Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att studera neuronal α-synuclein ackumulering i primära mus dopamin nervceller. Fosforylerade α-synucleinaggregat i nervceller induceras med förformade α-synuclein fibriller. Automatiserad avbildning av immunofluorescently märkta celler och opartisk bildanalys gör detta robusta protokoll lämpligt för medelhög till hög genomströmning screening av läkemedel som hämmar α-synuclein ackumulering.
Abstract
Målet med detta protokoll är att upprätta en robust och reproducerbar modell av α-synuclein ackumulering i primära dopamin nervceller. Kombinerat med immunstainning och opartisk automatiserad bildanalys möjliggör denna modell analys av effekterna av läkemedel och genetiska manipulationer på α-synucleinaggregation i neuronala kulturer. Primära midbrain kulturer ger en tillförlitlig källa till bona fide embryonala dopamin nervceller. I detta protokoll, kännetecknet histopathology av Parkinsons sjukdom, Lewy organ (LB), härmades genom tillägg av α-synuclein preformade fibriller (PFFs) direkt till neuronal kultur media. Ackumulering av endogena fosforylerade α-synuclein i soma av dopamin nervceller detekteras av immunstainning redan på 7 dagar efter PFF tillägg. In vitro-cellodlingsförhållanden är också lämpliga för tillämpning och utvärdering av behandlingar som förhindrar α-synukleinackumulering, såsom små molekylläkemedel och neurotrofa faktorer, samt lentivirusvektorer för genetisk manipulation (t.ex. med CRISPR/Cas9). Odling av nervceller i 96 brunnsplattor ökar robustheten och kraften i de experimentella uppställningarna. I slutet av experimentet är cellerna fixerade med paraformaldehyd för immunocytokemi och fluorescensmikroskopiavbildning. Multispektrala fluorescensbilder erhålls via automatiserad mikroskopi av 96 brunnsplattor. Dessa data kvantifieras (t.ex. räkna antalet fosfo-α-synuclein-innehållande dopamin nervceller per brunn) med hjälp av fri programvara som ger en plattform för opartisk höginnehåll fenotyp analys. PFF-inducerad modellering av fosforylerade α-synuclein ackumulering i primära dopamin nervceller ger ett tillförlitligt verktyg för att studera de underliggande mekanismerna medla bildning och eliminering av α-synuclein inneslutningar, med möjlighet till hög genomströmning drog screening och cellulära fenotyp analys.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är en neurodegenerativ sjukdom som kännetecknas av död midbrain dopamin nervceller i substantia nigra (SN), efterföljande förlust av dopamin tonen i basala ganglier, och därav följande motoriska nedskrivningar1,2. En stor histopatologiska funktionen i hjärnan hos PD-patienter är intracellulära protein /lipidaggregat som finns i neuronal soma, kallas Lewy organ (LB), eller i neurites, Lewy neurites (LN), kollektivt känd som Lewy patologi3. Lewy patologi i hjärnan verkar utvecklas med framåt PD liknar spridningen av patogena faktorer genom neuronala anslutningar. Riklig Lewy patologi finns i dopamin nervceller i SN och celler i andra områden som påverkas av neurodegeneration4. Men under sjukdomsprogression, spridning och uppkomsten av protein aggregering inte alltid korrelerar med neuronal död och det exakta bidraget av Lewy patologi till neuronal död är fortfarande oklart5.
LB och LN hade visat sig bestå av membranösa och proteinhaltiga komponenter3. De förstnämnda är membranfragment, vesikulära strukturer (eventuellt lysosomer och autofagosomer) och mitokondrierna3. Den senare består av minst 300 olika proteiner6. En hallmark studie av Spillantini et al.7 visade att den viktigaste proteinkomponenten i Lewy patologi är α-synuclein. Starkt uttryckt i nervceller, och i samband med membran fusion och signalsubstans release, α-synuclein i Lewy patologi är närvarande mestadels i felvikta, amyloid fibril form, varav huvuddelen fosforyleras på Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Viktigt, Det visades också att på grund av dess prion-liknande egenskaper, felvikta α-synuclein kan ha en orsakande roll i Lewy patologi bildning4. De prionliknande egenskaperna hos felvikta α-synuclein visades med både midbrainextrakt från patienter och exogent beredda α-synucleinpreformerade fibriller (PFFs) för att inducera α-synucleinaggregat i nervceller i kultur och in vivo9,10. PFFs presenterar en tillförlitlig och robust modell för att studera utvecklingen av α-synuclein patologi i dopamin nervceller. När PFFs tillämpas på odlade primära nervceller eller injiceras i djurhjärnan, de leder till bildandet av α-synuclein-innehållande inneslutningar i neuriter och cell soma11 som rekapitulerar många funktioner sett i Lewy patologi. Observerade inneslutningar är tvättmedelslösliga i Triton X, ubiquitinerade, färgade med amyloid specifika färgämnet Thioflavin S, och innehåller α-synuclein hyperfosforylerade på Ser12911,12. Viktigt, dessa inneslutningar bildas inte i α-synuclein knockout djur11, vilket tyder på beroendet av deras bildning på endogena α-synuclein.
Icke desto mindre är det svårt att direkt jämföra PFF-inducerad inneslutningar och Lewy patologi finns i PD patienter eftersom mänskliga LBs och LNs är mycket heterogena3. Observerade heterogenitet Lewy patologi kan orsakas av olika stadier av bildandet, olika anatomiska plats, eller skillnader i konformation av felvikta α-synuclein initiera aggregering processen. Samma faktorer kan påverka PFF-inducerad pS129-αsyn positiva inneslutningar. I själva verket, nyligen visade det sig att PFF-inducerad pS129-αsyn positiva inneslutningar i primära neuronala kulturer representerar mycket tidiga stadier av patologi som kan mogna till strukturer som liknar LB efter långvarig inkubationstid12,13.
Modellering tidig spridning och ackumulering av felvikta α-synuclein med PFFs är värdefullt för läkemedelsutveckling, som Lewy patologi spridning anses vara en av de tidiga sjukdomsmarkörerna. Därför kan aggregeringsförebyggande behandlingar vara lovande för att stoppa eller bromsa utvecklingen av PD i mycket tidiga skeden. Flera kliniska prövningar som syftar till att bromsa eller stoppa ackumulering av α-synuclein pågår14. För patienter i senare skeden kan transplantation av dopaminneuronala stamfader vara ett bättre behandlingsalternativ15. Lewy patologi dokumenterades dock i transplanterade embryonala nervceller under obduktionen analys av PD patientens hjärnor16,17, också anger behovet av skydd mot α-synuclein ackumulering.
In vitro, α-synuclein PFFs är kända för att inducera aggregering i förevigade cellinjer, eller oftare, i gnagare primära hippocampus eller när nervceller. Ingen av dessa är nära att recapitulating dopamin nervceller10. Odling av dessa nervceller kräver tät plätering av vissa antal nervceller in vitro18. För att uppnå hög plätering densitet med begränsat material (t.ex. primära dopamin nervceller), mikro ön odling metod används ofta. I mikro ö odling, celler är ursprungligen pläterade i en liten droppe medium (vanligtvis några mikroliter) hålls samman av ytspänning i mitten av en stor brunn18. Efter nervceller bifoga, hela brunnen är fylld med mediet medan cellerna förblir begränsade vid hög densitet i det lilla pläteringsområdet. Förutom att uppnå hög plätering densitet, mikro öar också förhindra plätering nära kanterna av brunnar, där variationer i celltäthet och överlevnad är vanliga. Mikroöar används ofta i relativt stora brunnar eller rätter; dock, upprättande midbrain neuronala kulturer i mikro öar i 96 väl platta format möjliggör studiet av Lewy patologi i bona fide dopamin nervceller med medelhög till hög genomströmning makt. In vitro-experiment med dessa nervceller tillät oss att upptäcka den gliacelllinjebaserade neurotrofa faktorn (GDNF), som främjar överlevnaden av mogna dopaminneuronin vitro och in vivo19,20,2121,22 och förhindrar även bildandet av α-synucleinaggregat i dopaminneuron23. Mänskliga patient-inducerad pluripotenta stamceller-härledda dopamin nervceller utgör en mer exakt modell på grund av deras mänskliga ursprung och längre överlevnad tid in vitro. Induktion av α-synucleinpatologi hos mänskliga nervceller observeras dock efter flera månader, jämfört med en vecka i mus embryonala nervceller och/eller med flera stressfaktorer (t.ex. kombination av α-synuclein overexpression och PFFs)24,25. Dessutom, underhåll av mänskliga dopamin nervceller är dyrare och mödosamt jämfört med primära embryonala nervceller, i huvudsak begränsa deras användning i hög genomströmning applikationer.
Vidare kan primära dopaminneuronkulturer modifieras genetiskt (t.ex. med CRISPR/Cas9) och/eller behandlas med farmakologiska medel23. De utgör en snabb och reproducerbar plattform för applikationer som molekylär väg dissekering och drogbibliotek screening. Även om begränsat material kan erhållas från dessa kulturer, är det fortfarande möjligt att genomföra små genomik /proteomics analyser. Odling primära nervceller i 96 väl format är bättre för immunocytochemistry och fluorescensmikroskopi tekniker, följt av hög innehåll fenotyp analys. Multispektrala fluorescensbilder från automatiserad avbildning av 96 brunnsplattor kan omvandlas till kvantitativa resultat (t.ex. antalet LB-innehållande nervceller per brunn). Sådana analyser kan göras med fri programvara, till exempel CellProfiler26,27. Totalt sett, primära embryonala midbrain kulturer pläterade i 96 väl plattor ger en robust och effektiv plattform för att studera dopamin nervceller och α-synuclein aggregering med möjlighet till hög genomströmning fenotyp screening.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Djurförsöksverket och genomfördes i enlighet med EU:s lagstiftning om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål.
1. Förberedelser
- Förbered dopamin neuron medium (DPM) med 0,46% D-glukos, 1% L-glutamin, 1% N2, 0,2% primocin, kompletteras med DMEM/F12. Filtrera DPM:en efter blandning av ingredienserna. Förvara DPM vid 4 °C och värm varje alikvot endast en gång.
OBS: DPM bör inte innehålla GDNF, eftersom det kommer att minska α-synuclein ackumulering i dopamin nervceller23. - Förbered silikoniserade glaspipetter som är extremt hydrofoba, vilket minimerar fastsättningen på ytan och förlust av celler under den första hanteringen av embryonala nervceller.
- Tillsätt 10 ml silikonvätska till 1 L destillerat vatten och blanda genom omrörning i ett 2 L-kärl. Låt glaspipetterna sänkas ned i silikonlösningen i 15 minuter.
- Skölj pipetterna 3–5x med destillerat vatten. Torka pipetterna över natten vid rumstemperatur (RT) eller i 1–2 timmar vid 100–120 °C uppvärmt sterilt utrymme för att påskynda torkningen.
- Sterilisera pipetterna genom standard autoklavering i en förseglad autoklavpåse.
- Förbered poly-L-ornitin (PO) belagda 96 brunnsplattor med genomskinliga bottnar genom att lägga till 60 μL PO-lösning i de mellersta brunnarna på 96-brunnsplattan som ska användas för såddning av nervcellerna, vilket lämnar minst en rad/kolumn av brunnar vid plattans kanter för att undvika kanteffekter. Förvara den belagda plattan över natten vid 4 °C eller 4 timmar vid RT.
- Före plätering av cellerna, aspirera PO helt och tvätta cellerna tre gånger med 100 μL 1x PBS. Sug upp 1x PBS från brunnarna och håll locket på plattan öppet för fullständig torkning.
Obs: Det är möjligt att samla in begagnad inköpsorder och filtrera den för återanvändning. Detta kan upprepas två gånger för samma PO-lösning. - Tillsätt 50 μl DPM till tidigare belagda brunnar. Sug dpm från brunnarna med en 100 μL plastspets och skrapa samtidigt botten av brunnen med cirkulära rörelser för att ta bort beläggningen vid omkretsen av varje brunn. En PO-belagda ön kommer att förbli i mitten av brunnen.
- Under en laminär huva, tillsätt 10 μl DPM till mitten av varje bestruken ö för att skapa mikroöar.
OBS: En platta med DPM-täckta mikroöar kan förvaras under den laminära flödeshuven i 1–2 timmar under isoleringen av celler.
2. Isolering av det ventrala mellanhjärnsgolvet från E13.5 musembryon
OBS: Se bild 1 för midbrain golv dissekering steg.
- Fyll en 10 cm petriskål med Dulbeccos buffert före dissekering och förvara den på is.
- Avliva en 13,5 gravid kvinnlig mus enligt institutionens riktlinjer. Placera musen platt på ryggen och spraya den främre kroppen med 70% etanol. Lyft huden ovanför livmodern med pincett och gör ett snitt med kirurgisk sax för att exponera livmodern.
- Ta försiktigt bort livmodern och placera den i den tidigare beredda petriskålen på is.
- Med hjälp av kirurgisk sax under laminärhuven på RT, ta försiktigt bort embryona från livmodern. Ta bort alla placentarester från embryona med pincett och placera dem i en ny 10 cm petriskål fylld med Dulbeccos buffert.
- Använd dissekeringstång pincett eller nålar, skär av bakkvartsdelen av huvudet från de platser som är markerade med svarta pilar i figur 1A. Ta bort den skurna biten från resten av embryot (figur 1B).
- Placera den bakre delen av den skurna biten mot observatören (figur 1C) och försiktigt skär den öppen från caudal till kranial (figur 1D). Från 0,5 mm under kranialöppningen, skär en 2 mm2–3 mm2 region, som visas i figur 1E.
- Samla upp det ventrala mellanhjärnsgolvet (se figur 1F) i ett tomt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förvara mikrocentrifugröret på is tills alla mellanhjärngolv samlas i det.
OBS: Alternativt kan mellanhjärngolven samlas in med en 1 ml mikropipette efter dissekering av alla embryohjärnor.
Figur 1: Dissekering av mellanhjärnsgolv från E13.5 mus embryo. (A) Skärplatser vid bakkvartsdelen av huvudet är markerad med svarta pilar och vita streckade linjer. (B)Stycket avlägsnades från resten av embryot. Den borttagna biten är inringad. (C) Stycket vändes 90° för att möta den bakre mot observatören. (D) Stycket öppnades från de svarta pilarna, från caudal till kranial (märkt med vit streckad linje). (E)Från 0,5 mm till 1 mm under öppningen, 2 mm2-4 mm2 regionen skars (märkt med svarta linjer). (F) Den ventrala mellanhjärnan golvet isolerades (märkt med svart streckad kvadrat). Skala staplar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Upprättande av primära embryonala midbrainkulturer från E13.5 musembryon i 96-brunnsplåtsformat
- Efter insamling av mellanhjärngolv från alla embryon i samma 1,5 ml-rör, ta bort den återstående Dulbeccos buffert och tvätta vävnadsbitarna tre gånger med 500 μL Ca2+, Mg2+-fri Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Ta bort HBSS och tillsätt 500 μL 0,5% trypsin till röret. Inkubera den vid 37 °C i 30 min.
- Under inkubation, värm 1,5 ml fetalt bovin serum (FBS) vid 37 °C, tillsätt 30 μl DNase I till FBS och blanda. Också, brand-polera spetsen av en silikoniserad glas pipett. Se till att hålet inte har några vassa kanter och är ungefär lika stort som en 1 ml mikropipettespets.
OBS: Alternativt kan en låg vidhäftning 1 mL mikropipette spets användas för trituration. Dock siliconized glas pipetter verkar ge bästa resultat. - Tillsätt 500 μl av FBS/DNase-blandningen till den delvis smälta vävnaden så snart inkubationen i steg 3.2 slutar. Använd glas pipetten för att triturate vävnaden i FBS / trypsin mix. Triturate tills vävnader separera i små, knappt synliga partiklar. Undvik bubblor under trituration.
- Låt de överblivna partiklarna fällas ned i botten av mikrocentrifugröret med tyngdkraften. Utan pipettering fällningen i botten, samla supernatanten i en tom 15 ml konisk polypropylenrör.
- Späd FBS/DNase I från steg 3.3 (98:2) med 1 000 μl HBSS för att erhålla FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Blanda genom pipettering upp och ner. Tillsätt 1 000 μL av den nya blandningen till överblivna partiklarna i mikrocentrifugröret. Triturate igen och upprepa steg 3.5.
- Upprepa föregående steg en gång till för att använda alla FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
- När alla supernatant samlas inuti 15 ml röret (från steg 3,5, 3,7 och 3,8), använd en bordsskiva centrifug för att snurra ner supernatanten (~ 3 ml) vid 100 x g, i 5 min. Ta bort supernatanten utan att röra pelleterade celler längst ner.
- Tvätta cellpelleten genom att lägga till 2 ml DPM till röret och snurra ner det i 100 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och upprepa tvättningen 2x för att minimera skräpet i de pelleterade cellerna.
OBS: Använd alltid färsk, uppvärmd DPM för de odlade nervcellerna. För tvättstegen behöver DPM inte vara färskt, utan bör förvärjas till 37 °C. - Späd cellerna med färsk, varm DPM och överför dem till ett mikrocentrifugrör. Mängden DPM för utspädning beror på antalet embryon som används för vävnadsdissekering. Använd till exempel 150 μl DPM för att späda ut de celler som erhålls från tio embryon.
- Överför 10 μl celler i DPM till ett mikrocentrifugrör. Blanda dem med 10 μL 0,4% Trypan blå fläck. Räkna liveceller (dvs. Trypan blå negativ) celler med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
OBS: Använd 30.000 celler för plätering per brunn för att få ~ 1,000 dopamin nervceller per brunn. Om celltätheten är högre än ~30 000 celler per 6 μL, späd cellerna ytterligare med DPM före plätering så att såvolymen inte är mindre än 6 μL. - Utan att röra botten av brunnarna, ta bort DPM från mikroöarna som skapats vid steg 1.6.
- För att få reproducerbar celltäthet vid varje brunn, blanda cellerna genom skonsam pipettering före plätering i brunnen. Med en 1-10 μL mikropipette, tillsätt 6 μL celler till mitten av brunnen, på platsen för varje tidigare mikroö.
- Fyll de tomma brunnarna vid kanterna av plattan med 150 μL vatten eller 1x PBS för att minimera avdunstning från brunnarna som innehåller neuronala kulturer. Inkubera plattan i en inkubator vid 37 °C, 5% CO2 för 1 h.
- Efter 1 h, ta bort plattan från inkubatorn, tillsätt 100 μl DPM i varje brunn med celler och placera den tillbaka i inkubatorn.
- Två dagar efter plätering (dag in vitro 2, eller DIV2), ta bort 25 μL och tillsätt 75 μl färsk DPM för att få den slutliga medievolymen till 150 μL och undvika avdunstning så mycket som möjligt.
- Byt ut hälften av mediet mot färsk DPM (dvs. ta bort 75 μL och tillsätt 75 μl färsk DPM) vid DIV5. Utför inga medieändringar efter DIV5.
4. Induktion av α-synucleinaggregat i primära embryonala dopaminneuroner genom sådd med förformade fibriller
Protokoll för anskaffning och validering av pff hade noggrant beskrivits och diskuterats i flera nyligen genomförda publikationer11,,28,,29,30. Efter allt arbete med PFFs, rengör laminära huven eller någon utrustning som kan ha kontaktat PFFs med 1% SDS, sedan med 70% etanol31.
- Före experimentet späds ut PFFs med 1x PBS till en slutlig koncentration på 100 μg/ml. Sonikera utspädda PDF i mikrocentrifugrör med bad sonicator vid hög effekt med vattenbadkylning vid 4 °C i 10 cykler, 30 s ON/30 s OFF.
OBS: Det är viktigt att fibriller vara ordentligt sonicated att generera fragment ~ 50 nm lång. Storleken på sonicated PFFs kan mätas direkt från överföring elektronmikroskop bilder av PFFs färgas som beskrivs av Patterson et al.30. Ultraljudsbehandling kan uppnås som beskrivs ovan i en hög effekt bad sonicator. Alternativt kan en spets sonicator användas30. Sonicated PFFs kan lagras vid -80 °C i små alikvoter för att undvika flera frysnings-/upptiningscykler. - På DIV8, tillsätt 3,75 μL 100 μg/ml PIF per brunn till 150 μL medium i brunnen till en slutlig koncentration på 2,5 μg/ml. Använd samma mängd 1x PBS för kontrollgruppen.
- Förbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS och förvara alikvoterna vid -20 °C. Följ stegen nedan för att göra det.
OBS: PFA är giftigt; bär mask och handskar under beredningen, arbeta alltid under en laminärhuva och kassera allt fast och flytande PFA-avfall enligt institutionens anvisningar.- Värm 500 ml 1x PBS i ett 1 L-kärl. Sätt en omrörstång i kärlet och sätt kärlet på en magnetisk omrörare med en värmefunktion. Justera temperaturen mellan 40–60 °C för att förhindra kokning samtidigt som lösningen håller värmen.
- Mät 20 g PFA-pulver under huven i en engångsförpackning av plast. Tillsätt försiktigt PFA-pulvret i kärlet fyllt med 1x PBS. Börja röra om i lösningen.
- Tillsätt 200 μl natriumhydroxid på 200 grader i lösningen och fortsätt omrörning i ~15 minuter tills PFA löses upp helt.
- När lösningen verkar homogen, tillsätt 168 μL av 5 M väteklorid för att balansera pH till ~7. Kontrollera pH med engångsfärgfasta pH-indikatorremsor.
- Ta bort kärlet från värmaren och låt det svalna till RT. Filtrera lösningen och alikvoten för förvaring vid -20 °C. Tina alikvoterna på RT före användning och frys inte igen efteråt.
- På DIV15 tar du bort alla medier från brunnarna genom pipettering. Tillsätt 50 μl 4% PFA till varje brunn för att fixera cellerna och inkubera i 20 min vid RT. Efter inkubation avlägsna PFA från brunnarna och tillsätt 100 μl 1x PBS till varje brunn för att tvätta cellerna. Ta bort 1x PBS och tvätta 2x mer.
- Lämna 100 μl 1x PBS i varje brunn för att undvika torkning. Förvara plattan vid 4 °C tills immunkemi utförs.
5. Immunfluorescent färgning och automatiserad avbildning av primära embryonala dopamin nervceller i 96 väl plattor
- Ta bort 1x PBS och permeabilisera cellerna genom att tillsätta 100 μL 0,2% Triton X-100 i PBS (PBST) per brunn och inkubera vid RT i 15 min.
- Ta bort PBST och tillsätt 50 μl 5% normalt hästserum (NHS) per brunn till PBST. För att blockera den ospecifika antigenaktiviteten inkuberar du vid RT i 1 h.
- Späd de primära antikropparna mot TH och pS129-αsyn (1:2 000) i 5% NHS i PBST. Tillsätt 50 μl utspädda antikroppar till varje brunn och inkubera över natten vid 4 °C.
- Avlägsna antikroppar och tillsätt 100 μl 1x PBS till varje brunn för att tvätta cellerna. Ta bort 1x PBS och upprepa tvättning 2x.
- För att förhindra blekning av fluorescerande molekyler, börja arbeta under minimala ljusförhållanden. Späd de sekundära fluorescerande märkta antikropparna (1:400) i PBST. Tillsätt 50 μL utspädda antikroppar till varje brunn och inkubera vid RT i 1 h.
- Ta bort antikroppslösningen och tillsätt 100 μl 1x PBS till varje brunn för att tvätta cellerna. Ta bort 1x PBS och upprepa tvättning 2x.
- Ta bort 1x PBS, tillsätt 50 μL av 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) per brunn för att färga kärnorna i de odlade cellerna och inkubera vid RT i 10 min.
- Tvätta cellerna 3x med 100 μl 1x PBS i 5 min vardera. Förvara 100 μl 1x PBS i varje brunn efter den sista tvätten. Täck plattan med aluminiumfolie och förvara den vid 4 °C tills avbildning.
- Bild primära embryonala dopamin nervceller i en 96 väl visa platta med en hög innehåll platt scanner (se Tabell över material) utrustad med en 10x mål.
- Justera inställningarna baserat på specifikationerna för 96-brunnsplattan, såsom plåttyp, tillverkare, storlek, avstånd mellan brunnar samt typ och mängd medium.
- Välj avbildningsområdet för brunnen för att täcka alla celler i en mikroö. Välj ett exempel på ett bra sätt om du vill justera autofokus. Basera det inledande fokuset på DAPI.
- Kalibrera förvärvstiden för varje fluorescerande kanal, baserat på intensiteten i färgning i kontrollbrunnar. Justera parametrarna så att man i PFF-behandlade kontrollbrunnar tydligt kan skilja dopaminceller som hyser pS129-αsyn-aggregat i cell soma, vilket möjliggör entydig kvantifiering av pS129-αsyn positiva och pS129-αsyn negativa celler.
OBS: Brunnar som inte innehåller PDF bör inte ha någon färgning för pS129-αsyn; Därför kan dessa brunnar användas som negativ kontroll för att justera pS129-αsyn intensitet. - Avbilda alla valda brunnar med ett 10x-mål samtidigt för alla kanaler med immunfluorescensfärgning med exakt samma parametrar.
- Alternativt kan etikett α-synuclein inneslutningar i en delmängd av brunnarna med antikroppar som är specifika för trådbildning α-synuclein bekräfta att förändringar i antalet pS129-αsyn-positiva inneslutningar återspeglar minskningen av proteinackumulering snarare än hämning av fosforylering eller defosforylering av pS129-αsyn.
- Upprepa steg 5.3 ersätta pS129-αsyn antikroppar med α-synuclein glödtråd antikroppar (1:2,000). Avbilda det färgade aggregerade α-synuclein som i steg 5.13.
6. Bildanalys med högt innehåll
Obs: Detta steg utförs med öppen tillgång programvara CellProfiler version 3.15 och CellProfiler Analyst version 2.2.1. 27,32. Men med viss erfarenhet kan analoga bildanalyspipelledningar ställas in i en annan version eller liknande programvara. Se programsidan för en detaljerad förklaring (se Tabell över material).
- Ladda ner och installera CellProfiler och CellProfiler Analyst programvara.
- Öppna CellProfiler. Välj fil| Importera| Pipeline från fil och ladda exempelpipelinen som tillhandahålls, TH_LB_V1.cpipe-fil (se tilläggsfilerna).
Exempelpipellines kräver specifika justeringar beroende på egenskaperna för de förvärvade avbildningarna och bildinhämtningsplattformen. Example_Imageskan användas för den första prövningen av programvaran. - Ladda bilder som ska analyseras genom att dra dem till bildmodulen. Använd filteralternativ för att välja endast bildfiler från den inlästa mappen.
- Använd modulen Metadata för att extrahera brunn, visningsfält och kanalinformation från bildfilsnamnet. Klicka på förstoringsglaset symbolen och ange reguljära uttryck för att extrahera Plate, Well, Imaging Site och Channel information från filnamn.
Obs: Reguljärt uttryck beror på fil namngivning konvention av platta mikroskop. Om du klickar på frågetecken bredvid förstoringsglaset får du information om syntaxen. - Under Modulen NamesAndTypes väljer du korrekta kanalnummer för DAPI, TH och pS129-αsyn-färgning(standardkanalerna 1, 2och 3). I modulen Grupper väljer du "Nej".
- Använd modulen Metadata för att extrahera brunn, visningsfält och kanalinformation från bildfilsnamnet. Klicka på förstoringsglaset symbolen och ange reguljära uttryck för att extrahera Plate, Well, Imaging Site och Channel information från filnamn.
- Använd IdentifyPrimaryObjects moduler för att segmentera dopamin nervceller med TH färgning av cell soma.
Obs! Specifika värden kräver inledande optimering baserat på hur plattor färgas och avbildas. Om efterföljande plattor bearbetas på liknande sätt ska inga eller minimala ytterligare justeringar behövas. - Använd MeasureObjectIntensity-modulen för att inhämta information om fluorescensintensitet från TH- och DAPI-kanaler.
- Använd MeasureObjectSizeShape modul för att mäta storlek och form funktioner segmentet dopamin nervceller.
- Använd MeasureTexture modul för att mäta textur funktionsinformation från TH-kanal från segmenterade dopamin nervceller.
- Använd Modulen ExporteraToDatabase för att spara mått i databasen.
- Namndatabasfilen enligt experimentnamnschemat (t.ex. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Välj Utdatamapp för databasfilen. Databasfilen kan vara flera gigabyte stor och bör sparas helst i den överordnade mappen i bildfilerna.
- Öppna CellProfiler Analyst och välj den V1_THCells.properties-fil som skapades i steg 6.8. Öppna verktyg| Klassificerare.
- Sortera segmenterade celler i två kategorier: positiva (dvs. korrekt segmenterade dopamin neuron cellkroppar) och negativa (dvs segmentering och färgning artefakter) Se figur 2A och 2B.
- Ange antalet hämtade celler till 50 slumpmässiga celler och klicka på Hämta (detta laddar bilder av de celler som segmenteras i steg 6.4). Sortera minst 30 celler på varje lagerplats genom att dra dem till motsvarande lagerplats längst ned i fönstret. Hämta fler celler efter behov.
- I den nedrullningsbara menyn väljer du Använd snabb skonsam boost med 50 max regler och klicka på Träna.
- Ställ in "Hämta" till 50 positiva celler och tryck på Hämta för att få TH-positiva celler enligt klassificeraren (bild 2A). Använd det erhållna resultatet för att utvärdera kvaliteten på den tränade klassificeraren.
- Upprepa steg 6.10.1–6.10.3 och lägg till nya exempelceller för att träna klassificeraren tills resultaten är tillfredsställande.
- Välj Avancerat| Redigera regler... och i ett nytt fönster markera all text (Ctrl + a) och kopiera den (Ctrl-c) till anteckningsblock (Ctrl-v). Spara som TH_rules.txt-fil.
OBS: Beroende på tätheten av neuronal kultur och kvaliteten på färgning och avbildning, detta steg kanske inte är nödvändigt, eftersom det kan vara möjligt att ställa in parametrar i steg 6.4 för att segmentera endast TH positiva celler med hög noggrannhet. Om så är fallet är en hel TH_LB_V1.cpipe-körning inte nödvändig, och de korrekta parametrarna för IdentifyPrimaryObjects-moduler bör placeras direkt i motsvarande modul i TH_LB_V2.cpipe.
Figur 2: Kvantifiering av dopaminneuron och pS129-αsyn positiva dopaminneuron med CellProfiler Analyst programvara baserad på DAPI, TH, och pS129-αsyn immunofluorescens. (A) TH-celler i den positiva bin valdes baserat på DAPI färgning (blå) märkt med en liten kvadrat vid den första cellen som valts vid bilden och den omgivande TH färgning (grå) på soma. (B)Icke-cell artefakter placerades i den negativa bin. (C) pS129-αsyn positiva TH nervceller valdes baserat på stor integration av pS129-αsyn färgning (röd) märkt med en liten kvadrat vid den första cellen som valts vid bilden, som omger kärnorna eller vid cell soma. (D)TH-celler utan sådana pS129-αsyn inneslutningar placerades i den negativa bin. Skalstänger = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Öppna CellProfiler och välj Arkiv| Importera| Pipeline från fil och läsa in TH_LB_V2.cpipe-fil. Upprepa steg 6.3–6.7. Den här delen av rörledningen ska vara identisk med TH_LB_V1.cpipe.
- Använd Modulen FilterObjects för att endast skicka sanna TH-positiva celler för vidare analys.
- Ange valfiltreringsläge till Regler. select I Regel- eller klassificerarfilnamn väljer du den TH_rules.txt-fil som skapades i steg 6.10.5.
- Ange fältet Klassnummer till 1 om TH-positiva celler sorterades till det nedre vänstra fönstret.
- Använd MeasureObjectIntensity-modulen för att hämta information om fluorescensintensitet från pS129-αsyn-kanalen.
- Använd MeasureTexture-modulen för att mäta texturfunktionsinformation från TH-kanal från filtrerade celler.
- Använd MeasureObjectSizeShape-modulen för att mäta storleks- och formegenskaper för filtrerade celler.
- Använd Modulen ExporteraToDatabase för att spara mått i databasen.
- Namndatabasfilen i enlighet med experimentnamngivningsschemat (t.ex. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Välj utdatamapp för databasfil.
- Öppna CellProfiler Analyst och välj V2_THpos.properties-filen.
- Sortera segmenterade celler i två kategorier – pS129-αsyn positiva och pS129-αsyn negativa celler (figur 2C,D).
- Ange antalet hämtade celler till 50 slumpmässiga celler och klicka på Hämta (detta laddar bilder av celler segmenterade i steg 4). Sortera minst 30 celler på varje lagerplats genom att dra dem till motsvarande lagerplats längst ned i fönstret.
- I den nedrullningsbara menyn väljer du Använd snabb skonsam boost med 50 maxregler rules eller Random Forest-klassificerare. Random Forest Klicka på Tåg.
- Ställ in "Hämta" till 50 positiva celler och tryck på Hämta för att få pS129-αsyn positiva celler enligt klassificerare (Figur 2C). Ställ in "Hämta" till 50 negativa celler och tryck på Hämta för att få pS129-αsyn-negativa celler enligt klassificerare (Bild 2D). Utvärdera kvaliteten på den tränade klassificeraren.
- Upprepa steg 6.17.2–6.17.4 och lägg till nya exempelceller för att träna klassificeraren tills resultaten är tillfredsställande.
- Klicka på Betyg alla för att få resultattabellen som sammanfattar antalet pS129-αsyn positiva och negativa dopaminneuron i varje brunn.
Representative Results
Några dagar efter plätering (DIV1-DIV3) gjordes ljusfältsmikroskopi för att bedöma de odlade cellernas hälsa och homogena spridning och enhetligheten hos dessa villkor vid de enskilda brunnarna (figur 3). Odlade mellanhjärnceller spreds homogent inom mikroön som skapades före pläteringen (figur 3A,B). Primära nervceller hade bosatt sig på den belagda marken homogent och etablerade neuronala prognoser (figur 3B). En liten klump av celler (diameter mindre än 150 μm) observerades vid brunnen och visades som ett exempel (figur 3C).
Figur 3: Några dagar efter plätering (t.ex. (A) Odlade celler spridda över mitten av brunnen inom DEN PO-belagda mikroön med en ungefärlig radie på 4,4 mm (visas med vita pilar) som skapats genom repor PO från cirka 1 mm väl omkrets (visas med svarta pilar). (B)Odlade primära nervceller homogent spridda inom området och neuronala prognoser (markerade med röda pilspetsar) observerades. (C)En cellklump med en diameter som är mindre än 150 μm är märkt med blå pilspetsar. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Primära mus mellanhjärnekulturer var immunstained med anti-TH och anti-pS129-αsyn antikroppar och avbildas med ett automatiserat mikroskop efter 15 dagar in vitro. Belagda mikroöar som begränsad areal för fastsättning av celler i mitten av brunnar (figur 4A,B). Dopaminneuronner som var immunmärkta med TH-markör spreds runt mikroön i ett monolager, separerade från varandra, utan klumpar (figur 4A' och 4B').
Figur 4: Vid DIV15 kvantifierades 800–1 000 dopaminceller från varje mikroö, med eller utan PFF-behandling. Representativa bilder av embryonala mellanhjärnhjärnkulturer immonustained med anti-TH och anti-pS129-αsyn antikroppar. (A, A', A'') Kontrollera celler utan PFF-behandling. (B, B', B'') PFF-behandlade celler med pS129-αsyn inneslutningar. (C)Kvantifiering av TH-positiva cellnummer i brunnar som behandlats med fordon (kontroll), PFFs eller PFFs med 50 ng/mL GDNF. DKvantifiering av pS129-αsyn-aggregat i TH-positiva celler som behandlats med fordon (kontroll), PDF eller PFFs med 50 ng/mL GDNF. Statistisk signifikans beräknades med slumpmässig blockdesign ANOVA. **p < 0,01, n = 4 enskilda plattor (biologiska replikat), var och en med 3–6 brunnar per behandlingsgrupp (tekniska upprepningar). Skalstänger = 300 μm för A, B; 50 μm för A', B'; 25 μm för A'', B''. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Även om kulturer utan PFF-behandling inte hade någon pS129- αsyn-signal (figur 4A' och 4A'') utvecklade kulturer som behandlades med α-synuclein PFFs pS129-αsyn positiva inneslutningar (figur 4B" och 4B''). In vitro PFF behandling för 7 dagar orsakade inte någon signifikant minskning av antalet TH-positiva nervceller, jämfört med andra experimentella grupper (figur 4C). PFF-behandlade kulturer hade en population av ~40% av pS129-αsyn positiva TH-positiva dopamin nervceller. Behandling med positiv kontroll, GDNF, minskade andelen TH-positiva dopamin nervceller med pS129-αsyn positiva inneslutningar (Figur 4D, se även rådata och exempelbilder i kompletterande filer).
Kompletterande filer: Exempel på pipelines för bildanalys med hög innehåll med CellProfiler och CellAnalyst-programpaket, exempelbilder och rådata för figur 4E, F. (1-9) Example_Images. Öppna dessa bilder med ImageJ eller CellProfiler. (10)Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Steg 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Steg 6.11–6.18) Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Sprida Lewy patologi, varav pS129-αsyn är en viktig beståndsdel, är en histopatologiska kännetecken för PD. Stoppa eller bromsa ansamling av aggregerade pS129-αsyn kan bromsa degeneration av dopamin nervceller och utvecklingen av alfa-synucleinopathy. Emellertid, en mekanistisk förståelse av hur pS129-αsyn aggregering bidrar till nedläggningen av dopamin nervceller fortfarande måste fastställas. Bevis från studier efter människans postmortem på hjärnprover från patienter i olika stadier av sjukdomen samt observation av pS129-αsyn positiv integration i transplanterade fetala nervceller tyder starkt på spridning av Lewy patologi mellan cellerna16,17,33. Prion-liknande spridning av pS129-αsyn har därför nyligen sammanfattats med hjälp av α-synuclein PFFs9,10. Etablera en robust, kostnadseffektiv, och relativt hög- eller medelgenomströmning modell av pS129-αsyn spridning och ackumulering, särskilt i dopamin nervceller, kan avsevärt påskynda sökandet efter nya behandlingar och föreningar ändra denna process.
Eftersom förlust av dopamin nervceller är den främsta orsaken till motoriska symtom i PD och dessa celler har många unika egenskaper2,34,35, modellering av prion-liknande spridning av pS129-αsyn i dopamin nervceller är den mest relevanta typen av modell från translationella perspektiv. Protokoll som använder mikro ö kulturer av embryonala midbrain nervceller på 4 väl plattor och halvautomatisk kvantifiering har beskrivits tidigare18. Det protokoll som beskrivs här anpassades till 96 brunnsplattor och ger mindre mödosam beredning av mikroöar, vilket möjliggör beredning av upp till fyra plattor som innehåller 60 brunnar vardera av en erfaren forskare under en arbetsdag. Culturing dopamin nervceller i 96 väl plattor möjliggör testning läkemedel på lägre mängder och möjliggör hög transduktion priser med lentivirus vektorer. Det är också möjligt att kombinera olika behandlingar för att utföra mer komplexa experiment.
Innan någon behandling (inklusive PFFs) tillämpas bör kvaliteten på odlingen kontrolleras med ljusfältsmikroskopi. Om mikroskopisystemet inte använder en CO2 kammare med uppvärmning, cellerna bör inte hållas utanför inkubatorn i mer än några minuter, eftersom primära mus dopamin nervceller är känsliga och lätt stressade. Av samma skäl rekommenderas att den första bildåtergivningen ska göras efter 24 timmars inkubation (mellan DIV1-DIV3). Cellerna ska verka vara vid liv med nuvarande cellkroppar och homogent spridas inuti mikroön. Primära nervceller skulle ha bosatt sig på PO-belagda marken och började etablera neuronala prognoser. Det är möjligt att observera små klumpar av celler (dvs. diameter mindre än 150–200 μm) som kan bildas om triturationsprocessen inte görs på rätt sätt eller pläteringsdensiteten är högre än rekommenderat. Dessa små klumpar skulle inte påverka experimentet, om de inte är mer än ett fåtal per brunn och / eller större. Klumpiga celler gör det mycket svårt att identifiera immunohistokemiska markörer och enskilda celler under bildanalysen. Det är viktigt att undvika sådana klumpar genom noggrann beläggning, triturating, och kontrollera plätering densitet. Om enhetligheten i dessa villkor inte kan iakttas vid vissa brunnar, inkludera inte dessa defekta brunnar i experimentet. Ett sådant undantag bör göras innan någon behandling utförs.
Dessutom, utnyttjande av 96 väl plattor möjliggör bekväm flerkanalig pipett användning under färgning förfaranden och direkt visualisering med automatisk platta mikroskop, ytterligare öka genomströmningen. Användning av automatiserad bildkvantifiering är oumbärlig för analys av data från högkvalitativa bildplattformar. Förutom förmågan att bearbeta tusentals bilder som erhållits från varje experiment, säkerställer det opartisk, identisk kvantifiering av alla behandlingsgrupper. Det arbetsflöde som föreslås för bildanalysen baseras på enkla principer för segmentering av dopaminneuroner, filtrering av korrekt segmenterade celler genom övervakad maskininlärning och därefter kvantifiering av fenotyper (pS129-αsyn positiv och pS129-αsyn negativ), igen genom övervakad maskininlärning. Även om flera olika metoder för denna uppgift kan föreställa sig, Vi har hittat kombinationen av segmentering med maskininlärning vara den mest robusta för dopamin kulturer på grund av hög plätering densitet, de olika formerna av dopamin nervceller, och förekomsten av starkt färgade neurites. Den föreslagna bildanalysalgoritmen implementerades i CellProfiler och CellProfiler Analyst, öppen källkod, fritt tillgänglig programvara för bildanalys av höginnehåll26,27. Algoritmen kan också implementeras med andra bildanalysprogram, antingen öppen källkod (t.ex. Men enligt vår erfarenhet dessa ofta offra anpassningsmöjligheter för användarvänlighet, och därför kanske inte fungerar bra i komplicerade analyser. Vi har funnit att CellProfiler och CellProfiler Analyst mjukvarupaket ger särskilt tillförlitliga resultat genom att kombinera ett stort antal implementerade algoritmer, extrem flexibilitet i utformningen av arbetsflödet, och samtidigt hantering och effektiv bearbetning av hög innehåll bilddata.
Det beskrivna protokollet kan också anpassas för kvantifiering av andra cellulära fenotyper som kännetecknas av immunsormning med olika antikroppar, såsom markörer för andra neuronala populationer (t.ex. DAT, GAD67, 5-HT etc.) och proteinaggregat (t.ex. fospo-Tau, ubiquitin). Flera fluorescerande markörer kan också kombineras för att skilja flera fenotyper (t.ex. celler med inneslutningar i olika stadier av mognad). Automatiserad klassificering av flera fenotyper bör också vara lätt att genomföra i de beskrivna bildanalyspipelledningarna genom att bara lägga till en kanal som innehåller immunofluorescent bilder av ytterligare markörer för att mäta steg och sortera celler i flera lagerplatser. Användning av flera markörer samtidigt skulle dock kräva optimering av immunstainning och bildframställning villkor. Dessutom, för bättre kvalitet i immunofluorescens imaging, användning av särskilda svartväggiga 96 väl plattor uttryckligen utformade för fluorescerande mikroskop rekommenderas. Dessa kan dock vara betydligt dyrare än vanliga cellodlingsplattor, vilket är tillräckligt för den analys som beskrivs i vårt protokoll.
Typ och kvalitet av utnyttjade PFFs är avgörande för resultatet av experimenten. PIF-fonder kan både påverka analysens robusthet och tolkningen av resultaten. Beredningsförhållanden kan påverka såddeffektiviteten hos pff-fonder och, faktiskt, PFF-"stammar" med olika fysiologiska egenskaper har rapporterats36. Utarbetandet och valideringen av pff:er ligger dock utanför denna artikels tillämpningsområde och har beskrivits i flera publikationer11,,28,,29,30. Utöver beredningsprotokollet bör ursprungsarten för α-synuklein i pff-fibrer (t.ex. mus, människa) och användningen av vildtyp eller muterat protein (t.ex. human a53T α-synuclein) beaktas, beroende på de särskilda experimentella förhållandena. Induktion av pS129-αsyn ackumulering av PFFs visade sig vara beroende av kulturens ålder (dvs. dagar in vitro), med mer mogna kulturer som visar mer uttalad induktion11. Detta beror förmodligen på det ökade antalet neuronala anslutningar i mer mogna kulturer, och ökade α-synuclein proteinnivåer. I våra händer gav behandling med PFFs vid DIV8 de mest robusta resultaten, med uttalad ackumulering av pS129-αsyn i dopamin neuron soma, utan att kompromissa med neuronal överlevnad. Det beskrivna protokollet är väl lämpad att studera behandlingar ändra tidiga händelser som leder till aggregering av endogena α-synuclein eftersom vi kvantifiera pS129-αsyn positiva inneslutningar vid en relativt tidig tidpunkt, 7 dagar efter inokulering med PFFs. Vid denna tidpunkt, intrasomal inneslutningar finns i en betydande del av cellerna och kan lätt särskiljas genom immunstaining medan ingen PFF-inducerad cell död observeras, förenkla tolkningen av resultaten. Viktigt, eftersom morfologi och sammansättning av PFF-inducerad inneslutningar kan förändras över tiden12,13, det beskrivna protokollet kan i princip ändras för att studera mer mogna inneslutningar genom fixering och immunstainning vid senare tidpunkter. Emellertid, hålla dopamin nervceller i kultur längre än 15 dagar kräver extrem försiktighet, och kan framkalla ytterligare variation på grund av celler inte överleva självständigt från PFF inokulering. Dessutom komplicerar mer utökade kulturer läkemedelsbehandlingsscheman. Många föreningar har begränsad eller inte dåligt kännetecknas stabilitet i cellodlingsmediet, och påfyllning av ett läkemedel är inte trivialt eftersom fullständigt utbyte av medium äventyrar överlevnaden av dopaminkulturer.
Fosforylering av α-synuklein vid Ser129 rapporteras konsekvent i PFF-baserade modeller av α-synucleinaggregering och colocalizes med markörer för felvikning och aggregering såsom Thioflavin S, ubiquitin, eller konformationsspecifika antikroppar11,12. I våra händer ger immunvård för pS129-αsyn också den starkaste signalen med den lägsta bakgrunden och är enklaste att analysera, vilket ger robusta resultat när flera behandlingar kontrolleras. Viktigt är att immunstainning med pS129-αsyn-antikroppar inte detekterar PDF:er som förblir utanför cellerna, vilket avsevärt minskar bakgrunden. Det är dock viktigt att komma ihåg att Ser129 fosforylering förmodligen är en av de tidigaste processer som är kopplade till felvikning av α-synuclein och kan regleras annorlunda under särskilda förhållanden. Därför bör alla resultat som visar positiva effekter på pS129-αsyn bekräftas av andra markörer.
Statistisk analys bör skräddarsys på motsvarande sätt med experimentell design. Det är viktigt att utföra experiment i minst tre oberoende biologiska replikat (dvs. separata primära neuronala kulturer). Dessa replikat bör pläteras på olika plattor och behandlas oberoende av dem. Vi analyserar data från replikat på olika plattor med slumpmässig blockdesign ANOVA37 för att ta hänsyn till ihopparning av data för olika experimentella plattor.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar prof. Kelvin Luk för hans generösa gåva av α-synuclein PFFs, Conjung Zheng för att etablera och odling neuronala celler, och Light Microscopy Unit vid Institutet för bioteknik, Helsingfors universitet, för imaging immunfläckade celler. Detta arbete stöddes av bidrag från 3i-Regeneration av Business Finland (Finansieringsverket för innovation), Finlands Akademi #309489, #293392, #319195. Sigrid Juselius Foundation, och de lagstadgade medlen från Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
