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Neuroscience

Étude de l’accumulation préforme induite d’α-synucléine par fibrile dans les neurones dopaminergiques de la souris embryonnaire primaire

Published: August 16, 2020 doi: 10.3791/61118
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Neuroscience Center, HiLIFE, University of Helsinki, 3Department of Brain Biochemistry, Maj Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences

Summary

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour étudier l’accumulation neuronale de α-synucléine dans les neurones primaires de dopamine de souris. Les agrégats α-synucléine phosphorylés dans les neurones sont induits avec des fibrilles préformées d’α-synucléine. L’imagerie automatisée des cellules immunofluorères et l’analyse impartiale de l’image rendent ce protocole robuste adapté au dépistage moyen à élevé des médicaments qui inhibent l’accumulation de synucléine.

Abstract

Le but de ce protocole est d’établir un modèle robuste et reproductible de l’accumulation d’α-synucléine dans les neurones dopaminergiques primaires. Combiné à l’immunostaining et à l’analyse automatisée impartiale de l’image, ce modèle permet l’analyse des effets des médicaments et des manipulations génétiques sur l’agrégation α-synucléine dans les cultures neuronales. Les cultures primaires de midbrain fournissent une source fiable de neurones embryonnaires de bonne foi de dopamine. Dans ce protocole, l’histopathologie caractéristique de la maladie de Parkinson, les corps de Lewy (LB), est imitée par l’ajout de fibrilles préformées (PFF) d’α-synucléine directement aux médias de culture neuronale. L’accumulation de α-synucléine phosphorylérée endogène dans le soma des neurones dopaminergiques est détectée par immunostaining déjà à 7 jours après l’addition de PFF. Les conditions de culture cellulaire in vitro conviennent également à l’application et à l’évaluation des traitements empêchant l’accumulation d’α-synucléine, tels que les médicaments à petites molécules et les facteurs neurotrophiques, ainsi que les vecteurs de lentivirus pour la manipulation génétique (p. ex., avec CRISPR/Cas9). La culture des neurones dans 96 plaques de puits augmente la robustesse et la puissance des configurations expérimentales. À la fin de l’expérience, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde pour l’immunocytochimie et l’imagerie microscopie de fluorescence. Les images de fluorescence multispectrale sont obtenues par microscopie automatisée de 96 plaques de puits. Ces données sont quantifiées (p. ex., en comptant le nombre de neurones dopaminergiques contenant de la phospho-α-synucléine par puits) avec l’utilisation de logiciels libres qui fournissent une plate-forme pour une analyse impartiale de phénotype à haute teneur. La modélisation induite par la PFF de l’accumulation α-synucléine phosphorylée dans les neurones dopaminergiques primaires fournit un outil fiable pour étudier les mécanismes sous-jacents de médiation de la formation et de l’élimination des inclusions de α-synucléine, avec la possibilité de dépistage de médicaments à haut débit et l’analyse du phénotype cellulaire.

Introduction

La maladie de Parkinson (PD) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la mort des neurones dopaminergiques midbrain dans la substantia nigra (SN), la perte subséquente de tonus dopaminergique dans les ganglions basaux, et les déficiences motrices conséquentes1,2. Une caractéristique histopathologique majeure dans le cerveau des patients atteints de MP sont des agrégats intracellulaires de protéines/lipides trouvés dans le soma neuronal, appelé corps de Lewy (LB), ou dans les neurites, neurites de Lewy (LN), collectivement connu sous le nom de pathologie de Lewy3. La pathologie de Lewy dans le cerveau semble progresser avec l’avancement de ressemblant à la propagation des facteurs pathogènes par des connexions neuronales. La pathologie abondante de Lewy se trouve dans les neurones de dopamine dans le SN et les cellules dans d’autres secteurs affectés par la neurodégénérescence4. Cependant, pendant la progression de la maladie, la propagation et l’apparition de l’agrégation de protéines ne sont pas toujours corrélées avec la mort neuronale et la contribution exacte de la pathologie de Lewy à la mort neuronale n’est pas encore claire5.

Il avait été démontré que lb et ln se composaient de composants membraneux et protéinés3. Les premiers sont des fragments de membrane, des structures vésiculaires (peut-être lysosomes et autophagosomes) et des mitochondries3. Ce dernier se compose d’au moins 300 protéines différentes6. Une étude caractéristique par Spillantini et coll.7 a démontré que la principale composante protéique de la pathologie de Lewy est l’α-synucléine. Fortement exprimée dans les neurones, et liée à la fusion membranaire et à la libération de neurotransmetteurs, l’α-synucléine dans la pathologie de Lewy est présente principalement sous la forme mal pliée et amyloïde fibrile, dont la majeure partie est phosphorylée à Ser129 (pS129-αsyn)4,8.

Fait important, il a également été démontré qu’en raison de ses propriétés prion-like, mal plié α-synucléine pourrait avoir un rôle causal dans la formation de pathologie de Lewy4. Les propriétés prion-like de l’α-synucléine mal pliée ont été montrées avec les deux extraits de midbrain des patients et exogènement préparé α-synucléine fibrilles préformées (PFF) pour induire des agrégats d’α-synucléine dans les neurones en culture et in vivo9,10. Les PFF présentent un modèle fiable et robuste pour étudier la progression de la pathologie de l’α-synucléine dans les neurones dopaminergiques. Lorsque les PFF sont appliqués aux neurones primaires cultivés ou injectés dans le cerveau animal, ils conduisent à la formation d’inclusions contenant de l’α-synucléine dans les neurites et le somacellulaire 11 qui récapitulent de nombreuses caractéristiques observées dans la pathologie de Lewy. Les inclusions observées sont insolubles dans triton X, ubiquitinées, tachées avec le colorant amyloïde spécifique Thioflavine S, et contiennent α-synucléine hyperphosphoryléed à Ser12911,12. Fait important, ces inclusions ne se forment pas chez les animaux knock-out α-synucléine11, indiquant la dépendance de leur formation sur l’α-synucléine endogène.

Néanmoins, il est difficile de comparer directement les inclusions induites par le PFF et la pathologie de Lewy trouvées dans les patients de parce que les LBs humains et les LN sont très hétérogènes3. L’hétérogénéité observée de la pathologie de Lewy pourrait être provoquée par différents stades de la formation, l’emplacement anatomique différent, ou des différences dans la conformation de l’α-synucléine mal pliée initiant le processus d’agrégation. Les mêmes facteurs pourraient influencer les inclusions positives de pS129-αsyn induites par le PFF. En effet, récemment, il a été démontré que pS129-αsyn inclusions positives induites par le PFF dans les cultures neuronales primaires représentent des stades très précoces de la pathologie qui peuvent mûrir à des structures ressemblant étroitement à LB après la période d’incubation prolongée12,13.

La modélisation de la propagation et de l’accumulation précoces de l’α-synucléine mal pliée avec des PFF est précieuse pour le développement de médicaments, car la propagation de la pathologie de Lewy est considérée comme l’un des marqueurs de la maladie à un stade précoce. Par conséquent, les traitements d’agrégation-préventifs peuvent être prometteurs pour arrêter ou ralentir la progression de la MP à des stades très précoces. Plusieurs essais cliniques visant à ralentir ou à arrêter l’accumulation d’α-synucléine sont en cours14. Pour les patients à un stade ultérieur, la transplantation de progéniteurs neuronaux dopaminergiques peut être une meilleure alternative de traitement15. Cependant, la pathologie de Lewy a été documentée dans les neurones embryonnaires transplantés pendant l’analyse post-mortem des cerveaux de patient de16,17, indiquant également la nécessité de protection contre l’accumulation d’α-synucléine.

In vitro, les PFF de l’α-synucléine sont connus pour induire l’agrégation dans les lignées cellulaires immortalisées, ou plus généralement, dans les neurones hippocampaux primaires ou corticaux des rongeurs. Ni l’un ni l’autre ne sont près de récapituler les neurones dopaminergiques10. La culture de ces neurones nécessite un placage dense de certains nombres de neurones in vitro18. Pour atteindre une densité de placage élevée avec un matériau limité (p. ex., les neurones dopaminergiques primaires), la méthode de culture micro-île est couramment utilisée. Dans la micro-culture insulaire, les cellules sont d’abord plaquées dans une petite goutte de milieu (généralement quelques microlitres) maintenues ensemble par la tension de surface au milieu d’un grand puits18. Après que les neurones s’attachent, le puits entier est rempli avec le milieu tandis que les cellules restent confinées à haute densité dans la petite zone de placage. En plus d’atteindre une densité de placage élevée, les micro-îles empêchent également le placage près des bords des puits, où les variations de densité cellulaire et de survie sont fréquentes. Les micro-îles sont souvent utilisées dans des puits ou des plats relativement grands; cependant, l’établissement de cultures neuronales de midbrain dans les micro-îles dans le format de plaque de puits de 96 permet l’étude de la pathologie de Lewy dans les neurones de dopamine de bonne foi avec la puissance moyenne-à-haut-débit. Des expériences in vitro avec ces neurones nous ont permis de découvrir le facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF), qui favorise la survie des neurones dopaminergiques matures in vitro et in vivo19,20,21,22 et empêche également la formation d’agrégats d’α-synucléine dans les neurones dopaminergiques23. Les neurones dopaminergiques pluripotents induits par le patient constituent un modèle plus précis en raison de leur origine humaine et de leur temps de survie in vitro plus long. Cependant, l’induction de la pathologie de l’α-synucléine dans les neurones humains est observée après plusieurs mois, comparativement à une semaine dans les neurones embryonnaires de souris, et/ou avec de multiples facteurs de stress (p. ex., combinaison de surexpression et de PFFs α-synucléine)24,25. En outre, le maintien des neurones humains de dopamine est plus coûteux et laborieux par rapport aux neurones embryonnaires primaires, limitant essentiellement leur utilisation dans les applications à haut débit.

De plus, les cultures neuronales primaires de dopamine peuvent être génétiquement modifiées (p. ex., avec CRISPR/Cas9) et/ou traitées avec des agents pharmacologiques23. Ils constituent une plate-forme rapide et reproductible pour des applications comme la dissection de voie moléculaire et le dépistage de la bibliothèque de médicaments. Même si des matériaux limités peuvent être obtenus à partir de ces cultures, il est toujours possible de mener des analyses génomiques/protéomiques de petite taille. La culture des neurones primaires au format 96 est meilleure pour les techniques d’immunocytochemisme et de microscopie de fluorescence, suivies d’une analyse de phénotype à forte teneur. Les images de fluorescence multispectrale dérivées de l’imagerie automatisée de 96 plaques de puits peuvent être converties en résultats quantitatifs (p. ex., le nombre de neurones contenant des LB par puits). De telles analyses peuvent être effectuées avec des logiciels libres, tels que CellProfiler26,27. Dans l’ensemble, les cultures embryonnaires primaires de cerveau milieu plaquées dans 96 plaques de puits fournissent une plate-forme robuste et efficace pour étudier les neurones dopaminergiques et l’agrégation d’α-synucléine avec la possibilité de dépistage du phénotype à haut débit.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Conseil national finlandais des expériences animales et ont été réalisées conformément à la législation européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

1. Préparation

  1. Préparer le milieu de neurone de dopamine (DPM) avec 0.46% D-glucose, 1% L-glutamine, 1% N2, 0.2% primocine, complété avec DMEM/F12. Filtrer le DPM après le mélange des ingrédients. Conserver le DPM à 4 °C et réchauffer chaque aliquot une seule fois.
    NOTE: DPM ne doit pas contenir GDNF, car il permettra de réduire l’accumulation d’α-synucléine dans les neurones dopaminergiques23.
  2. Préparer des pipettes en verre siliconées qui sont extrêmement hydrophobes, minimisant ainsi l’attachement à la surface et la perte de cellules lors de la manipulation initiale des neurones embryonnaires.
    1. Ajouter 10 mL de liquide de silicium à 1 L d’eau distillée et mélanger en remuant dans un récipient de 2 L. Laissez les pipettes en verre immergées dans la solution de silicium pendant 15 min.
    2. Rincer les pipettes 3 à 5x avec de l’eau distillée. Sécher les pipettes pendant la nuit à température ambiante (RT) ou pendant 1 à 2 h à 100-120 °C d’espace stérile chauffé pour accélérer le séchage.
    3. Stériliser les pipettes par autoclavage standard dans un sac autoclave scellé.
  3. Préparer des plaques de poly-L-ornithine (PO) recouvertes de 96 puits avec des fonds transparents en ajoutant 60 μL de solution PO dans les puits du milieu de la plaque de puits 96 à utiliser pour l’ensemencement des neurones, laissant au moins une rangée/colonne de puits sur les bords de la plaque pour éviter les effets de bord. Gardez la plaque enduite toute la nuit à 4 °C ou 4 h à RT.
  4. Avant de plaquer les cellules, aspirate PO complètement et laver les cellules trois fois avec 100 μL de 1x PBS. Assaisonner 1x PBS des puits et garder le couvercle de la plaque ouvert pour un séchage complet.
    REMARQUE : Il est possible de collecter les po usagés et de le filtrer pour la réutilisation. Cela peut être répété deux fois pour la même solution PO.
  5. Ajouter 50 μL de DPM aux puits précédemment enduits. Aspirate DPM des puits avec une pointe en plastique de 100 μL et en même temps gratter le fond du puits avec des mouvements circulaires pour enlever le revêtement au périmètre de chaque puits. Une île enduite de PO restera au milieu du puits.
  6. Sous une hotte laminaire, ajoutez 10 μL de DPM au milieu de chaque île enduite pour créer des micro-îles.
    REMARQUE : Une plaque avec des micro-îles recouvertes de DPM peut être conservée sous le capot d’écoulement laminaire pendant 1–2 h pendant l’isolement des cellules.

2. Isolement du plancher ventral midbrain des embryons de souris E13.5

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 1 pour les étapes de dissection du sol du milieu du cerveau.

  1. Avant la dissection, remplissez un plat Petri de 10 cm avec le tampon de Dulbecco et gardez-le sur la glace.
  2. Euthanasier une souris enceinte E13.5 enceinte selon les directives de l’institution. Placez la souris à plat sur son dos et pulvérisez le corps antérieur avec 70% d’éthanol. Soulevez la peau au-dessus de l’utérus avec des forceps et faites une incision avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer l’utérus.
  3. Retirez soigneusement l’utérus et placez-le dans la boîte de Pétri préalablement préparée sur la glace.
  4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux sous le capot laminaire à RT, retirez soigneusement les embryons de l’utérus. Retirez tous les résidus placentaires des embryons avec des forceps et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm remplie de tampon de Dulbecco.
  5. À l’aide de forceps ou d’aiguilles de dissection, couper le quart arrière de la tête des endroits marqués de flèches noires de la figure 1A. Retirez la pièce coupée du reste de l’embryon (figure 1B).
  6. Placez le postérieur de la pièce coupée vers l’observateur (figure 1C)et coupez-la doucement de caudale à crânienne (figure 1D). À partir de 0,5 mm sous l’ouverture crânienne, coupez une régionde 2mm 2 à 3 mm2, indiquée à la figure 1E.
  7. Recueillir le plancher ventral de midbrain (voir figure 1F)dans un tube de microcentrifuge vide de 1,5 m L. Gardez le tube de microcentrifuge sur la glace jusqu’à ce que tous les planchers de cerveau milieu soient rassemblés dedans.
    REMARQUE : Alternativement, les planchers de midbrain peuvent être rassemblés avec une micropipette de 1 mL après dissection de tous les cerveaux d’embryon.

Figure 1
Figure 1 : Dissection du plancher de cerveau moyen de l’embryon de souris E13.5. (A) Les emplacements de coupe à l’arrière de la tête sont marqués par des flèches noires et des lignes blanches pointillées. (B) La pièce a été retirée du reste de l’embryon. La pièce enlevée est encerclée. (C) La pièce a été tournée à 90° pour faire face au postérieur vers l’observateur. (D) La pièce a été ouverte des flèches noires, de caudale à crânienne (marquée de ligne blanche pointillée). EE) De 0,5 mm à 1 mm sous l’ouverture, la région de 2 mm2–4 mm2 a été coupée (marquée de lignes noires). (F) Le plancher ventral de midbrain était isolé (marqué de carré en pointillé noir). Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Établissement de cultures embryonnaires primaires de cerveau milieu à partir d’embryons de souris E13.5 dans le format 96 de plaque de puits

  1. Après la collecte des planchers midbrain de tous les embryons dans le même tube de 1,5 mL, retirez le tampon résiduel de Dulbecco et lavez les morceaux de tissu trois fois avec 500 μL de Ca2+, Mg2+-free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS).
  2. Retirez le HBSS et ajoutez 500 μL de trypsin de 0,5 % au tube. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
  3. Pendant l’incubation, chauffer 1,5 mL de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 °C, ajouter 30 μL de DNase I au FBS et mélanger. En outre, le feu-polir la pointe d’une pipette en verre siliconisé. Assurez-vous que le trou n’a pas de bords tranchants et est à peu près de la même taille qu’une pointe de micropipette de 1 mL.
    REMARQUE : Comme alternative, une pointe de micropipette à faible adhérence de 1 mL peut être utilisée pour la trituration. Cependant, les pipettes en verre siliconisées semblent donner les meilleurs résultats.
  4. Dès que l’incubation à l’étape 3.2 se termine, ajoutez 500 μL du mélange FBS/DNase au tissu partiellement digéré. Utilisez la pipette en verre pour triturer le tissu dans le mélange FBS/trypsin. Triturate jusqu’à ce que les tissus se dissocient en minuscules particules à peine visibles. Évitez les bulles pendant la trituration.
  5. Laissez les particules restantes se précipiter au fond du tube de microcentrifuge par gravité. Sans piper le précipité au fond, recueillir le supernatant dans un tube de polypropylène conique vide de 15 mL.
  6. Diluer FBS/DNase I de l’étape 3.3 (98:2) avec 1.000 μL de HBSS pour obtenir FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Mélanger en faisant des pipes de haut en bas. Ajouter 1 000 μL du nouveau mélange aux particules restantes dans le tube de microcentrifuge. Triturate à nouveau et répéter l’étape 3.5.
  7. Répétez l’étape précédente une fois de plus pour utiliser tous les FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
  8. Une fois que tous les supernatants sont recueillis à l’intérieur du tube de 15 mL (à partir des étapes 3,5, 3,7 et 3,8), utilisez une centrifugeuse de table pour faire tourner le supernatant (~3 mL) à 100 x g,pendant 5 min. Retirez le supernatant sans toucher les cellules granulées au fond.
  9. Laver la pastille cellulaire en ajoutant 2 ml de DPM au tube et faites-le tourner à 100 x g pendant 5 min. Retirez le supernatant et répétez le lavage 2x pour minimiser les débris dans les cellules granulées.
    REMARQUE: Utilisez toujours du DPM frais et réchauffé pour les neurones cultivés. Pour les étapes de lavage, DPM n’a pas besoin d’être frais, mais doit être prérementé à 37 °C.
  10. Diluer les cellules avec du DPM frais et chaud et les transférer dans un tube de microcentrifuge. La quantité de DPM pour la dilution dépend du nombre d’embryons utilisés pour la dissection tissulaire. Par exemple, utilisez 150 μL de DPM pour diluer les cellules obtenues à partir de dix embryons.
  11. Transférer 10 μL de cellules dans DPM dans un tube de microcentrifuge. Mélangez-les avec 10 μL de 0,4% de tache bleue Trypan. Compter les cellules vivantes (c.-à-d. les cellules négatives bleues trypan) à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
    REMARQUE : Utilisez 30 000 cellules pour le placage par puits afin d’obtenir environ 1 000 neurones dopaminergiques par puits. Si la densité cellulaire est supérieure à ~30 000 cellules par 6 μL, diluer davantage les cellules avec DPM avant le placage de sorte que le volume d’ensemencement n’est pas inférieur à 6 μL.
  12. Sans toucher le fond des puits, retirez le DPM des micro-îles créées à l’étape 1.6.
  13. Afin d’obtenir la densité cellulaire reproductible à chaque puits, mélanger les cellules par pipetage doux avant le placage dans le puits. Avec une micropipette de 1 à 10 μL, ajouter 6 μL de cellules au milieu du puits, à l’emplacement de chaque ancienne micro-île.
  14. Remplissez les puits vides aux bords de la plaque avec 150 μL d’eau ou 1x PBS afin de minimiser l’évaporation des puits contenant des cultures neuronales. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 pour 1 h.
  15. Après 1 h, retirer la plaque de l’incubateur, ajouter 100 μL de DPM dans chaque puits avec des cellules et la remettre dans l’incubateur.
  16. Deux jours après le placage (jour in vitro 2, ou DIV2), retirer 25 μL et ajouter 75 μL de DPM frais pour porter le volume de support final à 150 μL et éviter l’évaporation autant que possible.
  17. Échangez la moitié du milieu avec du DPM frais (c.-à-d. retirer 75 μL et ajouter 75 μL de DPM frais) à DIV5. N’effectuez aucun changement de média après DIV5.

4. Induction d’agrégats d’α-synucléine dans les neurones de dopamine embryonnaire primaire par ensemencement avec des fibrilles préformées

Les protocoles d’obtention et de validation des PFF ont été méticuleusement décrits et discutés dans plusieurs publications récentes11,28,29,30. Après tout travail avec les PFF, nettoyez le capot laminaire ou tout équipement qui aurait pu contacter les PFF avec 1% SDS, puis avec 70% d’éthanol31.

  1. Avant l’expérience, diluer les PFF avec 1x PBS à une concentration finale de 100 μg/mL. Sonicate les PFF dilués dans les tubes microcentrifuge avec un sonicator de bain à haute puissance avec refroidissement de bain d’eau à 4 °C pour 10 cycles, 30 s ON/30 s OFF.
    REMARQUE : Il est essentiel que les fibrilles soient correctement soniques pour générer des fragments de 50 nm de long. La taille des PFF sonicated peut être mesurée directement à partir d’images de microscope électronique de transmission de PFFs tachées comme décrit par Patterson et al.30. La sonication peut être réalisée comme décrit ci-dessus dans un sonicator de bain de haute puissance. Alternativement, un sonicator de pointe peut être employé30. Les PFF sonicated peuvent être stockés à -80 °C dans de petits aliquots pour éviter de multiples cycles de congélation/dégel.
  2. Sur DIV8, ajouter 3,75 μL de 100 μg/mL de PFF par puits aux 150 μL de milieu dans le puits à une concentration finale de 2,5 μg/mL. Utilisez la même quantité de 1x PBS pour le groupe témoin.
  3. Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) en 1x PBS et stocker les aliquots à -20 °C. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
    REMARQUE : La PFA est toxique; porter un masque et des gants pendant la préparation, travailler toujours sous une hotte laminaire, et disposer de tous les déchets solides et liquides PFA selon les instructions de l’institution.
    1. Chauffer 500 mL de 1x PBS dans un récipient de 1 L. Mettez une barre de remuer dans le récipient et mettez le récipient sur un agitateur magnétique avec une fonction de chauffage. Ajuster la température entre 40 et 60 °C pour éviter l’ébullition tout en gardant la solution au chaud.
    2. Mesurer 20 g de poudre PFA sous le capot dans un contenant de mesure en plastique jetable. Ajouter soigneusement la poudre PFA dans le récipient rempli de 1x PBS. Commencez à remuer la solution.
    3. Ajouter 200 μL d’hydroxyde de sodium de 5 M dans la solution et continuer à remuer pendant environ 15 min, jusqu’à ce que la PFA se dissout complètement.
    4. Une fois que la solution semble homogène, ajoutez 168 μL de chlorure d’hydrogène de 5 M pour équilibrer le pH à ~7. Vérifiez le pH avec des bandes d’indicateurs de pH fixes sur la couleur jetables.
    5. Retirez le récipient du chauffe-eau et laissez-le refroidir jusqu’à RT. Filtrer la solution et l’aliquot pour le stockage à -20 °C. Décongeler les aliquots à RT avant l’utilisation et ne pas recongeler par la suite.
  4. Sur DIV15, retirez tous les supports des puits par pipetage. Ajouter 50 μL de 4% de PFA à chaque puits pour fixer les cellules et incuber pendant 20 min à RT. Après l’incubation, retirez la PFA des puits et ajoutez 100 μL de 1x PBS à chaque puits pour laver les cellules. Retirer 1x PBS et laver 2 fois plus.
  5. Laissez 100 μL de 1x PBS dans chaque puits pour éviter le séchage. Conserver la plaque à 4 °C jusqu’à ce que l’immunochimie soit effectuée.

5. Coloration immunofluorescente et imagerie automatisée des neurones de dopamine embryonnaire primaire dans 96 plaques de puits

  1. Retirez 1x PBS et permeabilize les cellules en ajoutant 100 μL de 0,2% Triton X-100 dans PBS (PBST) par puits et en couvant à RT pendant 15 min.
  2. Retirez le PBST et ajoutez 50 μL de sérum de cheval normal (NHS) à 5 % par puits au PBST. Pour bloquer l’activité non spécifique de l’antigène, incuber à RT pendant 1 h.
  3. Diluer les anticorps primaires contre TH et pS129-αsyn (1:2,000) dans 5% NHS dans PBST. Ajouter 50 μL d’anticorps dilués à chaque puits et incuber toute la nuit à 4 °C.
  4. Retirer les anticorps et ajouter 100 μL de 1x PBS à chaque puits pour laver les cellules. Retirer 1x PBS et répéter le lavage 2x.
  5. Pour éviter le blanchiment des molécules fluorescentes, commencez à travailler dans des conditions minimales de lumière. Diluer les anticorps fluorescents secondaires (1:400) dans PBST. Ajouter 50 μL d’anticorps dilués à chaque puits et incuber à RT pendant 1 h.
  6. Retirez la solution d’anticorps et ajoutez 100 μL de 1x PBS à chaque puits pour laver les cellules. Retirer 1x PBS et répéter le lavage 2x.
  7. Retirez 1x PBS, ajoutez 50 μL de 200 ng/mL 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) par puits pour tacher les noyaux des cellules cultivées et incuber à RT pendant 10 min.
  8. Laver les cellules 3x avec 100 μL de 1x PBS pendant 5 min chacune. Conserver 100 μL de 1x PBS dans chaque puits après le dernier lavage. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et la conserver à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
  9. Image neurones embryonnaires primaires dopaminergique dans une plaque de vue de puits 96 avec un scanner de plaque à haute teneur (voir tableau des matériaux) équipé d’un objectif 10x.
  10. Ajuster les réglages en fonction des spécifications de la plaque de puits 96, telles que le type de plaque, le fabricant, la taille, la distance entre les puits, ainsi que le type et la quantité de milieu.
  11. Sélectionnez la zone d’imagerie du puits pour couvrir toutes les cellules d’une micro-île. Choisissez un exemple bien pour ajuster l’autofocus. Basez l’accent initial sur le DAPI.
  12. Calibrer le temps d’acquisition pour chaque canal fluorescent, en fonction de l’intensité de la coloration dans les puits de contrôle. Ajuster les paramètres de sorte que dans les puits de contrôle traités par PFF, on puisse distinguer clairement les cellules dopaminergiques hébergeant des agrégats pS129-αsyn dans les cellules soma permettant une quantification sans ambiguïté des cellules négatives pS129-αsyn et pS129-αsyn.
    REMARQUE : Les puits qui ne contiennent pas de PFF ne devraient pas avoir de coloration pour pS129-αsyn; par conséquent, ces puits peuvent être utilisés comme contrôle négatif pour ajuster l’intensité pS129-αsyn.
  13. Imagez tous les puits sélectionnés avec un objectif 10x simultanément pour tous les canaux avec la coloration d’immunofluorescence avec exactement les mêmes paramètres.
  14. En option, étiqueter les inclusions d’α-synucléine dans un sous-ensemble des puits avec des anticorps spécifiques à l’α-synucléine filamenteuse pour confirmer que les changements dans le nombre d’inclusions pS129-αsyn-positives reflètent la réduction de l’accumulation de protéines plutôt que l’inhibition de la phosphorylation ou de la déphosphorylation de pS129-αsyn.
  15. Répétez l’étape 5.3 remplaçant l’anticorps pS129-αsyn par un anticorps à filament α-synucléine (1:2 000). Image de l’α-synucléine agrégée tachée comme à l’étape 5.13.

6. Analyse d’image à contenu élevé

REMARQUE : Cette étape est effectuée avec le logiciel d’accès libre CellProfiler version 3.15 et CellProfiler Analyst version 2.2.1. 27,32. Toutefois, avec une certaine expérience, les pipelines d’analyse d’image analogues pourraient être mis dans une version différente ou un logiciel similaire. Veuillez consulter la page logicielle pour obtenir une explication détaillée (voir tableau des matériaux).

  1. Téléchargez et installez le logiciel CellProfiler et CellProfiler Analyst.
  2. Ouvrez CellProfiler. Sélectionner le fichier| Importation| Pipeline à partir du fichier et charger l’exemple de pipeline fourni, TH_LB_V1.cpipe fichier (voir les fichiers supplémentaires).
    REMARQUE : L’exemple de pipelines nécessitera des ajustements spécifiques en fonction des propriétés des images acquises et de la plate-forme d’acquisition d’images. Example_Imagespeut être utilisé pour l’essai initial du logiciel.
  3. Chargez les images à analyser en les faisant glisser dans le module Images. Utilisez des options de filtre pour sélectionner uniquement les fichiers image du dossier chargé.
    1. Utilisez le module Métadonnées pour extraire bien, le champ de vision et les informations de canalisation à partir du nom du fichier image. Cliquez sur le symbole de loupe et entrez l’expression régulière pour extraire les informations de plate, de puits, de site d’imagerie et de canal des noms de fichiers.
      REMARQUE : L’expression régulière dépendra de la convention de nommage de fichier du microscope de plaque. En cliquant sur le point d’interrogation à côté de la loupe, vous trouverez des détails sur la syntaxe.
    2. Sous Le module NamesAndTypes, sélectionnez les numéros de canal corrects pour la coloration DAPI, TH et pS129-αsyn(canaux par défaut 1, 2et 3). Dans le module Groupes, sélectionnez «Non».
  4. Utilisez les modules IdentifyPrimaryObjects pour segmenter les neurones dopaminergiques à l’aide de la coloration TH du soma cellulaire.
    REMARQUE : Les valeurs spécifiques nécessiteront une optimisation initiale en fonction de la façon dont les plaques sont tachées et image. Si les plaques ultérieures sont traitées de la même façon, aucun ajustement supplémentaire ou minime n’est nécessaire.
  5. Utilisez le module MeasureObjectIntensity pour obtenir des informations sur l’intensité de fluorescence des canaux TH et DAPI.
  6. Utilisez le module MeasureObjectSizeShape pour mesurer la taille et la forme des caractéristiques des neurones dopaminergiques du segment.
  7. Utilisez le module MeasureTexture pour mesurer les informations de la fonctionnalité de texture à partir du canal TH à partir de neurones dopaminergiques segmentés.
  8. Utilisez le module ExportToDatabase pour enregistrer des mesures dans la base de données.
    1. Fichier de base de données de noms selon le schéma de nommage d’expérience (p. ex., ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db). Sélectionnez Dossier de sortie pour le fichier de base de données. Le fichier de base de données peut être de plusieurs gigaoctets de grande taille et doit être enregistré de préférence dans le dossier parent des fichiers d’image.
  9. Ouvrez CellProfiler Analyst et sélectionnez le fichier V1_THCells.properties créé à l’étape 6.8. Outils ouverts| Classificateur.
  10. Trier les cellules segmentées en deux catégories : positif (c.-à-d. corps cellulaires des neurones dopaminergiques correctement segmentés) et négatif (c.-à-d. artefacts de segmentation et de coloration) Voir figure 2A et 2B.
    1. Définissez le nombre de cellules récupérées à 50 cellules aléatoires et cliquez sur Fetch (cela charge les images des cellules segmentées à l’étape 6.4). Trier au moins 30 cellules dans chaque bac en les faisant glisser vers le compartiment correspondant au bas de la fenêtre. Aller chercher plus de cellules au besoin.
    2. Dans le menu déroulant, sélectionnez Utiliser un boostage rapide avec 50 règles max et cliquez sur Train.
    3. Réglez "Fetch" à 50 cellules positives et appuyez sur Fetch pour obtenir des cellules positives TH selon le classificateur (Figure 2A). Utilisez le résultat obtenu pour évaluer la qualité du classificateur formé.
    4. Répétez les étapes 6.10.1–6.10.3, en ajoutant de nouvelles cellules d’exemple pour la formation du classificateur jusqu’à ce que les résultats soient satisfaisants.
    5. Sélectionnez Avancé| Modifier les règles... et dans une nouvelle fenêtre sélectionnez tout le texte (Ctrl+a) et copiez-le (Ctrl-c) sur le bloc-notes (Ctrl-v). Enregistrer en tant que fichier TH_rules.txt.
      REMARQUE : Selon la densité de la culture neuronale et la qualité de la coloration et de l’imagerie, cette étape peut ne pas être nécessaire, car il pourrait être possible de définir des paramètres à l’étape 6.4 pour segmenter uniquement les cellules positives TH avec une grande précision. Si tel est le cas, une course entière de TH_LB_V1.cpipe n’est pas nécessaire, et les paramètres corrects des modules IdentifyPrimaryObjects doivent être mis directement dans le module correspondant dans TH_LB_V2.cpipe.

Figure 2
Figure 2 : Quantification des neurones dopaminergiques et des neurones dopaminergiques positifs pS129-αsyn avec le logiciel CellProfiler Analyst basé sur l’immunofluorescence DAPI, TH et pS129-αsyn. (A) les cellules TH dans le bac positif ont été sélectionnées en fonction de la coloration DAPI (bleu) marquée d’un petit carré à la première cellule sélectionnée à l’image et la coloration TH environnante (gris) à soma. (B) Des artefacts non cellulaires ont été placés dans le bac négatif. (C) pS129-αsyn positif TH neurones ont été sélectionnés sur la base de la grande inclusion de pS129-αsyn coloration (rouge) marquée d’un petit carré à la première cellule sélectionnée à l’image, entourant les noyaux ou au soma cellulaire. (D) cellules TH sans de telles inclusions pS129-αsyn ont été placées dans le bac négatif. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Ouvrir CellProfiler et sélectionner Fichier| Importation| Pipeline à partir du fichier et de la charge TH_LB_V2.cpipe fichier. Répétez les étapes 6.3–6.7. Cette partie du pipeline doit être identique à TH_LB_V1.cpipe.
  2. Utilisez le module FilterObjects pour passer uniquement de vraies cellules positives TH pour une analyse plus approfondie.
    1. Définissez le mode de filtrage de sélection sur Règles. Dans Règles ou nom de fichier classificateur, sélectionnez le fichier TH_rules.txt créé à l’étape 6.10.5.
    2. Définissez le champ de numéro de classe à 1 si les cellules positives TH ont été triées en bas à gauche.
  3. Utilisez le module MeasureObjectIntensity pour obtenir des informations sur l’intensité de fluorescence du canal pS129-αsyn.
  4. Utilisez le module MeasureTexture pour mesurer les informations de la fonctionnalité de texture à partir du canal TH à partir de cellules filtrées.
  5. Utilisez le module MeasureObjectSizeShape pour mesurer la taille et la forme des entités des cellules filtrées.
  6. Utilisez le module ExportToDatabase pour enregistrer des mesures dans la base de données.
    1. Nommez le fichier de base de données en conséquence avec votre schéma de nommage d’expérience (p. ex., ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db). Sélectionnez dossier de sortie pour le fichier de base de données.
  7. Ouvrez CellProfiler Analyst et sélectionnez fichier V2_THpos.properties.
    1. Trier les cellules segmentées en deux catégories – pS129-αsyn positive et pS129-αsyn cellules négatives (Figure 2C,D).
    2. Définissez le nombre de cellules récupérées sur 50 cellules aléatoires et cliquez sur Fetch (cela charge les images de cellules segmentées à l’étape 4). Trier au moins 30 cellules dans chaque bac en les faisant glisser vers le compartiment correspondant au bas de la fenêtre.
    3. Dans le menu déroulant, sélectionnez Utiliser fast gentle boosting avec 50 règles max ou classificateurs de forêt aléatoire. Cliquez sur Train.
    4. Réglez "Fetch" à 50 cellules positives et appuyez sur Fetch pour obtenir pS129-αsyn cellules positives selon classificateur (Figure 2C). Réglez "Fetch" à 50 cellules négatives et appuyez sur Fetch pour obtenir des cellules négatives pS129-αsyn selon classificateur (Figure 2D). Évaluer la qualité du classificateur formé.
    5. Répétez les étapes 6.17.2–6.17.4, en ajoutant de nouvelles cellules d’exemple pour former le classificateur jusqu’à ce que les résultats soient satisfaisants.
  8. Cliquez sur Score Tout pour obtenir le tableau des résultats résumant le nombre de neurones dopaminergiques positifs et négatifs pS129-αsyn dans chaque puits.

Representative Results

Quelques jours après le placage (DIV1–DIV3), la microscopie à champ lumineux a été faite pour évaluer la santé et la propagation homogène des cellules cultivées, et l’uniformité de ces conditions dans les différents puits (figure 3). Les cellules cultivées de midbrain se sont propagées homogènement dans la micro-île créée avant le placage (Figure 3A,B). Les neurones primaires s’étaient installés sur le sol enduit de façon homogène et établis projections neuronales (Figure 3B). Un petit amas de cellules (diamètre inférieur à 150 μm) a été observé au puits et présenté comme exemple (figure 3C).

Figure 3
Figure 3 : Quelques jours après le placage (p. ex., DIV3), on a observé l’état des cultures primaires de midbrain avec la microscopie de champ lumineux. (A) Les cellules cultivées se propagent au milieu du puits à l’intérieur de la micro-île recouverte de PO avec un rayon approximatif de 4,4 mm (illustré de flèches blanches) créés en grattant po à partir d’un périmètre de puits d’environ 1 mm (illustré avec des flèches noires). (B) Les neurones primaires cultivés se propagent homogènement dans la région et des projections neuronales (marquées avec des pointes de flèche rouges) ont été observées. (C) Un amas de cellules d’un diamètre inférieur à 150 μm est marqué de pointes de flèche bleues. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les cultures primaires de mi-cerveau de souris ont été immunostained avec des anticorps anti-TH et anti-pS129-αsyn et imaged avec un microscope automatisé après 15 jours in vitro. Les micro-îles enduites ont fourni une zone restreinte pour l’attachement des cellules au milieu des puits (Figure 4A,B). Les neurones dopaminergiques immunolégrés avec le marqueur TH ont été répandus autour de la micro-île dans une monocouche, séparés les uns des autres, sans aucune agglutination (figure 4A' et 4B').

Figure 4
Figure 4 : À DIV15, 800 à 1 000 cellules dopaminergiques ont été quantifiées de chaque micro-île, avec ou sans traitement PFF. Images représentatives des cultures embryonnaires de midbrain immonustained avec des anticorps anti-TH et anti-pS129-αsyn. (A, A', A'') Contrôler les cellules sans traitement PFF. (B, B', B'') Cellules traitées par PFF avec inclusions pS129-αsyn. (C) Quantification des nombres de cellules TH-positives dans les puits traités avec véhicule (contrôle), PFFs, ou PFFs avec 50 ng/mL GDNF. (D) Quantification des agrégats pS129-αsyn dans les cellules TH-positives traitées avec le véhicule (contrôle), pffs, ou PFFs avec 50 ng/mL GDNF. La signification statistique a été calculée avec la conception aléatoire de bloc ANOVA. **p < 0,01, n = 4 plaques individuelles (répliques biologiques), chacune avec 3 à 6 puits par groupe de traitement (répétitions techniques). Barres d’échelle = 300 μm pour A, B; 50 μm pour A', B'; 25 μm pour A'', B''. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Bien que les cultures sans traitement PFF n’aient pas eu de signal pS129- αsyn (figure 4A' et 4A''), lescultures traitées avec des PFF α-synucléine ont développé des inclusions positives pS129-αsyn ( figure4B' et 4B''). Le traitement in vitro de PFF pendant 7 jours n’a pas causé de diminution significative du nombre de neurones TH-positifs, comparé à d’autres groupes expérimentaux (figure 4C). Les cultures traitées par PFF avaient une population d’environ 40 % des neurones dopaminergiques positifs à la TH de pS129-αsyn. Le traitement avec un contrôle positif, GDNF, a réduit le pourcentage de neurones dopaminergiques TH-positifs avec pS129-αsyn inclusions positives (Figure 4D, voir aussi les données brutes et les images d’exemple dans les fichiers supplémentaires).

Fichiers supplémentaires : Exemples de pipelines pour l’analyse d’images à contenu élevé avec CellProfiler et les packages logiciels CellAnalyst, les images par exemple et les données brutes pour la figure 4E, F. (1-9) Example_Images. Ouvrez ces images avec ImageJ ou CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Étapes 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Étapes 6.11–6.18) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La propagation de la pathologie de Lewy, dont pS129-αsyn est un constituant majeur, est une caractéristique histopathologique de la MP. Arrêter ou ralentir l’accumulation de pS129-αsyn agrégé peut ralentir la dégénérescence des neurones dopaminergiques et la progression de l’alpha-synucléinopathie. Cependant, une compréhension mécaniste de la façon dont l’agrégation pS129-αsyn contribue à la disparition des neurones dopaminergiques doit encore être établie. Les preuves d’études post mortem humaines sur des échantillons de cerveau de patients à différents stades de la maladie ainsi que l’observation de l’inclusion positive de pS129-αsyn dans les neurones foetaux transplantés suggère fortement la propagation de la pathologie de Lewy entre les cellules16,17,33. Par conséquent, la propagation de pS129-αsyn, semblable à prion, a récemment été récapitulée à l’aide de PFFs α-synucléine9,10. L’établissement d’un modèle robuste, rentable et relativement élevé ou moyen de propagation et d’accumulation de pS129-αsyn, en particulier dans les neurones dopaminergiques, peut considérablement accélérer la recherche de nouveaux traitements et composés modifiant ce processus.

Parce que la perte de neurones dopaminergiques est la principale cause des symptômes moteurs dans la MP et ces cellules possèdent de nombreuses propriétés uniques2,34,35, modélisation de la propagation prion-like de pS129-αsyn dans les neurones dopaminergiques est le type le plus pertinent de modèle du point de vue translationnel. Des protocoles utilisant des cultures micro-insulaires de neurones embryonnaires de midbrain sur 4 plaques de puits et la quantification semi-automatique ont été décrits précédemment18. Le protocole décrit ici a été adapté à 96 plaques de puits et fournit une préparation moins laborieuse des micro-îles, permettant la préparation de jusqu’à quatre plaques contenant 60 puits chacune par un chercheur expérimenté au cours d’une journée de travail. La culture des neurones dopaminergiques dans 96 plaques de puits permet de tester des médicaments à des quantités plus faibles et permet des taux de transduction élevés avec des vecteurs de lentivirus. Il est également possible de combiner différents traitements pour effectuer des expériences plus complexes.

Avant d’appliquer des traitements (y compris les PFF), la qualité de la culture doit être vérifiée avec une microscopie à champ lumineux. Si le système de microscopie n’utilise pas une chambre de CO2 avec chauffage, les cellules ne doivent pas être maintenues à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de deux minutes, parce que les neurones primaires de dopamine de souris sont délicats et facilement stressés. Pour la même raison, il est conseillé que la première imagerie devrait être faite après 24 h d’incubation (entre DIV1-DIV3). Les cellules devraient sembler vivantes avec les corps cellulaires actuels et se propager homogènement à l’intérieur de la micro-île. Les neurones primaires se seraient installés sur le sol enduit de PO et auraient commencé à établir des projections neuronales. Il est possible d’observer un petit amas de cellules (c.-à-d. un diamètre inférieur à 150–200 μm) qui peut être formé si le processus de trituration n’est pas fait correctement ou si la densité de placage est supérieure à celle recommandée. Ces petits amas n’affecteraient pas l’expérience, à moins qu’ils ne soient plus que quelques-uns par puits et/ou plus. Les cellules agglomérées rendent très difficile l’identification des marqueurs immunohistochimiques et des cellules individuelles lors de l’analyse de l’image. Il est essentiel d’éviter de tels amas par un revêtement soigneux, triturating, et le contrôle de la densité de placage. Si l’uniformité de ces conditions ne peut être observée à certains puits, n’incluez pas ces puits défectueux dans l’expérience. Une telle exclusion doit être faite avant l’exécution de tout traitement.

En outre, l’utilisation de 96 plaques de puits permet une utilisation pratique de la pipette multicanal pendant les procédures de coloration et la visualisation directe avec des microscopes automatiques de plaque, augmentant encore le débit. L’utilisation de la quantification automatisée des images est indispensable pour l’analyse des données provenant de plates-formes d’imagerie à forte teneur. En plus de la capacité de traiter des milliers d’images obtenues à partir de chaque expérience, il assure une quantification impartiale et identique de tous les groupes de traitement. Le flux de travail proposé pour l’analyse d’image est basé sur des principes simples de segmentation des neurones dopaminergiques, de filtrage correctement segmenté les cellules par l’apprentissage automatique supervisé, et par la suite la quantification des phénotypes (pS129-αsyn positif et pS129-αsyn négatif), encore une fois par l’apprentissage automatique supervisé. Bien que plusieurs approches différentes pour cette tâche peuvent être envisagées, nous avons trouvé la combinaison de la segmentation avec l’apprentissage automatique pour être le plus robuste pour les cultures de dopamine en raison de la densité de placage élevé, les diverses formes de neurones dopaminergiques, et la présence de neurites fortement tachés. L’algorithme d’analyse d’image proposé a été implémenté dans CellProfiler et CellProfiler Analyst, logiciel d’analyse d’images à haute teneur disponible librement disponible26,27. L’algorithme pourrait également être mis en œuvre avec d’autres logiciels d’analyse d’images, soit open source (par exemple, ImageJ/FIJI, KNIME) ou propriétaire. Cependant, dans notre expérience, ces capacités de personnalisation sacrifient souvent pour faciliter l’utilisation, et donc pourraient ne pas bien fonctionner dans les analyses compliquées. Nous avons constaté que les logiciels CellProfiler et CellProfiler Analyst donnent des résultats particulièrement fiables en combinant un nombre important d’algorithmes mis en œuvre, une flexibilité extrême dans la conception du flux de travail, et en même temps la manipulation et le traitement efficace des données d’imagerie à contenu élevé.

Le protocole décrit pourrait également être adapté pour la quantification d’autres phénotypes cellulaires caractérisés par l’immunostaining avec différents anticorps, tels que les marqueurs d’autres populations neuronales (p. ex., DAT, GAD67, 5-HT, etc.) et les agrégats protéiques (p. ex., phospo-Tau, ubiquitine). Plusieurs marqueurs fluorescents pourraient également être combinés pour distinguer plusieurs phénotypes (p. ex., cellules avec inclusions à différents stades de maturation). La classification automatisée de plusieurs phénotypes devrait également être facile à mettre en œuvre dans les pipelines d’analyse d’images décrits en ajoutant simplement un canal contenant des images immunofluorères de marqueurs supplémentaires pour mesurer les étapes et trier les cellules dans plusieurs bacs. L’utilisation de plusieurs marqueurs en même temps nécessiterait toutefois l’optimisation des conditions d’immunostaining et d’imagerie. En outre, pour une meilleure qualité dans l’imagerie par immunofluorescence, l’utilisation de plaques spéciales à parois noires 96 puits explicitement conçus pour le microscope fluorescent est recommandée. Cependant, ceux-ci peuvent être beaucoup plus chers que les plaques de culture cellulaire standard, qui sont suffisantes pour l’analyse décrite dans notre protocole.

Le type et la qualité des PFF utilisés sont essentiels pour le résultat des expériences. Les PFF peuvent à la fois influer sur la robustesse de l’essai et sur l’interprétation des résultats. Les conditions de préparation peuvent affecter l’efficacité de l’ensemencement des PFF et, en effet, des « souches » PFF ayant des propriétés physiologiques différentes ont été signalées36. Néanmoins, la préparation et la validation des PFF dépassent le champ d’application du présent article et ont été décrites dans plusieurs publications11,28,29,30. En plus du protocole de préparation, il convient d’envisager l’espèce d’origine de l’α-synucléine dans les PFF (p. ex., souris, humain) et l’utilisation de protéines sauvages ou mutées (p. ex., l’A53T α-synucléine humaine) selon les conditions expérimentales particulières. L’induction de l’accumulation de pS129-αsyn par les PFF s’est avérée dépendante de l’âge de la culture (c.-à-d. les jours in vitro), avec des cultures plus matures montrant une induction plus prononcée11. Cela est probablement dû à l’augmentation du nombre de connexions neuronales dans les cultures plus matures, et à l’augmentation des niveaux de protéines d’α-synucléine. Dans nos mains, le traitement avec des PFFs à DIV8 a donné les résultats les plus robustes, avec l’accumulation prononcée de pS129-αsyn dans le soma de neurone de dopamine, tout en ne compromettant pas la survie neuronale. Le protocole décrit est bien adapté aux traitements d’étude modifiant les événements précoces menant à l’agrégation de l’endogène α-synucléine parce que nous quantifions pS129-αsyn inclusions positives à un point de temps relativement précoce, 7 jours après l’inoculation avec les PFF. À ce stade, les inclusions intrasomales sont présentes dans une fraction significative des cellules et peuvent être facilement distinguées par l’immunostaining tandis qu’aucune mort cellulaire induite par PFF n’est observée, simplifiant l’interprétation des résultats. Fait important, comme la morphologie et la composition des inclusions induites par pff peuvent changer au fil du temps12,13, le protocole décrit pourrait, en principe, être modifié pour étudier les inclusions plus matures par fixation et immunostaining à des moments ultérieurs. Cependant, garder les neurones dopaminergiques en culture pendant plus de 15 jours nécessite des soins extrêmes, et pourrait induire des variations supplémentaires en raison de cellules ne parvenant pas à survivre indépendamment de l’inoculation PFF. En outre, les cultures plus étendues compliquent les calendriers de traitement de la toxicomanie. Beaucoup de composés ont la stabilité limitée ou pas mal caractérisée dans le milieu de culture cellulaire, et la reconstitution d’un médicament n’est pas triviale parce que l’échange complet de milieu compromet la survie des cultures de dopamine.

La phosphorylation de l’α-synucléine à Ser129 est constamment rapportée dans les modèles basés sur PFF d’agrégation α-synucléine et colocalise avec des marqueurs de pliage et d’agrégation erronées telles que Thioflavine S, ubiquitine, ou anticorps spécifiques à la conformation11,12. Dans nos mains, l’immunostaining pour pS129-αsyn donne également le signal le plus fort avec le fond le plus bas et est le plus simple à analyser, donnant des résultats robustes lorsque plusieurs traitements sont examinés. Fait important, l’immunostaining avec l’anticorps pS129-αsyn ne détecte pas les PFF qui restent à l’extérieur des cellules, réduisant considérablement l’arrière-plan. Cependant, il est important de se rappeler que la phosphorylation Ser129 est probablement l’un des premiers processus liés à l’erreur de pliage de l’α-synucléine et pourrait être réglementée différemment dans des conditions spécifiques. Par conséquent, tous les résultats qui montrent des effets positifs sur pS129-αsyn devraient être confirmés par d’autres marqueurs.

L’analyse statistique doit être adaptée en conséquence à la conception expérimentale. Il est essentiel d’effectuer des expériences dans au moins trois répliques biologiques indépendantes (c.-à-d. des cultures neuronales primaires distinctes). Ces répliques doivent être plaquées sur différentes plaques et traitées indépendamment. Nous analysons les données obtenues à partir de répliques sur différentes plaques avec la conception aléatoire de bloc ANOVA37 pour prendre en compte l’appariement des données pour différentes plaques expérimentales.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Professeur Kelvin Luk pour son généreux don de PFFs d’α-synucléine, Conjung Zheng pour l’établissement et la culture des cellules neuronales, et l’unité de microscopie légère de l’Institut de biotechnologie de l’Université d’Helsinki, pour l’imagerie des cellules immunostained. Ces travaux ont été soutenus par des subventions de 3i-Regeneration by Business Finland (Finnish Funding Agency for Innovation), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Foundation, et les fonds statutaires de l’Institut maj de pharmacologie, PAS, Pologne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue stain Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 15250061
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188261
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 10236276001
5 M HCl N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
5 M NaOH N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
96-well ViewPlate (Black) PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA 6005182
99.5% Ethanol (EtOH) Altia Oyj, Rajamäki, Finland N/A
AquaSil Siliconizing Fluid Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA TS-42799
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
Bioruptor sonication device Diagenode, Liege, Belgium B01020001
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 14175-053
CellProfiler and CellAnalyst software packages N/A N/A free open-source software
Centrifuge 5702 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 5702000019
CO2 Incubator HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA N/A
Counting chamber BioRad Inc., Hercules, California, USA 1450015
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA 29254706
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) Roche, Basel, Switzerland 22098700
D-glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA G8769
DMEM/F12 Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 21331–020
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A21202
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A31573
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A11015
Dulbecco's buffer N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 10500056
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 11507582
ImageXpress Nano Automated Imaging System Molecular Devices, San Jose, California, USA N/A
L-glutamine Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 25030–032
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German MAB318
N2 supplement Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 17502–048
Normal Horse Serum Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States S-2000
paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 158127
paraformaldehyde powder, 95% Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 158127
pH-Fix, color-fixed indicator strips Macherey-Nagel, Düren, Germany 92110
Phospohate Buffer Saline (PBS) N/A N/A Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
poly-L-ornithine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4957
Primocin InvivoGen, San Diego, California, USA ant-pm-1, ant-pm-2
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament Abcam, Cambridge, United Kingdom ab209538
rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein Abcam, Cambridge, United Kingdom ab51253
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany 3810000
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) N/A N/A Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk
Research Stereomicroscope System Olympus Corporation, Tokyo, Japan SZX10
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German ab1542
TC 20 Automated Cell Counter BioRad Inc., Hercules, California, USA 1450102
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 11332481001
trypsin MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China 2199700

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References

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Neuroscience Numéro 162 neurones dopaminergiques embryonnaires primaires α-synucléine fibrilles préformés corps lewy analyse d’image à haute teneur maladie de Parkinson synucleinopathie
Étude de l’accumulation préforme induite d’α-synucléine par fibrile dans les neurones dopaminergiques de la souris embryonnaire primaire
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Er, S., Hlushchuk, I., Airavaara, M., Chmielarz, P., Domanskyi, A. Studying Pre-formed Fibril Induced α-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61118, doi:10.3791/61118 (2020).

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