Summary
在这里，我们提出了一个详细的协议，研究神经元+-合成素积累在原发性小鼠多巴胺神经元。神经元中的磷酸化β-合成素聚合体通过预制的β-合成素纤维诱导。免疫荧光标记细胞的自动成像和无偏图像分析使这个强大的协议适用于抑制β-合成素积累的药物的中高通量筛选。
Abstract
该协议的目标是建立一个健壮和可重复的模型的β-合成素积累在原发性多巴胺神经元。结合免疫污染和无偏自动图像分析，该模型允许分析药物和基因操作对神经元培养文化中的β-合成素聚集的影响。原发性中脑培养提供了真正的胚胎多巴胺神经元的可靠来源。在该协议中，帕金森病的标志组织病理学，Lewy身体（LB），通过添加α-合成素预形成纤维（PFF）直接到神经元培养基。多巴胺神经元的索马内源性磷酸化β-合成素的积累在PFF添加后7天内通过免疫污染检测。体外细胞培养条件也适合应用和评估防止β-核素积累的治疗方法，如小分子药物和神经营养因子，以及用于遗传操作的扁病毒载体（例如，使用CRISPR/Cas9）。在96个井板中培养神经元可提高实验装置的鲁棒性和功率。实验结束时，用对蛋白甲醛固定，用于免疫细胞化学和荧光显微镜成像。多光谱荧光图像是通过96个孔板的自动显微镜获得的。这些数据是量化的（例如，计算每井含有磷-+-合成素的多巴胺神经元的数量）使用自由软件，为无偏见的高含量表型分析提供了一个平台。PFF诱导的磷酸化β-合成素在原发性多巴胺神经元中积累建模，为研究抗合成素内含物的相互作用和消除的基本机制提供了可靠的工具，并有机会进行高通量药物筛选和细胞表型分析。
Introduction
帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是基斯坦丁格拉（SN）中中脑多巴胺神经元的死亡，随后基底神经中多巴胺音的丧失，以及随后的运动损伤,1，2。PD患者大脑中的主要组织病理学特征是细胞内蛋白质/脂质聚集物，它们存在于神经元母体（LB）或中性粒细胞（LN）中，统称为Lewy病理学3。大脑中的 Lewy 病理学似乎随着 PD 的进步而进展， 类似于通过神经元连接传播致病因子。丰富的Lewy病理学发现在SN的多巴胺神经元和受神经退化4影响的其他区域的细胞。然而，在疾病进展期间，蛋白质聚集的传播和发病并不总是与神经元死亡相关，Lewy病理学对神经元死亡的确切贡献仍不清楚5。
LB和LN已被证明由甲壳体和蛋白质成分3组成。前者是膜碎片，车辆结构（可能是裂索体和自噬体）和线粒体3。后者由至少300种不同的蛋白质组成6。斯皮兰蒂尼等人7的一项标志性研究表明，Lewy病理学的主要蛋白质成分是β-合成素。高度表达在神经元中，并链接到膜融合和神经递质释放，在Lewy病理学中，+-合成素大多以错误折叠的淀粉样纤维形式存在，其中的大部分是磷酸化在Ser129（pS129-μsyn）4，8。4,8
重要的是，它也证明，由于其普里昂样的属性，错误折叠的α-合成素可能有一个因果关系在Lewy病理学形成4。错误折叠的β-合成素的prion样特性与患者的中脑提取物和外源性准备的β-合成素预制纤维（PFF）一起显示，以诱导培养和体内神经元,中的β--双核素聚合体。PFF提供了一个可靠和强大的模型来研究多巴胺神经元中α-四核素病理学的进展。当PFF应用于培养的原发神经元或注射到动物大脑时，它们会导致在中性细胞和细胞酶11中形成含有β-合成素的内含物，这些内含物可以重述在Lewy病理学中看到的许多特征。观察到的内含物在Triton X中不溶，泛泛素，沾染淀粉样色特异性染料硫奥夫拉芬S，并含有Α-合成素高磷化在Ser12911，,12。重要的是，这些内含物不会形成于β-合成素敲除动物11中，这表明它们的形成依赖于内源性β-合成素。
然而，很难直接比较PFF诱导的内含物和Lewy病理学发现在PD患者，因为人类LB和LNs是高度异质的3。Lewy 病理学的观察到的异质性可能是由形成的不同阶段、不同的解剖位置或启动聚合过程的错误折叠的 α-合成素的构象差异引起的。同样的因素可能会影响PFF诱导的pS129-μsyn阳性内含物。事实上，最近已经证明，PFF诱导的pS129-μsyn阳性内含物在原发神经元培养中代表病理学的早期阶段，在长时间的潜伏期12、13,之后，这些阶段可以成熟到与LB相似的结构。
使用 PFF 模拟错误折叠的 α-合成素的早期传播和积累对于药物开发很有价值，因为 Lewy 病理传播被认为是早期疾病标志之一。因此，聚合预防性治疗可能有望在早期阶段停止或减缓PD的进展。几个临床试验旨在减缓或停止+-合成素积累正在进行14。对于后期患者来说，移植多巴胺神经元祖细胞可以是一种更好的治疗选择15。然而，在PD患者大脑16、17的验尸分析中，17在移植的胚胎神经元中记录了Lewy病理学，也表明需要防止β-合成素的积累。
在体外，α-突触素PFF已知诱导聚合在不朽的细胞系，或更常见的，在啮齿动物初级海马或皮质神经元。这两个都不是接近重述多巴胺神经元10。培养这些神经元需要密集电镀一定数量的神经元在体外18。为了用有限的材料（如原发性多巴胺神经元）实现高电镀密度，通常采用微岛培养方法。在微岛培养中，细胞最初被镀在一小滴中（通常是几微升），通过表面张力在18号大井中间保持。神经元连接后，整个井充满介质，而细胞仍然限制在高密度的小电镀区。除了实现高电镀密度外，微岛还防止在井边缘附近电镀，因为水井密度和存活率的变化是频繁的。微型岛屿通常用在相对较大的井或盘子中;然而，在微细胞中建立96井板格式的中脑神经元培养，使得在具有中高通量能力的真实多巴胺神经元中研究Lewy病理学。在这些神经元的体外实验使我们能够发现胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF），它促进成熟的多巴胺神经元在体外和,体内19，20，21，22,20的生存21，也防止在多巴胺神经元23中形成β-合成素聚合体。人类患者诱导的多能干细胞衍生多巴胺神经元构成一个更准确的模型，由于其人类起源和更长的体外生存时间。然而，在人类神经元中诱导β-三核素病理学在几个月之后，与小鼠胚胎神经元的一周和/或具有多个压力源（例如，α-合成素过度表达和PFF的组合）相比，24，,25。此外，与初级胚胎神经元相比，人类多巴胺神经元的维持成本更高、更费力，这基本上限制了它们在高通量应用中的使用。
此外，原发性多巴胺神经元培养物可以进行基因改造（例如，使用CRISPR/Cas9）和/或使用药理剂23进行治疗。它们构成了一个快速和可重复的平台，用于分子通路解剖和药物库筛选等应用。即使可以从这些培养物中获得有限的材料，仍然可以进行小尺寸基因组学/蛋白质组学分析。培养96井格式的原发神经元更适合免疫细胞化学和荧光显微镜技术，其次是高含量表型分析。从96个井板的自动成像中得出的多光谱荧光图像可以转换为定量结果（例如，每个孔包含LB神经元的数量）。这样的分析可以通过自由软件，如细胞产品26，27。,27总体而言，在96个井板中镀的原发性胚胎中脑培养提供了一个强大而高效的平台，用于研究多巴胺神经元和β-核素聚集，并有机会进行高通量表型筛查。
Protocol
所有动物实验都得到芬兰国家动物实验委员会的批准，并按照欧洲关于保护用于科学目的的动物的立法进行。
1. 准备
- 准备多巴胺神经元介质 （DPM） 与 0.46% D-葡萄糖， 1% L-谷氨酰胺， 1% N2， 0.2% 原烟， 完成与 DMEM/F12.混合原料后过滤 DPM。在4°C下储存DPM，每次加热一次。
注：DPM不应含有GDNF，因为它将减少多巴胺神经元23中的β-合成素积累。 - 准备极易疏水的硅化玻璃移液器，从而最大限度地减少对表面的附着和在初始处理胚胎神经元时细胞的丧失。
- 将 10 mL 的硅化液加入 1 L 的蒸馏水中，并在 2 L 容器中搅拌混合。将玻璃移液器浸入硅化溶液中 15 分钟。
- 用蒸馏水冲洗移液器3~5倍。在室温 （RT） 下将移液器干燥过夜，或在 100-120°C 加热无菌空间下干燥 1~2 小时，以加快干燥速度。
- 在密封的高压灭菌袋中通过标准高压灭菌器对移液器进行灭菌。
- 准备聚-L-奥尼辛 （PO） 涂层 96 孔板与透明底部通过添加 60 μL 的 PO 溶液到 96 孔板的中间孔，用于播种神经元，留下至少一行/柱井在板的边缘，以避免边缘影响。将涂层板在 4 °C 或 RT 中保持 4 小时过夜。
- 在电镀细胞之前，将PO完全吸气，用100μL的1xPBS洗涤三次。从油井中吸出 1x PBS，使板盖保持打开，以完全干燥。
注：可以收集用过的 PO 并筛选它以重复使用。对于同一 PO 解决方案，可以重复两次。 - 将 50 μL 的 DPM 添加到以前涂层的油井中。用 100 μL 塑料尖端从油井中吸出 DPM，同时用圆形运动划伤井底，以去除每个孔周边的涂层。一个涂有PO涂层的岛屿将留在井的中间。
- 在层罩下，在每个涂层岛屿的中间加入 10 μL 的 DPM，以创建微型岛屿。
注：在细胞分离期间，具有 DPM 覆盖的微岛板可保存在层流罩下 1~2 小时。
2. 将腹间中脑地板与 E13.5 小鼠胚胎隔离
注：有关中脑地板解剖步骤，请参阅图1。
- 解剖前，用杜尔贝科的缓冲液填充10厘米的培养皿，并放在冰上。
- 根据该机构的指南，对E13.5怀孕雌性小鼠实施安乐死。将鼠标平放在其背部，用70%乙醇喷洒前体。用钳子将皮肤举过子宫，用手术剪刀做切口，露出子宫。
- 小心地取出子宫，并将其放入先前准备的冰上培养皿中。
- 使用 RT 的层罩下手术剪刀，小心地将胚胎从子宫中取出。用钳子去除胚胎上的所有胎盘残留物，并放入装满杜尔贝科缓冲液的新的10厘米培养皿中。
- 使用解剖钳或针头，切断头部的后部，从图1A中标有黑色箭头的地方。从胚胎的其余部分中切开切片（图1B）。
- 将切割件的后部朝向观察者（图1C），轻轻切开从颅骨到颅骨（图1D）。从颅面开口以下 0.5 mm 开始，切割2mm 2 +3 mm2 区域，如图 1E 所示。
- 在空的1.5 mL微离心管中收集腹间中脑地板（参见图 1F）。将微离心管放在冰上，直到所有中脑地板都收集起来。
注：或者，在解剖所有胚胎大脑后，可以使用1 mL微移液器收集中脑地板。
图1：从E13.5小鼠胚胎中脑底解剖。（A） 头部后部的切割位置标有黑色箭头和白色虚线。（B） 该块从胚胎的其余部分取出。移除的零件是圆形的。（C） 这件作品被转了 90 °， 面向观察者的后方。（D） 从黑色箭头打开，从长箭到颅骨（标有白色虚线）。（E） 从开口下方 0.5 mm~1 mm 开始，2 mm2+4 mm2 区域被切割（标有黑线）。（F） 腹间中脑地板被隔离（标有黑色虚线方块）。比例线 = 1 mm. 请单击此处查看此图的较大版本。
3. 以96井板格式从E13.5小鼠胚胎建立原发性胚胎中脑培养
- 从同一1.5 mL管中的所有胚胎收集中脑地板后，取出残留的Dulbecco缓冲液，用500μL的Ca 2+，Mg2+-免费汉克的平衡盐溶液（HBSS）洗涤组织片。
- 取出HPSS，在管中加入500μL的0.5%的三辛。在37°C孵育30分钟。
- 在孵育过程中，在37°C下加热1.5 mL的胎儿牛血清（FBS），将30μL的DNase I加入FBS，并混合。此外，用火抛光硅化玻璃移液器的尖端。确保孔没有锋利的边缘，其尺寸与 1 mL 微管尖端的大小大致相同。
注：作为替代方案，低粘附1 mL微管尖端可用于三角化。然而，硅化玻璃移液器似乎能产生最好的效果。 - 一旦步骤3.2中的孵育结束，将500μL的FBS/DNase混合物加入到部分消化的组织中。使用玻璃移液器在 FBS/trypsin 混合物中三角化组织。三联，直到组织分离成微小的，几乎看不见的颗粒。避免三角化过程中出现气泡。
- 让剩余的颗粒在微离心管底部通过重力沉淀。在不移液底部沉淀物的情况下，将上清液收集到空的 15 mL 锥形聚丙烯管中。
- 使用 1，000 μL 的 HBSS 稀释 FBS/DNase I，以获得 FBS/DNase-I/HBSS （49：1：50）。通过上下移液混合。在微离心管中的剩余颗粒中加入1，000μL的新混合物。再次三位一体，重复步骤 3.5。
- 再次重复上一步以使用所有 FBS/DNase-I/HBSS （49：1：50）。
- 一旦所有上清液被收集到15 mL管内（从步骤3.5、3.7和3.8），使用桌面离心机以100xg向下旋转上清液（±3 mL），5分钟。在不接触g底部的颗粒细胞的情况下，取出上清液。
- 通过将2 mL的DPM加入管中清洗细胞颗粒，并在100 x g 下旋转5分钟。取出上光，重复洗涤2倍，以尽量减少颗粒细胞中的碎屑。
注意： 始终对培养的神经元使用新鲜、温暖的DPM。对于洗涤步骤，DPM 不必新鲜，但应预预热至 37 °C。 - 用新鲜、温暖的DPM稀释细胞，并转移到微离心管中。用于稀释的 DPM 量取决于用于组织解剖的胚胎数量。例如，使用150μL的DPM稀释从10个胚胎获得的细胞。
- 将 DPM 中的 10 μL 细胞转移到微离心管。将它们与 10 μL 的 0.4% Trypan 蓝色污渍混合。使用血细胞计或自动细胞计数器计算活细胞（即 Trypan 蓝色阴性）细胞。
注：使用30，000个细胞每井电镀，每井获得1，000个多巴胺神经元。如果细胞密度高于每 6 μL +30，000 个细胞，则在电镀前用 DPM 进一步稀释细胞，使播种体积不低于 6 μL。 - 在不接触井底的情况下，从步骤 1.6 创建的微岛中卸下 DPM。
- 为了获得每个井的可重复细胞密度，在电镀井之前，通过温和的移液混合细胞。使用 1~10 μL 微管，在每个前微岛的位置将 6 μL 的细胞添加到井的中间。
- 用 150 μL 的水或 1x PBS 填充板边缘的空井，以最大限度地减少含有神经元培养的井的蒸发。在37°C的培养箱中孵育板，5%CO2为21小时。
- 1小时后，从培养箱中取出盘子，将100μL的DPM加入每个带细胞的井中，并放回培养箱中。
- 电镀后两天（体外2天或DIV2），去除25μL，加入75μL的新鲜DPM，使最终介质体积达到150μL，并尽可能避免蒸发。
- 在 DIV5 上用新鲜的 DPM（即去除 75 μL 并添加 75 μL 新鲜 DPM）交换介质的一半。DIV5 后不要执行任何介质更改。
4.通过预造纤维在初级胚胎多巴胺神经元中诱导β-合成素聚合体
在最近出版的11、28、29、30号出版物中，对获取和验证PF,的议定书进行了细致的描述和讨论。使用 PFF 后，清洁层罩或任何可能与 PFF 联系的设备，然后使用 70% 乙醇31。
- 在实验之前，用1x PBS稀释PFF，最终浓度为100μg/mL。在微离心管中用高功率的沐浴声波机对稀释的PFF进行声波化，水浴冷却温度为4°C，循环10次，30秒开/30秒。
注：关键是要正确对纤维进行声波化，以产生长约50纳米的碎片。声波PF的大小可以直接从透射电子显微镜图像的PFF染色的帕特森等人描述30。声波可以实现如上文所述的高功率浴声波器。或者，一个尖端声波器可以使用30。声波PF可以储存在-80°C的小等分，以避免多个冻结/解冻周期。 - 在 DIV8 上，将每井 100 μg/mL 的 3.75 μL 的 PFF 添加到井中的 150 μL 介质中，最终浓度为 2.5 μg/mL。对控制组使用相同数量的 1x PBS。
- 在 1x PBS 中准备 4% 的甲醛 （PFA），并在 -20°C 下存储等量。为此，请按照以下步骤操作。
注：PFA 是有毒的;在准备期间戴上口罩和手套，始终在层罩下工作，并按照机构的指示处理所有固体和液体PFA废物。- 在 1 L 容器中加热 500 mL 的 1x PBS。在容器中放入搅拌棒，将容器放在具有加热功能的磁搅拌器上。调节 40~60 °C 之间的温度，防止沸腾，同时保持溶液温暖。
- 在一次性塑料测量容器中，在发动机罩下测量 20 g PFA 粉末。小心地将 PFA 粉末加入装满 1x PBS 的容器中。开始搅拌溶液。
- 将 200 μL 的 5 M 氢氧化钠加入溶液中，继续搅拌约 15 分钟，直到 PFA 完全溶解。
- 溶液均质化后，加入168微升5M氯化氢，使pH值平衡至+7。使用一次性彩色固定 pH 指示灯条检查 pH 值。
- 将容器从加热器上拆下，让其冷却至 RT. 过滤溶液，并在 -20°C 下储存。使用前在 RT 解冻等分，之后不要重新冻结。
- 在 DIV15 上，通过移液从井中去除所有介质。在每个井中加入 50 μL 的 4% PFA，以固定细胞并在 RT 中孵育 20 分钟。孵育后，从井中去除PFA，并将100μL的1xPBS添加到每口井中，以清洗细胞。取出 1x PBS，然后清洗 2 倍更多。
- 在每个井中保留 100 μL 的 1x PBS，以避免干燥。将板储存在4°C，直到进行免疫化学。
5. 96井板原胚胎多巴胺神经元的免疫荧光染色和自动成像
- 每孔PBS （PBST） 中加入 100 μL 的 0.2% Triton X-100，并在 RT 中孵育 15 分钟，从而去除 1x PBS 并渗透细胞。
- 去除PBST，将50μL的5%正常马血清（NHS）添加到PBST中。要阻止非特异性抗原活性，在RT孵育1小时。
- 在PBST的5%NHS中稀释对TH和pS129-μsyn（1：2，000）的原抗体。将50μL稀释的抗体加入到每井中，并在4°C下孵育。
- 去除抗体，将100μL的1x PBS添加到每井中清洗细胞。取出 1x PBS 并重复清洗 2x。
- 为了防止荧光分子的漂白，在最小光条件下开始工作。稀释PBST中的二级荧光标记抗体（1：400）。将50μL稀释的抗体加入到每井中，并在RT下孵育1小时。
- 去除抗体溶液，将100μL的1x PBS添加到每井中清洗细胞。取出 1x PBS 并重复清洗 2x。
- 去除1x PBS，每井添加50μL的200纳克/mL 4'，6-二米多-2-苯酚（DAPI），染色培养细胞的核，并在RT孵育10分钟。
- 用 100 μL 的 1x PBS 清洗细胞 3 倍，每次 5 分钟。上次洗涤后，每井中保持 100 μL 的 1x PBS。用铝箔盖住板，并将其存放在4°C，直到成像。
- 在96井视盘中成像原发性胚胎多巴胺神经元，其含量高， 板扫描器（见材料表），具有10倍目标。
- 根据 96 孔板的规格调整设置，如板材类型、制造商、尺寸、井之间的距离以及介质的类型和数量。
- 选择井的成像区域以覆盖微岛中的所有细胞。选择一个示例来调整自动对焦。将初始焦点基于 DAPI。
- 根据控制井中染色的强度，校准每个荧光通道的采集时间。调整参数，使在PFF处理的控制井中，可以清楚地区分含有pS129-μsyn聚合物的多巴胺细胞，从而明确定量pS129-μsyn阳性和pS129-μsyn阴性细胞。
注：不含PFF的井不应对pS129-μsyn有任何染色;因此，这些孔可用作负控制，用于调整pS129-μsyn强度。 - 同时以 10 倍目标成像所有选定的孔，所有通道的免疫荧光染色参数完全相同。
- 可选地，将α-合成素内含物标记在孔的子集中，其抗体具有丝带+-合成素特异性，以确认pS129-μsyn阳性内含物数量的变化反映了蛋白质积累减少，而不是抑制磷酸化或pS129-μsyn脱磷化。
- 重复步骤5.3用β-合成丝抗体（1：2，000）代替pS129-μsyn抗体。如步骤 5.13 所示，将染色聚合的 + - 合成素成像。
6. 高含量图像分析
注意：此步骤使用开放访问软件 CellProfiler 版本 3.15 和 CellProfiler 分析师版本 2.2.1 执行。27，32.但是，根据某些经验，可以在不同的版本或类似的软件中设置类似的图像分析管道。有关详细说明，请参阅软件页面（参见 材料表）。
- 下载并安装 CellProfiler 和 CellProfiler 分析师软件。
- 打开细胞保护器。选择 文件|选择文件|选择文件|选择文件导入|导入|导入|导入|管道从文件和 加载提供的示例管道 ，TH_LB_V1.cpipe 文件（请参阅 补充文件）。
注：示例管道将需要根据获取的图像和图像采集平台的属性进行特定调整。 Example_Images可用于软件的初始试用。 - 通过将图像拖动到"图像"模块中加载要 分析的图像。使用筛选器选项仅从加载的文件夹中选择图像文件。
- 使用 元数据模块 从图像文件名中提取井、视野和通道信息。单击放大镜 符号并输入 正则表达式，从文件名中提取板、井、成像站点和通道信息。
注：正则表达式将取决于板显微镜的文件命名约定。单击 放大 镜 旁边的问号 将提供语法的详细信息。 - 在NamesandType 模块下，为 DAPI、TH 和 pS129-μsyn 染色（默认通道1、2和 3）选择正确的通道号。在"组"模块中，选择"否"。
- 使用 元数据模块 从图像文件名中提取井、视野和通道信息。单击放大镜 符号并输入 正则表达式，从文件名中提取板、井、成像站点和通道信息。
- 使用 识别主要对象模块，使用 细胞索马的 TH 染色对多巴胺神经元进行分割。
注：特定值需要根据板的染色和图像进行初始优化。如果后续板处理类似，则不需要或进行最少的进一步调整。 - 使用测量对象强度模块从TH 和 DAPI 通道获取荧光强度信息。
- 使用 测量对象大小形状模块测量 段多巴胺神经元的大小和形状特征。
- 使用 测量纹理模块测量 来自分段多巴胺神经元的 TH 通道的纹理特征信息。
- 使用 ExportToDatabase 模块 将测量值保存到数据库中。
- 根据实验命名架构命名数据库文件（例如，ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db）。为 数据库文件 选择输出文件夹。数据库文件可以大几千字节，最好保存在图像文件的父文件夹中。
- 打开 CellProfiler Analyst 并选择 在V1_THCells 6.8 中创建的"第一个属性文件"。打开 工具|打开工具|打开工具|打开工具分类器。
- 将分段细胞分为两类：阳性（即正确分割的多巴胺神经元细胞体）和阴性（即分段和染色伪影）参见图2A和2B。
- 将提取的单元格数设置为 50 个随机单元格 ，然后单击 "提取 "（这将加载步骤 6.4 中分段的单元格的图像）。通过将每个 bin 拖动到窗口 底部的相应 bin，对每个 bin 中的至少 30 个单元格进行排序。必要时获取更多单元格。
- 在下拉菜单中选择使用快速温和提升与50最大规则，然后单击火车。
- 将"提取"设置为50 个阳性细胞，然后按"提取"键根据分类器按"提取"获取 TH 阳性细胞（图2A）。使用获得的结果评估训练有素的分类器的质量。
- 重复步骤 6.10.1=6.10.3，添加新的示例单元以训练分类器，直到结果令人满意。
- 选择 "高级"|编辑规则... 并在新窗口中选择 所有文本 （Ctrl\a） 并将其 （Ctrl-c） 复制到 记事本 （Ctrl-v） 。保存 为 TH_rules.txt 文件。
注：根据神经元培养的密度和染色和成像的质量，此步骤可能没有必要，因为有可能在步骤 6.4 中设置参数，以仅对高精度 TH 阳性细胞进行分段。如果是这种情况， 则不需要整个 TH_LB_V1.cpipe 运行， 并且应直接将 identifyPrimaryObjects 模块的正确参数放入 TH_LB_V2.cpipe 中的相应模块中。
图2：使用基于DAPI、TH和pS129-μsyn免疫荧光的细胞普罗菲勒分析软件对多巴胺神经元和pS129-μsyn阳性多巴胺神经元进行定量。（A） 根据DAPI染色（蓝色）选择正条箱中的TH细胞，在图像中选择的第一个单元格上标有小方块，在索马选择周围的TH染色（灰色）。（B） 非细胞伪影被放置在负箱中。（C） pS129-μsyn阳性TH神经元的选定依据是pS129-μsyn染色（红色），在图像选择的第一个细胞上，围绕核或细胞索玛时标有小方块。（D） 没有这种pS129-μsyn内含物的TH细胞被放置在负箱中。比例线 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
- 打开单元格建议器并选择文件|导入|导入|导入|导入|从文件和加载.TH_LB_V2的管道。重复步骤 6.3=6.7。管道的这一部分应与TH_LB_V1. cpipe 相同。
- 使用 "滤波对象"模块仅 传递真正的 TH 阳性细胞，以进行进一步分析。
- 将选择筛选模式设置为"规则"。在规则或分类器文件名中，选择TH_rules 6.10.5中创建的 TH_rules.txt 文件。
- 如果 将 TH 正 单元格排序到左 下角窗口，将"类编号"字段设置为 1。
- 使用 测量对象强度模块从 pS129-μsyn 通道获取荧光强度信息。
- 使用 测量纹理模块测量 来自过滤单元格的 TH 通道的纹理要素信息。
- 使用 测量对象大小形状模块测量 筛选单元格的大小和形状特征。
- 使用 ExportToDatabase 模块 将测量值保存到数据库中。
- 与实验命名架构（例如，ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db）相应地命名数据库文件。为数据库文件选择输出文件夹。
- 打开 CellProfiler 分析师并选择 V2_THpos.属性 文件。
- 将分段细胞分为两类 [ pS129-μsyn 阳性和 pS129-μsyn 阴性细胞 （图 2C，D）.
- 将提取的单元格数设置为 50 个随机单元格 ，然后单击 "提取 "（这加载步骤 4 中分段的单元格的图像）。通过将每个 bin 拖动到窗口 底部的相应 bin，对每个 bin 中的至少 30 个单元格进行排序。
- 在下拉菜单中，选择使用具有 50 个最大规则的快速温和提升或随机林分类器。单击火车。
- 将"提取"设置为 50 个阳性细胞，然后按"提取"键根据分类器按"提取"以获取 pS129-μsyn 阳性细胞（图 2C）。将"提取"设置为 50 个负细胞，然后按 Fetch 根据分类器（图2D）获取 pS129-μsyn 阴性细胞。评估训练有素的分类器的质量。
- 重复步骤 6.17.2=6.17.4，添加新的示例单元格来训练分类器，直到结果令人满意。
- 单击 "全部 评分"可获取结果表，汇总每个井中 pS129-μsyn 阳性和负多巴胺神经元的数量。
Representative Results
电镀（DIV1~DIV3）几天后，对培养细胞的健康和同质分布进行光场显微镜评估，并在单个孔中评估这些条件的均匀性（图3）。培养的中脑细胞在电镀前创建的微岛内均匀分布（图3A，B）。B原生神经元均匀地在涂层地面上定居，并建立了神经元投影（图3B）。在井中观察到一小团细胞（直径小于150μm），并举例（图3C）。
图3：电镀几天后（例如，DIV3），通过亮场 显微镜观察初级中脑培养条件。（A） 培养的细胞分布在PO涂层微岛内的井中间，其半径约为4.4毫米（用白色箭头显示），通过从大约1毫米的井周长中抓刮PO（用黑色箭头显示）。（B） 培养的原神经元在该区域内均匀传播，并观察到神经元投影（标有红色箭头）。（C） 直径小于 150 μm 的细胞团用蓝色箭头标记。比例线 = 100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
原发性小鼠中脑培养物在体外15天后用抗TH和抗pS129-μsyn抗体进行免疫处理，并在自动显微镜下成像。涂层微岛为孔中间的细胞附着提供了限制区域（图4A，B）。B多巴胺神经元免疫标记与TH标记分布在一个单层微岛周围，彼此分离，没有任何块块（图4A'和4B'）。
图4：在DIV15，从每个微岛对800-1，000个多巴胺细胞进行量化，有无PFF治疗。 胚胎中脑培养物的代表性图像与抗TH和抗pS129-μsyn抗体结合。（A ， A '， A ''）无需 PFF 治疗的控制细胞。（B ， B '， B '）PFF 处理的细胞与 pS129-μsyn 内含物。（C） 使用车辆（控制）、PFF 或 PPF 处理的 50 ng/mL GDNF 的井中 TH 阳性细胞数的定量。（D） 使用车辆（控制）、PFF或PFF处理，用50纳克/mL GDNF治疗的TH阳性细胞中的pS129-μsyn聚合的定量。统计显著性是用随机块设计 ANOVA 计算的。**p < 0.01， n = 4 个单独的板 （生物复制）， 每个治疗组有 3×6 孔 （技术重复）。比例线 = 300 μm 表示 A ，B;50 μm 表示 A'， B';25 μm 表示 A'， B'。 请单击此处查看此图的较大版本。
虽然没有PFF治疗的培养物没有任何pS129-+syn信号（图4A'’和4A'），但使用α-合成素PFF治疗的培养物会开发pS129-μs-yn阳性内含物（图4B'’和4B'）。与其他实验组相比，7天的体外PFF治疗没有导致TH阳性神经元数量显著减少（图4C）。PFF 治疗培养物的 pS129-μyn 阳性 TH 阳性多巴胺神经元的种群数量为 +40%。使用阳性控制治疗，GDNF，降低与pS129-μsyn阳性内含物的TH阳性多巴胺神经元的百分比（图4D，另见补充文件中的原始数据和示例图像）。
补充文件： 使用 CellProfiler 和 CellAnalyst 软件包、示例图像以及图 4EF 的原始数据进行高内容图像分析 的示例管道。（1-9） Example_Images。使用 ImageJ 或 CellProfiler 打开这些图像。（10） Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs.（11） TH_LB_V1.cpipe （步骤 6.2–6.8）， （12） TH_LB_V2.cpipe （步骤 6.11~6.18）请点击这里下载此文件。
Discussion
传播 Lewy 病理学， 其中 pS129 -μsyn 是主要成分， 是 PD 的一个组织病理学标志。 停止或减缓聚合 pS129-μsyn 的积累可能会减缓多巴胺神经元的退化和α-细胞核素病变的进展。然而，对于pS129-μsyn聚合如何导致多巴胺神经元的消亡，仍必须建立机械学的理解。人类验尸研究来自疾病不同阶段患者的大脑样本的证据，以及观察pS129-μsyn在移植胎儿神经元中的阳性内，强烈表明Lewy病理学在细胞16、17、33,17之间传播。因此，pS129-μsyn的pion样传播最近被使用α-合成素PFF 9，,10 重新概括。建立一个稳健的，经济有效的，相对较高的，或中等的pS129-μsyn传播和积累模型，特别是在多巴胺神经元，可以大大加快寻找新的治疗和化合物的搜索，改变这个过程。
由于多巴胺神经元的丧失是PD中运动症状的主要原因，这些细胞,具有许多独特的特性2、34、35，,34从转化的角度来看，多巴胺神经元pS129-μsyn的pS129-μsyn的普里昂样传播的建模是最相关的模型类型。35在4个井板和半自动定量上利用胚胎中脑神经元的微岛培养的协议已经描述了前18条。此处描述的协议适用于 96 个井板，对微岛进行较少的制备，允许经验丰富的研究人员在一个工作日内制备多达四个包含 60 口井的板块。在96个井板中培养多巴胺神经元，可以以较低的量测试药物，并且能够使用扁病毒载体实现高转导率。也可以结合不同的治疗方法来进行更复杂的实验。
在应用任何治疗（包括PFF）之前，应用亮场显微镜检查培养质量。如果显微镜系统没有利用带暖气的 CO2 室，则不应将细胞保存在培养箱外超过几分钟，因为原发性小鼠多巴胺神经元很细腻，很容易受到压力。出于同样的原因，建议在24小时孵育后（在DIV1-DIV3之间）进行第一次成像。细胞应该看起来与现在的细胞体和同质地分布在微岛内。原发神经元会定居在PO涂层的地面上，并开始建立神经元投影。如果三聚工艺处理不当或电镀密度高于建议，可以观察到小团块（即直径小于 150–200 μm）。这些小团块不会影响实验，除非它们超过几个井和/或更大。在图像分析过程中，块块细胞很难识别免疫组织化学标记物和单个细胞。通过仔细的涂层、三角化和控制电镀密度来避免此类团块至关重要。如果在某些油井中无法观察到这些条件的均匀性，则实验中不要包括这些有缺陷的油井。这种排除应在执行任何治疗之前进行。
此外，96 孔板的利用允许在染色过程中方便多通道移液器使用，并使用自动板显微镜直接可视化，从而进一步提高了吞吐量。利用自动图像量化对于高含量成像平台的数据分析是必不可少的。除了能够处理从每个实验中获得的数千张图像外，它还确保所有治疗组得到无偏、相同的定量。为图像分析提出的工作流程基于简单的原则，即分段多巴胺神经元，通过监督机器学习过滤正确分割细胞，随后通过监督机器学习对表型进行定量（pS129-μsyn阳性和pS129-μsyn阴性）。虽然可以设想几种不同的方法，但我们发现，由于高电镀密度、多巴胺神经元形状不同以及强染色的中性粒细胞的存在，分割与机器学习的结合对多巴胺培养最可靠。提出了图像分析算法，在 CellProfiler 和 CellProfiler 分析师中实现了开源、免费提供的高内容图像分析软件26、27。,27该算法也可以与其他图像分析软件（如图像J/FIJI、KNIME）或专有软件一起实现。但是，根据我们的经验，这些通常会牺牲自定义功能以方便使用，因此在复杂的分析中可能无法很好地执行。我们发现，CellProfiler 和 CellProfiler Analyst 软件包结合了大量已实现的算法、在设计工作流方面极其灵活，同时处理和高效处理高内容成像数据，因此结果特别可靠。
所述协议还可以用于定量其他细胞表型，其特征是免疫具有不同抗体，如其他神经元种群（如DAT、GAD67、5-HT等）的标记物和蛋白质聚合体（如磷蛋白、泛素）。多个荧光标记也可以组合，以区分多个表型（例如，在成熟的不同阶段的内含细胞）。在描述的图像分析管道中，只需将包含其他标记的免疫荧光图像的通道添加到测量步骤中，然后将细胞分拣到多个条柱中，也很容易实现多个表型的自动分类。然而，同时使用多个标记需要优化免疫污染和成像条件。此外，为了提高免疫荧光成像的质量，建议使用专为荧光显微镜设计的专用黑壁96孔板。但是，这些电池培养板的成本可能比标准细胞培养板要贵得多，这足以用于我们协议中描述的分析。
利用的PFF的类型和质量对实验结果至关重要。PFF 可以影响测定的稳健性和结果的解释。制备条件可能会影响PFF的播种效率，事实上，PFF"应变"具有不同的生理特性已经报告36。尽管如此，PFF的编制和验证超出了,本文的范围，并在11、28、29、30,28,29号出版物中都有说明。除了制备协议外，还应考虑PFF中α-合成素的原产地（如小鼠、人类）和野生蛋白质或突变蛋白（如人类 A53T β-合成素）的使用，具体取决于特定的实验条件。PFF对pS129-μsyn积累的诱导证明取决于培养者的年龄（即体外天），更成熟的培养物表现出更明显的诱导11。这可能是由于更成熟培养物中神经元连接数量的增加，以及β-合成素蛋白水平的增加。在我们手中，在DIV8的PFF治疗给出了最有力的结果，在多巴胺神经元索马中pS129-μsyn的显著积累，同时不影响神经元生存。所述协议非常适合研究治疗改变早期事件导致内源性+ 合成素聚集，因为我们量化 pS129-μsyn 阳性内含物在相对早期的时间点，接种后 7 天与 PFF。此时点，体内内内内含物存在于相当一部分细胞中，在未观察到 PFF 诱导细胞死亡时，可以通过免疫抑制轻松区分，从而简化了对结果的解释。重要的是，由于PFF诱导内含物的形态和组成会随着时间12、13的变化而变化，所述协议原则上可以修改，以便以后通过固定和免疫污染来研究更成熟的内含物。然而，在培养物中保持多巴胺神经元超过15天需要极度小心，并且由于细胞无法从PFF接种中独立生存而引起额外的变异。此外，更多的扩展文化使药物治疗计划复杂化。许多化合物在细胞培养基中具有有限或不差的稳定性，而补充药物并非易事，因为完全交换药物会损害多巴胺培养物的生存。
在基于PFF的α-合成素聚合模型中，一致报告了α-合成素聚集的α-合成素的磷酸化，并用错折叠和聚合标记（如硫黄素S、泛素或符合性特异性抗体11、12,12）进行同化。在我们的手中，pS129-μsyn 的免疫保持也提供了最强信号，背景最低，分析最直接，在筛选多种治疗时提供可靠的结果。重要的是，使用pS129-μsyn抗体进行免疫抑制不会检测留在细胞外的PFF，显著减少背景。然而，重要的是要记住，Ser129磷酸化可能是最早与α-合成素的误折叠相关的过程之一，在特定条件下可能有不同的调控。因此，任何显示对pS129-μsyn有积极影响的发现都应得到其他标记的确认。
统计分析应根据实验设计进行相应的调整。在至少三个独立的生物复制（即独立的原神经元培养物）中进行实验至关重要。这些复制应镀在不同的板上，并独立处理。我们分析从随机块设计 ANOVA37 不同板的复制中获得的数据，以考虑不同实验板的数据配对。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Kelvin Luk教授慷慨赠送的α-合成素PFF，郑康琼为建立和培养神经元细胞，以及赫尔辛基大学生物技术研究所的光显微镜组，用于成像免疫污染细胞。这项工作得到了芬兰商业机构（芬兰创新资助机构）、芬兰科学院、#309489、#293392#319195;西格丽德·朱塞柳斯基金会，以及波兰PAS马吉药理学研究所的法定基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
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