Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til undersøgelse af neuronal α-synucleinakkumulering i primære muse dopaminneuroner. Fosforylerede α-synucleinaggregater i neuroner induceres med præformede α-synuclein fibrils. Automatiseret billeddannelse af immunfluorescent mærket celler og upartisk billedanalyse gør denne robuste protokol egnet til medium-til-høj gennemløb screening af lægemidler, der hæmmer α-synuclein akkumulering.
Abstract
Målet med denne protokol er at etablere en robust og reproducerbar model af α-synuclein akkumulering i primære dopamin neuroner. Kombineret med immunsinmination og upartisk automatiseret billedanalyse, denne model giver mulighed for analyse af virkningerne af narkotika og genetiske manipulationer på α-synuclein aggregering i neuronal kulturer. Primær midbrain kulturer giver en pålidelig kilde til bona fide embryonale dopamin neuroner. I denne protokol efterlignes kendetegnende histopatologi af Parkinsons sygdom, Lewy bodies (LB), ved tilsætning af α-synuclein præ-formede fibriller (PFFs) direkte til neuronal kultur medier. Akkumulering af endogene fosforylerede α-synuclein i soma af dopamin neuroner påvises ved immunseende allerede 7 dage efter FSR tilsætning. In vitro cellekultur betingelser er også egnet til anvendelse og evaluering af behandlinger, der forhindrer α-synuclein akkumulering, såsom små molekyle lægemidler og neurotrofiske faktorer, samt lentivirus vektorer for genetisk manipulation (f.eks med CRISPR/Cas9). Skabning af neuroner i 96 brøndplader øger robustheden og kraften i de eksperimentelle opsætninger. Ved forsøgets afslutning er cellerne fastgjort med paraformaldehyd for immunocytokemi og fluorescensmikroskopi billeddannelse. Multispektrale fluorescensbilleder opnås via automatiseret mikroskopi af 96 brøndplader. Disse data er kvantificeret (f.eks, tælle antallet af fosfo-α-synuclein-holdige dopamin neuroner per brønd) med brugen af gratis software, der giver en platform for upartisk højt indhold fænotype analyse. PS-induceret modellering af fosforyleret α-synuclein akkumulering i primære dopamin neuroner giver et pålideligt værktøj til at studere de underliggende mekanismer mægle dannelse og eliminering af α-synuclein indeslutninger, med mulighed for høj-throughput drug screening og cellulære fænotype analyse.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er en neurodegenerativ lidelse karakteriseret ved død af midbrain dopamin neuroner i substantia nigra (SN), efterfølgende tab af dopamin tone i basal ganglier, og deraf følgende motoriske svækkelser1,2. En stor histopatologisk træk i hjernen hos PD patienter er intracellulære protein / lipid aggregater findes i neuronal soma, kaldet Lewy organer (LB), eller i neurites, Lewy neurites (LN), kollektivt kendt som Lewy patologi3. Lewy patologi i hjernen synes at udvikle sig med fremrykkende PD ligner spredningen af patogene faktorer gennem neuronale forbindelser. Rigelig Lewy patologi findes i dopamin neuroner i SN og celler i andre områder ramt af neurodegeneration4. Men under sygdomsprogression, spredning og debut af protein aggregering ikke altid korrelerer med neuronal død og det nøjagtige bidrag Lewy patologi til neuronal død er stadig uklart5.
LB og LN havde vist sig at bestå af membranøse og proteinholdige komponenter3. Førstnævnte er membranfragmenter, vesikulære strukturer (muligvis lysosomer og autophagosomes) og mitokondrier3. Sidstnævnte består af mindst 300 forskellige proteiner6. En hallmark undersøgelse af Spillantini et al.7 viste, at den vigtigste proteinkomponent i Lewy patologi er α-synuclein. Højt udtrykt i neuroner, og forbundet med membran fusion og neurotransmitter frigivelse, α-synuclein i Lewy patologi er til stede for det meste i fejlfoldet, amyloid fibril form, hvoraf størstedelen er fosforyleret på Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Vigtigere, det blev også vist, at på grund af sin prion-lignende egenskaber, misfolded α-synuclein kan have en årsagssammenhæng rolle i Lewy patologi dannelse4. De prionlignende egenskaber af forkertfoldet α-synuclein blev vist med både midbrainekstrakter fra patienter og eksogent fremstillet α-synuclein præforme fibriller (PFF' er) til at fremkalde α-synucleinaggregater i neuroner i kultur og in vivo9,10. PFF'er udgør en pålidelig og robust model til undersøgelse af udviklingen af α-synucleinpatologi i dopaminneuroner. Når PFF'er anvendes på dyrkede primære neuroner eller injiceres i dyrets hjerne, fører de til dannelsen af α-synucleinholdige indeslutninger i neurites og celle soma11, der opsummerer mange funktioner, der ses i Lewy-patologien. Observerede indeslutninger er vaskemiddel-uopløselige i Triton X, ubiquitinated, plettet med amyloid specifikke farvestof Thioflavin S, og indeholder α-synuclein hyperphosphorylated ved Ser12911,12. Det er vigtigt, at disse indeslutninger ikke dannes i α-synuclein knockout dyr11,hvilket indikerer afhængigheden af deres dannelse af endogene α-synuclein.
Ikke desto mindre er det vanskeligt direkte at sammenligne FSE-inducerede indeslutninger og Lewy patologi findes i PD patienter, fordi menneskelige LBs og LNs er meget heterogene3. Observeret heterogenitet af Lewy patologi kan være forårsaget af forskellige stadier af dannelsen, forskellige anatomiske placering, eller forskelle i kropsbygning af forkert foldet α-synuclein indleder aggregeringsprocessen. De samme faktorer kan påvirke FSR-inducerede pS129-αsyn positive inklusioner. For nylig blev det faktisk påvist, at FS129-αsyn positive inklusioner i primære neuronale kulturer repræsenterer meget tidlige stadier af patologi, der kan modnes til strukturer, der ligner LB efter længere tids inkubationstid12,13.
Modellering tidlig spredning og akkumulering af forkert foldet α-synuclein med PFF'er er værdifuld for udviklingen af lægemidler, da Lewy patologispredning betragtes som en af de tidlige sygdomsmarkører. Derfor kan aggregerings-forebyggende behandlinger være lovende for at stoppe eller bremse udviklingen af PD på meget tidlige stadier. Flere kliniske forsøg, der har til formål at bremse eller stoppe akkumulering af α-synuclein, eri gang 14. For senere patienter, transplantation af dopamin neuronale stamfædre kan være en bedre behandling alternativ15. Lewy patologi blev imidlertid dokumenteret i transplanterede embryonale neuroner under post mortem-analysen af PD-patienthjerner16,17, hvilket også indikerer behovet for beskyttelse mod akkumulering af α-synuclein.
In vitro, α-synuclein PFFs er kendt for at fremkalde aggregering i udødeliggjorte cellelinjer, eller mere almindeligt, i gnavere primære hippocampal eller kortikale neuroner. Ingen af disse er tæt på at opsummere dopamin neuroner10. Ætsning af disse neuroner kræver tæt belægning af visse antal neuroner in vitro18. For at opnå høj belægningsgrad med begrænset materiale (f.eks primære dopamin neuroner), mikroøen ætsning metode er almindeligt udnyttet. I mikro ø liggende, celler er i første omgang belagt i en lille dråbe medium (normalt et par mikroliter) holdes sammen af overfladespænding i midten af en stor brønd18. Efter neuronerne vedhæfte, hele brønden er fyldt med mediet, mens cellerne forbliver begrænset ved høj tæthed i den lille plating område. Ud over at opnå høj belægningsgrad forhindrer mikroøer også plating nær kanterne af brønde, hvor der er hyppigt variationer i celletæthed og overlevelse. Mikroøer bruges ofte i relativt store brønde eller retter; men, etablering midbrain neuronal kulturer i mikro øer i 96 godt plade format gør det muligt at studere Lewy patologi i bona fide dopamin neuroner med medium-til-high-throughput magt. In vitro eksperimenter med disse neuroner tillod os at opdage glial celle linje-afledt neurotrofisk faktor (GDNF), som fremmer overlevelsen af modne dopamin neuroner in vitro og in vivo19,20,21,22 og forhindrer også dannelsen af α-synuclein aggregater i dopamin neuroner23. Human patient-induceret pluripotente stamceller-afledte dopamin neuroner udgør en mere præcis model på grund af deres menneskelige oprindelse og længere overlevelse tid in vitro. Induktion af α-synucleinpatologi i humane neuroner observeres dog efter flere måneder sammenlignet med en uge hos embryonale neuroner med musen og/eller med flere stressorer (f.eks. kombination af α-synucleinoverekspression og PFF' er)24,25. Desuden, vedligeholdelse af humane dopamin neuroner er dyrere og besværlige i forhold til primære embryonale neuroner, hovedsagelig begrænse deres anvendelse i høj-throughput applikationer.
Desuden kan primære dopaminneuronale kulturer være genetisk modificerede (f.eks. med CRISPR/Cas9) og/eller behandles med farmakologiske midler23. De udgør en hurtig og reproducerbar platform for applikationer som molekylær vej dissektion og narkotika bibliotek screening. Selv om der kan opnås begrænset materiale fra disse kulturer, er det stadig muligt at foretage analyser af mindre genomforskning/proteomiske. Ætsning primære neuroner i 96 godt format er bedre for immunocytokemi og fluorescens mikroskopi teknikker, efterfulgt af højt indhold fænotype analyse. Multispektrale fluorescensbilleder, der stammer fra automatiseret billeddannelse af 96 brøndplader, kan konverteres til kvantitative resultater (f.eks. antallet af LB-holdige neuroner pr. brønd). Sådanne analyser kan gøres med fri software, såsom CellProfiler26,27. Samlet set giver primære embryonale midbrainkulturer belagt med 96 brøndplader en robust og effektiv platform til at studere dopaminneuroner og α-synuclein-sammenlægning med mulighed for screening af fænotype med høj gennemløb.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af det finske nationale råd for dyreforsøg og blev udført i henhold til EU-lovgivningen om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål.
1. Forberedelse
- Forbered dopamin neuron medium (DPM) med 0,46% D-glukose, 1% L-glutamin, 1% N2, 0,2% primocin, afsluttet med DMEM/F12. Filtrer DPM'en efter blanding af ingredienserne. DPM opbevares ved 4 °C, og hver aliquot opvarmes kun én gang.
BEMÆRK: DPM bør ikke indeholde GDNF, da det vil reducere α-synuclein akkumulering i dopamin neuroner23. - Forbered silikoneglaspipetter, der er ekstremt hydrofobiske, og dermed minimere fastgørelsen til overfladen og tab af celler under den første håndtering af embryonale neuroner.
- Der tilsættes 10 ml silikonevæske til 1 L destilleret vand og blandes ved omrøring i en 2 L-beholder. Lad glaspipetterne blive nedsænket i silikoneopløsningen i 15 min.
- Skyl pipetterne 3-5x med destilleret vand. Pipetterne tørres natten over ved stuetemperatur (RT) eller i 1-2 timer ved 100-120 °C opvarmet steril plads for at fremskynde tøringen.
- Pipetter pipetterne steriliseres ved standard autoklavering i en forseglet autoklavepose.
- Poly-L-ornithin (PO) belagt 96 godt plader med gennemsigtig bunde ved at tilføje 60 μL PO opløsning i midten brønde af 96 godt plade, der skal anvendes til såning af neuroner, forlader mindst én række / kolonne af brønde på kanterne af pladen for at undgå kant effekter. Den overtrukne plade opbevares natten over ved 4 °C eller 4 timer ved RT.
- Før plating cellerne, aspirere PO helt og vaske cellerne tre gange med 100 μL af 1x PBS. Indsug 1x PBS fra brøndene og hold låget på pladen åbent for fuldstændig tørring.
BEMÆRK: Det er muligt at indsamle brugt PO og filtrere det til genbrug. Dette kan gentages to gange for den samme PO-opløsning. - Der tilsættes 50 μL DPM til tidligere belagte brønde. Indsug DPM fra brøndene med en 100 μL plastspids og skrab samtidig bunden af brønden med cirkulære bevægelser for at fjerne belægningen på kanten af hver brønd. En PO-belagt ø vil forblive i midten af brønden.
- Under en laminar hætte, tilsættes 10 μL DPM til midten af hver belagt ø for at skabe mikroøer.
BEMÆRK: En plade med DPM-dækkede mikroøer kan opbevares under laminar flowhætte i 1-2 timer under isolering af celler.
2. Isolering af det ventrale midbraingulv fra E13.5-museembryoner
BEMÆRK: Se figur 1 for dissektionstrin på midbraingulvet.
- Før dissektion fyldes en 10 cm petriskål med Dulbeccos buffer og opbevares på is.
- Aflive en E13.5 gravid kvindelig mus i henhold til institutionens retningslinjer. Placer musen fladt på ryggen og spray den forreste krop med 70% ethanol. Løft huden over livmoderen med fletninger og lav et snit med kirurgisk saks for at afsløre livmoderen.
- Fjern forsigtigt livmoderen og læg den i den tidligere forberedte petriskål på is.
- Ved hjælp af kirurgisk saks under laminar hætte på RT, forsigtigt fjerne embryoner fra livmoderen. Fjern alle placentarester fra embryonerne med en hæcen, og læg dem i en ny 10 cm petriskål fyldt med Dulbeccos buffer.
- Ved hjælp af dissektionstøjninger eller nåle afskæres bagfjerdingen af hovedet fra de steder, der er markeret med sorte pile i figur 1A. Tag det afskårne stykke væk fra resten af fosteret (Figur 1B).
- Den bageste del af snittet anbringes mod observatøren (figur 1C), og skær den forsigtigt åben fra hale til kranie (figur 1D). Fra 0,5 mm under kranieåbningen skæres et område på 2 mm2-3mm2, som vist i figur 1E.
- Det ventrale midhjernen gulv (se figur 1F)opsamles i et tomt mikrocentrifugerør på 1,5 ml. Hold mikrocentrifugerøret på is, indtil alle midbraingulve er opsamlet i det.
BEMÆRK: Alternativt kan midbraingulvene opsamles med en 1 ml mikropipette efter dissektion af alle embryohjerner.
Figur 1: Dissektion af midhjernen fra E13.5 museembryon. (A) Skæresteder ved bagfjerdingen af hovedet er markeret med sorte pile og hvide stiplede linjer. (B) Stykket blev fjernet fra resten af fosteret. Det fjernede stykke er omringet. (C) Stykket blev vendt 90 ° til ansigt den bageste mod observatøren. (D) Stykket blev åbnet fra de sorte pile, fra hale til kranial (markeret med hvid stiplede linje). (E) Fra 0,5 mm til 1 mm under åbningen blev området 2 mm2-4mm2 skåret (markeret med sorte linjer). (F) Den ventrale midbrain gulvet blev isoleret (markeret med sort stiplede firkant). Skalerbarer = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Etablering af primære embryonale midbrainkulturer fra E13.5-museembryoner i 96 brøndpladeformater
- Efter indsamling af midbrain gulve fra alle embryoner i samme 1,5 ml rør, fjerne den resterende Dulbecco buffer og vaske væv stykker tre gange med 500 μL ca2 +, Mg2 +-fri Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- HBSS fjernes, og der tilsættes 500 μL 0,5 % trypsin til røret. Inkuber det ved 37 °C i 30 min.
- Under inkubationen opvarmes 1,5 ml føtalt kvægserum (FBS) ved 37 °C, der tilsættes 30 μL DNase I til FBS, og der blandes. Også brand-polere spidsen af en siliciumglas pipette. Sørg for, at hullet ikke har skarpe kanter og er omkring samme størrelse som en 1 ml mikropipettespids.
BEMÆRK: Alternativt kan en mikropipettespids med lav vedhæftning bruges til triturering. Men silikoneglas pipetter synes at give de bedste resultater. - Så snart inkubationen i trin 3.2 slutter, tilsættes 500 μL af FBS/DNase-blandingen til det delvist fordøjede væv. Brug glaspipetten til at triturere vævet i FBS/trypsin mix. Triturate indtil væv dissociere i bittesmå, knap synlige partikler. Undgå bobler under trituration.
- Lad de resterende partikler bundfælde i bunden af mikrocentrifugerøret ved tyngdekraften. Uden pipettering bundfaldet i bunden, opsamler supernatanten i et tomt 15 ml konisk polypropylenrør.
- FBS/DNase I fortyndes fra trin 3.3 (98:2) med 1.000 μL HBSS for at opnå FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Bland ved pipettering op og ned. Der tilsættes 1.000 μL af den nye blanding til de resterende partikler i mikrocentrifugerøret. Triturate igen og gentag trin 3.5.
- Gentag det forrige trin igen for at bruge alle FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
- Når alle supernatant er indsamlet inde i 15 ml rør (fra trin 3,5, 3,7, og 3,8), skal du bruge en bordplade centrifuge at spinne ned supernatant (~ 3 ml) ved 100 x g, i 5 min. Fjern supernatant uden at røre de pelleterede celler i bunden.
- Vask cellepelleten ved at tilføje 2 ml DPM til røret og drej den ned ved 100 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og gentag vasken 2x for at minimere snavset i de pelleterede celler.
BEMÆRK: Brug altid frisk, opvarmet DPM til de dyrkede neuroner. For vasketrinne behøver DPM ikke at være frisk, men skal forvarmes til 37 °C. - Cellerne fortyndes med frisk, varm DPM og overføres til et mikrocentrifugerør. Mængden af DPM til fortynding afhænger af antallet af embryoner, der anvendes til vævsdissektion. Brug for eksempel 150 μL DPM til at fortynde cellerne fra ti embryoner.
- 10 μL celler overføres i DPM til et mikrocentrifugerør. Bland dem med 10 μL af 0,4% Trypan blå plet. Tæl levende (dvs. Trypan blå negative) celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celle tæller.
BEMÆRK: Brug 30.000 celler til plating pr brønd for at opnå ~ 1.000 dopamin neuroner pr brønd. Hvis celletætheden er højere end ~30.000 celler pr. 6 μL, fortyndes cellerne yderligere med DPM, før de beplaneres, så såvolumen ikke er mindre end 6 μL. - Uden at røre bunden af brøndene, fjerne DPM fra mikroøerne skabt på trin 1,6.
- For at opnå reproducerbar celletæthed ved hver brønd blandes cellerne ved skånsom pipettering før plating i brønden. Med en mikropipette på 1-10 μL tilsættes 6 μL celler til midten af brønden på hver tidligere mikroø.
- Fyld de tomme brønde ved pladens kanter med 150 μL vand eller 1x PBS for at minimere fordampningen fra de brønde, der indeholder neuronalkulturer. Pladen inkuberes i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2 for 1 time.
- Efter 1 time fjernes pladen fra kuvøsen, der tilsættes 100 μL DPM i hver brønd med celler, og den sættes tilbage i kuvøsen.
- To dage efter plating (dag in vitro 2 eller DIV2) fjernes 25 μL, og der tilsættes 75 μL frisk DPM for at bringe det endelige medievolumen op på 150 μL og undgå fordampning så meget som muligt.
- Halvdelen af mediet udskiftes med frisk DPM (dvs. fjern 75 μL og tilsættes 75 μL frisk DPM) ved DIV5. Udfør ikke medieændringer efter DIV5.
4. Induktion af α-synucleinaggregater i primære embryonale dopaminneuroner ved såning med præforme fibriller
Protokollerne for fremskaffelse og validering af PFF'er er blevet omhyggeligt beskrevet og drøftet i flere nylige publikationer11,28,29,30. Efter ethvert arbejde med PFF'er rengøres laminarhætten eller udstyr, der kan have kontaktet PFF'erne med 1% SDS, derefter med 70% ethanol31.
- Før forsøget fortyndes PFF'erne med 1x PBS til en endelig koncentration på 100 μg/ml. Sonikere de fortyndede PFF'er i mikrocentrifugerør med en badsonicator ved høj effekt med vandbadkøling ved 4 °C i 10 cyklusser, 30 s ON/30 s OFF.
BEMÆRK: Det er afgørende, at fibrillerne skal sonikeres korrekt for at generere fragmenter ~ 50 nm lang. Størrelsen af sonikerede PFF'er kan måles direkte fra transmissionselektronmikroskopbilleder af PFF'er, der farves som beskrevet af Patterson et al.30. Sonikering kan opnås som beskrevet ovenfor i en høj effekt bad sonikator. Alternativt kan en spids sonikator bruges30. Sonikerede PFF'er kan opbevares ved -80 °C i små aliquots for at undgå flere frysning / optøning cykler. - På DIV8 tilsættes 3,75 μL 100 μg/ml PFF pr. brønd til 150 μL medium i brønden til en endelig koncentration på 2,5 μg/ml. Brug den samme mængde 1x PBS til kontrolgruppen.
- Der tilberedes 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS og opbevares aliquoterne ved -20 °C. Det kan du gøre ved at følge nedenstående trin.
BEMÆRK: PFA er giftigt. bære en maske og handsker under forberedelse, arbejde altid under en laminar hætte, og bortskaffe alt fast og flydende PFA affald i henhold til institutionens anvisninger.- Varm 500 ml 1x PBS i et 1 L fartøj. Sæt en røre bar i fartøjet og sætte fartøjet på en magnetisk omrører med en varmefunktion. Juster temperaturen mellem 40-60 °C for at undgå kogning, mens opløsningen er varm.
- Mål 20 g PFA-pulver under kølerhjelmen i en engangsplastbeholder. Tilsættes forsigtigt PFA-pulveret i beholderen fyldt med 1x PBS. Begynd at røre ved opløsningen.
- Der tilsættes 200 μL 5 M natriumhydroxid i opløsningen, og omrøringen fortsættes i ~15 min, indtil PFA opløses fuldstændigt.
- Efter opløsningen synes homogen, tilsættes 168 μL 5 M hydrogenchlorid til balance pH til ~7. Kontroller pH med engangs farvefaste pH-indikatorstrimler.
- Fjern beholderen fra varmeapparatet og lad det køle ned til RT. Filtrer opløsningen og prøven til opbevaring ved -20 °C. Tø aliquots på RT før brug og ikke genfryse bagefter.
- På DIV15 skal du fjerne alle medier fra brøndene ved at pipettere. Der tilsættes 50 μL af 4% PFA til hver brønd for at fastgøre cellerne og inkubere i 20 min ved RT. Efter inkubationen fjernes PFA'en fra brøndene, og der tilsættes 100 μL 1x PBS til hver brønd for at vaske cellerne. Fjern 1x PBS og vask 2x mere.
- Der efterlades 100 μL 1x PBS i hver brønd for at undgå tørring. Pladen opbevares ved 4 °C, indtil der er foretaget immunkemi.
5. Immunofluorescent farvning og automatiseret billeddannelse af primære embryoniske dopamin neuroner i 96 godt plader
- 1x PBS fjernes, og cellerne gennemtrænges ved at tilsætte 100 μL 0,2% Triton X-100 i PBS (PBST) pr. brønd og inkubere ved RT i 15 min.
- PBST fjernes, og 50 μL af 5% normalt hesteserum (NHS) til PBST tilsættes. For at blokere den uspecifik antigenaktivitet skal der inkuberes ved RT i 1 time.
- De primære antistoffer mod TH og pS129-αsyn (1:2.000) fortyndes i 5% NHS i PBST. Der tilsættes 50 μL fortyndede antistoffer til hver brønd, og der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Antistofferne fjernes, og der tilsættes 100 μL 1x PBS til hver brønd for at vaske cellerne. Fjern 1x PBS og gentag vask 2x.
- For at forhindre blegning af fluorescerende molekyler, begynde at arbejde under minimale lysforhold. De sekundære fluorescerende antistoffer (1:400) fortyndes i PBST. Der tilsættes 50 μL fortyndede antistoffer til hver brønd og inkuberes ved RT i 1 time.
- Antistofopløsningen fjernes, og der tilsættes 100 μL 1x PBS til hver brønd for at vaske cellerne. Fjern 1x PBS og gentag vask 2x.
- 1x PBS fjernes, der tilsættes 50 μL 200 ng/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) pr. brønd for at plette kernerne i de dyrkede celler og inkubere ved RT i 10 min.
- Cellerne vaskes 3x med 100 μL 1x PBS i 5 min hver. Der opbevares 100 μL 1x PBS i hver brønd efter den sidste vask. Dæk pladen med aluminiumsfolie og opbevar den ved 4 °C indtil billeddannelse.
- Billede primære embryonale dopamin neuroner i en 96 godt se plade med et højt indhold plade scanner (se Tabel over Materialer) udstyret med en 10x mål.
- Juster indstillingerne baseret på specifikationerne for 96 brøndpladen, såsom pladetype, producent, størrelse, afstand mellem brønde, samt type og mængde af medium.
- Vælg billedbehandlingsområdet for brønden for at dække alle cellerne på en mikroø. Vælg et eksempel godt for at justere autofokus. Basere det indledende fokus på DAPI.
- Kalibrer anskaffelsestiden for hver fluorescerende kanal baseret på intensiteten af farvning i kontrolrør. Justere parametrene, så man i FSR-behandlede kontrolb nås klart kan skelne dopaminceller, der huser pS129-αsynaggregater i celle soma, hvilket giver mulighed for entydig kvantificering af pS129-αsyn positive og pS129-αsyn negative celler.
BEMÆRK: Brønde, der ikke indeholder PFF'er, bør ikke have nogen farvning for pS129-αsyn; Derfor kan disse brønde bruges som negativ kontrol til justering af pS129-αsyn intensitet. - Image alle de valgte brønde med en 10x mål samtidig for alle kanaler med immunfluorescens farvning med nøjagtig de samme parametre.
- Eventuelt skal du mærke α-synucleininin indeslutninger i en delmængde af brøndene med antistoffer, der er specifikke for filamentøs α-synuclein, for at bekræfte, at ændringer i antallet af pS129-αsyn-positive indeslutninger afspejler reduktionen i proteinakkumulering snarere end hæmning af fosforylering eller dephosphorylation af pS129-αsyn.
- Trin 5.3 gentages, og pS129-αsyn antistof erstattes med α-synucleinfilamentets antistof (1:2.000). Billede den farvede aggregerede α-synuclein som i trin 5.13.
6. Billedanalyse med højt indhold
BEMÆRK: Dette trin udføres med open access software CellProfiler version 3.15 og CellProfiler Analyst version 2.2.1. 27,32. Men med en vis erfaring, kunne de tilsvarende billedanalyse rørledninger sættes i en anden version eller lignende software. Se softwaresiden for en detaljeret forklaring (se materialetabel).
- Download og installer CellProfiler og CellProfiler Analyst software.
- Åbn Celleprofiler. Vælg Fil| Import| Pipeline fra fil og indlæse eksempel pipeline forudsat, TH_LB_V1.cpipe fil (se de supplerende filer).
BEMÆRK: Eksempelpipelines kræver specifikke justeringer afhængigt af egenskaberne for de erhvervede billeder og billederhvervelsesplatformen. Example_Imageskan bruges til den første prøveversion af softwaren. - Indlæs billeder, der skal analyseres, ved at trække dem ind i modulet Billeder. Brug filterindstillinger til kun at vælge billedfiler fra den indlæste mappe.
- Brug metadatamodulet til at udtrække brønd, visningsfelt og kanaloplysninger fra billedfilnavnet. Klik på forstørrelsesglas symbolet og indtast regulært udtryk for at udtrække Plate, Well, Imaging Site og Channel oplysninger fra filnavne.
BEMÆRK: Regulært udtryk vil afhænge af navngivningskonventionen af plademikroskopet. Hvis du klikker på spørgsmålstegnet ved siden af forstørrelsesglas, får du oplysninger om syntaksen. - Vælg korrekte kanalnumre for DAPI, TH og pS129-αsyn farvning under NamesAndTypes (standardkanalerne 1, 2og 3). Vælg " Nej " imoduletGrupper.
- Brug metadatamodulet til at udtrække brønd, visningsfelt og kanaloplysninger fra billedfilnavnet. Klik på forstørrelsesglas symbolet og indtast regulært udtryk for at udtrække Plate, Well, Imaging Site og Channel oplysninger fra filnavne.
- Brug IdentifyPrimaryObjects moduler til at segmentere dopamin neuroner ved hjælp af TH farvning af celle soma.
BEMÆRK: Specifikke værdier kræver indledende optimering baseret på, hvordan plader farves og afbildes. Hvis efterfølgende plader behandles på samme måde, skal der ikke foretages yderligere justeringer eller minimale justeringer. - Brug MeasureObjectIntensity-modulet til at hente oplysninger om fluorescensintensitet fra TH- og DAPI-kanaler.
- Brug MeasureObjectSizeShape modul til at måle størrelse og form funktioner segment dopamin neuroner.
- Brug MeasureTexture modul til at måle tekstur indslag oplysninger fra TH kanal fra segmenterede dopamin neuroner.
- Brug modulet ExportToDatabase til at gemme målinger i databasen.
- Navndatabasefil i henhold til eksperimentets navngivningsskema (f.eks. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Vælg Outputmappe til databasefilen. Databasefilen kan være flere gigabyte store og skal gemmes helst i den overordnede mappe af billedfilerne.
- Åbn CellProfiler, og vælg den V1_THCells.properties-fil, der blev oprettet i trin 6.8. Åbne værktøjer| Klassificering.
- Sortér opdelte celler i to kategorier: positiv (dvs. korrekt segmenteret dopamin neuron celle organer) og negative (dvs. segmentering og farvning artefakter) Se Figur 2A og 2B.
- Indstil antallet af hentede celler til 50 tilfældige celler, og klik på Hent (dette indlæser billeder af cellerne segmenteret i trin 6.4). Sorter mindst 30 celler i hver placering ved at trække dem til den tilsvarende placering nederst i vinduet. Hent flere celler efter behov.
- I rullemenuen skal du vælge Brug Hurtig blid boosting med 50 max regler, og klik på Træn.
- Indstil "Hent" til 50 positive celler, og tryk på Hent for at få TH-positive celler i henhold til klassificeringen (Figur 2A). Brug det opnåede resultat til at vurdere kvaliteten af den uddannede klassificering.
- Gentag trin 6.10.1-6.10.3, og tilsætning af nye eksempelceller til træning af klassificeringen, indtil resultaterne er tilfredsstillende.
- Vælg Avanceret| Rediger regler... og marker al select all text tekst (Ctrl+a)i et nyt vindue, og kopiér den (Ctrl-c) til notesblok (Ctrl-v). Gem som TH_rules.txt-fil.
BEMÆRK: Afhængigt af densiteten af den neuronale kultur og kvaliteten af farvning og billeddannelse, er dette trin måske ikke nødvendigt, da det kan være muligt at indstille parametre i trin 6.4 til kun at segmentere TH-positive celler med høj nøjagtighed. Hvis dette er tilfældet, er en hel TH_LB_V1.cpipe-kørsel ikke nødvendig, og de korrekte parametre for IdentifyPrimaryObjects-moduler skal placeres direkte i det tilsvarende modul i TH_LB_V2.cpipe.
Figur 2: Kvantificering af dopaminneuroner og pS129-αsyn positive dopaminneuroner med CellProfiler Analyst-software baseret på DAPI, TH og pS129-αsyn immunofluorescens. (A) TH-celler i den positive beholder blev valgt baseret på DAPI farvning (blå) markeret med en lille firkant ved den første celle, der blev valgt på billedet, og den omgivende TH-farvning (grå) ved soma. (B) Ikke-celledefakter blev placeret i den negative placering. (C) pS129-αsyn positive TH neuroner blev valgt baseret på stor optagelse af pS129-αsyn farvning (rød) markeret med en lille firkant ved den første celle valgt på billedet, omkring kerner eller på celle soma. (D) TH-celler uden sådanne pS129-αsyn indeslutninger blev placeret i den negative beholder. Skalastænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Åbn CellProfiler, og vælg Filer| Import| Pipeline fra fil og indlæs TH_LB_V2.cpipe-fil. Gentag trin 6.3-6.7. Denne del af rørledningen skal være identisk med TH_LB_V1.cpipe.
- Brug FilterObjects-modulet til kun at overføre ægte TH-positive celler til yderligere analyse.
- Angiv vælge filtreringstilstand til Regler. Vælg den fil, der er oprettet i trin TH_rules 6.10.5, i Regler eller klassefilnavn.
- Angiv feltet Klassenummer til 1, hvis TH-positive celler blev sorteret til nederste venstre vindue.
- Brug MeasureObjectIntensity-modulet til at hente oplysninger om fluorescensintensitet fra pS129-αsyn-kanalen.
- Brug MeasureTexture-modulet til at måle teksturfunktionsoplysninger fra TH-kanalen fra filtrerede celler.
- Brug modulet MålobjektSizeShape til at måle størrelse og formfunktioner i filtrerede celler.
- Brug modulet ExportToDatabase til at gemme målinger i databasen.
- Navngr databasefil i overensstemmelse hermed med eksperimentnavngivningsskemaet (f.eks. ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Vælg outputmappe til databasefil.
- Åbn CellProfiler, og vælg V2_THpos.properties-fil.
- Sorter segmenterede celler i to kategorier – pS129-αsyn positive og pS129-αsyn negative celler (Figur 2C,D).
- Indstil antallet af hentede celler til 50 tilfældige celler, og klik på Hent (dette indlæser billeder af celler segmenteret i trin 4). Sorter mindst 30 celler i hver placering ved at trække dem til den tilsvarende placering nederst i vinduet.
- I rullemenuen skal du vælge Brug Hurtig blid boosting med 50 maks. rules Random Forest Klik på Træn.
- Indstil "Hent" til 50 positive celler, og tryk på Hent for at få pS129-αsyn positive celler i henhold til klassificering (Figur 2C). Indstil "Hent" til 50 negative celler, og tryk på Hent for at få pS129-αsyn negative celler i henhold til klassificering (Figur 2D). Vurder kvaliteten af den uddannede klassificering.
- Gentag trin 6.17.2-6.17.4, og tilsætning af nye eksempelceller for at træne klassificeringen, indtil resultaterne er tilfredsstillende.
- Klik på Score Alle for at få resultater tabel opsummerer antallet af pS129-αsyn positive og negative dopamin neuroner i hver brønd.
Representative Results
Et par dage efter plating (DIV1-DIV3), lyse-felt mikroskopi blev gjort for at vurdere sundhed og homogen spredning af de dyrkede celler, og ensartethed af disse betingelser på de enkelte brønde (Figur 3). Kulturperlede midhjernceller blev spredt homogent inden for mikroøen, der blev skabt før plating (figur 3A,B). Primære neuroner havde slået sig ned på det overtrukne jord homogent og etableret neuronale fremskrivninger (Figur 3B). En lille klump celler (diameter mindre end 150 μm) blev observeret ved brønden og vist som et eksempel (Figur 3C).
Figur 3: Få dage efter platingen (f.eks. DIV3) blev tilstanden af primær midbrainkulturer observeret med lysfeltmikroskopi. (A) Kulturperler celler spredt over midten af brønden inden for PO-belagt mikro ø med en omtrentlig radius på 4,4 mm (vist med hvide pile) skabt ved at ridse PO fra ca 1 mm godt omkreds (vist med sorte pile). (B) Kulturperler primære neuroner homogent spredt inden for området og neuronale fremskrivninger (markeret med røde pilespidser) blev observeret. CC) En cellekmpning med en diameter på under 150 μm er markeret med blå pilespidser. Skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Primære musemidhiner blev immunstainedtøbt med anti-TH og anti-pS129-αsyn antistoffer og afbildet med et automatiseret mikroskop efter 15 dage in vitro. Overtrukne mikroøer gav begrænset område til fastgørelse af celler i midten af brønde (Figur 4A,B). Dopaminneuroner, der er immunmærket med TH-markør, blev spredt rundt om mikroøen i et monolag, adskilt fra hinanden, uden sammenklumpning (Figur 4A' og 4B').
Figur 4: Ved DIV15 blev 800-1.000 dopaminceller kvantificeret fra hver mikroø, med eller uden FSR-behandling. Repræsentative billeder af embryonale midbrainkulturer, der er immonustained med anti-TH- og anti-pS129-αsyn-antistoffer. (A, A', A'' Kontrolceller uden FSR-behandling. (B, B', B'') PS-behandlede celler med pS129-αsyn-indeslutninger. CC) Kvantificering af TH-positive celletal i brønde behandlet med køretøj (kontrol), PFF'er eller PFF'er med 50 ng/ml GDNF. DD) Kvantificering af pS129-αsynaggregater i TH-positive celler behandlet med køretøj (kontrol), PFF'er eller PFF'er med 50 ng/ml GDNF. Statistisk signifikans blev beregnet med random block design ANOVA. **p < 0,01, n = 4 individuelle plader (biologiske replikater), hver med 3-6 brønde pr. behandlingsgruppe (tekniske gentagelser). Skalastænger = 300 μm for A, B; 50 μm for A', B' 25 μm for A'', B''. Klik her for at se en større version af dette tal.
Mens kulturer uden PSN-behandling ikke havde noget pS129- αsyn-signal (figur 4A' og 4A''), udviklede kulturer behandlet med α-synuclein PFF'er pS129-αsyn positive inklusioner (Figur 4B'og 4B''). In vitro-FSFR-behandling i 7 dage meddømte ikke signifikante fald i antallet af TH-positive neuroner sammenlignet med andre forsøgsgrupper (figur 4C). FSR-behandlede kulturer havde en population på ~40% af pS129-αsyn positive TH-positive dopamin neuroner. Behandling med positiv kontrol, GDNF, reducerede procentdelen af TH-positive dopaminneuroner med pS129-αsyn positive indeslutninger (Figur 4D,se også de rå data og eksempelbilleder i de supplerende filer).
Supplerende filer: Eksempel på pipelines til billedanalyse med højt indhold med CellProfiler og CellAnalyst-softwarepakker, eksempelbilleder og rådata til Figur 4E, F. (1-9) Example_Images. Åbn disse billeder med ImageJ eller CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Trin 6.2-6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Trin 6.11-6.18) Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Spredning Lewy patologi, hvoraf pS129-αsyn er en vigtig bestanddel, er en histopatologisk kendetegn for PD. Standsning eller bremse ophobning af aggregerede pS129-αsyn kan bremse degeneration af dopamin neuroner og progression af alfa-synucleinopati. Men, en mekanistisk forståelse af, hvordan pS129-αsyn sammenlægning bidrager til lukningen af dopamin neuroner stadig skal etableres. Dokumentation fra humane postmortemundersøgelser af hjerneprøver fra patienter på forskellige stadier af sygdommen samt observation af pS129-αsyn positiv inklusion i transplanterede foneturoner tyder stærkt på, at Lewy-patologien spredesmellem cellerne 16,17,33. Derfor blev prionlignende spredning af pS129-αsyn for nylig opsummeret ved hjælp af α-synucleinPFFs 9,10. Etablering af en robust, omkostningseffektiv, og relativt høj- eller medium-throughput model af pS129-αsyn spredning og akkumulering, specielt i dopamin neuroner, kan betydeligt fremskynde søgningen efter nye behandlinger og forbindelser ændre denne proces.
Fordi tab af dopamin neuroner er den vigtigste årsag til motoriske symptomer i PD og disse celler har mange unikke egenskaber2,,34,,35, modellering af prion-lignende spredning af pS129-αsyn i dopamin neuroner er den mest relevante type model fra translationel perspektiv. Protokoller, der anvender mikroøkulturer af embryonale midbrainneuronner på 4 brøndplader og halvautomatisk kvantificering, er tidligerebeskrevet 18. Den protokol, der er beskrevet her, er tilpasset 96 brøndplader og giver mindre møjsommelig forberedelse af mikroøer, hvilket giver mulighed for forberedelse af op til fire plader, der indeholder 60 brønde hver af en erfaren forsker i løbet af en arbejdsdag. Ætsning dopamin neuroner i 96 godt plader giver mulighed for at teste lægemidler ved lavere mængder og muliggør høj transduktion satser med lentivirus vektorer. Det er også muligt at kombinere forskellige behandlinger for at udføre mere komplekse eksperimenter.
Før der anvendes behandlinger (herunder PFF'er), skal kvaliteten af ætsning kontrolleres med lysfeltmikroskopi. Hvis mikroskopisystemet ikke udnytter et CO2-kammer med opvarmning, bør cellerne ikke holdes uden for inkubatoren i mere end et par minutter, fordi primære muse dopaminneuroner er sarte og let stressede. Af samme grund tilrådes det, at den første billeddannelse skal ske efter 24 timers inkubation (mellem DIV1-DIV3). Cellerne skal synes at være levende med nuværende cellekroppe og homogent spredes inde i mikroøen. Primære neuroner ville have afgjort på PO-belagt jorden og begyndte at etablere neuronale fremskrivninger. Det er muligt at observere en lille klump celler (dvs. en diameter, der er mindre end 150-200 μm), som kan dannes, hvis triturationsprocessen ikke udføres korrekt, eller belægningsgraden er højere end anbefalet. Disse små klumper ville ikke påvirke forsøget, medmindre de er mere end et par per brønd og / eller større. Klumpede celler gør det meget vanskeligt at identificere immunhistokemiske markører og individuelle celler under billedanalysen. Det er vigtigt at undgå sådanne klumper ved omhyggelig belægning, triturating, og kontrollerende plating tæthed. Hvis disse betingelser ikke kan overholdes ensartet ved visse brønde, må disse defekte brønde ikke medtages i forsøget. En sådan udelukkelse bør ske, før behandlingen foretages.
Desuden udnyttelse af 96 godt plader giver mulighed for praktisk multichannel pipette brug under farvning procedurer og direkte visualisering med automatiskplade mikroskoper, yderligere at øge gennemløb. Udnyttelse af automatiseret billedkvantificering er nødvendig for analysen af data fra billedbehandlingsplatforme med højt indhold. Ud over evnen til at behandle tusindvis af billeder fra hvert eksperiment, sikrer det upartisk, identisk kvantificering af alle behandlingsgrupper. Den foreslåede arbejdsgang for billedanalysen er baseret på enkle principper for segmentering af dopaminneuroner, filtrering af korrekt segmenterede celler ved overvåget maskinlæring og efterfølgende kvantificering af fænotyper (pS129-αsyn positive og pS129-αsyn negative), igen ved overvåget maskinlæring. Selv om flere forskellige tilgange til denne opgave kan forestille sig, har vi fundet kombinationen af segmentering med machine learning at være den mest robuste for dopamin kulturer på grund af høj belægningsgrad, de forskellige former af dopamin neuroner, og tilstedeværelsen af stærkt farvede neurites. Den foreslåede billedanalyse algoritme blev gennemført i CellProfiler og CellProfiler Analyst, open source, frit tilgængelige højt indhold billedanalyse software26,27. Algoritmen kan også implementeres med andre billedanalyse software, enten open source (f.eks ImageJ / FIJI, KNIME) eller proprietære. Men det er vores erfaring, at disse ofte ofrer tilpasningsmuligheder for brugervenlighed og derfor måske ikke klarer sig godt i komplicerede analyser. Vi har konstateret, at CellProfiler og CellProfiler Analyst softwarepakker giver særligt pålidelige resultater ved at kombinere et betydeligt antal implementerede algoritmer, ekstrem fleksibilitet i udformningen af arbejdsgange, og samtidig håndtering og effektiv behandling af højindhold billedbehandling data.
Den beskrevne protokol kan også tilpasses til kvantificering af andre cellulære fænotyper karakteriseret ved immunsindeholding med forskellige antistoffer, såsom markører for andre neuronale populationer (f.eks. DAT, GAD67, 5-HT osv.) og proteinaggregater (f.eks. phospo-Tau, ubiquitin). Flere fluorescerende markører kan også kombineres for at skelne mellem flere fænotyper (f.eks. celler med indeslutninger på forskellige stadier af modning). Automatiseret klassificering af flere fænotyper bør også være let at implementere i de beskrevne billedanalysepipelines ved blot at tilføje en kanal, der indeholder immunfluorescerende billeder af yderligere markører, til måletrin og sortering af celler i flere spande. Udnyttelse af flere markører på samme tid ville imidlertid kræve optimering af immunstøbe og billeddannelse betingelser. Derudover anbefales det at anvende særlige sortvæggede 96 brøndplader, der udtrykkeligt er designet til fluorescerende mikroskop, for at opnå bedre kvalitet i immunofluorescensbilleddannelse. Disse kan dog være betydeligt dyrere end standardcellekulturplader, som er tilstrækkelige til den analyse, der er beskrevet i vores protokol.
Typen og kvaliteten af udnyttede PFF'er er afgørende for resultatet af forsøgene. PFF'er kan både påvirke analysens robusthed og fortolkningen af resultaterne. Præparatet betingelser kan påvirke såningseffektiviteten af PFF'er, og fs.36 Ikke desto mindre ligger forberedelsen og valideringen af PFF'er uden for denne artikels anvendelsesområde og er beskrevet i flerepublikationer 11,28,29,30. Ud over præparatprotokollen bør oprindelsesarten af α-synuclein i PFF'er (f.eks. mus, mennesker) og brugen af vildtype eller muteret protein (f.eks. humant A53T α-synuclein) tages i betragtning afhængigt af de særlige forsøgsbetingelser. Induktion af pS129-αsyn akkumulering ved PFF'er viste sig at være afhængig af kulturens alder (dvs. dage in vitro), hvor mere modne kulturer viste mere udtalt induktion11. Dette skyldes sandsynligvis det øgede antal neuronale forbindelser i mere modne kulturer, og øget α-synuclein protein niveauer. I vores hænder gav behandling med PFF'er på DIV8 de mest robuste resultater med udtalt akkumulering af pS129-αsyn i dopaminneneurn soma, uden at gå på kompromis med neuronal overlevelse. Den beskrevne protokol er velegnet til studiebehandlinger, der ændrer tidlige hændelser, der fører til aggregering af endogent α-synuclein, fordi vi kvantificerer pS129-αsyn positive inklusioner på et relativt tidligt tidspunkt, 7 dage efter inokulering med PFF'er. På dette tidspunkt, intrasomal indeslutninger er til stede i en betydelig brøkdel af celler og kan let skelnes ved immunsintaining mens ingen FSR-induceret celledød er observeret, forenkle fortolkningen af resultaterne. Det er vigtigt, at den beskrevne protokol i princippet kan ændres, da morfologien og sammensætningen af FSR-inducerede indeslutninger kan ændre sig over tid12,13, for at undersøge mere modne inklusioner ved fiksering og immunsåring på et senere tidspunkt. Men, holde dopamin neuroner i kulturen i længere end 15 dage kræver ekstrem pleje, og kan fremkalde yderligere variation på grund af celler ikke at overleve uafhængigt af PSPPokulering. Derudover, mere udvidede kulturer komplicere narkotika behandling tidsplaner. Mange forbindelser har begrænset eller ikke dårligt karakteriseret stabilitet i cellekulturmediet, og genopfyldning af et lægemiddel er ikke trivielt, fordi fuldstændig udveksling af medium kompromitterer dopaminkulturerne overlevelse.
Fosforylering af α-synuclein ved Ser129 rapporteres konsekvent i PSB-baserede modeller af α-synuclein-aggregering og colocalizes med markører for fejlfolde og aggregering såsom Thioflavin S, ubiquitin eller konformationsspecifikke antistoffer11,12. I vores hænder giver immunsisten for pS129-αsyn også det stærkeste signal med den laveste baggrund og er mest ligetil at analysere, hvilket giver robuste resultater, når flere behandlinger screenes. Det er vigtigt, at immunstøbe med pS129-αsyn antistof ikke registrerer PFF'er, der forbliver uden for cellerne, hvilket reducerer baggrunden betydeligt. Det er dog vigtigt at huske, at Ser129 fosforylering sandsynligvis er en af de tidligste processer i forbindelse med misfolding af α-synuclein og kan reguleres forskelligt under særlige forhold. Derfor bør alle resultater, der viser positive virkninger på pS129-αsyn, bekræftes af andre markører.
Den statistiske analyse bør tilpasses forsøgsdesignet på en sådan måde. Det er vigtigt at udføre forsøg i mindst tre uafhængige biologiske replikater (dvs. separate primære neuronale kulturer). Disse replikater skal forgyldes på forskellige plader og behandles uafhængigt. Vi analyserer data fra replikater på forskellige plader med random block design ANOVA37 for at tage højde for parringen af data til forskellige eksperimentelle plader.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker prof. Kelvin Luk for hans generøse gave af α-synuclein PFFs, Conjung Zheng for oprettelse og ætsning neuronal celler, og Light Mikroskopi Enhed ved Institut for Bioteknologi, University of Helsinki, for billeddannelse immunostained celler. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra 3i-Regeneration fra Business Finland (det finske finansieringsagentur for innovation), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Foundation, og de lovpligtige midler fra Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
