Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å studere nevronal α-synuclein akkumulering i primære mus dopamin nevroner. Fosforylert α-synuclein aggregater i nevroner induseres med pre-formet α-synuclein fibriller. Automatisert avbildning av immunfluorescerende merkede celler og objektiv bildeanalyse gjør denne robuste protokollen egnet for middels til høy gjennomstrømningsscreening av legemidler som hemmer α-synuclein akkumulering.
Abstract
Målet med denne protokollen er å etablere en robust og reproduserbar modell av α-synuclein akkumulering i primære dopamin nevroner. Kombinert med immunostaining og objektiv automatisert bildeanalyse, gjør denne modellen det mulig å analysere effekten av narkotika og genetiske manipulasjoner på α-synuclein aggregering i nevronale kulturer. Primære midbrain kulturer gir en pålitelig kilde til bona fide embryonale dopamin nevroner. I denne protokollen, kjennetegnet histopathology av Parkinsons sykdom, Lewy organer (LB), etterlignes av tillegg av α-synuclein pre-formet fibrils (PFFs) direkte til nevronale kultur medier. Akkumulering av endogene fosforylert α-synuclein i soma av dopaminnevroner oppdages ved immunos oppnåelse allerede på 7 dager etter PFF-tillegget. In vitro cellekultur forhold er også egnet for anvendelse og evaluering av behandlinger som hindrer α-synuclein akkumulering, som små molekyl medisiner og nevrotrofiske faktorer, samt lentivirus vektorer for genetisk manipulasjon (f.eks med CRISPR / Cas9). Å ulturre nevronene i 96 brønnplater øker robustheten og kraften i de eksperimentelle oppsettene. På slutten av forsøket er cellene festet med paraformaldehyd for immunocytokjemi og fluorescensmikroskopi. Multispektrale fluorescensbilder oppnås via automatisert mikroskopi av 96 brønnplater. Disse dataene kvantifiseres (f.eks. teller antall fosfor-α-synucleinholdige dopaminnevroner per brønn) med bruk av fri programvare som gir en plattform for objektiv fenotypeanalyse med høyt innhold. PFF-indusert modellering av fosforolert α-synuclein akkumulering i primære dopamin nevroner gir et pålitelig verktøy for å studere de underliggende mekanismene mediere dannelse og eliminering av α-synuclein inneslutninger, med mulighet for høy gjennomstrømning narkotika screening og cellulær fenotype analyse.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er en nevrodegenerativ lidelse preget av død av midbrain dopamin nevroner i substantia nigra (SN), påfølgende tap av dopamin tone i basal ganglia, og påfølgende motoriske funksjonsnedsettelser1,2. En stor histoppathological funksjon i hjernen til PD pasienter er intracellulære protein / lipid aggregater funnet i nevronal soma, kalt Lewy organer (LB), eller i neurites, Lewy neurites (LN), kollektivt kjent som Lewy patologi3. Lewy patologi i hjernen ser ut til å utvikle seg med å fremme PD som ligner spredningen av patogene faktorer gjennom nevronale forbindelser. Rikelig Lewy patologi finnes i dopamin nevroner i SN og celler i andre områder som er berørt av nevrodegenerasjon4. Men under sykdomsprogresjon, spredning og utbruddet av proteinaggregasjon ikke alltid korrelerer med nevronal død og det nøyaktige bidraget av Lewy patologi til nevronal død er fortsatt uklart5.
LB og LN hadde vist seg å bestå av membranøse og proteinholdige komponenter3. Den tidligere er membran fragmenter, vesikulære strukturer (muligens lysosomer og autophagosomer) og mitokondrier3. Sistnevnte består av minst 300 forskjellige proteiner6. En kjennetegnstudie av Spillantini et al.7 viste at den viktigste proteinkomponenten i Lewy patologi er α-synuclein. Svært uttrykt i nevroner, og knyttet til membranfusjon og nevrotransmitter utgivelse, α-synuclein i Lewy patologi er til stede hovedsakelig i misfolded, amyloid fibril form, hvorav hoveddelen er fosforylert på Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Viktigere, det ble også vist at på grunn av sin prion-lignende egenskaper, feilfoldet α-synuclein kan ha en årsakssammenheng rolle i Lewy patologiformasjon 4. De prionlignende egenskapene til feilfoldet α-synuclein ble vist med både midbrainekstrakter fra pasienter og eksogent forberedt α-synuclein preformed fibriller (PFFs) for å indusere α-synuclein aggregater i nevroner i kultur og in vivo9,10. PFFs presenterer en pålitelig og robust modell for å studere utviklingen av α-synuclein patologi i dopaminnevroner. Når PFFs brukes på kultiverte primære nevroner eller injiseres i dyrehjernen, fører de til dannelsen av α-synuclein-inneholdende inneslutninger i neurites og cellesoma11 som rekapitulerer mange funksjoner sett i Lewy patologi. Observerte inneslutninger er vaskemiddel-uoppløselige i Triton X, ubiquitinated, farget med amyloid spesifikk fargestoff Thioflavin S, og inneholder α-synuclein hyperphosphorylated på Ser12911,12. Viktigere, disse inneslutningene ikke dannes i α-synuclein knockout dyr11, noe som indikerer avhengigheten av deres dannelse på endogene α-synuclein.
Likevel er det vanskelig å direkte sammenligne PFF-induserte inneslutninger og Lewy patologi funnet i PD-pasienter fordi menneskelige LBer og LNs er svært heterogene3. Observert heterogenitet av Lewy patologi kan være forårsaket av ulike stadier av formasjonen, forskjellig anatomisk plassering, eller forskjeller i konformasjonen av feilbrettet α-synuclein initiere aggregeringsprosessen. De samme faktorene kan påvirke PFF-induserte pS129-αsyn positive inneslutninger. Faktisk ble det nylig vist at PFF-indusert pS129-αsyn positive inneslutninger i primære nevronale kulturer representerer svært tidlige stadier av patologi som kan modnes til strukturer som ligner LB tett etter langvarig inkubasjonsperiode12,13.
Modellering tidlig spredning og akkumulering av feilbrettet α-synuclein med PFFs er verdifull for narkotikautvikling, da Lewy patologi spredning regnes som en av de tidlige sykdomsmarkørene. Derfor kan aggregeringsforebyggende behandlinger være lovende for å stoppe eller bremse utviklingen av PD i svært tidlige stadier. Flere kliniske studier som tar sikte på å bremse eller stoppe α-synuclein akkumulering pågår14. For senere stadium pasienter, transplantasjon av dopamin nevronale stamfar kan være et bedre behandlingsalternativ15. Imidlertid ble Lewy patologi dokumentert i transplanterte embryonale nevroner under post-mortem analyse av PD pasient hjerner16,17, også indikerer behovet for beskyttelse mot α-synuclein akkumulering.
In vitro, α-synuclein PFFs er kjent for å indusere aggregering i udødeliggjorte cellelinjer, eller oftere, i gnager primære hippocampal eller kortikale nevroner. Ingen av disse er i nærheten av rekapitulerende dopaminnevroner10. Culturing disse nevronene krever tett plating av visse antall nevroner in vitro18. For å oppnå høy plating tetthet med begrenset materiale (f.eks primære dopamin nevroner), mikro øya kulturing metoden er ofte utnyttet. I mikro øykultering, celler er opprinnelig belagt i en liten dråpe medium (vanligvis noen mikroliters) holdt sammen av overflatespenning i midten av en storbrønn 18. Etter at nevronene festes, er hele brønnen fylt med mediet mens cellene forblir begrenset ved høy tetthet i det lille platingområdet. I tillegg til å oppnå høy plating tetthet, mikro øyer også hindre plating nær kantene av brønner, hvor variasjoner i celletetthet og overlevelse er hyppige. Mikroøyer brukes ofte i relativt store brønner eller retter; Men å etablere midbrain nevronale kulturer i mikroøyer i 96 brønnplateformat gjør det mulig å studere Lewy patologi i bona fide dopamin nevroner med middels til høy gjennomstrømningskraft. In vitro eksperimenter med disse nevronene tillot oss å oppdage glial celle linje-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF), som fremmer overlevelse av modne dopamin nevroner in vitro og in vivo19,20,21,22 og også forhindrer dannelsen av α-synuclein aggregater i dopamin nevroner23. Human pasient-indusert pluripotent stamcelle-avledede dopamin nevroner utgjør en mer nøyaktig modell på grunn av deres menneskelige opprinnelse og lengre overlevelsestid in vitro. Induksjon av α-synucleinpatologi hos humane nevroner observeres imidlertid etter flere måneder, sammenlignet med en uke i mus embryonale nevroner, og/eller med flere stressfaktorer (f.eks. kombinasjon av α-synuclein overuttrykk og PFFs)24,25. I tillegg er vedlikehold av humane dopaminnevroner dyrere og arbeidskrevende sammenlignet med primære embryonale nevroner, som i hovedsak begrenser bruken i høygjennomstrømningsapplikasjoner.
Videre kan primære dopamin nevronale kulturer genmodifiseres (f.eks. med CRISPR/Cas9) og/eller behandles med farmakologiske midler23. De utgjør en rask og reproduserbar plattform for applikasjoner som molekylær veidisseksjon og narkotikabibliotekscreening. Selv om begrenset materiale kan fås fra disse kulturene, er det fortsatt mulig å gjennomføre mikroomikkanalyser i liten størrelse. Culturing primære nevroner i 96 brønnformat er bedre for immunocytokjemi og fluorescens mikroskopi teknikker, etterfulgt av høyinnholds fenotype analyse. Multispektralfluorescensbilder avledet fra automatisert avbildning av 96 brønnplater kan konverteres til kvantitative resultater (f.eks. antall LB-inneholdende nevroner per brønn). Slike analyser kan gjøres med fri programvare, for eksempel CellProfiler26,27. Samlet sett gir primære embryonale midbrainkulturer belagt med 96 brønnplater en robust og effektiv plattform for å studere dopaminnevroner og α-synuclein aggregering med mulighet for høy gjennomstrømning fenotype screening.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av det finske nasjonalstyret for dyreforsøk og ble utført i henhold til europeisk lovgivning om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål.
1. Forberedelse
- Forbered dopamin neuron medium (DPM) med 0,46% D-glukose, 1% L-glutamin, 1% N2, 0,2% primocin, fullført med DMEM / F12. Filtrer DPM etter at du har blandet ingrediensene. Oppbevar DPM ved 4 °C og varm hvert aliquot kun én gang.
MERK: DPM skal ikke inneholde GDNF, da det vil redusere α-synuclein akkumulering i dopamin nevroner23. - Forbered silikoniserte glasspipetter som er ekstremt hydrofobe, og dermed minimere vedlegget til overflaten og tap av celler under den første håndteringen av embryonale nevroner.
- Tilsett 10 ml silikonspiss til 1 L destillert vann og bland ved omrøring i et 2 L fartøy. La glasspipetter nedsenket i silikonløsningen i 15 min.
- Skyll pipettene 3–5x med destillert vann. Tørk pipettene over natten ved romtemperatur (RT) eller i 1–2 timer ved 100-120 °C oppvarmet sterilt rom for å øke hastigheten på tørkingen.
- Steriliser pipettene ved standard autoklavering i en forseglet autoklavpose.
- Forbered poly-L-ornitin (PO) belagt 96 brønnplater med gjennomsiktig bunn ved å legge til 60 μL PO-løsning i de midterste brønnene i 96-brønnplaten som skal brukes til såing av nevronene, og la minst en rad / kolonne med brønner på kantene av platen for å unngå kanteffekter. Oppbevar den belagte platen over natten ved 4 °C eller 4 timer ved RT.
- Før plating cellene, aspirere PO helt og vaske cellene tre ganger med 100 μL av 1x PBS. Aspirer 1x PBS fra brønnene og hold lokket på platen åpent for fullstendig tørking.
MERK: Det er mulig å samle inn brukt po og filtrere den for gjenbruk. Dette kan gjentas to ganger for samme PO-løsning. - Tilsett 50 μL DPM til tidligere belagte brønner. Aspirer DPM fra brønnene med en 100 μL plastspiss og samtidig skrape bunnen av brønnen med sirkulære bevegelser for å fjerne belegget på omkretsen av hver brønn. En PO-belagt øy vil forbli midt i brønnen.
- Under en laminærhette legger du til 10 μL DPM til midten av hver belagt øy for å lage mikroøyer.
MERK: En tallerken med DPM-dekket mikroøyer kan oppbevares under laminærstrømningshetten i 1–2 timer under isolasjon av celler.
2. Isolering av ventralmidjernsgulvet fra E13,5 museembryoer
MERK: Se figur 1 for disseksjonstrinn for midtbraingulv.
- Før disseksjon, fyll en 10 cm Petriskål med Dulbeccos buffer og hold den på is.
- Euthanize en E13.5 gravid kvinnelig mus i henhold til institusjonens retningslinjer. Plasser musen flatt på ryggen og spray den fremre kroppen med 70% etanol. Løft huden over livmoren med tang og gjør et snitt med kirurgisk saks for å eksponere livmoren.
- Fjern livmoren forsiktig og legg den i den tidligere tilberedte petriskålen på is.
- Bruk kirurgisk saks under laminærhetten ved RT, fjern forsiktig embryoene fra livmoren. Fjern alle placental rester fra embryoene med tang og plasser dem i en ny 10 cm Petri parabolen fylt med Dulbeccos buffer.
- Ved hjelp av disseksjonstråd eller nåler, kutt av bakrommet på hodet fra de stedene merket med svarte piler i figur 1A. Ta det kuttede stykket bort fra resten av embryoet (figur 1B).
- Plasser bakre av kuttet brikken mot observatøren (Figur 1C) og kutt den forsiktig opp fra caudal til kranial (Figur 1D). Fra 0,5 mm under kranialåpningen, kutt en 2 mm2–3 mm2 region, vist i figur 1E.
- Samle det ventrale midbraingulvet (se figur 1F) i et tomt mikrosyblyrør på 1,5 ml. Hold mikrosytriksrøret på is til alle midbraingulvene samles i den.
MERK: Alternativt kan midbraingulvene samles med en 1 ml mikropipette etter disseksjon av alle embryohjerner.
Figur 1: Disseksjon av midbraingulv fra E13.5 museembryo. (A)Kuttesteder på bakrommet på hodet er merket med svarte piler og hvite stiplede linjer. (B)Stykket ble fjernet fra resten av embryoet. Det fjernede stykket er sirklet. (C) Stykket ble slått 90° for å møte bakre mot observatøren. (D)Stykket ble åpnet fra de svarte pilene, fra caudal til kranial (merket med hvit stiplet linje). (E) Fra 0,5 mm –1 mm under åpningen ble2mm 2 –4 mm2-regionen kuttet (merket med svarte linjer). (F)Det ventrale midtbraingulvet ble isolert (merket med svart stiplet firkant). Skala barer = 1 mm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
3. Etablering av primære embryonale midbrainkulturer fra E13.5 museembryoer i 96 brønnplateformat
- Etter innsamling av midbrain gulv fra alle embryoer i samme 1,5 ml rør, fjern gjenværende Dulbecco buffer og vask vevbitene tre ganger med 500 μL ca2 +, Mg2 +-fri Hank's Balansert Salt Solution (HBSS).
- Fjern HBSS og tilsett 500 μL 0,5% trypsin til røret. Inkuber den ved 37 °C i 30 min.
- Ved inkubasjon tilsettes varm 1,5 ml føtal storfeserum (FBS) ved 37 °C, tilsett 30 μL DNase I til FBS og bland. Også brannpoler spissen av en silikonisert glasspipette. Kontroller at hullet ikke har skarpe kanter og er omtrent samme størrelse som en 1 ml mikropipettespiss.
MERK: Som et alternativ kan en lav vedheft 1 ml mikropipettespiss brukes til triturasjon. Imidlertid ser silikoniserte glasspipetter ut til å gi de beste resultatene. - Så snart inkubasjonen i trinn 3.2 slutter, tilsett 500 μL av FBS/DNase-blandingen til det delvis fordøyde vevet. Bruk glasspipetten til å triturate vevet i FBS/trypsin mix. Triturate til vev dissosiere i små, knapt synlige partikler. Unngå bobler under triturasjon.
- La de resterende partiklene bunnfalle på bunnen av mikrosyrifugerøret ved tyngdekraften. Uten å pipe bunnfallet nederst, samle supernatanten i et tomt 15 ml konisk polypropylenrør.
- Fortynn FBS/DNase I fra trinn 3.3 (98:2) med 1000 μL HBSS for å få FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Bland ved å pipe opp og ned. Tilsett 1000 μL av den nye blandingen til restpartiklene i mikrosyrifugerøret. Triturate igjen og gjenta trinn 3.5.
- Gjenta forrige trinn igjen for å bruke opp alle FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
- Når all supernatanten samles inn i 15 ml-røret (fra trinn 3,5, 3,7 og 3,8), bruk en bordsenkniv til å spinne ned den supernatante (~ 3 ml) ved 100 x g, i 5 min. Fjern supernatanten uten å berøre pelleterte celler nederst.
- Vask cellepelleten ved å tilsette 2 ml DPM til røret og spinn den ned ved 100 x g i 5 min. Fjern supernatanten og gjenta vasken 2x for å minimere rusk i pelleted cellene.
MERK: Bruk alltid frisk, oppvarmet DPM for de kultiverte nevronene. For vasketrinn trenger ikke DPM å være frisk, men bør være forvard til 37 °C. - Fortynn cellene med frisk, varm DPM og overfør dem til et mikrosytrifusrør. Mengden DPM for fortynning avhenger av antall embryoer som brukes til vevdisseksjon. Bruk for eksempel 150 μL DPM for å fortynne cellene som er hentet fra ti embryoer.
- Overfør 10 μL celler i DPM til et mikrocentrifugerør. Bland dem med 10 μL på 0,4% Trypan blå flekk. Telle levende (dvs. Trypan blå negative) celler ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller.
MERK: Bruk 30.000 celler for plating per godt for å få ~ 1000 dopamin nevroner per brønn. Hvis celletettheten er høyere enn ~ 30 000 celler per 6 μL, fortynner du cellene ytterligere med DPM før plating slik at såingsvolumet ikke er mindre enn 6 μL. - Uten å berøre bunnen av brønnene, fjern DPM fra mikroøyene som ble opprettet i trinn 1.6.
- For å oppnå reproduserbar celletetthet ved hver brønn, bland cellene ved skånsom pipettering før plating i brønnen. Med en 1–10 μL mikropipette, tilsett 6 μL celler til midten av brønnen, på plasseringen av hver tidligere mikroøy.
- Fyll de tomme brønnene på kantene av platen med 150 μL vann eller 1x PBS for å minimere fordampning fra brønnene som inneholder nevronale kulturer. Inkuber platen i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 i 1 time.
- Etter 1 time, fjern platen fra inkubatoren, tilsett 100 μL DPM i hver brønn med celler og plasser den tilbake i inkubatoren.
- To dager etter plating (dag in vitro 2, eller DIV2), fjern 25 μL og tilsett 75 μL fersk DPM for å bringe det endelige medievolumet til 150 μL og unngå fordampning så mye som mulig.
- Bytt halvparten av mediet med frisk DPM (dvs. fjern 75 μL og tilsett 75 μL frisk DPM) ved DIV5. Ikke utfør noen medieendringer etter DIV5.
4. Induksjon av α-synuclein aggregater i primære embryonale dopaminnevroner ved såing med preformed fibriller
Protokoller for innhenting og validering av PFFs hadde blitt omhyggelig beskrevet og diskutert i flere nyere publikasjoner11,28,29,30. Etter ethvert arbeid med PFFs, rengjør laminærhetten eller utstyr som kan ha kontaktet PFFs med 1% SDS, deretter med 70% etanol31.
- Før eksperimentet fortynner du PFFs med 1x PBS til en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml. Sonicate fortynnet PFFs i mikrocentrifuge rør med en bad sonicator ved høy effekt med vann bad kjøling ved 4 ° C for 10 sykluser, 30 s ON /30 s OFF.
MERK: Det er avgjørende at fibrils være riktig sonikert for å generere fragmenter ~ 50 nm lang. Størrelsen på sonikerte PFFs kan måles direkte fra transmisjonselektronmikroskopbilder av PFFs farget som beskrevet av Patterson et al.30. Sonikering kan oppnås som beskrevet ovenfor i en høyeffekts bad sonicator. Alternativt kan et tips sonicator brukes30. Sonikerte PFFs kan lagres ved -80 °C i små aliquots for å unngå flere fryse-/tiningssykluser. - På DIV8 tilsett 3,75 μL 100 μg/ml PFFs per brønn til 150 μL medium i brønnen til en endelig konsentrasjon på 2,5 μg/ml. Bruk samme mengde 1x PBS for kontrollgruppen.
- Forbered 4 % paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS og oppbevar aliquotene ved -20 °C. Følg trinnene nedenfor for å gjøre dette.
MERK: PFA er giftig; bruk en maske og hansker under tilberedning, arbeid alltid under en laminærhette, og kast alt fast og flytende PFA-avfall i henhold til institusjonens anvisninger.- Varm 500 ml 1x PBS i et 1 L fartøy. Sett en røre bar i fartøyet og sette fartøyet på en magnetisk rører med en varmefunksjon. Juster temperaturen mellom 40–60 °C for å unngå koking mens oppløsningen holdes varm.
- Mål 20 g PFA pulver under panseret i en engangs plast målebeholder. Legg FORSIKTIG PFA pulveret inn i fartøyet fylt med 1x PBS. Begynn å røre løsningen.
- Tilsett 200 μL av 5 M natriumhydroksid i oppløsningen og fortsett å røre i ~ 15 min, til PFA oppløses helt.
- Etter at løsningen ser homogen ut, tilsett 168 μL 5 M hydrogenklorid for å balansere pH til ~ 7. Kontroller pH med engangsfargefaste pH-indikatorstrimler.
- Fjern fartøyet fra varmeren og la det avkjøles til RT. Filtrer oppløsningen og aliquoten til lagring ved -20 °C. Tin aliquotene ved RT før bruk og ikkefrys etterpå.
- På DIV15 fjerner du alle medier fra brønnene ved å pipe. Tilsett 50 μL på 4% PFA til hver brønn for å fikse cellene og inkubere i 20 min ved RT. Etter inkubasjon fjern PFA fra brønnene og tilsett 100 μL 1x PBS til hver brønn for å vaske cellene. Fjern 1x PBS og vask 2x mer.
- La 100 μL av 1x PBS i hver brønn for å unngå tørking. Oppbevar platen ved 4 °C til immunkjemi utføres.
5. Immunofluorescerende farging og automatisert avbildning av primære embryonale dopaminnevroner i 96 brønnplater
- Fjern 1x PBS og permeabilize cellene ved å legge til 100 μL av 0,2% Triton X-100 i PBS (PBST) per brønn og inkubere ved RT i 15 min.
- Fjern PBST og tilsett 50 μL av 5% normal hesteserum (NHS) per brønn til PBST. For å blokkere den uspesifikke antigenaktiviteten, inkuber ved RT i 1 timer.
- Fortynn de primære antistoffene mot TH og pS129-αsyn (1:2,000) i 5% NHS i PBST. Tilsett 50 μL fortynnede antistoffer til hver brønn og inkuber over natten ved 4 °C.
- Fjern antistoffer og tilsett 100 μL 1x PBS til hver brønn for å vaske cellene. Fjern 1x PBS og gjenta vask 2x.
- For å forhindre bleking av fluorescerende molekyler, begynn å arbeide under minimum lysforhold. Fortynn de sekundære fluorescerende merkede antistoffene (1:400) i PBST. Tilsett 50 μL fortynnede antistoffer til hver brønn og inkuber ved RT i 1 time.
- Fjern antistoffoppløsningen og tilsett 100 μL 1x PBS til hver brønn for å vaske cellene. Fjern 1x PBS og gjenta vask 2x.
- Fjern 1x PBS, tilsett 50 μL av 200 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) per brønn for å farge kjernene i de kultiverte cellene og inkubere ved RT i 10 min.
- Vask cellene 3x med 100 μL 1x PBS i 5 min hver. Hold 100 μL 1x PBS i hver brønn etter siste vask. Dekk platen med aluminiumsfolie og oppbevar den ved 4 °C til bildebehandling.
- Bilde primære embryonale dopamin nevroner i en 96 brønn visning plate med en høy innhold plate skanner (se Tabell av materialer) utstyrt med en 10x mål.
- Juster innstillingene basert på spesifikasjonene til 96-brønnplaten, for eksempel platetype, produsent, størrelse, avstand mellom brønner, samt type og mengde middels.
- Velg bildeområdet av brønnen for å dekke alle cellene i en mikroøy. Velg et eksempel godt for å justere autofokus. Baser det første fokuset på DAPI.
- Kalibrer anskaffelsestiden for hver fluorescerende kanal, basert på intensiteten av flekker i kontrollbrønner. Juster parametrene slik at i PFF-behandlede kontrollbrønner kan man tydelig skille dopaminceller som skjuler pS129-αsyn aggregater i cellesoma, noe som muliggjør entydig kvantifisering av pS129-αsyn positive og pS129-αsynα negative celler.
MERK: Brønner som ikke inneholder PFFs bør ikke ha noen farging for pS129-αsyn; Disse brønnene kan derfor brukes som negativ kontroll for justering av pS129-αsyn-intensitet. - Bilde alle de valgte brønnene med et 10x-mål samtidig for alle kanaler med immunfluorescensfarging med nøyaktig de samme parametrene.
- Eventuelt, etikett α-synuclein inneslutninger i en undergruppe av brønnene med antistoffer som er spesifikke for filamentøs α-synuclein for å bekrefte at endringer i antall pS129-αsyn-positive inneslutninger gjenspeiler reduksjonen i proteinakkumulering i stedet for hemming av fosforylering eller dephosphorylation av pS129-αsyn.
- Gjenta trinn 5.3 som erstatter pS129-αsyn antistoff med α-synuclein filament antistoff (1:2,000). Bilde den aggregerte α-synuclein som i trinn 5.13.
6. Bildeanalyse med høyt innhold
Merk: Dette trinnet utføres med open access-programvaren CellProfiler versjon 3.15 og CellProfiler Analyst versjon 2.2.1. 27,32. Men med litt erfaring kan de analoge bildeanalyserørledningene angis i en annen versjon eller lignende programvare. Se programvaresiden for en detaljert forklaring (se Materialtabell).
- Last ned og installer CellProfiler og CellProfiler Analyst programvare.
- Åpne CellProfiler. Velg Fil| Importer| Pipeline fra filen og laste inn eksempelet pipeline gitt, TH_LB_V1.cpipe-filen (se tilleggsfiler).
MERK: Eksempelrørledningene krever spesifikke justeringer avhengig av egenskapene til de oppkjøpte bildene og bildeoppkjøpsplattformen. Example_Imageskan brukes til den første prøveversjonen av programvaren. - Last inn bilder som skal analyseres ved å dra dem inn i Bilder-modulen. Bruk filteralternativer til å velge bare bildefiler fra den lastede mappen.
- Bruk Metadata-modulen til å trekke ut godt, synsfelt og kanalinformasjon fra bildefilnavnet. Klikk på forstørrelsesglasssymbolet og skriv inn vanlig uttrykk for å trekke ut Plate- og Imaging Site- og Kanalinformasjon fra filnavn.
MERK: Regulært uttrykk vil avhenge av filnavnets navnekonvensjon for platemikroskop. Hvis du klikker spørsmålstegn ved siden av forstørrelsesglasset, får du detaljer om syntaksen. - Under NamesAndTypes-modul velger du riktige kanalnumre for DAPI,TH og pS129-αsyn-farging (standardkanaler 1, 2og 3). Velg Groups module, Nei".
- Bruk Metadata-modulen til å trekke ut godt, synsfelt og kanalinformasjon fra bildefilnavnet. Klikk på forstørrelsesglasssymbolet og skriv inn vanlig uttrykk for å trekke ut Plate- og Imaging Site- og Kanalinformasjon fra filnavn.
- Bruk IdentifyPrimaryObjects moduler for å segmentere dopamin nevroner ved hjelp av TH farging av celle soma.
MERK: Spesifikke verdier krever innledende optimalisering basert på hvordan plater er farget og avbildet. Hvis etterfølgende plater behandles på samme måte, skal det ikke være nødvendig med ytterligere justeringer eller minimale ytterligere justeringer. - Bruk MeasureObjectIntensity-modulen til å innhente informasjon om fluorescensintensitet fra TH- og DAPI-kanaler.
- Bruk MeasureObjectSizeShape-modulen til å måle størrelses- og formetrekkene til segmentet dopaminnevroner.
- Bruk MeasureTexture-modulen til å måle teksturfunksjonsinformasjon fra TH-kanal fra segmenterte dopaminnevroner.
- Bruk ExportToDatabase-modulen til å lagre målinger i databasen.
- Navnedatabasefilen i henhold til eksperimentnavneskjemaet (f.eks. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Velg Utdatamappe for databasefilen. Databasefilen kan være flere gigabyte store og bør lagres fortrinnsvis i den overordnede mappen i bildefilene.
- Åpne CellProfiler Analyst og velg filen V1_THCells.properties som ble opprettet i trinn 6.8. Åpne verktøy| Klassifikator.
- Sorter segmenterte celler i to kategorier: positive (dvs. riktig segmenterte dopaminnevroncellelegemer) og negative (dvs. segmentering og flekker) Se figur 2A og 2B.
- Angi antall hentede celler til 50 tilfeldige celler, og klikk Hent (dette laster inn bilder av cellene som er segmentert i trinn 6.4). Sorter minst 30 celler i hver hylle ved å dra dem til den tilsvarende hyllen nederst i vinduet. Hent flere celler etter behov.
- I rullegardinmenyen velger du Bruk rask mild forsterkning med 50 maksregler, og klikk På Tog.
- Sett "Fetch" til 50 positive celler og trykk Hent for å få TH positive celler i henhold til klassifikatoren ( Figur2A). Bruk det oppnådde resultatet til å evaluere kvaliteten på den opplærte klassifikatoren.
- Gjenta trinn 6.10.1–6.10.3, og legg til nye eksempelceller for opplæring av klassifikatoren til resultatene er tilfredsstillende.
- Velg Avansert| Rediger regler... og i et nytt vindu merke all tekst ( Ctrl +a) og kopiere den (Ctrl-c) til notisblokk (Ctrl-v). Lagre som TH_rules.txt-filen.
MERK: Avhengig av tettheten av nevronal kultur og kvaliteten på farging og bildebehandling, kan dette trinnet ikke være nødvendig, da det kan være mulig å sette parametere i trinn 6.4 for å segmentere bare TH-positive celler med høy nøyaktighet. Hvis dette er tilfelle, er en hel TH_LB_V1.cpipe run ikke nødvendig, og de riktige parametrene for IdentifyPrimaryObjects-moduler skal settes direkte inn i den tilsvarende modulen i TH_LB_V2.cpipe.
Figur 2: Kvantifisering av dopaminnevroner og pS129-αsyn positive dopaminnevroner med CellProfiler Analyst-programvare basert på DAPI,TH og pS129-αsyn immunofluorescens. (A) TH-celler i den positive beholderen ble valgt basert på DAPI-flekker (blå) merket med en liten firkant ved den første cellen som er valgt på bildet og den omkringliggende TH-fargetonen (grå) på soma. (B)Ikke-celleartefakter ble plassert i den negative beholderen. (C) pS129-αsyn positive TH nevroner ble valgt basert på stor inkludering av pS129-αsyn farging (rød) merket med en liten firkant ved den første cellen valgt på bildet, rundt kjernene eller ved celle soma. (D)TH-celler uten slike pS129-αsyn-inneslutninger ble plassert i den negative beholderen. Skalalinjer = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Åpne CellProfiler og velg Fil| Importer| Pipeline fra fil og laste TH_LB_V2.cpipe-filen. Gjenta trinn 6.3–6.7. Denne delen av rørledningen skal være identisk med TH_LB_V1.cpipe.
- Bruk FilterObjects-modulen til å sende bare ekte TH-positive celler for videre analyse.
- Sett velg filtreringsmodus til Regler. I Regler eller klassifikatorfilnavn velger du filen TH_rules.txt som ble opprettet i trinn 6.10.5.
- Sett klassenummerfeltet til 1 hvis TH-positive celler ble sortert til nederste venstre vindu.
- Bruk MeasureObjectIntensity-modulen til å innhente informasjon om fluorescensintensitet fra pS129-αsyn-kanalen.
- Bruk MeasureTexture-modulen til å måle teksturfunksjonsinformasjon fra TH-kanal fra filtrerte celler.
- Bruk MeasureObjectSizeShape-modulen til å måle størrelses- og formende trekk ved filtrerte celler.
- Bruk ExportToDatabase-modulen til å lagre målinger i databasen.
- Navnedatabasefilen i henhold til eksperimentnavneskjemaet (f.eks. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Velg utdatamappe for databasefilen.
- Åpne CellProfiler Analyst og velg filen V2_THpos.properties.
- Sorter segmenterte celler i to kategorier – pS129-αsyn positive og pS129-αsyn negative celler (Figur 2C,D).
- Angi antall hentede celler til 50 tilfeldige celler, og klikk Hent (dette laster inn bilder av celler som er segmentert i trinn 4). Sorter minst 30 celler i hver hylle ved å dra dem til den tilsvarende hyllen nederst i vinduet.
- I rullegardinmenyen velger du Bruk rask mild økning med 50 maksregler rules eller Random Forest-klassifikatorer. Random Forest Klikk Tog.
- Sett "Fetch" til 50 positive celler og trykk Hent for å få pS129-αsyn positive celler i henhold til klassifikator ( Figur2C). Sett "Fetch" til 50 negative celler og trykk Hent for å få pS129-αsyn negative celler i henhold til klassifikator ( Figur2D). Evaluer kvaliteten på den opplærte klassifikatoren.
- Gjenta trinn 6.17.2–6.17.4, og legg til nye eksempelceller for å trene klassifikatoren til resultatene er tilfredsstillende.
- Klikk Score Alle for å få resultater tabellen oppsummerer antall pS129-αsyn positive og negative dopamin nevroner i hver brønn.
Representative Results
Noen dager etter plating (DIV1-DIV3), lysfelt mikroskopi ble gjort for å vurdere helse og homogen spredning av de kultiverte cellene, og ensartethet av disse forholdene ved de enkelte brønnene (Figur 3). Kultiverte midbrainceller ble spredt homogent innenfor mikroøya som ble opprettet før plating (figur 3A,B). Primære nevroner hadde bosatt seg på den belagte bakken homogent og etablerte nevronale projeksjoner (Figur 3B). En liten klump av celler (diameter mindre enn 150 μm) ble observert ved brønnen og vist som et eksempel (figur 3C).
Figur 3: Noen dager etter plating (f.eks DIV3), tilstanden til primære midbrain kulturer ble observert med lys-feltet mikroskopi. (A)Kultiverte celler spredt over midten av brønnen innenfor den PO-belagte mikroøya med en omtrentlig radius på 4,4 mm (vist med hvite piler) opprettet ved å skrape PO fra ca. 1 mm brønnsonre (vist med svarte piler). (B)Kultiverte primære nevroner som ble homogent spredt i området, og nevronale projeksjoner (merket med røde pilspisser) ble observert. (C) En celleklumpe med en diameter mindre enn 150 μm er merket med blå pilspisser. Skalalinjer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Primære musemidbrainkulturer ble immunostainert med anti-TH og anti-pS129-αsyn antistoffer og avbildet med et automatisert mikroskop etter 15 dager in vitro. Belagte mikroøyer gitt begrenset område for feste av celler i midten av brønner (Figur 4A,B). Dopaminnevroner immunolabeled med TH markør ble spredt rundt mikroøya i et monolayer, atskilt fra hverandre, uten klumping (Figur 4A' og 4B ').
Figur 4: Ved DIV15 ble 800–1000 dopaminceller kvantifisert fra hver mikroøy, med eller uten PFF-behandling. Representative bilder av embryonale midbrain kulturer immonustained med anti-TH og anti-pS129-αsyn antistoffer. (A, A', A'') Kontrollceller uten PFF-behandling. -Jeg har ikke noeå gjøre. PFF-behandlede celler med pS129-αsyn-inneslutninger. (C) Kvantifisering av TH-positive celletall i brønner behandlet med kjøretøy (kontroll), PFFs eller PFFs med 50 ng/ml GDNF. (D) Kvantifisering av pS129-αsyn aggregater i TH-positive celler behandlet med kjøretøy (kontroll), PFFs eller 50 ng/ml GDNF. Statistisk signifikans ble beregnet med tilfeldig blokkdesign ANOVA. **p < 0,01, n = 4 individuelle plater (biologiske replikerer), hver med 3–6 brønner per behandlingsgruppe (tekniske repetisjoner). Skalalinjer = 300 μm for A, B; 50 μm for A', B '; 25 μm for A'', B''. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mens kulturer uten PFF-behandling ikke hadde noen pS129- αsyn signal (Figur 4A' og 4A''), kulturer behandlet med α-synuclein PFFs utviklet pS129-αsyn positive inneslutninger (Figur 4B' og 4B''). Behandling med endetro PFF i 7 dager forårsaket ingen signifikant reduksjon i antall TH-positive nevroner sammenlignet med andre eksperimentelle grupper (figur 4C). PFF-behandlede kulturer hadde en befolkning på ~ 40% av pS129-αsyn positive TH-positive dopamin nevroner. Behandling med positiv kontroll, GDNF, reduserte prosentandelen av TH-positive dopaminnevroner med pS129-αsyn positive inneslutninger (figur 4D, se også rådata og eksempelbilder i tilleggsfilene).
Tilleggsfiler: Eksempel på datasamlebånd for bildeanalyse med høyt innhold med CellProfiler og CellAnalyst-programvarepakker, eksempelbilder og rådata for figur 4E, F. (1-9) Example_Images. Åpne disse bildene med ImageJ eller CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (trinn 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (trinn 6.11–6.18) Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Spredning av Lewy patologi, hvorav pS129-αsyn er en stor bestanddel, er et histopodoologisk kjennetegn på PD. Stoppe eller bremse akkumuleringen av aggregert pS129-αsyn kan bremse degenerasjonen av dopaminnevroner og utviklingen av alfa-synucleinopati. Imidlertid bidrar en mekanistisk forståelse av hvordan pS129-αsyn aggregering til bortfallet av dopaminnevroner fortsatt må etableres. Bevis fra menneskelige postmortem studier på hjerneprøver fra pasienter på ulike stadier av sykdommen samt observasjon av pS129-αsyn positiv inkludering i transplanterte fosternevroner sterkt antyder spredning av Lewy patologi mellom celler16,17,33. Følgelig ble prionlignende spredning av pS129-αsyn nylig rekapitulert ved hjelp av α-synuclein PFFs9,10. Etablering av en robust, kostnadseffektiv og relativt høy eller middels gjennomstrømning modell av pS129-αsyn spredning og akkumulering, spesielt i dopamin nevroner, kan betydelig fremskynde søket etter nye behandlinger og forbindelser endre denne prosessen.
Fordi tap av dopamin nevroner er hovedårsaken til motoriske symptomer i PD og disse cellene har mange unike egenskaper2,34,35, modellering av prion-lignende spredning av pS129-αsyn i dopamin nevroner er den mest relevante typen modell fra det translasjonære perspektivet. Protokoller ved hjelp av mikroøykulturer av embryonale midbrain nevroner på 4 brønnplater og halvautomatisk kvantifisering har blitt beskrevet tidligere18. Protokollen som er beskrevet her ble tilpasset 96 brønnplater og gir mindre arbeidskrevende forberedelse av mikroøyer, noe som åpner for fremstilling av opptil fire plater som inneholder 60 brønner hver av en erfaren forsker i løpet av en arbeidsdag. Culturing dopamin nevroner i 96 brønnplater gjør det mulig for testing av narkotika ved lavere mengder og muliggjør høye transduksjonsrater med lentivirus vektorer. Det er også mulig å kombinere ulike behandlinger for å utføre mer komplekse eksperimenter.
Før du bruker noen behandlinger (inkludert PFFs), bør kvaliteten på kulturingen kontrolleres med lysfeltmikroskopi. Hvis mikroskopisystemet ikke bruker et CO2-kammer med oppvarming, bør cellene ikke holdes utenfor inkubatoren i mer enn par minutter, fordi primære musee dopaminnevroner er delikate og lett stresset. Av samme grunn anbefales det at den første avbildningen skal gjøres etter 24 t inkubasjon (mellom DIV1-DIV3). Cellene skal synes å være i live med nåværende cellelegemer og homogent spredt inne på mikroøya. Primære nevroner ville ha slått seg ned på po-belagt bakken og begynte å etablere nevronale projeksjoner. Det er mulig å observere små klumper av celler (dvs. diameter mindre enn 150-200 μm) som kan dannes hvis triturasjonsprosessen ikke er gjort riktig eller plating tetthet er høyere enn anbefalt. Disse små klumpene ville ikke påvirke eksperimentet, med mindre de er mer enn noen få per brønn og / eller større. Klumpede celler gjør det svært vanskelig å identifisere immunohistokjemiske markører og individuelle celler under bildeanalysen. Det er viktig å unngå slike klumper ved forsiktig belegg, triturating, og kontrollere plating tetthet. Hvis ensartetheten av disse forholdene ikke kan observeres ved visse brønner, må du ikke inkludere disse defekte brønnene i forsøket. Slik utelukkelse bør gjøres før gjennomføring av noen behandlinger.
Videre gir utnyttelse av 96 brønnplater praktisk flerkanals pipettebruk under fargingsprosedyrer og direkte visualisering med automatiske platemikroskoper, noe som øker gjennomstrømningen ytterligere. Utnyttelse av automatisert bildekvantifisering er uunnværlig for analysen av dataene fra bildeplattformer med høyt innhold. I tillegg til evnen til å behandle tusenvis av bilder hentet fra hvert eksperiment, sikrer det objektiv, identisk kvantifisering av alle behandlingsgrupper. Arbeidsflyten foreslått for bildeanalysen er basert på enkle prinsipper for segmentering av dopaminnevroner, filtrering riktig segmenterte celler ved tilsyn maskinlæring, og deretter kvantifisering av fenotyper (pS129-αsyn positiv og pS129-synα negativ), igjen ved tilsyn maskinlæring. Selv om flere forskjellige tilnærminger for denne oppgaven kan forestilles, har vi funnet kombinasjonen av segmentering med maskinlæring for å være den mest robuste for dopaminkulturer på grunn av høy plating tetthet, de ulike formene av dopamin nevroner, og tilstedeværelsen av sterkt farget neurites. Den foreslåtte bildeanalysealgoritmen ble implementert i CellProfiler og CellProfiler Analyst, åpen kildekode, fritt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare med høyt innhold26,27. Algoritmen kan også implementeres med annen bildeanalyseprogramvare, enten åpen kildekode (f.eks. ImageJ/FIJI, KNIME) eller proprietær. Men etter vår erfaring ofrer disse ofte tilpasningsevner for brukervennlighet, og kan derfor ikke fungere godt i kompliserte analyser. Vi har funnet ut at cellprofiler- og cellprofileranalytikerprogramvarepakkene gir spesielt pålitelige resultater ved å kombinere et betydelig antall implementerte algoritmer, ekstrem fleksibilitet i utformingen av arbeidsflyten og samtidig håndtere og effektivt behandle data med høyinnhold.
Den beskrevne protokollen kan også tilpasses for kvantifisering av andre cellulære fenotyper preget av immunostaining med forskjellige antistoffer, som markører for andre nevronale populasjoner (f.eks. DAT, GAD67, 5-HT osv.) og proteinaggregater (f.eks. fospo-Tau, ubiquitin). Flere fluorescerende markører kan også kombineres for å skille mellom flere fenotyper (f.eks. celler med inneslutninger på ulike stadier av modning). Automatisert klassifisering av flere fenotyper bør også være lett å implementere i de beskrevne bildeanalyserørledningene ved bare å legge til en kanal som inneholder immunfluorescerende bilder av flere markører til måletrinn og sortering av celler i flere hyller. Utnyttelse av flere markører samtidig ville imidlertid kreve optimalisering av immunostaining og bildebehandlingsforhold. I tillegg, for bedre kvalitet i immunfluorescensavbildning, anbefales bruk av spesielle svartveggede 96 brønnplater eksplisitt designet for det fluorescerende mikroskopet. Disse kan imidlertid være betydelig dyrere enn standard cellekulturplater, som er tilstrekkelige for analysen som er beskrevet i vår protokoll.
Typen og kvaliteten på de benyttede PFFs er avgjørende for utfallet av eksperimentene. PFFs kan både påvirke analysens robusthet og tolkning av resultatene. Forberedelsesforhold kan påvirke såingseffektiviteten til PFFs og faktisk PFF "stammer" med forskjellige fysiologiske egenskaper har blitt rapportert36. Likevel er forberedelse og validering av PFFs utenfor omfanget av denne artikkelen og har blitt beskrevet i flere publikasjoner11,28,29,30. I tillegg til preparatprotokollen bør arten av opprinnelse av α-synuclein i PFFs (f.eks, mus, menneske) og bruk av villtype eller mutert protein (f.eks. humant A53T α-synuclein) vurderes, avhengig av de spesielle eksperimentelle forholdene. Induksjon av pS129-αsyn akkumulering av PFFs ble vist å være avhengig av alder av kulturen (dvs. dager in vitro), med mer modne kulturer som viser mer uttalt induksjon11. Dette skyldes sannsynligvis det økte antallet nevronale forbindelser i mer modne kulturer, og økte α-synuclein proteinnivåer. I våre hender ga behandling med PFFs ved DIV8 de mest robuste resultatene, med uttalt akkumulering av pS129-αsyn i dopaminnevron soma, mens det ikke gikk på akkord med nevronal overlevelse. Den beskrevne protokollen er godt egnet til å studere behandlinger som endrer tidlige hendelser som fører til aggregering av endogene α-synuclein fordi vi kvantifiserer pS129-αsyn positive inneslutninger på et relativt tidlig tidspunkt, 7 dager etter inokulasjon med PFFs. På dette tidspunktet er intrasomale inneslutninger tilstede i en betydelig brøkdel av celler og kan lett skilles ved immunostaining mens ingen PFF-indusert celledød observeres, noe som forenkler tolkningen av resultatene. Viktigere, som morfologi og sammensetning av PFF-induserte inneslutninger kan endres over tid12,13, den beskrevne protokollen kan i prinsippet endres for å studere mer modne inneslutninger ved fiksering og immunos oppnåelse på senere tidspunkter. Men å holde dopaminnevroner i kulturen i mer enn 15 dager krever ekstrem omsorg, og kan indusere ytterligere variasjon på grunn av celler som ikke overlever uavhengig av PFF-inokulasjon. I tillegg kompliserer mer utvidede kulturer behandlingsplaner. Mange forbindelser har begrenset eller ikke dårlig preget stabilitet i cellekulturmediet, og etterfylling av et stoff er ikke trivielt fordi fullstendig utveksling av middels kompromisser overlevelsen av dopaminkulturene.
Fosforylering av α-synuclein ved Ser129 rapporteres konsekvent i PFF-baserte modeller av α-synuclein aggregering og kolokalizes med markører for feilfolding og aggregering som Thioflavin S, ubiquitin eller konformasjonsspesifikke antistoffer11,,12. I våre hender gir immunostaining for pS129-αsyn også det sterkeste signalet med lavest bakgrunn og er mest grei å analysere, noe som gir robuste resultater når flere behandlinger screenes. Viktigere, immunos taining med pS129-αsyn antistoff oppdager ikke PFFs som forblir utenfor cellene, noe som reduserer bakgrunnen betydelig. Det er imidlertid viktig å huske at Ser129 fosforylering sannsynligvis er en av de tidligste prosessene knyttet til feilfolding av α-synuclein og kan være forskjellig regulert under bestemte forhold. Eventuelle funn som viser positive effekter på pS129-αsyn, bør derfor bekreftes av andre markører.
Statistisk analyse bør skreddersys tilsvarende til eksperimentell design. Det er viktig å utføre eksperimenter i minst tre uavhengige biologiske replikeringer (dvs. separate primære nevronale kulturer). Disse replikene skal belagt på forskjellige plater og behandles uavhengig. Vi analyserer dataene som er hentet fra replikere på forskjellige plater med tilfeldig blokkdesign ANOVA37 for å ta hensyn til sammenkobling av data for ulike eksperimentelle plater.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker prof. Kelvin Luk for hans sjenerøse gave av α-synuclein PFFs, Conjung Zheng for å etablere og kultinere nevronale celler, og Light Microscopy Unit ved Institutt for bioteknologi, Universitetet i Helsinki, for avbildningsimmuniserte celler. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra 3i-Regeneration av Business Finland (Finnish Funding Agency for Innovation), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Foundation, og de lovbestemte midlene til Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
