ספציפי נוגדנים11,12. בידינו, חיסוני עבור pS129-αsyn גם נותן את האות החזק ביותר עם הרקע הנמוך ביותר הוא פשוט ביותר לנתח, מתן תוצאות חזקות כאשר מספר טיפולים מוקרן. חשוב מכך, הpS129 החיסונית עם הנוגדן לαsyn אינו מזהה PFFs שנשארים מחוץ לתאים, הפחתת משמעותית את הרקע. עם זאת, חשוב לזכור כי Ser129 זרחון הוא כנראה אחד התהליכים המוקדמים ביותר הקשורים עם הקיפול של α-synuclein והוא עשוי להיות שונה מוסדר בתנאים ספציפיים. לכן, כל הממצאים הראו אפקטים חיוביים על pS129-αsyn צריך להיות מאושר על ידי סמנים אחרים.
ניתוח סטטיסטי צריך להיות מותאם בהתאמה לעיצוב ניסיוני. חיוני לבצע ניסויים בלפחות שלושה משכפל ביולוגי בלתי תלוי (כלומר, הפרדה בין התרבויות הנוירואליות הראשיות). משכפל זה צריך להיות מצופה על צלחות שונות מטופלים באופן עצמאי. אנו מנתחים את הנתונים שהתקבלו משכפל על צלחות שונות עם עיצוב בלוק אקראי ANOVA37 לקחת בחשבון את הזיווג של נתונים עבור לוחיות ניסוי שונות.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לפרופסור קלווין לוק על מתנתו הנדיבה של α-סינונוקלאוב PFFs, Conjung ג'נג להקמת תאים עצביים, ואת יחידת המיקרוסקופיה האור במכון לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת הלסינקי, עבור תאים הדמיה חיסוני. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים 3i-התחדשות ידי עסקים פינלנד (הסוכנות הפינית מימון לחדשנות), האקדמיה של פינלנד #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius קרן, וכספים סטטוטוריים של מכון רס"ן לפרמקולוגיה, PAS, פולין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
