Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neuronale α-synucleinaccumulatie in primaire muis dopamine neuronen te bestuderen. Fosforyleerde α-synuclein aggregaten in neuronen worden geïnduceerd met voorgevormde α-synucleinfibrils. Geautomatiseerde beeldvorming van immunofluorescently gelabelde cellen en onbevooroordeelde beeldanalyse maken dit robuuste protocol geschikt voor medium-to-high doorvoerscreening van geneesmiddelen die α-synucleinaccumulatie remmen.
Abstract
Het doel van dit protocol is om een robuust en reproduceerbaar model van α-synuclein accumulatie in primaire dopamine neuronen vast te stellen. In combinatie met immunostaining en onbevooroordeelde geautomatiseerde beeldanalyse maakt dit model de analyse mogelijk van de effecten van geneesmiddelen en genetische manipulaties op α-synucleinaggregatie in neuronale culturen. Primaire midbrain culturen bieden een betrouwbare bron van bonafide embryonale dopamine neuronen. In dit protocol wordt het kenmerkende histopathologie van de ziekte van Parkinson, Lewy bodies (LB), nagebootst door de toevoeging van α-synuclein voorgevormde fibrils (PFF's) rechtstreeks aan neuronale kweekmedia. Accumulatie van endogene fosforylated α-synuclein in de soma van dopamineneuronen wordt gedetecteerd door immunostaining al op 7 dagen na de PFF-toevoeging. In vitro cel kweekomstandigheden zijn ook geschikt voor de toepassing en evaluatie van behandelingen die α-synuclein accumulatie voorkomen, zoals kleine moleculen en neurotrofische factoren, evenals lentivirusvectoren voor genetische manipulatie (bijvoorbeeld met CRISPR/Cas9). Het kweken van de neuronen in 96 goed platen verhoogt de robuustheid en kracht van de experimentele opstellingen. Aan het einde van het experiment worden de cellen gefixeerd met paraformaldehyde voor immunocytochemie en fluorescentiemicroscopiebeeldvorming. Multispectrale fluorescentiebeelden worden verkregen via geautomatiseerde microscopie van 96 putplaten. Deze gegevens zijn gekwantificeerd (bijvoorbeeld het tellen van het aantal fosfo-α-synuclein-bevattende dopamine neuronen per goed) met het gebruik van vrije software die een platform biedt voor onbevooroordeelde high-content fenotype analyse. PFF-geïnduceerde modellering van fosforyleerde α-synuclein accumulatie in primaire dopamine neuronen biedt een betrouwbaar hulpmiddel om de onderliggende mechanismen bemiddelen vorming en eliminatie van α-synuclein insluitsels te bestuderen, met de mogelijkheid voor high-throughput drug screening en cellulaire fenotype analyse.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door de dood van de midbrain dopamine neuronen in de substantia nigra (SN), daaropvolgende verlies van dopamine toon in basale ganglia, en de daaruit voortvloeiende motorische stoornissen1,2. Een belangrijke histopathologische functie in de hersenen van PD-patiënten zijn intracellulaire eiwit / lipide aggregaten gevonden in neuronale soma, genaamd Lewy lichamen (LB), of in neurites, Lewy neurites (LN), gezamenlijk bekend als Lewy pathologie3. Lewy pathologie in de hersenen lijkt vooruitgang te boeken met het bevorderen van PD die lijkt op de verspreiding van pathogene factoren via neuronale verbindingen. Overvloedige Lewy pathologie wordt gevonden in dopamine neuronen in de SN en cellen in andere gebieden die worden beïnvloed door neurodegeneratie4. Echter, tijdens de progressie van de ziekte, verspreiding en het begin van eiwit aggregatie niet altijd correleren met neuronale dood en de exacte bijdrage van Lewy pathologie aan neuronale dood is nog onduidelijk5.
LB en LN bleken te bestaan uit membranous en proteinaceous componenten3. De eerste zijn membraanfragmenten, vesiculaire structuren (mogelijk lysosomen en autophagosomen) en mitochondriën3. Deze laatste bestaat uit ten minste 300 verschillende eiwitten6. Een kenmerkende studie van Spillantini et al.7 toonde aan dat de belangrijkste eiwitcomponent van Lewy pathologie α-synuclein is. Zeer uitgedrukt in neuronen, en gekoppeld aan membraanfusie en neurotransmitter release, α-synuclein in Lewy pathologie is meestal aanwezig in verkeerd gevouwen, amyloïde fibril vorm, waarvan het grootste deel is fosforylated bij Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Belangrijk is dat ook werd aangetoond dat vanwege zijn prion-achtige eigenschappen verkeerd gevouwen α-synuclein een oorzakelijke rol kan spelen in lewy pathologievorming4. De prion-achtige eigenschappen van verkeerd gevouwen α-synuclein werden getoond met zowel midbrain extracten van patiënten als exogeen bereid α-synuclein voorgevormde fibrils (PFF's) om α-synuclein aggregaten in neuronen in cultuur en in vivo9,10te induceren . PFF's presenteren een betrouwbaar en robuust model om de progressie van α-synucleinpathologie in dopamineneuronen te bestuderen. Wanneer PFF's worden toegepast op gekweekte primaire neuronen of geïnjecteerd in de dierlijke hersenen, ze leiden tot de vorming van α-synuclein-bevattende insluitsels in neurites en cel soma11 die veel kenmerken van lewy pathologie recapituleren. Waargenomen insluitsels zijn wasmiddel-onoplosbaar in Triton X, alomtegenwoordig, gekleurd met de amyloïde specifieke kleurstof Thioflavin S, en bevatten α-synuclein hyperphosphorylated bij Ser12911,12. Belangrijk is dat deze insluitsels zich niet vormen in α-synuclein knock-out dieren11, wat wijst op de afhankelijkheid van hun vorming van endogene α-synuclein.
Niettemin is het moeilijk om pff-geïnduceerde insluitsels en Lewy-pathologie bij PD-patiënten direct te vergelijken, omdat menselijke LBs en LNs zeer heterogeen zijn3. Waargenomen heterogeniteit van Lewy-pathologie kan worden veroorzaakt door verschillende stadia van de vorming, verschillende anatomische locatie of verschillen in de conformatie van verkeerd gevouwen α-synuclein die het aggregatieproces initieert. Dezelfde factoren kunnen van invloed zijn op pff-geïnduceerde pS129-αsyn positieve insluitsels. Onlangs werd immers aangetoond dat pff-geïnduceerde pS129-αsyn positieve insluitsels in primaire neuronale culturen een zeer vroeg stadium van pathologie vertegenwoordigen die kunnen rijpen tot structuren die sterk lijken op LB na een langdurige incubatieperiode12,13.
Het modelleren van vroege verspreiding en accumulatie van verkeerd gevouwen α-synuclein met PFF's is waardevol voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat lewypathologieverspreiding wordt beschouwd als een van de vroege ziektemarkers. Daarom kunnen aggregatie-preventieve behandelingen veelbelovend zijn voor het stoppen of vertragen van de progressie van PD in een zeer vroeg stadium. Verschillende klinische studies gericht op het vertragen of stoppen van α-synuclein accumulatie zijn aan de gang14. Voor patiënten in een later stadium, transplantatie van dopamine neuronale voorouders kan een betere behandeling alternatief15. Lewy pathologie werd echter gedocumenteerd in getransplanteerde embryonale neuronen tijdens de postmortemanalyse van PD-patiënthersensenen16,17, wat ook aangeeft dat bescherming tegen α-synucleinaccumulatie nodig is.
In vitro, α-synuclein PFFs is bekend dat aggregatie induceren in vereeuwigde cellijnen, of vaker, in knaagdier primaire hippocampal of corticale neuronen. Geen van deze zijn dicht bij het samenvatten van dopamine neuronen10. Het kweken van deze neuronen vereist dichte beplating van bepaalde aantallen neuronen in vitro18. Om een hoge beplatingsdichtheid te bereiken met beperkt materiaal (bijvoorbeeld primaire dopamineneuronen), wordt de micro-eilandculende methode vaak gebruikt. In micro-eiland kweken, cellen zijn in eerste instantie verguld in een kleine druppel medium (meestal een paar microliters) bij elkaar gehouden door oppervlaktespanning in het midden van een grote put18. Nadat de neuronen hechten, wordt de hele put gevuld met het medium, terwijl de cellen beperkt blijven bij hoge dichtheid in het kleine beplatingsgebied. Naast het bereiken van een hoge beplatingsdichtheid, voorkomen micro-eilanden ook beplating in de buurt van de randen van putten, waar variaties in celdichtheid en overleving frequent voorkomen. Micro-eilanden worden vaak gebruikt in relatief grote putten of gerechten; echter, de oprichting van midbrain neuronale culturen in micro-eilanden in 96 goed plaat formaat maakt de studie van Lewy pathologie in bonafide dopamine neuronen met medium-tot-hoge doorvoer kracht. In vitro experimenten met deze neuronen konden we de gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) ontdekken, die de overleving van volwassen dopamineneuronen in vitro en in vivo19,20,21,22 bevordert en ook de vorming van α-synuclein aggregaten in dopamineneuronen23voorkomt. Menselijke patiënt-geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide dopamine neuronen vormen een nauwkeuriger model vanwege hun menselijke oorsprong en langere overlevingstijd in vitro. Echter, inductie van α-synuclein pathologie in menselijke neuronen wordt waargenomen na meerdere maanden, in vergelijking met een week in de muis embryonale neuronen, en / of met meerdere stressoren (bijvoorbeeld, combinatie van α-synuclein overexpressie en PFFs)24,25. Bovendien, onderhoud van menselijke dopamine neuronen is duurder en moeizame in vergelijking met primaire embryonale neuronen, in wezen het beperken van hun gebruik in toepassingen met hoge doorvoer.
Verder kunnen primaire dopamineneuronale culturen genetisch gemodificeerd zijn (bijvoorbeeld met CRISPR/Cas9) en/of behandeld worden met farmacologische middelen23. Ze vormen een snel en reproduceerbaar platform voor toepassingen zoals moleculaire paddissectie en drug bibliotheek screening. Hoewel beperkt materiaal uit deze culturen kan worden verkregen, is het nog steeds mogelijk om kleine genomics/proteomics analyses uit te voeren. Het kweken van primaire neuronen in 96 goed formaat is beter voor immunocytochemie en fluorescentie microscopie technieken, gevolgd door een hoog gehalte fenotype analyse. Multispectrale fluorescentiebeelden afgeleid van geautomatiseerde beeldvorming van 96 putplaten kunnen worden omgezet in kwantitatieve resultaten (bijvoorbeeld het aantal LB-bevattende neuronen per put). Dergelijke analyses kunnen worden gedaan met vrije software, zoals CellProfiler26,27. Over het algemeen bieden primaire embryonale midbrainculturen verguld in 96 goed platen een robuust en efficiënt platform om dopamineneuronen en α-synucleinaggregatie te bestuderen met de mogelijkheid voor screening met een hoge doorvoerfenotype.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Finse Nationale Raad voor Dierproeven en werden uitgevoerd volgens de Europese wetgeving inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt.
1. Voorbereiding
- Bereid dopamine neuron medium (DPM) met 0,46% D-glucose, 1% L-glutamine, 1% N2, 0,2% primocine, aangevuld met DMEM/F12. Filter de DPM na het mengen van de ingrediënten. Sla DPM op 4 °C en verwarm elke aliquot slechts één keer.
OPMERKING: DPM mag geen GDNF bevatten, omdat het α-synucleinaccumulatie in dopamineneuronen23zal verminderen. - Bereid siliconen glazen pipetten die zeer hydrofoob zijn, waardoor de gehechtheid aan het oppervlak en het verlies van cellen tijdens de eerste behandeling van embryonale neuronen tot een minimalisering worden geminimaliseerd.
- Voeg 10 mL siliconen vloeistof toe aan 1 L gedestilleerd water en meng door te roeren in een 2 L vat. Laat de glazen pipetten 15 minuten onderdompelen in de siliconenoplossing.
- Spoel de pipetten 3-5x af met gedestilleerd water. Droog de pipetten 's nachts op kamertemperatuur (RT) of voor 1-2 uur bij 100-120 °C verwarmde steriele ruimte om het drogen te versnellen.
- Steriliseer de pipetten door standaard autoclaving in een verzegelde autoclave zak.
- Bereid poly-L-ornithine (PO) gecoate 96 goed platen met transparante bodems door het toevoegen van 60 μL po-oplossing in de middelste putten van de 96 put plaat te worden gebruikt voor het zaaien van de neuronen, waardoor ten minste een rij / kolom van putten aan de randen van de plaat om randeffecten te voorkomen. Houd de gecoate plaat 's nachts op 4 °C of 4 uur bij RT.
- Voorafgaand aan het plating van de cellen, aspirate PO volledig en was de cellen driemaal met 100 μL van 1x PBS. Aspirate 1x PBS uit de putten en houd het deksel van de plaat open voor volledige droging.
LET OP: Het is mogelijk om gebruikte PO te verzamelen en te filteren voor hergebruik. Dit kan twee keer worden herhaald voor dezelfde PO-oplossing. - Voeg 50 μL DPM toe aan eerder gecoate putten. Aspirate DPM uit de putten met een 100 μL plastic tip en tegelijkertijd krassen op de onderkant van de put met cirkelvormige bewegingen om de coating te verwijderen aan de rand van elke put. Een PO-gecoat eiland blijft in het midden van de put.
- Voeg onder een laminaire kap 10 μL DPM toe aan het midden van elk gecoate eiland om micro-eilanden te creëren.
OPMERKING: Een plaat met met DPM bedekte micro-eilanden kan 1-2 uur onder de laminaire stroomkap worden bewaard tijdens de isolatie van cellen.
2. Isolatie van de ventrale midbrainvloer van E13.5 muisembryo's
OPMERKING: Raadpleeg figuur 1 voor middenherensectiestappen.
- Vul voorafgaand aan de dissectie een petrischaaltje van 10 cm met de buffer van Dulbecco en houd deze op ijs.
- Euthanaseer een E13.5 zwangere vrouwelijke muis volgens de richtlijnen van de instelling. Leg de muis plat op zijn rug en spuit het voorste lichaam met 70% ethanol. Til de huid boven de baarmoeder met tangen en maak een incisie met chirurgische schaar om de baarmoeder bloot te stellen.
- Verwijder de baarmoeder voorzichtig en leg deze in de eerder bereide petrischaal op ijs.
- Met behulp van chirurgische schaar onder de laminaire kap bij RT, verwijder voorzichtig de embryo's uit de baarmoeder. Verwijder alle placentaresten uit de embryo's met tangen en plaats ze in een nieuwe petrischaal van 10 cm gevuld met de buffer van Dulbecco.
- Met behulp van dissectie tangen of naalden, afgesneden het achterkwartier van het hoofd van de plaatsen gemarkeerd met zwarte pijlen in figuur 1A. Haal het gesneden stuk weg van de rest van het embryo(figuur 1B).
- Plaats het achterste van het snijstuk naar de waarnemer(figuur 1C)en snijd het voorzichtig open van staart tot schedel (figuur 1D). Van 0,5 mm onder de schedelopening, snijd een 2 mm2–3 mm2 regio, weergegeven in figuur 1E.
- Verzamel de ventrale midbrainvloer (zie figuur 1F)in een lege microcentrifugebuis van 1,5 mL. Houd de microcentrifugebuis op ijs totdat alle midbrainvloeren erin worden verzameld.
OPMERKING: Als alternatief kunnen de midbrainvloeren worden verzameld met een 1 mL micropipet na dissectie van alle embryohersenen.
Figuur 1: Dissectie van de middenhersenbodem van E13.5 muisembryo. (A) Snijlocaties aan de achtervoet van het hoofd zijn gemarkeerd met zwarte pijlen en witte stippellijnen. (B) Het stuk is uit de rest van het embryo verwijderd. Het verwijderde stuk wordt omcirkeld. (C) Het stuk werd 90° gedraaid om het achterste naar de waarnemer te kijken. (D) Het stuk werd geopend van de zwarte pijlen, van caudal tot cranial (gemarkeerd met witte stippellijn). (E) Van 0,5 mm–1 mm onder de opening werd het 2 mm2 –4mm2-gebied gesneden (gemarkeerd met zwarte lijnen). (F) De ventrale midbrain vloer was geïsoleerd (gemarkeerd met zwart gestippelde vierkant). Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
3. Vaststelling van primaire embryonale midbrainculturen van E13.5 muisembryo's in 96 putplaatformaat
- Na het verzamelen van midbrainvloeren van alle embryo's in dezelfde 1,5 mL buis, verwijder je de resterende Dulbecco's buffer en was je de weefselstukken driemaal met 500 μL Ca2+, Mg2+-free Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Verwijder HBSS en voeg 500 μL van 0,5% trypsine toe aan de buis. Broed het op 37 °C gedurende 30 minuten.
- Tijdens de incubatie, warm 1,5 mL foetale runder serum (FBS) bij 37 °C, voeg 30 μL DNase I aan de FBS, en meng. Ook, brand-polijsten de punt van een geconsliceerde glazen pipet. Zorg ervoor dat het gat geen scherpe randen heeft en ongeveer even groot is als een 1 mL micropipet tip.
OPMERKING: Als alternatief kan een lage hechting 1 mL micropipet tip worden gebruikt voor trituratie. Echter, siliconen glas pipetten lijken de beste resultaten te geven. - Zodra de incubatie in stap 3.2 eindigt, voegt u 500 μL van het FBS/DNase-mengsel toe aan het gedeeltelijk verteerde weefsel. Gebruik de glazen pipet om het weefsel in de FBS/trypsine mix te tritureren. Trituraat totdat weefsels zich distantiëren in kleine, nauwelijks zichtbare deeltjes. Vermijd bubbels tijdens trituratie.
- Laat de overgebleven deeltjes neerslaan aan de onderkant van de microcentrifuge buis door de zwaartekracht. Zonder het neerslag aan de onderkant te pipetten, verzamel je de supernatant in een lege 15 mL conische polypropyleenbuis.
- Verdun FBS/DNase I van stap 3.3 (98:2) met 1.000 μL HBSS om FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) te verkrijgen. Meng door pipetting op en neer. Voeg 1.000 μL van de nieuwe mix toe aan de overgebleven deeltjes in de microcentrifugebuis. Trituraat opnieuw en herhaal stap 3.5.
- Herhaal de vorige stap nogmaals om alle FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) op te gebruiken.
- Zodra alle supernatant is verzameld in de 15 mL buis (vanaf stap 3.5, 3.7, en 3.8), gebruik maken van een tafelblad centrifuge te draaien van de supernatant (~ 3 mL) op 100 x g, voor 5 min. Verwijder de supernatant zonder het aanraken van de pelleted cellen aan de onderkant.
- Was de celpellet door 2 mL DPM aan de buis toe te voegen en draai deze 5 min naar beneden op 100 x g. Verwijder de supernatant en herhaal de was 2x om het puin in de gepelde cellen te minimaliseren.
OPMERKING: Gebruik altijd verse, opgewarmde DPM voor de gekweekte neuronen. Voor de wasstappen hoeft DPM niet vers te zijn, maar moet het worden voorverwarmd tot 37 °C. - Verdun de cellen met verse, warme DPM en breng ze over naar een microcentrifugebuis. De hoeveelheid DPM voor verdunning is afhankelijk van het aantal embryo's dat wordt gebruikt voor weefseldissectie. Gebruik bijvoorbeeld 150 μL DPM om de cellen verkregen uit tien embryo's te verdunnen.
- Breng 10 μL cellen in DPM over op een microcentrifugebuis. Meng ze met 10 μL van 0,4% Trypan blauwe vlek. Tel live (d.w.z. Trypan blauwe negatieve) cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
OPMERKING: Gebruik 30.000 cellen voor beplating per put om ~ 1.000 dopamine neuronen per put te verkrijgen. Als de celdichtheid hoger is dan ~ 30.000 cellen per 6 μL, verdun de cellen verder met DPM voordat u beplating, zodat het zaaivolume niet minder dan 6 μL is. - Zonder de onderkant van de putten aan te raken, verwijdert u de DPM van de micro-eilanden die bij stap 1.6 zijn gemaakt.
- Om reproduceerbare celdichtheid bij elke put te verkrijgen, mengt u de cellen door zachte pipetting voorafgaand aan het beplating in de put. Voeg met een micropipet van 1-10 μL 6 μL cellen toe aan het midden van de put, op de locatie van elk voormalig micro-eiland.
- Vul de lege putten aan de randen van de plaat met 150 μL water of 1x PBS om verdamping uit de putten met neuronale culturen te minimaliseren. Incubeer de plaat in een couveuse bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.
- Na 1 uur haal je de plaat uit de couveuse, voeg je 100 μL DPM in elke put met cellen toe en plaats deze terug in de couveuse.
- Twee dagen na beplating (dag in vitro 2, of DIV2), verwijder 25 μL en voeg 75 μL verse DPM toe om het uiteindelijke mediavolume op 150 μL te brengen en verdamping zoveel mogelijk te voorkomen.
- Wissel de helft van het medium om met verse DPM (d.w.z. verwijder 75 μL en voeg 75 μL verse DPM toe) bij DIV5. Voer geen mediawijzigingen uit na DIV5.
4. Inductie van α-synuclein aggregaten in primaire embryonale dopamineneuronen door te zaaien met voorgevormde fibrils
Protocollen voor het verkrijgen en valideren van PFF's waren zorgvuldig beschreven en besproken in verschillende recente publicaties11,28,29,30. Na alle werkzaamheden met PFF's, reinig de laminaire kap of apparatuur die zou kunnen hebben contact opgenomen met de PFFs met 1% SDS, dan met 70% ethanol31.
- Verdun de PFF's voorafgaand aan het experiment met 1x PBS tot een uiteindelijke concentratie van 100 μg/mL. Soniceer de verdunde PFF's in microcentrifugebuizen met een badsononicator bij hoog vermogen met waterbadkoeling bij 4 °C gedurende 10 cycli, 30 s ON/30 s OFF.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de fibrils goed worden gesoniceerd om fragmenten ~ 50 nm lang te genereren. De grootte van gesoniceerde PFF's kan rechtstreeks worden gemeten op de transmissie elektronenmicroscoop beelden van PFF's gekleurd zoals beschreven door Patterson et al.30. Sonicatie kan worden bereikt zoals hierboven beschreven in een high power bad sonicator. Als alternatief kan een tip sonicator worden gebruikt30. Sonicated PFF's kunnen bij -80 °C in kleine aliquots worden opgeslagen om meerdere bevriezings-/ontdooicycli te voorkomen. - Voeg op DIV8 3,75 μL van 100 μg/mL PFFs per put toe aan de 150 μL van medium in de put tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 μg/mL. Gebruik dezelfde hoeveelheid 1x PBS voor de controlegroep.
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x PBS en bewaar de aliquots op -20 °C. Volg hiervoor de onderstaande stappen.
LET OP: PFA is giftig; draag een masker en handschoenen tijdens de voorbereiding, werk altijd onder een laminaire kap, en gooi alle vaste en vloeibare PFA afval volgens de aanwijzingen van de instelling.- Warm 500 mL van 1x PBS in een 1 L schip. Doe een roerstaaf in het vat en leg het vat op een magnetische roerder met een verwarmingsfunctie. Pas de temperatuur tussen 40-60 °C aan om te voorkomen dat de oplossing wordt gekookt terwijl de oplossing warm blijft.
- Meet 20 g PFA-poeder onder de motorkap in een wegwerp plastic meetcontainer. Voeg voorzichtig het PFA-poeder toe aan het vat gevuld met 1x PBS. Begin met roeren van de oplossing.
- Voeg 200 μL natriumhydroxide van 5 M toe aan de oplossing en blijf roeren gedurende ~15 min, totdat de PFA volledig oplost.
- Nadat de oplossing homogeen lijkt, voeg 168 μL van 5 M waterstofchloride toe om de pH in evenwicht te brengen tot ~7. Controleer de pH met wegwerpkleurvaste pH-indicatorstrips.
- Haal het vat uit de kachel en laat het afkoelen tot RT. Filter de oplossing en aliquot voor opslag bij -20 °C. Ontdooi de aliquots bij RT voor het gebruik en niet achteraf opnieuw invriezen.
- Verwijder op DIV15 alle media uit de putten door pipetting. Voeg 50 μL van 4% PFA toe aan elke put om de cellen te fixeren en 20 minuten in rt in te broeden. Na incubatie verwijder de PFA uit de putten en voeg 100 μL van 1x PBS toe aan elke put om de cellen te wassen. Verwijder 1x PBS en was 2x meer.
- Laat 100 μL 1x PBS in elke put om te voorkomen dat drogen. Bewaar de plaat op 4 °C totdat immunochemie wordt uitgevoerd.
5. Immunofluorescente kleuring en geautomatiseerde beeldvorming van primaire embryonale dopamineneuronen in 96 goedplaten
- Verwijder 1x PBS en permeabiliseer de cellen door 100 μL van 0,2% Triton X-100 in PBS (PBST) per put toe te voegen en 15 minuten in RT uit te broeden.
- Verwijder PBST en voeg 50 μL van 5% normaal paardenserum (NHS) per put toe aan de PBST. Om de niet-specifieke antigeenactiviteit te blokkeren, moet u 1 uur bij RT uitbroeden.
- Verdun de primaire antilichamen tegen TH en pS129-αsyn (1:2.000) in 5% NHS in PBST. Voeg 50 μL verdunde antilichamen toe aan elke put en broeder 's nachts bij 4 °C.
- Verwijder antilichamen en voeg 100 μL 1x PBS toe aan elke put om de cellen te wassen. Verwijder 1x PBS en herhaal het wassen 2x.
- Om te voorkomen dat het bleken van fluorescerende moleculen, beginnen te werken onder minimale lichtomstandigheden. Verdun de secundaire fluorescerende antilichamen (1:400) in PBST. Voeg 50 μL verdunde antilichamen toe aan elke put en broed gedurende 1 uur bij RT.
- Verwijder de antilichaamoplossing en voeg 100 μL 1x PBS toe aan elke put om de cellen te wassen. Verwijder 1x PBS en herhaal het wassen 2x.
- Verwijder 1x PBS, voeg 50 μL van 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per put toe om de kernen van de gekweekte cellen en incubate bij RT gedurende 10 minuten te bevlekken.
- Was cellen 3x met 100 μL van 1x PBS gedurende 5 minuten per stuk. Bewaar na de laatste wasbeurt 100 μL 1x PBS in elke put. Bedek de plaat met aluminiumfolie en bewaar deze op 4 °C tot de beeldvorming.
- Beeld primaire embryonale dopamine neuronen in een 96 goed uitzicht plaat met een hoog-gehalte plaat scanner (zie Tabel van Materialen) uitgerust met een 10x doelstelling.
- Pas de instellingen aan op basis van de specificaties van de 96-putplaat, zoals plaattype, fabrikant, grootte, afstand tussen putten, evenals type en hoeveelheid medium.
- Selecteer het beeldgebied van de put om alle cellen in een micro-eiland te bedekken. Kies een voorbeeld goed om de autofocus aan te passen. Baseer de eerste focus op DAPI.
- Kalibreer de aanschaftijd voor elk fluorescerend kanaal, op basis van de intensiteit van de kleuring in controleputten. Pas de parameters zo aan dat men in PFF-behandelde controleputten duidelijk dopaminecellen kan onderscheiden die pS129-αsyn aggregaten in cel soma herbergen, waardoor eenduidige kwantificering van pS129-αsyn-positieve en pS129-αsyn negatieve cellen mogelijk is.
OPMERKING: Putten die geen PFF's bevatten, mogen geen vlekken hebben voor pS129-αsyn; daarom kunnen deze putten worden gebruikt als negatieve controle voor het aanpassen van pS129-αsyn intensiteit. - Beeld alle geselecteerde putten met een 10x doelstelling tegelijk voor alle kanalen met immunofluorescentie kleuring met precies dezelfde parameters.
- Optioneel kunnen label α-synucleininclusies in een deel van de putten met antilichamen die specifiek zijn voor filamenteuze α-synuclein, bevestigen dat veranderingen in het aantal pS129-αsyn-positieve insluitsels de vermindering van eiwitaccumulatie weerspiegelen in plaats van remming van fosforylatie of defosfolyfolatie van pS129-αsyn.
- Herhaal stap 5.3 die pS129-αsyn-antilichaam vervangt door α-synuclein filamentantilichaam (1:2.000). Afbeelding van de gekleurde geaggregeerde α-synuclein als in stap 5.13.
6. Beeldanalyse met hoge inhoud
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met open access software CellProfiler versie 3.15 en CellProfiler Analyst versie 2.2.1. 27,32. Echter, met enige ervaring, de analoge beeldanalyse pijpleidingen kunnen worden ingesteld in een andere versie of soortgelijke software. Raadpleeg de softwarepagina voor een gedetailleerde uitleg (zie Tabel met materialen).
- Download en installeer CellProfiler en CellProfiler Analyst software.
- Open CellProfiler. Bestand selecteren| Importeren| Pijplijn uit bestand en laad de meegeleverde voorbeeldpijplijn, TH_LB_V1.cpipe-bestand (zie de aanvullende bestanden).
OPMERKING: De voorbeeldpijplijnen vereisen specifieke aanpassingen, afhankelijk van de eigenschappen van de verworven afbeeldingen en het platform voor het verkrijgen van afbeeldingen. Example_Imageskan worden gebruikt voor de eerste proef van de software. - Afbeeldingen laden om te analyseren door ze naar de module Afbeeldingente slepen. Gebruik filteropties om alleen afbeeldingsbestanden uit de geladen map te selecteren.
- Gebruik de module Metagegevens om goed, gezichtsveld en kanaalgegevens uit de naam van het afbeeldingsbestand te extraheren. Klik op het vergrootglas symbool en voer reguliere expressie om Plaat te extraheren, Nou, Imaging Site en Channel informatie uit bestandsnamen.
OPMERKING: Regelmatige expressie is afhankelijk van bestandsnaamconventie van plaatmicroscoop. Als u op het vraagteken naast het vergrootglas klikt, worden details van de syntaxis weergegeven. - Selecteer onder de module NamesAndTypes de juiste kanaalnummers voor DAPI-, TH- en pS129-αsyn-kleuring(standaardkanalen 1, 2en 3). Selecteer in de module Groepen 'Nee'.
- Gebruik de module Metagegevens om goed, gezichtsveld en kanaalgegevens uit de naam van het afbeeldingsbestand te extraheren. Klik op het vergrootglas symbool en voer reguliere expressie om Plaat te extraheren, Nou, Imaging Site en Channel informatie uit bestandsnamen.
- Gebruik IdentifyPrimaryObjects modules te segment dopamine neuronen met behulp van TH kleuring van cel soma.
OPMERKING: Specifieke waarden vereisen initiële optimalisatie op basis van hoe platen worden gekleurd en afgebeeld. Indien de volgende platen op dezelfde manier worden verwerkt, zijn er geen of minimale verdere aanpassingen nodig. - Gebruik de MeasureObjectIntensity-module om informatie over fluorescentieintensiteit te verkrijgen van TH- en DAPI-kanalen.
- Gebruik MeasureObjectSizeShape module om grootte en vorm kenmerken van segment dopamine neuronen te meten.
- Gebruik MeasureTexture module om textuur functie informatie van TH kanaal van gesegmenteerde dopamine neuronen te meten.
- Gebruik de module ExportToDatabase om metingen op te slaan in de database.
- Naamdatabasebestand volgens het experimentnaamschema (bijvoorbeeld ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Selecteer Uitvoermap voor het databasebestand. Het databasebestand kan enkele gigabytes groot zijn en moet bij voorkeur worden opgeslagen in de bovenliggende map van de afbeeldingsbestanden.
- Open CellProfiler Analyst en selecteer het bestand V1_THCells.properties dat is gemaakt bij stap 6.8. Open Tools| Classificatie.
- Sorteer gesegmenteerde cellen in twee categorieën: positief (d.w.z. correct gesegmenteerde dopamineneuroncellichamen) en negatief (d.w.z. segmentatie- en kleuringsartefacten) Zie figuur 2A en 2B.
- Stel het aantal opgehaalde cellen in op 50 willekeurige cellen en klik op Ophalen (hiermee worden afbeeldingen van de cellen gesegmenteerd in stap 6.4 geladen). Sorteer ten minste 30 cellen in elke opslaglocatie door ze naar de bijbehorende opslaglocatie onder aan het venster te slepen. Haal meer cellen als dat nodig is.
- Selecteer in het vervolgkeuzemenu Fast Gentle Boosting gebruiken met 50 max-regels en klik op Trainen.
- Stel 'Fetch'in op 50 positieve cellen en druk op Fetch om TH-positieve cellen te krijgen volgens de classificatie ( figuur2A). Gebruik het verkregen resultaat om de kwaliteit van de getrainde classificatie te evalueren.
- Herhaal stap 6.10.1–6.10.3 en voeg nieuwe voorbeeldcellen toe voor het trainen van de classificatie totdat de resultaten bevredigend zijn.
- Selecteer Geavanceerd| Regels bewerken... en selecteer in een nieuw venster alle tekst (Ctrl+a)en kopieer deze (Ctrl-c)naar kladblok (Ctrl-v). Opslaan als TH_rules.txt-bestand.
OPMERKING: Afhankelijk van de dichtheid van de neuronale cultuur en de kwaliteit van de kleuring en beeldvorming, kan deze stap niet nodig zijn, omdat het mogelijk zou kunnen zijn om parameters in stap 6.4 in te stellen om alleen TH-positieve cellen met hoge nauwkeurigheid te segmenteren. Als dit het geval is, is een volledige TH_LB_V1.cpipe run niet nodig en moeten de juiste parameters van IdentifyPrimaryObjects-modules rechtstreeks in de overeenkomstige module in TH_LB_V2.cpipeworden geplaatst.
Figuur 2: Kwantificering van dopamineneuronen en pS129-αsyn positieve dopamineneuronen met CellProfiler Analyst software op basis van DAPI, TH en pS129-αsyn immunofluorescentie. (A) TH-cellen in de positieve bak werden geselecteerd op basis van DAPI-kleuring (blauw) gemarkeerd met een klein vierkantje bij de eerste cel die is geselecteerd bij de afbeelding en de omringende TH-kleuring (grijs) bij soma. (B) Niet-cel artefacten werden geplaatst in de negatieve bak. (C) pS129-αsyn positieve TH-neuronen werden geselecteerd op basis van grote opname van pS129-αsyn -kleuring (rood) gemarkeerd met een klein vierkantje bij de eerste cel die bij de afbeelding is geselecteerd, rond de kernen of op celsokma. (D) TH-cellen zonder dergelijke pS129-αsyn-insluitsels werden in de negatieve bak geplaatst. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Celprofiler openen en Bestand selecteren| Importeren| Pijplijn uit bestand en laad TH_LB_V2.cpipe-bestand. Herhaal stap 6.3–6.7. Dit deel van de pijpleiding moet identiek zijn aan TH_LB_V1.cpipe.
- Gebruik de module FilterObjects om alleen echte TH-positieve cellen door te geven voor verdere analyse.
- Stel de filtermodus in op Regels. Selecteer in Regels of bestandsnaam van classificatie het TH_rules.txt-bestand dat is gemaakt in stap 6.10.5.
- Stel klassenummerveld in op 1 als TH-positieve cellen zijn gesorteerd op het linkerbenedenvenster onderin.
- Gebruik de MeasureObjectIntensity-module om informatie over fluorescentieintensiteit te verkrijgen van het pS129-αsyn-kanaal.
- Gebruik de module MeasureTexture om textuurfunctiegegevens van het TH-kanaal van gefilterde cellen te meten.
- Gebruik de module MeasureObjectSizeShape om de grootte en vormkenmerken van gefilterde cellen te meten.
- Gebruik de module ExportToDatabase om metingen op te slaan in de database.
- Geef dienovereenkomstig een databasebestand met het naamgevingsschema van het experiment (bijvoorbeeld ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Selecteer uitvoermap voor databasebestand.
- Open CellProfiler Analyst en selecteer V2_THpos.properties-bestand.
- Sorteer gesegmenteerde cellen in twee categorieën: pS129-αsyn positieve en pS129-αsyn negatieve cellen (figuur 2C,D).
- Stel het aantal opgehaalde cellen in op 50 willekeurige cellen en klik op Ophalen (hiermee worden afbeeldingen van cellen gesegmenteerd in stap 4 geladen). Sorteer ten minste 30 cellen in elke opslaglocatie door ze naar de bijbehorende opslaglocatie onder aan het venster te slepen.
- Selecteer in het vervolgkeuzemenu Fast Gentle Boosting gebruiken met 50 max-regels of Random max Random Forest Forest-classificeerders. Klik op Trainen.
- Stel 'Fetch'in op 50 positieve cellen en druk op Fetch om pS129-αsyn positieve cellen te krijgen volgens classificatie ( Figuur2C). Stel 'Fetch'in op 50 negatieve cellen en druk op Fetch om pS129-αsyn negatieve cellen te krijgen volgens classificatie ( Figuur2D). Evalueer de kwaliteit van de getrainde classificatie.
- Herhaal stap 6.17.2–6.17.4 en voeg nieuwe voorbeeldcellen toe om de classificatie te trainen totdat de resultaten bevredigend zijn.
- Klik op Score Alles om resultaten tabel samenvatting van het aantal pS129-αsyn positieve en negatieve dopamine neuronen in elke put te krijgen.
Representative Results
Een paar dagen na de beplating (DIV1–DIV3) werd de microscopie van bright-field gedaan om de gezondheid en homogene verspreiding van de gekweekte cellen en uniformiteit van deze omstandigheden bij de afzonderlijke putten te beoordelen (figuur 3). Gekweekte midbraincellen werden homogeen verspreid binnen het micro-eiland dat vóór de beplating werd gecreëerd (figuur 3A,B). Primaire neuronen hadden zich op de gecoate grond homogeen gevestigd en neuronale projecties vastgesteld(figuur 3B). Een kleine klomp cellen (diameter kleiner dan 150 μm) werd waargenomen in de put en getoond als voorbeeld (Figuur 3C).
Figuur 3: Een paar dagen na de beplating (bijvoorbeeld DIV3) werd de toestand van primaire midhersenculturen waargenomen met helderveldmicroscopie. (A) Gekweekte cellen verspreid over het midden van de put binnen de PO-gecoate micro-eiland met een geschatte straal van 4,4 mm (weergegeven met witte pijlen) gemaakt door krassen PO van ongeveer 1 mm goed omtrek (weergegeven met zwarte pijlen). (B) Gekweekte primaire neuronen homogeen verspreid binnen het gebied en neuronale projecties (gemarkeerd met rode pijlpunten) werden waargenomen. (C) Een celklonter met een diameter kleiner dan 150 μm is gemarkeerd met blauwe pijlpunten. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Primaire muis midbrain culturen werden immunostained met anti-TH en anti-pS129-αsyn antilichamen en afgebeeld met een geautomatiseerde microscoop na 15 dagen in vitro. Gecoate micro-eilanden verstrekt beperkt gebied voor de bevestiging van cellen in het midden van putten (Figuur 4A,B). Dopamine neuronen immunolabeled met TH marker werden verspreid over het micro-eiland in een monolayer, gescheiden van elkaar, zonder klonterende(Figuur 4A' en 4B').
Figuur 4: Bij DIV15 werden 800-1.000 dopaminecellen gekwantificeerd van elk micro-eiland, met of zonder PFF-behandeling. Representatieve beelden van embryonale midbrainculturen die zijn vastgehouden met anti-TH en anti-pS129-αsyn antilichamen. A,A', A'') Controleer cellen zonder PFF-behandeling. b,B%quot% PFF-behandelde cellen met pS129-αsyn insluitsels. (C) Kwantificering van TH-positieve celnummers in putten die met voertuig (controle), PFF's of PFF's met 50 ng/mL GDNF worden behandeld. (D) Kwantificering van pS129-αsyn aggregaten in TH-positieve cellen behandeld met voertuig (controle), PFF's of PFF's met 50 ng/mL GDNF. Statistische significantie werd berekend met random block design ANOVA. **p < 0,01, n = 4 afzonderlijke platen (biologische replicaties), elk met 3-6 putten per behandelingsgroep (technische herhalingen). Schaalbalken = 300 μm voor A, B; 50 μm voor A", B"; 25 μm voor A', B''. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Terwijl culturen zonder PFF-behandeling geen pS129- αsyn-signaal(figuur 4A' en 4A' hadden),ontwikkelden culturen die met α-synuclein PFF's werden behandeld pS129-αsyn positieve insluitsels ( figuur4B' en 4B').’ In vitro PFF behandeling gedurende 7 dagen niet leiden tot een significante daling van het aantal TH-positieve neuronen, in vergelijking met andere experimentele groepen (Figuur 4C). PFF-behandelde culturen hadden een bevolking van ~ 40% van pS129-αsyn positieve TH-positieve dopamine neuronen. Behandeling met positieve controle, GDNF, verminderde het percentage TH-positieve dopamine neuronen met pS129-αsyn positieve insluitsels (Figuur 4D, zie ook de ruwe gegevens en voorbeeld beelden in de aanvullende bestanden).
Aanvullende bestanden: Voorbeeldpijplijnen voor beeldanalyse met hoge inhoud met CellProfiler en de CellAnalyst-softwarepakketten, voorbeeldafbeeldingen en ruwe gegevens voor figuur 4E, F. (1-9) Example_Images. Open deze afbeeldingen met ImageJ of CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Stappen 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (stappen 6.11–6.18) Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het verspreiden van Lewy pathologie, waarvan pS129-αsyn een belangrijk bestanddeel is, is een histopathologisch kenmerk van PD. Het stoppen of vertragen van de accumulatie van geaggregeerde pS129-αsyn kan de degeneratie van dopamineneuronen en de progressie van alfa-synucleinopathie vertragen. Echter, een mechanistisch begrip van hoe pS129-αsyn aggregatie bijdraagt aan de ondergang van dopamine neuronen moet nog worden vastgesteld. Bewijs van menselijke postmortemstudies over hersenmonsters van patiënten in verschillende stadia van de ziekte en observatie van pS129-αsyn positieve opname in getransplanteerde foetale neuronen suggereert sterk de verspreiding van lewy pathologie tussen cellen16,17,33. Bijgevolg werd de prion-achtige verspreiding van pS129-αsyn onlangs samengevat met behulp van α-synuclein PFFs9,10. Het vaststellen van een robuust, kosteneffectief en relatief hoog- of middeldoorvoermodel van pS129-αsyn-verspreiding en accumulatie, met name in dopamineneuronen, kan de zoektocht naar nieuwe behandelingen en verbindingen die dit proces wijzigen aanzienlijk versnellen.
Omdat verlies van dopamine neuronen is de belangrijkste oorzaak van motorische symptomen in PD en deze cellen bezitten vele unieke eigenschappen2,34,35, modellering van prion-achtige verspreiding van pS129-αsyn in dopamine neuronen is de meest relevante vorm van model vanuit het translationele perspectief. Protocollen met behulp van micro-eiland culturen van embryonale midbrain neuronen op 4 goed platen en semi-automatische kwantificering zijn eerder beschreven18. Het hier beschreven protocol werd aangepast aan 96 putplaten en biedt een minder moeizame voorbereiding van micro-eilanden, waardoor maximaal vier platen met 60 putten elk door een ervaren onderzoeker tijdens een werkdag kunnen worden voorbereid. Het kweken van dopamineneuronen in 96 goed platen maakt het mogelijk om geneesmiddelen bij lagere hoeveelheden te testen en maakt hoge transductiesnelheden mogelijk met lentivirusvectoren. Het is ook mogelijk om verschillende behandelingen te combineren om complexere experimenten uit te voeren.
Alvorens behandelingen (inclusief PFF's) toe te passen, moet de kwaliteit van de kweek worden gecontroleerd met een helderveldmicroscopie. Als het microscopiesysteem geen CO2-kamer met verwarming gebruikt, mogen de cellen niet langer dan een paar minuten buiten de incubator worden gehouden, omdat primaire dopamineneuronnen van muizen delicaat en gemakkelijk gestrest zijn. Om dezelfde reden wordt geadviseerd dat de eerste beeldvorming moet worden gedaan na 24 uur incubatie (tussen DIV1-DIV3). De cellen moeten lijken te leven met de huidige cellichamen en homogeen verspreid in het micro-eiland. Primaire neuronen zou hebben gevestigd op de PO-gecoate grond en begon neuronale projecties vast te stellen. Het is mogelijk om kleine klont cellen (d.w.z. diameter kleiner dan 150-200 μm) te observeren die kunnen worden gevormd als het trituratieproces niet goed wordt uitgevoerd of de beplatingsdichtheid hoger is dan aanbevolen. Deze kleine klontjes zou niet van invloed op het experiment, tenzij ze meer dan een paar per goed en / of groter. Geklonterde cellen maken het zeer moeilijk om immunohistochemische markers en individuele cellen te identificeren tijdens de beeldanalyse. Het is essentieel om dergelijke klonten te vermijden door zorgvuldige coating, triturating, en het regelen van plating dichtheid. Als de uniformiteit van deze voorwaarden niet kan worden nageleefd bij bepaalde putten, neem dan niet deze defecte putten in het experiment. Een dergelijke uitsluiting moet worden uitgevoerd vóór de uitvoering van eventuele behandelingen.
Bovendien, het gebruik van 96 put platen zorgt voor handige multichannel pipet gebruik tijdens kleuring procedures en directe visualisatie met automatische plaat microscopen, verdere toenemende doorvoer. Het gebruik van geautomatiseerde beeldkwantificering is onmisbaar voor de analyse van de gegevens van high-content imaging platforms. Naast de mogelijkheid om duizenden beelden verkregen uit elk experiment te verwerken, zorgt het voor onbevooroordeelde, identieke kwantificering van alle behandelingsgroepen. De voorgestelde workflow voor de beeldanalyse is gebaseerd op eenvoudige principes van het segmenteren van dopamineneuronen, het filteren van correct gesegmenteerde cellen door onder toezicht van machine learning, en vervolgens kwantificering van fenotypes (pS129-αsyn positief en pS129-αsyn negatief), opnieuw door onder toezicht machine learning. Hoewel verschillende benaderingen voor deze taak kunnen worden voorzien, hebben we de combinatie van segmentatie met machine learning gevonden als de meest robuuste voor dopamineculturen vanwege de hoge beplatingsdichtheid, de diverse vormen van dopamineneuronen en de aanwezigheid van sterk bevlekte neurites. Het voorgestelde algoritme voor beeldanalyse werd geïmplementeerd in CellProfiler en CellProfiler Analyst, open source, vrij beschikbare high-content beeldanalysesoftware26,27. Het algoritme kan ook worden geïmplementeerd met andere software voor beeldanalyse, ofwel open source (bijvoorbeeld ImageJ/FIJI, KNIME) of eigendom. Echter, in onze ervaring deze vaak offer aanpassing mogelijkheden voor gebruiksgemak, en daarom misschien niet goed presteren in ingewikkelde analyses. We hebben vastgesteld dat de CellProfiler en CellProfiler Analyst softwarepakketten bijzonder betrouwbare resultaten opleveren door een aanzienlijk aantal geïmplementeerde algoritmen te combineren, extreme flexibiliteit in het ontwerpen van workflows en tegelijkertijd het verwerken en efficiënt verwerken van high-content imaging data.
Het beschreven protocol kan ook worden aangepast voor kwantificering van andere cellulaire fenotypes die worden gekenmerkt door immunosmetten met verschillende antilichamen, zoals markers van andere neuronale populaties (bijvoorbeeld DAT, GAD67, 5-HT enz.) en eiwitaggregaten (bijvoorbeeld phospo-Tau, ubiquitine). Meerdere fluorescerende markers kunnen ook worden gecombineerd om meerdere fenotypen te onderscheiden (bijvoorbeeld cellen met insluitsels in verschillende stadia van rijping). Geautomatiseerde classificatie van meerdere fenotypen moet ook eenvoudig te implementeren zijn in de beschreven beeldanalysepijplijnen door alleen een kanaal toe te voegen dat immunofluorescente beelden van extra markers bevat aan meetstappen en cellen in meerdere opslaglocaties sorteert. Het gebruik van meerdere markers tegelijkertijd zou echter de optimalisatie van immunostaining en beeldvormingsvoorwaarden vereisen. Bovendien, voor een betere kwaliteit in immunofluorescentie beeldvorming, het gebruik van speciale zwartwandige 96 goed platen expliciet ontworpen voor de fluorescerende microscoop wordt aanbevolen. Deze kunnen echter aanzienlijk duurder zijn dan standaard celkweekplaten, die voldoende zijn voor de analyse die in ons protocol wordt beschreven.
Het type en de kwaliteit van gebruikte PFF's zijn van cruciaal belang voor de uitkomst van de experimenten. PFF's kunnen zowel de robuustheid van de test als de interpretatie van de resultaten beïnvloeden. Bereidingsomstandigheden kunnen van invloed zijn op de zaadefficiëntie van PFF's en er zijn inderdaad PFF-stammen met verschillende fysiologische eigenschappen gemeld36. Niettemin vallen de voorbereiding en validatie van PFF's buiten het toepassingsgebied van dit artikel en zijn zij beschreven in verschillende publicaties11,28,29,30. Naast het bereidingsprotocol moeten de soorten van oorsprong van α-synuclein in PFF's (bijvoorbeeld muis, mens) en het gebruik van wilde of gemuteerde eiwitten (bijvoorbeeld menselijke A53T α-synuclein) worden overwogen, afhankelijk van de specifieke experimentele omstandigheden. Inductie van pS129-αsyn accumulatie door PFF's bleek afhankelijk te zijn van leeftijd van de cultuur (d.w.z. dagen in vitro), met meer volwassen culturen met meer uitgesproken inductie11. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het toegenomen aantal neuronale verbindingen in meer volwassen culturen, en verhoogde α-synuclein eiwitniveaus. In onze handen gaf de behandeling met PFF's bij DIV8 de meest robuuste resultaten, met uitgesproken accumulatie van pS129-αsyn in dopamineneuron soma, terwijl het neuronale overleving niet in gevaar bracht. Het beschreven protocol is zeer geschikt voor het bestuderen van behandelingen die vroege gebeurtenissen wijzigen die leiden tot aggregatie van endogene α-synuclein omdat we pS129-αsyn positieve insluitsels kwantificeren op een relatief vroeg tijdstip, 7 dagen na inenting met PFFs. Op dit moment zijn intrasomale insluitsels aanwezig in een aanzienlijke fractie van cellen en kunnen gemakkelijk worden onderscheiden door immunostaining terwijl er geen pff-geïnduceerde celdood wordt waargenomen, waardoor de interpretatie van de resultaten wordt vereenvoudigd. Belangrijk is dat, aangezien de morfologie en samenstelling van pff-geïnduceerde insluitsels in de loop van de tijd12,13kunnen veranderen, het beschreven protocol in principe kan worden gewijzigd om meer volwassen insluitsels te bestuderen door fixatie en immunostaining op latere tijdstippen. Echter, het houden van dopamine neuronen in de cultuur voor langer dan 15 dagen vereist extreme zorg, en kan leiden tot extra variatie als gevolg van cellen niet onafhankelijk van PFF inenting te overleven. Bovendien, meer uitgebreide culturen compliceren drug behandeling schema's. Veel verbindingen hebben beperkte of niet slecht gekarakteriseerde stabiliteit in de celcultuur medium, en aanvulling van een drug is niet triviaal omdat volledige uitwisseling van medium compromissen de overleving van de dopamine culturen.
Fosforylatie van α-synuclein bij Ser129 wordt consequent gerapporteerd in PFF-gebaseerde modellen van α-synucleinaggregatie en colocalizes met markers van misfolding en aggregatie zoals Thioflavin S, ubiquitine of conformatiespecifieke antilichamen11,12. In onze handen geeft immunostaining voor pS129-αsyn ook het sterkste signaal met de laagste achtergrond en is het meest eenvoudig te analyseren, waardoor robuuste resultaten worden gegeven wanneer meerdere behandelingen worden gescreend. Belangrijk is dat immunostaining met pS129-αsyn antilichaam geen PFF's detecteert die buiten de cellen achterblijven, waardoor de achtergrond aanzienlijk wordt verminderd. Het is echter belangrijk om te onthouden dat Ser129 fosforylatie waarschijnlijk een van de vroegste processen is die verband houden met het verkeerd vouwen van α-synuclein en onder specifieke omstandigheden anders kan worden gereguleerd. Daarom moeten alle bevindingen die positieve effecten op pS129-αsyn vertonen, worden bevestigd door andere merkers.
Statistische analyse moet overeenkomstig worden afgestemd op experimenteel ontwerp. Het is essentieel om experimenten uit te voeren in ten minste drie onafhankelijke biologische replicaties (d.w.z. afzonderlijke primaire neuronale culturen). Deze replica's moeten op verschillende platen worden verguld en onafhankelijk worden behandeld. We analyseren de gegevens verkregen uit replica's op verschillende platen met random block design ANOVA37 om rekening te houden met het koppelen van gegevens voor verschillende experimentele platen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken prof. Kelvin Luk voor zijn gulle gift van α-synuclein PFFs, Conjung Zheng voor het oprichten en kweken van neuronale cellen, en de Light Microscopie Unit aan het Institute of Biotechnology, Universiteit van Helsinki, voor beeldvorming immunostained cellen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van 3i-Regeneration door Business Finland (Fins Financieringsagentschap voor innovatie), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Foundation, en de statutaire fondsen van het Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, Pt 5 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease - repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson's model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson's disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
