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Neuroscience

प्राथमिक भ्रूण माउस मिडब्रेन डोपामाइन न्यूरॉन्स में पूर्व-गठित फिब्रिल प्रेरित α-सिन्यूक्लिन संचय का अध्ययन

Published: August 16, 2020 doi: 10.3791/61118
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Neuroscience Center, HiLIFE, University of Helsinki, 3Department of Brain Biochemistry, Maj Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences

Summary

यहां, हम प्राथमिक माउस डोपामाइन न्यूरॉन्स में न्यूरोनल α-सिन्यूक्लिन संचय का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। न्यूरॉन्स में फॉस्फोरिलेटेड α-सिन्यूक्लिन समुच्चय पूर्व-गठित α-सिन्यूक्लिन फाइब्रिल्स के साथ प्रेरित होते हैं। इम्यूनोफ्लोरोसेंशली लेबल कोशिकाओं और निष्पक्ष छवि विश्लेषण की स्वचालित इमेजिंग इस मजबूत प्रोटोकॉल को दवाओं की मध्यम से उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त बनाती है जो α-सिन्यूक्लिन संचय को रोकती है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य प्राथमिक डोपामाइन न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन संचय का एक मजबूत और प्रजनन योग्य मॉडल स्थापित करना है। इम्यूनोस्टेपिंग और निष्पक्ष स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त, यह मॉडल न्यूरोनल संस्कृतियों में α-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण पर दवाओं और आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभावों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। प्राथमिक मिडब्रेन संस्कृतियां सदाशयी भ्रूण डोपामाइन न्यूरॉन्स का एक विश्वसनीय स्रोत प्रदान करती हैं। इस प्रोटोकॉल में, पार्किंसंस रोग, लेवी बॉडीज (एलबी) की हॉलमार्क हिस्टोपैथोलॉजी, सीधे न्यूरोनल कल्चर मीडिया को α-सिन्यूक्लिन प्री-स्ट्रगल फिब्रिल्स (पीएफएफ) के अलावा की नकल है। डोपामाइन न्यूरॉन्स के सोमा में अंतर्जात फॉस्फोरिलेटेड α-सिन्यूक्लिन का संचय पीएफएफ अतिरिक्त के 7 दिनों के बाद पहले से ही इम्यूनोदाता द्वारा पता लगाया जाता है। इन विट्रो सेल संस्कृति की स्थिति छोटे अणु दवाओं और न्यूरोट्रोफिक कारकों जैसे α-सिन्यूक्लिन संचय को रोकने वाले उपचारों के आवेदन और मूल्यांकन के साथ-साथ आनुवंशिक हेरफेर के लिए लेंटीवायरस वैक्टर (उदाहरण के लिए, CRISPR/Cas9 के साथ) के लिए भी उपयुक्त हैं। 96 अच्छी तरह से प्लेटों में न्यूरॉन्स culturing मजबूती और प्रयोगात्मक सेटअप की शक्ति बढ़ जाती है। प्रयोग के अंत में, कोशिकाओं को इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ तय किया जाता है। मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस छवियों को 96 अच्छी तरह से प्लेटों की स्वचालित माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। इन आंकड़ों को मात्रा निर्धारित किया गया है (उदाहरण के लिए, प्रति अच्छी तरह से फास्फो-α-सिन्यूक्लिन युक्त डोपामाइन न्यूरॉन्स की संख्या की गिनती) मुफ्त सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ जो निष्पक्ष उच्च सामग्री फेनोटाइप विश्लेषण के लिए एक मंच प्रदान करता है। प्राथमिक डोपामाइन न्यूरॉन्स में फॉस्फोरिलेटेड α-सिन्यूक्लिन संचय के पीएफएफ-प्रेरित मॉडलिंग उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और सेलुलर फेनोटाइप विश्लेषण के अवसर के साथ, α-सिन्यूक्लिन समावेशन के अंतर्निहित तंत्र मध्यस्थता और उन्मूलन का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) एक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो सब्स्तानटिया निग्रा (एसएन) में मिडब्रेन डोपामाइन न्यूरॉन्स की मौत, बेसल गंगलिया में डोपामाइन टोन के बाद के नुकसान, और परिणामस्वरूप मोटर हानि1,,2की विशेषता है। पीडी रोगियों के दिमाग में एक प्रमुख हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषता न्यूरोनल सोमा में पाए जाने वाले इंट्रासेलुलर प्रोटीन/लिपिड समुच्चय हैं, जिन्हें लेवी बॉडीज (एलबी) कहा जाता है, या न्यूराइट्स में, लेवी न्यूराइट्स (एलएन), सामूहिक रूप से लेवी पैथोलॉजी 3 के रूप में जानाजाताहै । मस्तिष्क में लेवी विकृति न्यूरोनल कनेक्शन के माध्यम से रोगजनक कारकों के प्रसार जैसी पीडी को आगे बढ़ाने के साथ प्रगति करने के लिए प्रकट होती है। एसएन में डोपामाइन न्यूरॉन्स और न्यूरोडिजेनरेशन4से प्रभावित अन्य क्षेत्रों में कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में लेवी पैथोलॉजी पाई जाती है । हालांकि, रोग प्रगति के दौरान, प्रोटीन एकत्रीकरण का प्रसार और शुरुआत हमेशा न्यूरोनल मृत्यु से सहसंबंधित नहीं होती है और न्यूरोनल डेथ में लेवी पैथोलॉजी का सटीक योगदान अभी भी अस्पष्ट है5।

एलबी और एलएन में झिल्लीदार और प्रोटीनसियस कंपोनेंट्स3से मिलकर दिखाया गया था । पूर्व झिल्ली के टुकड़े, वेसिकुलर संरचनाएं (संभवतः लाइसोसोम और ऑटोफगोसोम) और माइटोकॉन्ड्रिया3हैं। उत्तरार्द्ध में कम से कम 300 विभिन्न प्रोटीन होते हैं6. स्पिलेंटिनी एट अल7 द्वारा एक बानगी अध्ययन से पता चला है कि लेवी पैथोलॉजी का प्रमुख प्रोटीन घटक α-सिन्यूक्लिन है। न्यूरॉन्स में अत्यधिक व्यक्त किया गया है, और झिल्ली संलयन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज से जुड़ा हुआ है, लेवी पैथोलॉजी में α-सिन्यूक्लिन ज्यादातर गलत मुड़ा हुआ, एमिलॉयड फिब्रिल रूप में मौजूद है, जिनमें से अधिकांश सेर129 (pS129-αsyn)4,,8में फॉस्फोरिलेटेड है।

महत्वपूर्ण बात यह भी है कि यह भी प्रदर्शित किया गया था कि इसके prion की तरह गुणों के कारण, गलत मुड़ा हुआ α-सिन्यूक्लिन लेवी पैथोलॉजीगठन 4में एक कारक भूमिका हो सकती है । गलत मुड़ा हुआ α-सिन्यूक्लिन के प्रियोन जैसे गुणों को रोगियों से मिडब्रेन अर्क के साथ दिखाया गया था और संस्कृति में न्यूरॉन्स में और वीवो9,,10में α-सिन्यूक्लिन प्रीफेड फिब्रिल्स (पीएफएफ) तैयार करने के लिए एक्सोजेनसली रूप से तैयार किया गया था। पीएफएफ डोपामाइन न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी की प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत मॉडल पेश करता है। जब पीपीएफ को सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स पर लागू किया जाता है या पशु मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है, तो वे न्यूराइट्स और सेल सोमा11 में α-सिन्यूक्लिन युक्त समावेशन के गठन का कारण बनते हैं जो लेवी पैथोलॉजी में देखी गई कई विशेषताओं को पुनः प्राप्त करते हैं। मनाया समावेशन ट्राइटन एक्स में डिटर्जेंट-अघुलनशील होते हैं, सर्वव्यापी, एमिलॉयड विशिष्ट डाई थिओफ्लेविन एस से सना हुआ होता है, और इसमें सेर12911,,12में α-सिन्यूक्लिन हाइपरफॉस्फोस्फोरिलेटेड होते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि ये समावेश α-सिन्यूक्लिन नॉकआउट जानवरों11में नहीं बनते हैं, जो अंतर्जात α-सिन्यूक्लिन पर उनके गठन की निर्भरता का संकेत देते हैं।

फिर भी, पीडी रोगियों में पाए जाने वाले पीएफएफ-प्रेरित समावेशन और लेवी पैथोलॉजी की सीधे तुलना करना मुश्किल है क्योंकि मानव एलबीएस और एलएन अत्यधिक विषम3हैं। लेवी पैथोलॉजी की देखी गई विषमता गठन के विभिन्न चरणों, विभिन्न शारीरिक स्थान, या एकत्रीकरण प्रक्रिया शुरू करने वाले गलत मुड़ा हुआ α-सिन्यूक्लिन के अनुरूपता में अंतर के कारण हो सकती है। यही कारक पीएफएफ-प्रेरित pS129-αsyn सकारात्मक समावेशन को प्रभावित कर सकते हैं। दरअसल, हाल ही में यह प्रदर्शित किया गया था कि प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों में PFF-प्रेरित pS129-αsyn सकारात्मक समावेशन विकृति के बहुत शुरुआती चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो लंबे समय तक इनक्यूबेशन अवधि12,,13के बाद एलबी जैसी संरचनाओं के लिए परिपक्व हो सकते हैं।

पीएफएफ के साथ गलत α-सिन्यूक्लिन का जल्दी फैलने और संचय करना दवा विकास के लिए मूल्यवान है, क्योंकि लेवी पैथोलॉजी स्प्रेड को प्रारंभिक चरण के रोग मार्कर में से एक माना जाता है। इसलिए, एकत्रीकरण-निवारक उपचार बहुत शुरुआती चरणों में पीडी की प्रगति को रोकने या धीमा करने के लिए वादा किया जा सकता है। α-सिन्यूक्लिन संचय को धीमा या रोकने के उद्देश्य से कई नैदानिक परीक्षण चल रहे हैं14। बाद के चरण के रोगियों के लिए, डोपामाइन न्यूरोनल जनकों का प्रत्यारोपण एक बेहतर उपचार विकल्प15हो सकता है । हालांकि, लेवी पैथोलॉजी पीडी रोगी दिमाग16, 17,17के पोस्टमार्टम विश्लेषण के दौरान प्रत्यारोपित भ्रूण न्यूरॉन्स में प्रलेखित किया गया था, यह भी α-yynuclein संचय के खिलाफ सुरक्षा की आवश्यकता का संकेत है ।

इन विट्रो में, α-सिन्यूक्लिन पीएफएफ को कृंतक प्राथमिक हिप्पोकैम्पस या कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में अमर कोशिका रेखाओं में या अधिक सामान्यतः एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। इनमें से कोई भी डोपामाइन न्यूरॉन्स10को फिर से काटने के करीब नहीं हैं । इन न्यूरॉन्स को बनाने के लिए विट्रो18में कुछ संख्या में न्यूरॉन्स की सघन चढ़ाना होता है । सीमित सामग्री (जैसे, प्राथमिक डोपामाइन न्यूरॉन्स) के साथ उच्च चढ़ाना घनत्व प्राप्त करने के लिए, माइक्रो द्वीप संस्कृति विधि आमतौर पर उपयोग किया जाता है। माइक्रो आइलैंड कल्टिंग में, कोशिकाओं को शुरू में मध्यम की एक छोटी बूंद (आमतौर पर कुछ माइक्रोलीटर) में चढ़ाया जाता है जो एक बड़े कुएं18के बीच में सतह तनाव से एक साथ रखा जाता है। न्यूरॉन्स संलग्न करने के बाद, पूरा कुआं माध्यम से भर जाता है जबकि कोशिकाएं छोटे चढ़ाना क्षेत्र में उच्च घनत्व पर सीमित रहती हैं। उच्च चढ़ाना घनत्व प्राप्त करने के अलावा, सूक्ष्म द्वीप भी कुओं के किनारों के पास चढ़ाना रोकते हैं, जहां सेल घनत्व और अस्तित्व में भिन्नता अक्सर होती है । सूक्ष्म द्वीपों का उपयोग अक्सर अपेक्षाकृत बड़े कुओं या व्यंजनों में किया जाता है; हालांकि, 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में सूक्ष्म द्वीपों में मिडब्रेन न्यूरोनल संस्कृतियों की स्थापना मध्यम-से-उच्च-थ्रूपुट शक्ति के साथ सदाशयी डोपामाइन न्यूरॉन्स में लेवी पैथोलॉजी का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है। इन न्यूरॉन्स के साथ विट्रो प्रयोगों ने हमें ग्लियल सेल लाइन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (जीडीएनएफ) की खोज करने की अनुमति दी, जो विट्रो में परिपक्व डोपामाइन न्यूरॉन्स के अस्तित्व को बढ़ावा देता है और वीवो19,20,,,21,,22 में और डोपामाइन न्यूरॉन्स23में α-सिन्यूक्लिन समुच्चय के गठन को भी रोकता है। मानव रोगी प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न डोपामाइन न्यूरॉन्स उनके मानव मूल और विट्रो में लंबे समय तक जीवित रहने के समय के कारण एक अधिक सटीक मॉडल का गठन । हालांकि, मानव न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी का प्रेरण कई महीनों के बाद मनाया जाता है, माउस भ्रूणीय न्यूरॉन्स में एक सप्ताह की तुलना में, और/या कई तनावों के साथ (उदाहरण के लिए, α-सिन्यूक्लिन ओवरएक्सप्रेशन और पीएफएफ का संयोजन)24,,25। इसके अलावा, प्राथमिक भ्रूणीय न्यूरॉन्स की तुलना में मानव डोपामाइन न्यूरॉन्स का रखरखाव अधिक महंगा और श्रमसाध्य होता है, अनिवार्य रूप से उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों में उनके उपयोग को सीमित करता है।

इसके अलावा, प्राथमिक डोपामाइन न्यूरोनल संस्कृतियों को आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, CRISPR/Cas9 के साथ) और/या औषधीय एजेंटों के साथ इलाज23। वे आणविक मार्ग विच्छेदन और दवा पुस्तकालय स्क्रीनिंग जैसे अनुप्रयोगों के लिए एक तेज और प्रजनन योग्य मंच का गठन करते हैं। यद्यपि इन संस्कृतियों से सीमित सामग्री प्राप्त की जा सकती है, फिर भी छोटे आकार के जीनोमिक्स/प्रोटेओमिक्स विश्लेषण करना संभव है । 96 अच्छी तरह से प्रारूप में प्राथमिक न्यूरॉन्स को बाहर करना इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए बेहतर है, जिसके बाद उच्च सामग्री फेनोटाइप विश्लेषण किया जाता है। 96 अच्छी प्लेटों की स्वचालित इमेजिंग से प्राप्त मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस छवियों को मात्रात्मक परिणामों में परिवर्तित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, प्रति अच्छी तरह से एलबी युक्त न्यूरॉन्स की संख्या)। इस तरह के विश्लेषण मुफ्त सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है, जैसे सेलप्रोफिलर26,,27। कुल मिलाकर, 96 अच्छी प्लेटों में चढ़ाया गया प्राथमिक भ्रूण मिडब्रेन संस्कृतियां उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइप स्क्रीनिंग के अवसर के साथ डोपामाइन न्यूरॉन्स और α-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और कुशल मंच प्रदान करती हैं।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों फिनिश राष्ट्रीय पशु प्रयोगों के बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया और वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय कानून के अनुसार किया गया ।

1. तैयारी

  1. डीएमईएम/एफ 12 के साथ पूरा 0.46% डी-ग्लूकोज, 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% N2, 0.2% प्राइमोसिन के साथ डोपामाइन न्यूरॉन मीडियम (डीपीएम) तैयार करें। सामग्री मिलाने के बाद डीपीएम को छान लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर डीपीएम स्टोर करें और प्रत्येक अलीकोट को केवल एक बार गर्म करें।
    नोट: डीपीएम में जीडीएनएफ नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह डोपामाइन न्यूरॉन्स23में α-सिन्यूक्लिन संचय को कम करेगा ।
  2. सिलिकॉन ग्लास पिपेट तैयार करें जो बेहद हाइड्रोफोबिक हैं, जिससे भ्रूणीय न्यूरॉन्स की प्रारंभिक हैंडलिंग के दौरान सतह और कोशिकाओं के नुकसान के लगाव को कम किया जा सके।
    1. 1 एल आसुत पानी में सिलिकॉनिंग तरल पदार्थ के 10 एमएल जोड़ें और 2 एल पोत में सरगर्मी करके मिलाएं। 15 मिनट के लिए सिलिकॉनिंग समाधान में डूबे ग्लास पिपेट छोड़ दें।
    2. डिस्टल्ड पानी के साथ पिपेट 3-5x कुल्ला। कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर पिपेट को सुखाएं या सुखाने की गति के लिए 100-120 डिग्री सेल्सियस गर्म बाँझ स्थान पर 1-2 घंटे के लिए।
    3. एक सील ऑटोक्लेव बैग में मानक ऑटोक्लेविंग द्वारा पिपेट को स्टरलाइज करें।
  3. न्यूरॉन्स के सीडिंग के लिए इस्तेमाल की जाने वाली 96 वेल प्लेट के मध्य कुओं में पीओ समाधान के 60 माइक्रोन जोड़कर पारदर्शी नीचे से 96 अच्छी प्लेटों के साथ पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीओ) लेपित 96 वेल प्लेटें तैयार करें, जिससे किनारे के प्रभाव से बचने के लिए प्लेट के किनारों पर कुओं की कम से कम एक पंक्ति/कॉलम छोड़ दिया जाए। कोटेड प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस या 4 घंटे पर आरटी में रखें।
  4. कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले, एस्पिरेट पीओ पूरी तरह से और कोशिकाओं को तीन बार 1x PBS के 100 माइक्रोन के साथ धोएं। कुओं से 1x पीबीएस को एस्पिरेट करें और प्लेट के ढक्कन को पूरी तरह सुखाने के लिए खुला रखें।
    नोट: उपयोग किए गए पीओ को इकट्ठा करना और पुन: उपयोग के लिए इसे फ़िल्टर करना संभव है। यह एक ही पीओ समाधान के लिए दो बार दोहराया जा सकता है।
  5. पहले से लेपित कुओं में डीपीएम के 50 माइक्रोन जोड़ें। एक 100 माइक्रोन प्लास्टिक टिप के साथ कुओं से डीपीएम को एस्पिरेट करें और साथ ही प्रत्येक कुएं की परिधि पर कोटिंग को हटाने के लिए परिपत्र आंदोलनों के साथ कुएं के नीचे खरोंच करें। एक पीओ-कोटेड द्वीप कुएं के बीच में रहेगा।
  6. एक लैमिनार हुड के तहत, माइक्रो द्वीप बनाने के लिए प्रत्येक लेपित द्वीप के बीच में डीपीएम के 10 माइक्रोल जोड़ें।
    नोट: डीपीएम से ढके माइक्रो द्वीपों वाली प्लेट को कोशिकाओं के अलगाव के दौरान 1-2 घंटे के लिए लेमिनार फ्लो हुड के नीचे रखा जा सकता है।

2. E13.5 माउस भ्रूण से वेंट्रल मिडब्रेन फर्श का अलगाव

नोट: मिडब्रेन फ्लोर विच्छेदन चरणों के लिए चित्रा 1 का उल्लेख करें।

  1. विच्छेदन से पहले, दुलबेको के बफर के साथ 10 सेमी पेट्री डिश भरें और इसे बर्फ पर रखें।
  2. संस्था के दिशा-निर्देशों के अनुसार एक E13.5 गर्भवती महिला माउस को इच्छामृत्यु दें । माउस को अपनी पीठ पर फ्लैट रखें और पूर्वकाल शरीर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। गर्भ के ऊपर त्वचा को संदंश के साथ उठाएं और गर्भाशय को बेनकाब करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ एक चीरा बनाएं।
  3. ध्यान से गर्भाशय निकालें और बर्फ पर पहले से तैयार पेट्री डिश में रखें।
  4. आरटी में लैमिनार हुड के नीचे सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, ध्यान से गर्भाशय से भ्रूण को हटा दें। सभी अपरा अवशेषों को संदंश के साथ भ्रूण से निकालें और उन्हें दुल्बेको के बफर से भरे एक नए 10 सेमी पेट्री डिश में रखें।
  5. विच्छेदन संदंश या सुइयों का उपयोग करके, चित्र 1 एमें काले तीरों के साथ चिह्नित स्थानों से सिर के हिंदक्वार्टर को काट लें। कट पीस को बाकी भ्रूण(चित्रा 1B)से दूर ले जाएं ।
  6. कटौती टुकड़े के पीछे पर्यवेक्षक(चित्रा 1C)की ओर रखें और धीरे से इसे कौडल से कपाल(चित्रा 1D)के लिए खुला काट दिया । कपाल खोलने के नीचे 0.5 मिमी से, चित्रा 1E में दिखाए गए2मिमी2 -3 मिमी 2 क्षेत्र को काटें।
  7. एक खाली 1.5एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वेंट्रल मिडब्रेन फ्लोर (चित्रा 1F देखें) को इकट्ठा करें। बर्फ पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें जब तक कि इसमें सभी मिडब्रेन फर्श एकत्र न हो जाएं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सभी भ्रूण दिमाग के विच्छेदन के बाद मिडब्रेन फर्श को 1 एमएल माइक्रोपिपेट के साथ एकत्र किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: E13.5 माउस भ्रूण से मिडब्रेन मंजिल का विच्छेदन। (क)सिर के हिंदक्वार्टर में कटिंग स्थानों पर काले तीर और सफेद धराशायी रेखाओं के निशान होते हैं । (ख)बाकी भ्रूण से टुकड़ा निकाल लिया गया। हटाए गए टुकड़े की परिक्रमा की जाती है। (ग)टुकड़ा ९० ° प्रेक्षक की ओर पीछे का सामना करने के लिए बदल गया था । (घ)टुकड़ा काले तीर से खोला गया था, कौडल से कपाल (सफेद धराशायी रेखा के साथ चिह्नित) । (ई)खोलने के नीचे 0.5 मिमी -1 मिमी से, 2 मिमी2-4मिमी 2 क्षेत्र को काटा गया था (काली रेखाओं के साथ चिह्नित)। (च)वेंट्रल मिडब्रेन फर्श को अलग-थलग कर दिया गया था (काले धराशायी वर्ग के साथ चिह्नित)। स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. ९६ अच्छी तरह से थाली प्रारूप में E13.5 माउस भ्रूण से प्राथमिक भ्रूण मिडब्रेन संस्कृतियों की स्थापना

  1. एक ही 1.5 एमएल ट्यूब में सभी भ्रूणों से मिडब्रेन फर्श के संग्रह के बाद, अवशिष्ट Dulbecco के बफर को हटा दें और सीए2 +,एमजी2 +-मुक्त हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 500 माइक्रोन के साथ ऊतक के टुकड़ों को तीन बार धोएं।
  2. एचबीएसएस निकालें और ट्यूब में 0.5% ट्राइपसिन के 500 माइक्रोन जोड़ें। इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के गर्म 1.5 एमएल, एफबीएस में DNase I के 30 माइक्रोन जोड़ें, और मिश्रण करें। इसके अलावा, एक सिलिकॉन ग्लास पिपेट की नोक को आग से पॉलिश करें। सुनिश्चित करें कि छेद में कोई तेज किनारे नहीं है और 1 एमएल माइक्रोपिपेट टिप के समान आकार के आसपास है।
    नोट: एक विकल्प के रूप में, एक कम आसंजन 1 एमएल माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग ट्रिट्यूशन के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सिलिकॉन ग्लास पिपेट सबसे अच्छा परिणाम देने लगते हैं।
  4. जैसे ही चरण 3.2 में इनक्यूबेशन समाप्त होता है, आंशिक रूप से पचा ऊतक के लिए FBS/DNase मिश्रण के ५०० μL जोड़ें । एफबीएस/ट्राइप्सिन मिक्स में टिश्यू को ट्रिट करने के लिए ग्लास पिपेट का इस्तेमाल करें । जब तक ऊतक छोटे, बमुश्किल दिखाई देने वाले कणों में अलग न होते तब तक ट्राइटुरेट करें। ट्रिट्यूशन के दौरान बुलबुले से बचें।
  5. बचे हुए कणों को गुरुत्वाकर्षण द्वारा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के तल पर वर्षा करने दें। नीचे की ओर तेज़ को पाइपिंग किए बिना, सुपरनैट को एक खाली 15 एमएल शंकु पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में इकट्ठा करें।
  6. तनु FBS/DNase मैं कदम ३.३ (98:2) से एचबीबीएस के १,००० μL के साथ FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) प्राप्त करने के लिए । ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में बचे हुए कणों में नए मिश्रण के 1,000 माइक्रोन जोड़ें। फिर से ट्रिटेट करें और चरण 3.5 दोहराएं।
  7. सभी FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) का उपयोग करने के लिए पिछले कदम को एक बार और दोहराएं ।
  8. एक बार जब सभी सुपरनेट्रट 15 एमएल ट्यूब (चरण 3.5, 3.7 और 3.8 से) के अंदर एकत्र हो जाते हैं, तो 100 x ग्रामपर सुपरनैंट (~ 3 एमएल) को स्पिन करने के लिए टेबलटॉप सेंट्रलाइज का उपयोग करें, 5 मिनट के लिए। नीचे पैलेट कोशिकाओं को छूने के बिना सुपरनैंट निकालें।
  9. ट्यूब में डीपीएम के 2 एमएल जोड़कर सेल पेलेट को धोएं और इसे 5 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें। 100 x g पर 5 मिनट के लिए सुपरनेट निकालें और पैलेट कोशिकाओं में मलबे को कम करने के लिए वॉशिंग 2x दोहराएं।
    नोट: हमेशा सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के लिए ताजा, गरम डीपीएम का उपयोग करें। धुलाई के कदमों के लिए डीपीएम को फ्रेश नहीं होना है, बल्कि इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म किया जाना चाहिए।
  10. कोशिकाओं को ताजा, गर्म डीपीएम के साथ पतला करें और उन्हें माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमजोर पड़ने के लिए डीपीएम की मात्रा ऊतक विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले भ्रूणों की संख्या पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, दस भ्रूण से प्राप्त कोशिकाओं को पतला करने के लिए डीपीएम के 150 माइक्रोन का उपयोग करें।
  11. डीपीएम में कोशिकाओं के 10 माइक्रोल को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। उन्हें 0.4% ट्राइपैन ब्लू दाग के 10 माइक्रोल के साथ मिलाएं। हेमोसिटोमीटर या ऑटोमेटेड सेल काउंटर का उपयोग करके लाइव (यानी, ट्राइपैन ब्लू निगेटिव) कोशिकाओं को गिनें।
    नोट: प्रति अच्छी तरह चढ़ाना के लिए 30,000 कोशिकाओं का उपयोग करें ~ 1,000 डोपामाइन न्यूरॉन्स प्रति अच्छी तरह प्राप्त करने के लिए। यदि कोशिका घनत्व प्रति 6 माइक्रोन ~ ~ 30,000 कोशिकाओं से अधिक है, तो चढ़ाना से पहले डीपीएम के साथ कोशिकाओं को और पतला करें ताकि सीडिंग की मात्रा 6 माइक्रोन से कम न हो।
  12. कुओं के नीचे को छूने के बिना, चरण 1.6 पर बनाए गए सूक्ष्म द्वीपों से डीपीएम को हटा दें।
  13. प्रत्येक कुएं पर प्रजनन योग्य कोशिका घनत्व प्राप्त करने के लिए, अच्छी तरह से चढ़ाना से पहले कोमल पिपटिंग द्वारा कोशिकाओं को मिलाएं। 1-10 माइक्रोपिपेट के साथ, प्रत्येक पूर्व माइक्रो द्वीप के स्थान पर, कुएं के बीच में कोशिकाओं के 6 माइक्रोल जोड़ें।
  14. न्यूरोनल संस्कृतियों वाले कुओं से वाष्पीकरण को कम करने के लिए प्लेट के किनारों पर खाली कुओं को 150 माइक्रोन पानी या 1x पीबीएस के साथ भरें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 फॉर1 घंटे पर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  15. 1 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें, कोशिकाओं के साथ प्रत्येक कुएं में डीपीएम के 100 माइक्रोन जोड़ें और इसे वापस इनक्यूबेटर में रखें।
  16. चढ़ाना के दो दिन बाद (दिन में विट्रो 2, या DIV2), 25 माइक्रोन निकालें और 150 माइक्रोन करने के लिए अंतिम मीडिया वॉल्यूम लाने के लिए ताजा डीपीएम के 75 माइक्रोन जोड़ें और जितना संभव हो वाष्पीकरण से बचें।
  17. ताजा डीपीएम के साथ माध्यम का आधा एक्सचेंज करें (यानी, 75 माइक्रोन निकालें और DIV5 में 75 माइक्रोल ताजा डीपीएम जोड़ें। DIV5 के बाद कोई भी मीडिया परिवर्तन न करें।

4. प्रीफॉर्मेड फाइब्रिल्स के साथ सीडिंग करके प्राथमिक भ्रूण डोपामाइन न्यूरॉन्स में α-सिन्यूक्लिन का प्रेरण

पीएफएफ प्राप्त करने और उनके सत्यापन के लिए प्रोटोकॉल का सावधानीपूर्वक वर्णन किया गया था और हाल के कई प्रकाशनों11,28 , 29,,30में चर्चा की गई थी ।,29 PFFs के साथ किसी भी काम के बाद, लेमिनार हुड या किसी भी उपकरण है कि 1% एसडीएस के साथ PFFs से संपर्क किया हो सकता है साफ है, तो ७०% इथेनॉल31के साथ ।

  1. प्रयोग से पहले, 1x पीबीएस के साथ पीएफएफ को 100 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें। 10 चक्रों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान ठंडा करने के साथ उच्च शक्ति पर एक स्नान ध्वनिक के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में पतला PFFs Sonicate, 30 s ON/30 s बंद ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि फाइब्रिल्स को ~ 50 एनएम लंबे टुकड़े उत्पन्न करने के लिए ठीक से सोनिकेट किया जाए। सोनिकेटेड पीएफएफ के आकार को सीधे पैटरसन एट अल30द्वारा वर्णित पीएफएफ के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों से मापा जा सकता है। एक उच्च शक्ति स्नान सोनिकेटर में ऊपर वर्णित के रूप में सोनीशन प्राप्त किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक टिप सोनिकेटर का उपयोग30किया जा सकता है। कई ठंड/विगलन चक्रों से बचने के लिए सोनिकेटेड पीएफएफ को छोटे एलिकोट्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. DIV8 पर, 2.5 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से मध्यम के 150 माइक्रोन में पीएफएफ के 100 माइक्रोन/एमएल का 3.75 माइक्रोन जोड़ें। नियंत्रण समूह के लिए 1x पीबीएस की एक ही राशि का उपयोग करें।
  3. 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स स्टोर करें। ऐसा करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    नोट: पीएफए विषाक्त है; तैयारी के दौरान एक मुखौटा और दस्ताने पहनें, हमेशा एक लैमिनार हुड के नीचे काम करें, और संस्था के निर्देशों के अनुसार सभी ठोस और तरल पीएफए कचरे का निपटान करें।
    1. 1 एल पोत में 1x पीबीएस के गर्म 500 एमएल। पोत में एक हलचल बार रखो और एक हीटिंग समारोह के साथ एक चुंबकीय उभारकर पर पोत डाल दिया। समाधान को गर्म रखते हुए उबलने से रोकने के लिए तापमान को 40-60 डिग्री सेल्सियस के बीच समायोजित करें।
    2. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक मापने कंटेनर में हुड के नीचे पीएफए पाउडर के 20 ग्राम उपाय। ध्यान से, 1x पीबीएस से भरे पोत में पीएफए पाउडर जोड़ें। समाधान सरगर्मी शुरू करते हैं।
    3. समाधान में 5 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड के 200 माइक्रोन जोड़ें और ~ 15 मिनट के लिए सरगर्मी जारी रखें, जब तक कि पीएफए पूरी तरह से घुल न जाए।
    4. समाधान समरूप दिखाई देने के बाद, पीएच को ~ 7 में संतुलित करने के लिए 5 मीटर हाइड्रोजन क्लोराइड के 168 माइक्रोन जोड़ें। डिस्पोजेबल रंग-निश्चित पीएच संकेतक स्ट्रिप्स के साथ पीएच की जांच करें।
    5. हीटर से बर्तन निकालें और इसे आरटी में ठंडा करने की अनुमति दें। -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए समाधान और एलिकोट को फ़िल्टर करें। उपयोग से पहले आरटी पर एलिकोट्स को पिघलाएं और बाद में फिर से फ्रीज न करें।
  4. DIV15 पर, सभी मीडिया को पाइपिंग करके कुओं से हटा दें। कोशिकाओं को ठीक करने और आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 4% पीएफए के 50 माइक्रोन जोड़ें। इनक्यूबेशन के बाद कुओं से पीएफए को हटा दें और कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस के 100 माइक्रोन जोड़ें। 1x पीबीएस निकालें और 2x अधिक धोएं।
  5. सुखाने से बचने के लिए प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस के 100 माइक्रोन छोड़ दें। इम्यूनोकेमिस्ट्री किए जाने तक प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्टेनिंग और 96 अच्छी तरह से प्लेटों में प्राथमिक भ्रूण डोपामाइन न्यूरॉन्स की स्वचालित इमेजिंग

  1. 1x पीबीएस निकालें और पीबीएस (पीबीएसटी) में 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के 100 माइक्रोल जोड़कर और 15 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेटिंग करके कोशिकाओं को पार करें।
  2. पीबीएसएल को हटाएं और पीबीएसएल में प्रति अच्छी तरह से 5% सामान्य हॉर्स सीरम (एनएचएस) के 50 माइक्रोन जोड़ें। अविशिष्ट एंटीजन गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए, 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  3. पीबीएसटी में 5% एनएचएस में टीएच और पीएस129-αsyn (1:2,000) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। प्रत्येक कुएं में पतला एंटीबॉडी का 50 माइक्रोन जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. एंटीबॉडी निकालें और कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1x PBS के 100 माइक्रोल जोड़ें। 1x पीबीएस निकालें और 2x धोने दोहराएं।
  5. फ्लोरोसेंट अणुओं की ब्लीडिंग को रोकने के लिए, न्यूनतम प्रकाश परिस्थितियों में काम करना शुरू करें। पीबीएसटी में माध्यमिक फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी (1:400) को पतला करें। प्रत्येक अच्छी तरह से पतला एंटीबॉडी के 50 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट।
  6. एंटीबॉडी समाधान निकालें और कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1x PBS के 100 माइक्रोन जोड़ें। 1x पीबीएस निकालें और 2x धोने दोहराएं।
  7. 1x PBS निकालें, 200 एनजी के 50 μL जोड़ें/
  8. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के 100 माइक्रोल के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं। पिछले धोने के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से 1x PBS के 100 माइक्रोन रखें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली को कवर और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  9. छवि प्राथमिक भ्रूण डोपामाइन न्यूरॉन्स एक उच्च सामग्री प्लेट स्कैनर के साथ एक 96 अच्छी तरह से देखने की थाली में (सामग्री की मेजदेखें) एक 10x उद्देश्य के साथ लगे।
  10. 96 वेल प्लेट के विनिर्देशों के आधार पर सेटिंग्स को समायोजित करें, जैसे प्लेट प्रकार, निर्माता, आकार, कुओं के बीच की दूरी, साथ ही प्रकार और मध्यम की मात्रा।
  11. एक माइक्रो द्वीप में सभी कोशिकाओं को कवर करने के लिए अच्छी तरह से इमेजिंग क्षेत्र का चयन करें। ऑटोफोकस को समायोजित करने के लिए अच्छी तरह से एक उदाहरण चुनें। DAPI पर प्रारंभिक ध्यान केंद्रित आधार।
  12. नियंत्रण कुओं में धुंधला की तीव्रता के आधार पर, प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए अधिग्रहण के समय को कैलिब्रेट करें। मापदंडों को समायोजित करें ताकि पीएफएफ-उपचारित नियंत्रण कुओं में एक स्पष्ट रूप से डोपामाइन कोशिकाओं को अलग कर सकता है जो सेल सोमा में PS129-αsyn समुच्चय को शरण देता है जो PS129-αsyn सकारात्मक और pS129-αsyn नकारात्मक कोशिकाओं के स्पष्ट मात्राकरण के लिए अनुमति देता है।
    नोट: जिन कुओं में पीएफएफ नहीं होता है, उनमें PS129-αsyn के लिए कोई धुंधला नहीं होना चाहिए; इसलिए, इन कुओं का उपयोग PS129-αsyn तीव्रता को समायोजित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है।
  13. छवि एक 10x उद्देश्य के साथ सभी चैनलों के लिए एक साथ सभी चैनलों के लिए एक साथ सभी चयनित कुओं बिल्कुल एक ही मापदंडों के साथ धुंधला ।
  14. वैकल्पिक रूप से, इस बात की पुष्टि करने के लिए कि PS129-αsyn-सकारात्मक समावेशन की संख्या में परिवर्तन pS12ylation या pS129-αsyn के dephosphorylation के अवरोध के बजाय प्रोटीन संचय में कमी को प्रतिबिंबित करने के लिए filamentous α-yynuclein के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ कुओं के एक सबसेट में लेबल-सिन्यूक्लिन समावेशन ।
  15. दोहराएं कदम 5.3 α-सिन्यूक्लिन फिलामेंट एंटीबॉडी (1:2,000) के साथ pS129-αsyn एंटीबॉडी प्रतिस्थापन। छवि दाग एकत्रित α-सिन्यूक्लिन के रूप में कदम 5.13 में.

6. उच्च सामग्री छवि विश्लेषण

नोट: यह कदम ओपन एक्सेस सॉफ्टवेयर सेलप्रोफिलर संस्करण 3.15 और सेलप्रोफिलर विश्लेषक संस्करण 2.2.1 के साथ किया जाता है। 27,32. हालांकि, कुछ अनुभव के साथ, अनुरूप छवि विश्लेषण पाइपलाइनों को एक अलग संस्करण या इसी तरह के सॉफ्टवेयर में स्थापित किया जा सकता है। कृपया एक विस्तृत विवरण के लिए सॉफ्टवेयर पृष्ठ का उल्लेख करें (सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. सेलप्रोफिलर और सेलप्रोफिलर एनालिस्ट सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें।
  2. ओपन सेलप्रोफिलर। फाइल चुनें। आयात। फाइल से पाइपलाइन और प्रदान की गई उदाहरण पाइपलाइन लोड, TH_LB_V1.cpipe फ़ाइल (अनुपूरक फाइलेंदेखें)।
    नोट: उदाहरण पाइपलाइनों को अधिग्रहीत छवियों और छवि अधिग्रहण मंच के गुणों के आधार पर विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता होगी। Example_Imagesसॉफ्टवेयर के प्रारंभिक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. उन्हें इमेज मॉड्यूल में खींचकर विश्लेषण किए जाने वाले छवियोंको लोड करें। लोडेड फ़ोल्डर से केवल छवि फ़ाइलों का चयन करने के लिए फ़िल्टर विकल्पों का उपयोग करें।
    1. छवि फ़ाइल नाम से अच्छी तरह से निकालने, देखने के क्षेत्र और चैनल जानकारी के लिए मेटाडेटा मॉड्यूल का उपयोग करें। आवर्धक ग्लास प्रतीक पर क्लिक करें और फ़ाइल नामों से प्लेट, वेल, इमेजिंग साइट और चैनल जानकारी निकालने के लिए नियमित अभिव्यक्ति दर्ज करें।
      नोट: नियमित अभिव्यक्ति प्लेट माइक्रोस्कोप के फ़ाइल नामकरण सम्मेलन पर निर्भर करेगी। आवर्धक ग्लास के बगल में प्रश्न चिह्न पर क्लिक करने से वाक्य विन्यास का विवरण मिलेगा।
    2. नाम और टाइप मॉड्यूल के तहत, DAPI, TH, और PS129-αsyn धुंधला (डिफ़ॉल्टचैनल 1, 2,और 3)के लिए सही चैनल संख्या का चयन करें । समूह मॉड्यूल में, "नहीं"का चयन करें।
  4. सेल सोमा के TH धुंधला का उपयोग कर डोपामाइन न्यूरॉन्स खंड के लिए पहचानप्रिमोमायऑब्जेक्ट्स मॉड्यूल का उपयोग करें।
    नोट: विशिष्ट मानों के आधार पर प्रारंभिक अनुकूलन की आवश्यकता होगी कि प्लेटें कैसे दाग और चित्रित की जाती हैं। यदि बाद की प्लेटों को इसी तरह संसाधित किया जाता है, तो किसी भी या न्यूनतम समायोजन की आवश्यकता नहीं होगी।
  5. टीएच और डीएपीआई चैनलों से फ्लोरेसेंस तीव्रता की जानकारी प्राप्त करने के लिए उपायसूक्यापन मॉड्यूल का उपयोग करें।
  6. सेगमेंट डोपामाइन न्यूरॉन्स के आकार और आकार सुविधाओं को मापने के लिए MeasureObjectSizeShape मॉड्यूल का उपयोग करें।
  7. खंडित डोपामाइन न्यूरॉन्स से टीएच चैनल से बनावट सुविधा जानकारी को मापने के लिए उपायटेक्स्चर मॉड्यूल का उपयोग करें।
  8. डेटाबेस में माप को बचाने के लिए एक्सपोर्टटोडाटाबेस मॉड्यूल का उपयोग करें।
    1. नाम डेटाबेस फाइल प्रयोग नामकरण स्कीमा (जैसे, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db) के अनुसार। डेटाबेस फ़ाइल के लिए आउटपुट फ़ोल्डर चुनें। डेटाबेस फ़ाइल कई गीगाबाइट बड़ी हो सकती है और छवि फ़ाइलों के मूल फ़ोल्डर में अधिमानतः सहेजी जानी चाहिए।
  9. ओपन सेलप्रोफिलर विश्लेषक और चरण 6.8 पर बनाई गई V1_THCells.गुण फ़ाइल का चयन करें। खुले उपकरण । क्लासिफायर।
  10. खंडित कोशिकाओं को दो श्रेणियों में सॉर्ट करें: सकारात्मक (यानी, सही ढंग से खंडित डोपामाइन न्यूरॉन सेल निकाय) और नकारात्मक (यानी, विभाजन और धुंधला कलाकृतियों) चित्रा 2A और 2Bदेखें।
    1. 50 यादृच्छिक कोशिकाओं के लिए लाया कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें और लाओ क्लिक करें (यह चरण 6.4 में खंडित कोशिकाओं की छवियों को लोड करता है)। खिड़की के नीचे इसी बिन में उन्हें खींचकर प्रत्येक बिन में कम से कम 30 कोशिकाओं को सॉर्ट करें। आवश्यक के रूप में और अधिक कोशिकाओं को लाने के लिए।
    2. ड्रॉप-डाउन मेनू में 50 अधिकतम नियमों और क्लिक ट्रेनके साथ फास्ट जेंटल बूस्टिंग का उपयोग करें।
    3. सेट"लाने" ५० सकारात्मक कोशिकाओं के लिए और प्रेस लाने के लिए classifier(चित्रा 2A)के अनुसार TH सकारात्मक कोशिकाओं को मिलता है । प्रशिक्षित वर्गीकरण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए प्राप्त परिणाम का उपयोग करें।
    4. कदम दोहराएं 6.10.1-6.10.3, जब तक परिणाम संतोषजनक हैं तब तक क्लासिफायर को प्रशिक्षित करने के लिए नए उदाहरण कोशिकाओं को जोड़ना।
    5. उन्नत चुनें। नियमों को संपादित करें... और एक नई खिड़की में सभी पाठ (Ctrl +a)का चयन करें और इसे(Ctrl-c) नोटपैड (Ctrl-v)के लिए कॉपी करें । TH_rules.txt फ़ाइलके रूप में सहेजें ।
      नोट: न्यूरोनल संस्कृति के घनत्व और धुंधला और इमेजिंग की गुणवत्ता के आधार पर, यह कदम आवश्यक नहीं हो सकता है, क्योंकि उच्च सटीकता के साथ केवल TH सकारात्मक कोशिकाओं को खंडित करने के लिए चरण 6.4 में पैरामीटर सेट करना संभव हो सकता है। यदि यह स्थिति है, तो एक संपूर्ण TH_LB_V1.cpipe रन आवश्यक नहीं है, और पहचानप्रिमयऑब्जेक्ट मॉड्यूल के सही मापदंडों को सीधे TH_LB_V2.cpipeमें इसी मॉड्यूल में रखा जाना चाहिए।

Figure 2
चित्रा 2: डोपामाइन न्यूरॉन्स और pS129-αsyn सकारात्मक डोपामाइन न्यूरॉन्स के साथ CellProfiler विश्लेषक सॉफ्टवेयर DAPI, TH, और pS129-αsyn इम्यूनोफ्लोरेसेंस पर आधारित है । (क)सकारात्मक बिन में टीएच कोशिकाओं का चयन दापी स्टेनिंग (नीला) के आधार पर किया गया था, जो छवि में चयनित पहले सेल में एक छोटे वर्ग के साथ चिह्नित किया गया था और सोमा में आसपास के टीएच धुंधला (ग्रे) । (ख)नॉन-सेल कलाकृतियों को निगेटिव बिन में रखा गया था । (C)PS129-αsyn सकारात्मक TH न्यूरॉन्स PS129-αsyn धुंधला (लाल) के बड़े समावेश के आधार पर चुना गया था छवि पर चयनित पहले सेल में एक छोटे वर्ग के साथ चिह्नित, नाभिक के आसपास या सेल सोमा पर । (घ)इस तरह के pS129-αsyn समावेशन के बिना TH कोशिकाओं को नकारात्मक बिन में रखा गया था । स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. सेलप्रोफिलर खोलें और फ़ाइल का चयन करें। आयात। फाइल और लोड से पाइपलाइन TH_LB_V2.cpipe फाइल। 6.3-6.7 चरणों को दोहराएं। पाइपलाइन का यह हिस्सा TH_LB_V1 सीपीआईपीई के समान होना चाहिए।
  2. आगे के विश्लेषण के लिए केवल सच्चे TH सकारात्मक कोशिकाओं को पारित करने के लिए फ़िल्टरऑब्जेक्ट मॉड्यूल का उपयोग करें।
    1. नियमोंके लिए फ़िल्टरिंग मोड का चयन करें । नियम या क्लासिफायर फ़ाइल नाम में चरण 6.10.5 में बनाई गई TH_rules.txt फ़ाइल का चयन करें।
    2. यदि टीएच पॉजिटिव कोशिकाओं को नीचे बाईं खिड़की तक हल किया गया तो कक्षा संख्या क्षेत्र को 1 सेट करें।
  3. PS129-αsyn चैनल से फ्लोरेसेंस तीव्रता की जानकारी प्राप्त करने के लिए MeasureObjectIntensity मॉड्यूल का उपयोग करें।
  4. फ़िल्टर की गई कोशिकाओं से टीएच चैनल से बनावट सुविधा जानकारी को मापने के लिए उपायटेक्स्चर मॉड्यूल का उपयोग करें।
  5. फ़िल्टर की गई कोशिकाओं के आकार और आकार की विशेषताओं को मापने के लिए MeasureObjectShape मॉड्यूल का उपयोग करें।
  6. डेटाबेस में माप को बचाने के लिए एक्सपोर्टटोडाटाबेस मॉड्यूल का उपयोग करें।
    1. नाम डेटाबेस अपने प्रयोग के साथ तदनुसार फ़ाइल स्कीमा नामकरण (जैसे, ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db) । डेटाबेस फ़ाइल के लिए आउटपुट फ़ोल्डर चुनें।
  7. ओपन सेलप्रोफिलर विश्लेषक और V2_THpos गुण फ़ाइल का चयन करें।
    1. खंडित कोशिकाओं को दो श्रेणियों में सॉर्ट करें - pS129-αsyn सकारात्मक और pS129-αsyn नकारात्मक कोशिकाएं(चित्रा 2C,D)।
    2. 50 यादृच्छिक कोशिकाओं के लिए दिलवाया कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें और लाओ क्लिक करें (यह चरण 4 में खंडित कोशिकाओं की छवियों को लोड करता है)। खिड़की के नीचे इसी बिन में उन्हें खींचकर प्रत्येक बिन में कम से कम 30 कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
    3. ड्रॉप-डाउन मेनू में, 50 अधिकतम नियमों या रैंडम वन क्लासिफायर के साथ फास्ट जेंटल बूस्टिंग का उपयोग करें। क्लिक करें ट्रेन।
    4. सेट"लाने" ५० सकारात्मक कोशिकाओं के लिए और प्रेस लाने के लिए pS129-αsyn सकारात्मक कोशिकाओं को वर्गीकृत(चित्रा 2C)के अनुसार मिलता है । सेट"लाने" ५० नकारात्मक कोशिकाओं के लिए और प्रेस लाने के लिए pS129-αsyn नकारात्मक कोशिकाओं को वर्गीकृत(चित्रा 2D)के अनुसार मिलता है । प्रशिक्षित वर्गीकरण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें।
    5. कदम दोहराएं 6.17.2-6.17.4, परिणाम संतोषजनक होने तक क्लासिफायर को प्रशिक्षित करने के लिए नए उदाहरण कोशिकाओं को जोड़ना।
  8. स्कोर सभी पर क्लिक करें प्रत्येक अच्छी तरह से PS129-αsyn सकारात्मक और नकारात्मक डोपामाइन न्यूरॉन्स की संख्या सारांश परिणाम प्राप्त करने के लिए ।

Representative Results

चढ़ाना (DIV1-DIV3) के कुछ दिनों बाद, सुसंस्कृत कोशिकाओं के स्वास्थ्य और समरूप प्रसार का आकलन करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी किया गया था, और व्यक्तिगत कुओं(चित्रा 3)में इन स्थितियों की एकरूपता । सुसंस्कृत मिडब्रेन कोशिकाओं को चढ़ाना(चित्रा 3 ए,बी)से पहले बनाए गए माइक्रो द्वीप के भीतर समरूप रूप से फैलाया गया था। प्राथमिक न्यूरॉन्स लेपित जमीन पर समरूप और स्थापित न्यूरोनल अनुमानों(चित्रा 3B)पर बस गया था । कोशिकाओं का एक छोटा सा झुरमुट (150 माइक्रोन से छोटा व्यास) कुएं पर देखा गया और एक उदाहरण(चित्र 3 सी)के रूप में दिखाया गया।

Figure 3
चित्र 3: चढ़ाना (जैसे, DIV3) के कुछ दिनों बाद, प्राथमिक मिडब्रेन संस्कृतियों की स्थिति उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ देखी गई। (क)सुसंस्कृत कोशिकाएं पीओ-लेपित माइक्रो द्वीप के भीतर कुएं के बीच में फैली हुई हैं, जिसमें लगभग 1 मिमी अच्छी परिधि (काले तीरों के साथ दिखाया गया) पीओ खरोंच द्वारा बनाया गया 4.4 मिमी (सफेद तीर के साथ दिखाया गया) के अनुमानित त्रिज्या के साथ। (ख)सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स समरूप रूप से क्षेत्र के भीतर फैल गया और न्यूरोनल अनुमानों (लाल तीर के साथ चिह्नित) मनाया गया । (ग)150 माइक्रोन से छोटे व्यास वाले सेल झुरमुट को नीले तीर के निशान से चिह्नित किया जाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्राथमिक माउस मिडब्रेन संस्कृतियों को एंटी-टीएच और एंटी-पीएस 129-αsyn एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडांड किया गया था और विट्रो में 15 दिनों के बाद एक स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ इमेज किया गया था। लेपित माइक्रो द्वीपों ने कुओं के बीच में कोशिकाओं के लगाव के लिए प्रतिबंधित क्षेत्र प्रदानकिया (चित्रा 4A,बी)। टीएच मार्कर के साथ डोपामाइन न्यूरॉन्स इम्यूनोलेबल एक मोनोलेयर में माइक्रो द्वीप के चारों ओर फैले हुए थे, जो एक दूसरे से अलग थे, बिना किसी झुरमुट(चित्रा 4A'और 4B')।

Figure 4
चित्रा 4: DIV15 में, 800-1,000 डोपामाइन कोशिकाओं को प्रत्येक सूक्ष्म द्वीप से, पीएफएफ उपचार के साथ या बिना निर्धारित किया गया था। भ्रूण मिडब्रेन संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियां विरोधी TH और विरोधी pS129-αsyn एंटीबॉडी के साथ अनमोन्यूमैंड। (A, A', A'' पीएफएफ उपचार के बिना नियंत्रण कोशिकाएं। (B, B', B'') PFF-pS129-αsyn समावेशन के साथ कोशिकाओं का इलाज किया। (C)वाहन (नियंत्रण), पीएफएफ, या पीएफएफ के साथ ५० एनजी/एमएल जीडीएनएफ के साथ इलाज किए गए कुओं में टीएच-पॉजिटिव सेल नंबरों का परिमाणीकरण । (घ)50 एनजी/एमएल जीडीएनएफ के साथ वाहन (नियंत्रण), पीएफएफ या पीएफएफ के साथ इलाज की जाने वाली टीएच-पॉजिटिव कोशिकाओं में PS129-αsyn का मात्राकरण। सांख्यिकीय महत्व यादृच्छिक ब्लॉक डिजाइन ANOVA के साथ गणना की गई थी। **p & 0.01, n = 4 व्यक्तिगत प्लेटें (जैविक प्रतिकृति), प्रत्येक उपचार समूह प्रति 3-6 कुओं (तकनीकी दोहराता है) के साथ। स्केल बार = ए, बीके लिए 300 माइक्रोन ; 50 माइक्रोन फॉर ए', बी'; 25 μm के लिए एक ''' ' बी '। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जबकि PFF उपचार के बिना संस्कृतियों में कोई pS129-αsyn संकेत(चित्रा 4A'’ और 4A')नहीं था, α-ynuclein PFFs के साथ इलाज संस्कृतियों PS129-αsyn सकारात्मक समावेशन विकसित(चित्रा 4B' और 4B ''। 7 दिनों के लिए इन विट्रो पीएफएफ उपचार में अन्य प्रयोगात्मक समूहों(चित्रा 4C)की तुलना में टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं आई। पीएफएफ-इलाज संस्कृतियों में PS129-αsyn सकारात्मक TH-सकारात्मक डोपामाइन न्यूरॉन्स की ~ 40% की आबादी थी। सकारात्मक नियंत्रण के साथ उपचार, जीडीएनएफ ने PS129-αsyn सकारात्मक समावेशन के साथ टीएच-पॉजिटिव डोपामाइन न्यूरॉन्स का प्रतिशत कम करदिया (चित्रा 4D, पूरक फ़ाइलोंमें कच्चे डेटा और उदाहरण छवियों को भी देखें)।

अनुपूरक फाइलें: सेलप्रोफिलर और सेलएनालिस्ट सॉफ्टवेयर पैकेज, उदाहरण छवियों और चित्र 4 ई, एफके लिए कच्चे डेटा के साथ उच्च सामग्री छवि विश्लेषण के लिए उदाहरण पाइपलाइनें। (1-9)Example_Images । इन छवियों को इमेजजे या सेलप्रोफिलर के साथ खोलें। (10)Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs । (11)TH_LB_V1.cpipe (कदम 6.2-6.8),(12)TH_LB_V2.cpipe (कदम 6.11-6.18) कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

लेवी पैथोलॉजी का प्रसार, जिसमें से PS129-αsyn एक प्रमुख घटक है, पीडी की एक हिस्टोपैथोलॉजिकल बानगी है। एकत्रित pS129-αsyn के संचय को रोकना या धीमा करना डोपामाइन न्यूरॉन्स के पतन और अल्फा-सिन्यूक्लियिनोपैथी की प्रगति को धीमा कर सकता है। हालांकि, कैसे pS129-αsyn एकत्रीकरण डोपामाइन न्यूरॉन्स के निधन के लिए योगदान देता है की एक यंत्रवादी समझ अभी भी स्थापित किया जाना है । रोग के विभिन्न चरणों में रोगियों से मस्तिष्क के नमूनों पर मानव पोस्टमॉर्टम अध्ययन के साक्ष्य के साथ - साथ प्रत्यारोपित भ्रूण न्यूरॉन्स में pS129-αsyn सकारात्मक समावेश के अवलोकन से कोशिकाओं के बीच लेवी विकृति के प्रसार का दृढ़ता से पता चलता है16,17,,33।, नतीजतन, PS129-αsyn के prion की तरह फैल हाल ही में α-सिन्यूक्लिन PFFs9,,10का उपयोग करके पुनर्निर्धारित किया गया था । विशेष रूप से डोपामाइन न्यूरॉन्स में PS129-αsyn प्रसार और संचय के एक मजबूत, लागत प्रभावी, और अपेक्षाकृत उच्च या मध्यम-थ्रूपुट मॉडल की स्थापना, इस प्रक्रिया को संशोधित करने वाले उपन्यास उपचार और यौगिकों की खोज को काफी गति दे सकती है।

क्योंकि डोपामाइन न्यूरॉन्स का नुकसान पीडी में मोटर लक्षणों का मुख्य कारण है और इन कोशिकाओं में कई अद्वितीय गुण हैं2,,34,,35,डोपामाइन न्यूरॉन्स में PS129-αsyn के प्रेशन जैसे प्रसार की मॉडलिंग ट्रांसलेशनल परिप्रेक्ष्य से मॉडल का सबसे प्रासंगिक प्रकार है। 4 अच्छी प्लेटों और अर्धस्वचालित मात्राकरण पर भ्रूणीय मिडब्रेन न्यूरॉन्स की सूक्ष्म द्वीप संस्कृतियों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल पहले18वर्णित किए गए हैं । यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 96 अच्छी तरह से प्लेटों के अनुकूल बनाया गया था और सूक्ष्म द्वीपों की कम श्रमसाध्य तैयारी प्रदान करता है, जिससे एक कार्यदिवस के दौरान एक अनुभवी शोधकर्ता द्वारा 60 कुओं वाले चार प्लेटों को तैयार करने की अनुमति मिलती है। 96 अच्छी प्लेटों में डोपामाइन न्यूरॉन्स को बनाने से कम मात्रा में दवाओं के परीक्षण की अनुमति होती है और लेंटीवायरस वैक्टर के साथ उच्च ट्रांसडक्शन दरों को सक्षम बनाता है। अधिक जटिल प्रयोग करने के लिए विभिन्न उपचारों को जोड़ना भी संभव है।

किसी भी उपचार (PFFs सहित) लागू करने से पहले, खेती की गुणवत्ता उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की जानी चाहिए । यदि माइक्रोस्कोपी प्रणाली हीटिंग के साथ एक CO2 कक्ष का उपयोग नहीं करता है, कोशिकाओं को कुछ मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेटर के बाहर नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि प्राथमिक माउस डोपामाइन न्यूरॉन्स नाजुक और आसानी से जोर दिया जाता है । इसी कारण से, यह सलाह दी जाती है कि पहली इमेजिंग इनक्यूबेशन के 24 घंटे (DIV1-DIV3 के बीच) के बाद की जानी चाहिए। कोशिकाओं को वर्तमान कोशिका निकायों के साथ जीवित होना चाहिए और सूक्ष्म द्वीप के अंदर समरूप रूप से फैल जाना चाहिए । प्राथमिक न्यूरॉन्स पीओ-लेपित जमीन पर बस गए होंगे और न्यूरोनल अनुमानों को स्थापित करना शुरू कर दिया होगा। कोशिकाओं के छोटे झुरमुट (यानी, व्यास 150-200 माइक्रोन से छोटा) का निरीक्षण करना संभव है जो यदि ट्रियूशन प्रक्रिया ठीक से नहीं की जाती है या प्लेटिंग घनत्व अनुशंसित से अधिक होता है तो बनाया जा सकता है। इन छोटे झुरमुट प्रयोग को प्रभावित नहीं होगा, जब तक कि वे अच्छी तरह से कुछ प्रति अधिक कर रहे है और/ झुरमुट कोशिकाओं को छवि विश्लेषण के दौरान इम्यूनोहिस्टोकेमिकल मार्कर और व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान करना बहुत मुश्किल हो जाता है। सावधानीपूर्वक कोटिंग, ट्रिटरिंग और प्लेटिंग घनत्व को नियंत्रित करके ऐसे झुरमुटों से बचना आवश्यक है। यदि कुछ कुओं पर इन शर्तों की एकरूपता नहीं देखी जा सकती है, तो प्रयोग में इन दोषपूर्ण कुओं को शामिल न करें । इस तरह के बहिष्कार किसी भी उपचार के निष्पादन से पहले किया जाना चाहिए ।

इसके अलावा, 96 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान सुविधाजनक मल्टीचैनल पिपेट उपयोग के लिए अनुमति देता है और स्वचालित प्लेट माइक्रोस्कोप के साथ प्रत्यक्ष दृश्य, आगे बढ़ते थ्रूपुट। उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफार्मों से डेटा के विश्लेषण के लिए स्वचालित छवि मात्राकरण का उपयोग अपरिहार्य है। प्रत्येक प्रयोग से प्राप्त हजारों छवियों को संसाधित करने की क्षमता के अलावा, यह सभी उपचार समूहों के निष्पक्ष, समान मात्राकरण सुनिश्चित करता है। छवि विश्लेषण के लिए प्रस्तावित कार्यप्रवाह डोपामाइन न्यूरॉन्स को खंडित करने के सरल सिद्धांतों पर आधारित है, पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग द्वारा सही ढंग से खंडित कोशिकाओं को फ़िल्टर करना, और बाद में फेनोटाइप (pS129-αsyn सकारात्मक और PS129-αsyn नकारात्मक) का मात्राकरण, फिर से पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग द्वारा। यद्यपि इस कार्य के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोणों की कल्पना की जा सकती है, हमने उच्च चढ़ाना घनत्व, डोपामाइन न्यूरॉन्स के विविध आकारों और दृढ़ता से दाग वाले न्यूराइट्स की उपस्थिति के कारण डोपामाइन संस्कृतियों के लिए मशीन लर्निंग के साथ विभाजन का संयोजन पाया है। प्रस्तावित छवि विश्लेषण एल्गोरिदम को सेलप्रोफिलर और सेलप्रोफिलर विश्लेषक, ओपन सोर्स, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उच्च सामग्री छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर26,,27में लागू किया गया था। एल्गोरिदम को अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ भी लागू किया जा सकता है, या तो ओपन सोर्स (जैसे, इमेजजे/फिजी, KNIME) या मालिकाना। हालांकि, हमारे अनुभव में ये अक्सर उपयोग में आसानी के लिए अनुकूलन क्षमताओं का बलिदान करते हैं, और इसलिए जटिल विश्लेषणों में अच्छा प्रदर्शन नहीं कर सकते हैं। हमने पाया है कि सेलप्रोफिलर और सेलप्रोफिलर विश्लेषक सॉफ्टवेयर पैकेज पर्याप्त संख्या में लागू एल्गोरिदम, वर्कफ़्लो डिजाइन करने में अत्यधिक लचीलापन, और साथ ही उच्च सामग्री इमेजिंग डेटा को संभालने और कुशलता से संसाधित करके विशेष रूप से विश्वसनीय परिणाम देते हैं।

वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेटिंग द्वारा विशेषता वाले अन्य सेलुलर फेनोटाइप के मात्राकरण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि अन्य न्यूरोनल आबादी के मार्कर (जैसे, डैट, जीएडी 67, 5-एचटी आदि) और प्रोटीन समुच्चय (जैसे, फॉस्पो-ताऊ, सर्वव्यापक) । कई फ्लोरोसेंट मार्कर को कई फेनोटाइप (उदाहरण के लिए, परिपक्वता के विभिन्न चरणों में समावेशन के साथ कोशिकाओं) को अलग करने के लिए भी जोड़ा जा सकता है। कई फेनोटाइप का स्वचालित वर्गीकरण भी वर्णित छवि विश्लेषण पाइपलाइनों में केवल एक चैनल जोड़कर लागू करना आसान होना चाहिए जिसमें अतिरिक्त मार्कर की इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवियों को मापन चरणों में जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को कई डिब्बे में छांटता है। हालांकि, एक ही समय में कई मार्कर के उपयोग के लिए इम्यूनोस्टेटिंग और इमेजिंग स्थितियों के अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग में बेहतर गुणवत्ता के लिए, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए स्पष्ट रूप से डिज़ाइन की गई विशेष काले दीवारों वाली 96 अच्छी प्लेटों के उपयोग की सिफारिश की जाती है। हालांकि, ये मानक सेल कल्चर प्लेटों की तुलना में काफी अधिक महंगे हो सकते हैं, जो हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं।

प्रयोगों के परिणाम के लिए उपयोग किए गए पीएफएफ का प्रकार और गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। PFFs दोनों परख की मजबूती और परिणामों की व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं । तैयारी की स्थिति पीएफएफ की सीडिंग दक्षता को प्रभावित कर सकती है और, वास्तव में, विभिन्न शारीरिक गुणों के साथ पीएफएफ "उपभेदों" को36बताया गया है। फिर भी , पीएफएफ की तैयारी और सत्यापन इस लेख के दायरे,से बाहर है और इसका वर्णन11, 28 ,29,,30के कई प्रकाशनों में किया गया है .29 तैयारी प्रोटोकॉल के अलावा, पीएफएफ (जैसे, माउस, मानव) में α-सिन्यूक्लिन की उत्पत्ति की प्रजातियों और जंगली प्रकार या उत्परिवर्तित प्रोटीन (जैसे, मानव A53T α-ynuclein) के उपयोग पर विशेष प्रयोगात्मक परिस्थितियों के आधार पर विचार किया जाना चाहिए। पीएफएफ द्वारा PS129-αsyn संचय का प्रेरण संस्कृति की आयु (यानी, विट्रो में दिन) पर निर्भर दिखाया गया था, जिसमें अधिक परिपक्व संस्कृतियों को अधिक स्पष्ट प्रेरण11दिखाया गया था। यह शायद अधिक परिपक्व संस्कृतियों में न्यूरोनल कनेक्शन की बढ़ी हुई संख्या के कारण है, और α-सिन्यूक्लिन प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई है। हमारे हाथों में, DIV8 में PFFs के साथ उपचार सबसे मजबूत परिणाम दिया, डोपामाइन न्यूरॉन सोमा में pS129-αsyn के स्पष्ट संचय के साथ, जबकि न्यूरोनल अस्तित्व समझौता नहीं है । वर्णित प्रोटोकॉल प्रारंभिक घटनाओं को संशोधित करने वाले उपचारों का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है जिससे अंतर्जात α-सिन्यूक्लिन का एकत्रीकरण होता है क्योंकि हम पीएफएफ के साथ टीका लगाने के 7 दिनों बाद अपेक्षाकृत शुरुआती समय बिंदु पर PS129-αsyn सकारात्मक समावेशन की मात्रा निर्धारित करते हैं। इस समय बिंदु पर, इंट्रासोमल समावेश कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण अंश में मौजूद होते हैं और आसानी से इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है जबकि कोई पीएफएफ-प्रेरित सेल मृत्यु नहीं देखी जाती है, परिणामों की व्याख्या को सरल बनाता है। महत्वपूर्ण बात, के रूप में आकृति विज्ञान और PFF की संरचना प्रेरित समावेशन समय12,,13के साथ बदल सकते हैं, वर्णित प्रोटोकॉल, सिद्धांत रूप में, निर्धारण और बाद के समय अंक पर इम्यूनोदाता द्वारा अधिक परिपक्व समावेशन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । हालांकि, 15 दिनों से अधिक समय तक संस्कृति में डोपामाइन न्यूरॉन्स रखने के लिए अत्यधिक देखभाल की आवश्यकता होती है, और PFF टीका से स्वतंत्र रूप से जीवित रहने में विफल रहने वाली कोशिकाओं के कारण अतिरिक्त भिन्नता पैदा हो सकती है। इसके अतिरिक्त, अधिक विस्तारित संस्कृतियों दवा उपचार कार्यक्रम जटिल । कई यौगिकों सीमित है या नहीं खराब कोशिका संस्कृति माध्यम में स्थिरता की विशेषता है, और एक दवा की भरपाई तुच्छ नहीं है क्योंकि मध्यम समझौते के पूर्ण विनिमय डोपामाइन संस्कृतियों के अस्तित्व ।

Ser129 में α-yynuclein के फॉस्फोरिलेशन लगातार पीएफएफ-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण के मॉडल आधारित है और थिओफ्लाविन एस, सर्वव्यापकता, या संरचना-विशिष्ट एंटीबॉडी11, 12,जैसे गलत और एकत्रीकरण के मार्कर के साथ कोलोकैलिज़ कियाजाताहै। हमारे हाथों में, PS129-αsyn के लिए इम्यूनोस्टेटिंग भी सबसे कम पृष्ठभूमि के साथ सबसे मजबूत संकेत देता है और विश्लेषण करने के लिए सबसे सीधा है, मजबूत परिणाम दे जब कई उपचार की जांच कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, PS129-αsyn एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोशेपिंग पीएफएस का पता नहीं लगाता है जो कोशिकाओं के बाहर रहते हैं, पृष्ठभूमि को काफी कम करते हैं। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि Ser129 फॉस्फोरिलेशन शायद α-सिन्यूक्लिन के गलत गुना से जुड़ी शुरुआती प्रक्रियाओं में से एक है और विशिष्ट परिस्थितियों में अलग-अलग विनियमित किया जा सकता है। इसलिए, PS129-αsyn पर सकारात्मक प्रभाव दिखाने वाले किसी भी निष्कर्ष की पुष्टि अन्य मार्कर द्वारा की जानी चाहिए।

सांख्यिकीय विश्लेषण तदनुसार प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुरूप होना चाहिए। कम से कम तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति (यानी, अलग प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों) में प्रयोग करना आवश्यक है। इन प्रतिकृति को विभिन्न प्लेटों पर चढ़ाया जाना चाहिए और स्वतंत्र रूप से इलाज किया जाना चाहिए। हम विभिन्न प्रायोगिक प्लेटों के लिए डेटा की पेयरिंग को ध्यान में रखने के लिए यादृच्छिक ब्लॉक डिजाइन एवोवा37 के साथ विभिन्न प्लेटों पर प्रतिकृति से प्राप्त डेटा का विश्लेषण करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रो केल्विन लुक को इम्यूनो दाग कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए α-सिन्यूक्लिन पीएफएफ, कोंजुंग झेंग को न्यूरोनल कोशिकाओं की स्थापना और खेती करने के लिए उनके उदार उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं, और हेलसिंकी विश्वविद्यालय के जैव प्रौद्योगिकी संस्थान में लाइट माइक्रोस्कोपी यूनिट। इस काम को बिजनेस फिनलैंड (फिनिश फंडिंग एजेंसी फॉर इनोवेशन), फिनलैंड #309489, #293392, #319195 अकादमी द्वारा 3i-उत्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; सिग्रिड जुसेलियस फाउंडेशन, और मेजर इंस्टीट्यूट ऑफ फार्माकोलॉजी, पीए, पोलैंड के सांविधिक धन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue stain Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 15250061
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188261
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 10236276001
5 M HCl N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
5 M NaOH N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
96-well ViewPlate (Black) PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA 6005182
99.5% Ethanol (EtOH) Altia Oyj, Rajamäki, Finland N/A
AquaSil Siliconizing Fluid Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA TS-42799
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
Bioruptor sonication device Diagenode, Liege, Belgium B01020001
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 14175-053
CellProfiler and CellAnalyst software packages N/A N/A free open-source software
Centrifuge 5702 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 5702000019
CO2 Incubator HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA N/A
Counting chamber BioRad Inc., Hercules, California, USA 1450015
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA 29254706
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) Roche, Basel, Switzerland 22098700
D-glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA G8769
DMEM/F12 Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 21331–020
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A21202
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A31573
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A11015
Dulbecco's buffer N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 10500056
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 11507582
ImageXpress Nano Automated Imaging System Molecular Devices, San Jose, California, USA N/A
L-glutamine Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 25030–032
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German MAB318
N2 supplement Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 17502–048
Normal Horse Serum Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States S-2000
paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 158127
paraformaldehyde powder, 95% Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 158127
pH-Fix, color-fixed indicator strips Macherey-Nagel, Düren, Germany 92110
Phospohate Buffer Saline (PBS) N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
poly-L-ornithine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4957
Primocin InvivoGen, San Diego, California, USA ant-pm-1, ant-pm-2
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament Abcam, Cambridge, United Kingdom ab209538
rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein Abcam, Cambridge, United Kingdom ab51253
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany 3810000
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) N/A N/A Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk
Research Stereomicroscope System Olympus Corporation, Tokyo, Japan SZX10
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German ab1542
TC 20 Automated Cell Counter BioRad Inc., Hercules, California, USA 1450102
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 11332481001
trypsin MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China 2199700

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