Summary
여기에 설명된 담배 연기 추출물이 폐 상피 세포의 세균 성 식민지화에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 프로토콜이 있습니다.
Abstract
담배 흡연은 폐 기종및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 주요 병인원인입니다. 담배 흡연은 또한 호흡기내 세균 감염에 대한 감수성을 촉진합니다. 그러나, 인간의 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기가 나는 의 효력은 아직 철저히 공부되지 않았습니다. 여기에 설명된 담배 흡연 추출물(CSE), CSE를 함유한 인간 폐 상피 세포의 치료, 세균 감염 및 감염 결정의 준비를 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. CSE는 종래의 방법으로 제조하였다. 폐 상피 세포는 CSE 처리된 세포가 3h. CSE 처리된 세포에 대해 4% CSE로 처리된 다음, 10의 감염(MOI)의 복합성에서 슈도모나스로 감염되었다. 세포의 세균적 하중은 세 가지 다른 방법에 의해 결정되었다. 결과는 CSE가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 부하를 증가했다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이 프로토콜은 폐 상피 세포의 세균 감염에 대한 담배 연기의 영향을 연구하기 위한 간단하고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.
Introduction
담배 흡연은 전 세계 수백만 명의 공중 보건에 영향을 미칩니다. 폐암및 만성폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 많은 해로운 질환은 담배 흡연1,2와2관련이 있는 것으로 보고된다. 담배 흡연은 호흡기33, 4,4,5에서급성 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킨다. 더욱이, 장착 증거는 담배 흡연이 많은 만성 질환의 발병을 향상시킨다는 것을 증명6,,7,,8. 예를 들어, 담배 흡연은 COPD 악화를 일으키는 바이러스성 또는 세균성 감염을 증가시킬 수 있습니다9. 에인디컬쳐가 COPD의 급성 악화에 에 기여하는 세균성 병원체 들 중, 기회성 그람 음성 혈관 병원균, 슈도모나스 아루기노사,가난한 예후 및 더 높은 사망과 상관 관계가 있는 감염을 일으킨다10,,11. COPD 악화는 병리학적 진행을 가속화하여 질병을 악화시다. 항증상 관리를 제외하고는 COPD 악화에 대한 효과적인 치료법이없다(12). COPD 악화는 환자 사망률을 촉진하고 삶의 질을 감소시키고 사회13에대한 경제적 부담을 증가시킵니다.
호흡기기도는 개방된 시스템으로, 지속적으로 외부적으로 존재하는 다양한 미생물 병원균을 받는다. 기회성 세균성 병원균은 일반적으로 상부 기도에서 검출되지만 때로는 하부기도(14,,15)에서관찰된다. 동물 모델P. aeruginosa감염 후 1h로 즉시 폐포 낭에서 검출될 수 있다16. 주요 방어 메커니즘으로, 대식세포 또는 호중구와 같은 면역 세포는 기도에 있는 박테리아를 제거합니다. 폐 상피 세포는 첫 번째 생리 장벽으로서 미생물 감염에 대한 숙주 방어에서 독특한 역할을 수행합니다. 폐 상피 세포는 면역세포(17)와무관한 미생물 침입, 식민지 화 또는 복제를 조절할 수 있다. PPARg를 포함한 상피 세포에서 발견되는 일부 분자는 항균 기능을 발휘하여 폐 상피세포(18)에서세균 성 식민지화 및 복제를 조절한다. 담배 흡연은 분자를 변경하고 폐 상피 세포(19,,20)에서정상적인 방어 기능을 손상시킬 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 로봇 흡연장치(21,,22)를사용하여 폐 상피 세포에 담배 연기가 직접 노출되었다고 보고하였다. 연기에 노출은 CSE의 적용을 포함하여 다른 방법으로 수행될 수 있습니다. CSE의 준비는 담배 연기에 간접적으로 드러나는 혈관 내피 세포를 포함하여 그밖 세포 모형에 있는 잠재적인 응용을 가진 재현가능한 접근입니다.
이 보고서는 폐 상피 세포에 있는 세균성 부하를 바꾸기 위하여 담배 연기 추출물을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. CSE는 P. aeruginosa의세균성 부하를 증가시키고, 일반적으로 COPD 악화에서 볼 수있는 세균 감염의 재발에 기여할 수 있습니다. 종래의 방법은 CSE의 제조를 위해 사용된다. 폐 상피 세포는 기하급수적인 성장 단계에서 3 시간 동안 4 % CSE로 치료됩니다. 대안적으로, 단층 배양폐 상피 세포는 공기 액체 인터페이스에서 담배 연기에 직접 노출될 수 있다. CSE 처리된 세포는 그 때 10의 감염 (MOI)의 복합성에 슈도모나스와 도전됩니다. 박테리아는 그들의 전체 침략적인 용량을 유지하기 위하여 그들의 flagella의 형태가 그대로 남아 있는지 확인하기 위하여 특정 동요 속도로 전파됩니다. 겐타마이신은 배양 배지에 남아 있는 박테리아를 죽이기 위해 사용되며, 이에 따라 세균 부하의 후속 결정 시 잠재적 오염을 감소시킵니다. 이 프로토콜은 또한 다른 모델에서 슈도모나스 감염을 연구하는 강력한 도구로 활용된 GFP 라벨 슈도모나스(Pseudomonas)를사용합니다. Pseudomonas 대표적인 균주는 P. 형광의미굴라(23)이다. Migula23 CSE 치료 후 감염 또는 세균 부하의 정도는 콜로니 카운팅을 이용한 드롭 플레이트 방법, 슈도모나스 16S rRNA 특이프라이머를 이용한 정량적 PCR 또는 형광 슈도모나스에감염된 세포종계의 유동 세포측정등 세 가지 방법으로 결정된다. 이 프로토콜은 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기의 효력을 연구하기 위하여 간단하고 재현가능한 접근입니다.
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Protocol
1. 100% CSE 준비
- 60 mL 주사기로 혈청 없는 세포 배양 매체(BEAS-2B 세포를 위한 DMEM/F12; HSAEC 세포를 위한 기도 상피 세포 기저 배지)를 10mL로 그립니다.
- 적절하게 다듬어진 1mL 파이펫 팁을 주사기노즐에 전자담배(3R4F)를 고정시키는 어댑터로 부착합니다.
- 담배의 필터를 제거합니다. 팁 어댑터에 담배를 부착하고 담배를 연소.
- 40mL의 연기가 함유된 공기를 10mL의 혈청 프리 미디어에 그립니다. 격렬하게 흔들어 서 중간과 연기를 혼합 (30 무승부 당).
- 담배가 완전히 소진 될 때까지 ~ 7 분 에서 약 11x에 대해 1.4 단계를 반복하십시오.
- 0.22 μm 필터로 훈제 매체의 10mL를 필터링하여 미생물및 용해성 입자를 제외합니다. 폐쇄된 멸균 튜브로 옮김합니다. 후속 분석 전에 30분 이상 100% CSE를 준비합니다.
2. 슈도모나스 문화
- 37°C에서 야간 배양을 위한 트립틱 콩 육수(TSB) 한농어판으로 냉동 P. aeruginosa(균주 PAO143) 또는 P. 형광미굴라(균주 PAO143)를 접종하였다.
참고 : 배양에 대한 충분한 박테리아를 얻으려면 가능한 한 TSB 한천 접시에 많은 박테리아를 퍼 뜨리세요. - 세균 얼룩을 수집하고 탄소 공급원으로 글리세롤의 5 %와 TSB의 20 mL에서 배양.
- 1h에 대해 200 rpm에서 37°C 인큐베이터에서 세균 현탁액을 흔들어 OD600 값 = 0.6까지 흔들어주세요.
주의: 흔들림 속도가 200rpm을 초과하지 않도록 하십시오. 더 높은 흔들림 속도는 세균 성 기색의 형태를 손상시키고 폐 상피에 세균 성 침략에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, 매우 침습성 박테리아를 얻기 위해 1 h로 흔들림 시간을 제한합니다. OD600 값을 측정하여 박테리아 수를 추정합니다. OD600 = 1은 ~109 콜로니 성형 유닛(CFU)/mL에 해당합니다.
3. 인간 폐 상피 세포 배양 및 CSE 치료
- 히테스 배지에서 인간 BEAS-2B 세포 배양 (DMEM/F12의 500mL, 2.5 mg 인슐린, 2.5 mg 트랜스퍼린, 2.5 mg 의 나트륨 셀레니트, 2.5 mg 이송린, 10 μM 하이드로코르티손, 10 μM β-estradiol, 10 mMHE, 2 mM L-글루타민)으로 보충된10%태아 소 세루(FBS)가 이전에 설명되었다.
- 기도 상피 세포 배양 배지(500mL의 기도 세포 기저배지, 500 μg/mL HSA) 에서 인간 1차 소형기도 상피 세포(HSAEC)를 배양하고, 0.6 μM 리놀레산, 0.6 μg/mL 레시틴, 6mM L-글루타민, 0.4% 추출물 P, 1.0 μM 에피네프린, 5 μg/mL 트랜스퍼린, 10nM T3, 1 μg/mL 하이드로코르티손, Rh EGF 5 ng/mL, 및 5g ll.인슐린 세포를 37°C에서 5% CO2로배양한다.
- 세포가 플레이트 의 바닥에서 완전히 분리 될 때까지 5 분 동안 0.25 % 트립신의 1 mL로 세포를 분리합니다.
- 트립신을 중화하고 15 mL 튜브에서 세포를 수집하기 위해 완전한 HITES 매체10 mL을 추가하십시오. 300 x g에서 4 °C에서 원심 분리기는 5 분 동안.
주의: 과다소화가 세포 사망을 일으킬 수 있기 때문에 현미경 검사법에 의한 트립신 소화 시간을 주의 깊게 모니터링합니다. - 10% FBS로 치테스 배지의 2mL에서 수퍼를 버리고 세포를 다시 중단한다.
- 상기 셀 서스펜션의 파이펫 10 μL을 플레이트에 삽입하여 자동 셀 카운터에 삽입하여 세포/mL의 농도를 얻습니다.
- 플레이트 BEAS-2B 세포는 3× 105 세포/mL의 농도에서 HITES 배지에서 총 2mL의 총 부피로 6개의 웰 플레이트로 하룻밤 배양을 위한 FBS의 10%를 보충하였다.
- 셀을 약 80% 인플루엔티지 또는 5 x 105 세포/mL로 치료하고, 3h의 경우 4%의 CSE를 갖는다. CSE 치료 전에, FBS의 1%로 HITES 매체로 배지를 변경합니다.
4. 세균 감염
- P. aeruginosa 또는 P. 플루오레스향 미굴라 (~1 × 107 CFU/mL)를 CSE 처리 된 세포의 각 우물에 추가하고 5 % CO2에서37 °C에서 1 시간 동안 배양한다.
- 수퍼나티를 흡인하고 신선한 HITES 배지 2mL로 교체하여 4% CSE 및 100 μg/mL 젠타미신으로 처리합니다.
참고: 겐타미신은 인간의 폐 상피 세포막을 관통할 수 없기 때문에 사용됩니다. 따라서, 그것은 매체에 있는 모든 박테리아를 죽일 수 있습니다 그러나 폐 상피 세포를 침략한 박테리아는 아닙니다. - CSE/겐타미신 처리 후 37°C에서 5%CO2에서,슈퍼나티를 흡인하고 후속 세균 농도 측정을 위해 PBS로 세포 3배를 세척한다.
참고: 내재된 박테리아를 확인하기 위해 GFP 표지P. 형광미굴라에 감염된 세포는 형광 현미경 검사의 밑에 관찰되었다.
5. 드롭 플레이트 방법을 사용하여 세균 농도의 결정
- 낙하 플레이트 방법으로 감염된 세포에서 세균 부하를 결정하려면, 감기 PBS의 2mL로 gentamycin 처리 된 세포를 2 x로 세척하십시오.
- 각 웰에 셀 리시스 버퍼 1mL(PBS에서 0.5% 트리톤 X-100)를 추가합니다.
- TSB 한천 판에 다음 접종을 위해 그라데이션(1:10, 1:100, 1:1,000 및 1:10,000)에서 내부화된 박테리아를 함유한 세포 용액을 희석시 희석시.
- 16h의 배양 후 세균성 식민지를 세어 CFU의 결과를 얻습니다.
6. 세균 성 16S rRNA의 RT-qPCR 검출
- 상기와 같이 슈도모나스-감염된폐 상피 세포(~1 x 106 세포/mL)를 젠타마이신으로 치료한다. 매체를 흡인하고 감기 PBS2mL로 세포를 2x로 세척합니다.
- 구아니듐 티오세네이트 리시스 버퍼의 0.35 mL을 6 웰 플레이트의 웰 당 추가합니다. 셀 스크레이퍼로 세포를 수집합니다. 리세이트 파이펫은 마이크로센심심분리기 튜브에 넣고 파이펫과 부드럽게 섞습니다.
- 리자이트에 70% 에탄올을 새로 준비한 것과 동일한 볼륨(0.35mL)을 첨가하고 잘 섞는다. 모든 샘플을 2mL 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 전송합니다. 20-25°C에서 30s용 10,000 x g의 원심분리기. 그런 다음 컬렉션 튜브에서 버퍼를 폐기합니다.
- 0.7 mL의 세척 버퍼 1로 컬럼을 씻으시다. 30초동안 10,000 x g의 원심분리기입니다. 0.5mL의 완충액으로 컬럼 2x를 세척하여 멤브레인 바운드 RNA를 세척합니다. 원심분리를 10,000 x g에서 2분 동안 반복합니다.
- 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브에 넣습니다. 30-50 μL RNase가 없는 물을 추가합니다. 원심 분리기 10,000 x g에서 1 분 동안. 흐름을 수집하고 RNA 농도를 측정합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 수행합니다. 총 RNA 1 μg을 반응 버퍼 10mL, 역전사 1μL 및 RNase 없는 물과 혼합하여 20μL 반응을 합니다. 역전사 반응을 37°C에서 1시간 동안 수행한 다음 5분 동안 95°C를 수행한다.
- cDNA 템플릿(위의 각 역전사 반응의 1 μL), SYBR 염료를 함유한 마스터 믹스의 5μL, 각 200nM 특이 프라이머의 1μL, 다음 PCR 분석을 위한 20 μL 혼합물에 물을 혼합합니다.
참고 : 다음은 P. aeruginosa의16S rRNA를 대상으로 프라이머입니다 : 앞으로 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3′; 역 5′-타가트CTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH는 다음과 같은 프라이머와 로딩 컨트롤로 사용되었다: 앞으로: 5′-GGCATGGGGACTTCATGA-3′; 역: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′. - 비교 CT 메서드를 사용하여 식을 결정합니다.
7. 유동 세포측정을 가진 형광 성구 성구의 검출
- 상기 형광 슈도모나스-감염된폐 상피 세포(~1 x 106 세포/mL)를 이전에 설명한 대로 젠타마이신으로 치료한다. 매체를 흡인하고 감기 PBS2mL로 세포를 2x로 세척합니다.
- GFP의 검출을 위해 509 nm의 파장에서 유동 세포계로 샘플을 분석합니다. 각 읽기를 100,000 개에서 종료합니다. 획득한 데이터를 관련 소프트웨어로 분석합니다.
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Representative Results
다이어그램은 그림 1에서프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다. 폐 상피 BEAS-2B 세포는 CSE로 처리되고 슈도모나스로도전하였다. 배양 배지에서 슈도모나스는 첨가된 젠타마이신에 의해 살해되었고 세포는 낙하판 분석, RT-qPCR 검출을 거쳐 슈도모나스 리보섬 16S RNA, 및 유동 세포측정을 하였다. 대조군과 비교하여 CSE 치료는 낙하판방법(도 2)에서세균 감염이 크게 증가하였다. 이에 상응하여, CSE는 HSAEC에서 세균 부하에 영향을미쳤다(그림 3). 세포 생존력은 4% CSE 처리의 3 시간 후에, 슈도모나스 감염의 1 h에서, 또는 젠타마이신 처리의 1 h에서(도 4 그림 5 도 6)후에상당히 변화하지 않았다. 상기 16S rRNA-표적 RT-qPCR방법(도 7)및 유동 세포측정법(도8)은유사한 결과를 입증하였다. 형광 현미경 검사법의 결과는 GFP 표지된 박테리아가 P. 형광미굴라 감염 실험(도 9)에서BEAS-2B 세포와 공존한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 결과는 담배 흡연이 BEAS-2B 세포에서 슈도모나스 부하를 증가시키는 것을 시사한다.
그림 1: 폐 상피 세포의 슈도모나스 감염에 대한 담배 연기 효과를 연구하기 위한 프로토콜의 회로도 프리젠테이션. 세포 배양소에서 자란 폐 상피 세포 또는 종래의 배양판 또는 폐 오르가노이드는 흡연 로봇을 통해 16분 동안 담배 연기에 노출되거나 3시간 동안 4% CSE로 제조되었다. 이 세포는 그 때 1 h (MOI = 10)를 위한 P. aeruginosa에 감염되었다. 겐타마이신은 배양 배지에서 살아있는 슈도모나를 제거하는 데 사용되었다. 상기 세포는 세균 부하를 결정하기 위해 낙하 플레이트 방법, qRT-PCR 또는 유동 세포측정 접근법의 영향을 받았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 폐 상피 BEAS-2B 세포에서 세균 부하를 결정하는 드롭 플레이트 방법. BEAS-2B 세포는 3시간 동안 4% CSE로 처리하였다. 세포는 그 때 P. aeruginosa (균주 PAO1) 감염을 1 h에 대한 다음 다른 1 h에 대한 gentamycin 처리를 실시하였다. 세포는 용액을 하고 세포 용액은 16h에 대한 TSB 플레이트를 접종하기 위해 희석되었다. 식민지는 계산되었다; CFU 번호는 플롯에 설명되어 있습니다. 그래프는 sD± 의미하며 "*"는 P< 0.05를 나타냅니다. 결과는 n = 3 실험을 대표합니다. 양방향 페어링되지 않은 t학생 t-테스트는 연기 처리 및 치료되지 않은 그룹에 사용되었습니다. P< 0.05는 통계적 유의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HSAEC 세포에서 세균 부하를 결정하는 드롭 플레이트 방법. 인간 1차 소형 기도 상피 세포는 3시간 동안 4% CSE로 처리하였다. 세포는 그 때 P. aeruginosa (균주 PAO1) 감염을 1 h에 대한 다음 다른 1 h에 대한 gentamycin 처리를 실시하였다. 세포는 용액이 되었고 세포 용액은 16h동안 TSB 플레이트에 접종하도록 희석하였다. 식민지는 계산되었다; CFU 번호는 플롯에 설명되어 있습니다. 그래프는 sD± 의미하며 "*"는 P< 0.05를 나타냅니다. 결과는 n = 3 실험을 대표합니다. 양방향 페어링되지 않은 t학생 t-테스트는 연기 처리 및 치료되지 않은 그룹에 사용되었습니다. P< 0.05는 통계적 유의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: CSE 처리폐 상피 BEAS-2B 세포에서 세포 생존가능성의 결정. 폐 상피 BEAS-2B 세포는 3 시간 동안 4% CSE로 처리되었다. 세포는 트라이판 블루로 염색되었고 세포 생존성은 세포 카운터로 측정하였다. 그래프는 sD에 ± 나타내며 결과는 n = 3 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 슈도모나스에서세포 생존가능성의 결정 -감염된 폐 상피 BEAS-2B 세포. 폐 상피 BEAS-2B 세포는 P. aeruginosa (MOI = 10)에 1 h에 감염되었다. 세포는 트라이판 블루로 염색되었고 세포 생존성은 세포 카운터로 측정하였다. 그래프는 sD에 ± 나타내며 결과는 n = 3 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 젠타마이신 처리폐 상피 BEAS-2B 세포에서 세포 생존가능성의 결정. 폐 상피 BEAS-2B 세포는 1h에 대해 100 μg/mL 젠타마이신으로 처리하였다. 세포는 트라이판 블루로 염색되었고 세포 생존성은 세포 카운터로 측정하였다. 그래프는 sD에 ± 나타내며 결과는 n = 3 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 폐 상피 세포의 세균 부하를 결정하는 qRT-PCR. 도 2에서 처리된 세포는 총 RNA 추출을 실시하였다. 각 샘플로부터의 동등한 양의 RNA는 cDNA로 전사되었고, P. aeruginosa의 16S RNA의 양은 특정 프라이머 쌍을 사용하여 정량적인 PCR로 결정되었다. qPCR의 결과는 그래프에 플롯됩니다. 그래프는 sD± 의미하며 "*"는 P< 0.05를 나타냅니다. 결과는 n = 3 실험을 대표합니다. 양방향 페어링되지 않은 t학생 t-테스트는 연기 처리 및 치료되지 않은 그룹에 사용되었습니다. P< 0.05는 통계적 유의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 폐 상피 세포에서 세균 부하를 결정하기 위한 유동 세포측정. BEAS-2B 세포는 CSE로 처리되고 P. 형광 미굴라 (균주 PAO143)에 감염되었다. 감염된 세포는 젠타마이신으로 치료되었고 세포 현탁액을 만들기 위해 트립신으로 소화되었습니다. 세포 현탁액은 혈류 세포계및 형광 슈도모나스-양성세포를 509nm의 파장에서 결정하였다. 흐름 세포측정의 결과가 그래프에 그려져 있습니다. 그래프는 sD± 의미하며 "*"는 P< 0.05를 나타냅니다. 결과는 n = 3 실험을 대표합니다. 양방향 페어링되지 않은 t학생 t-테스트는 연기 치료 및 치료되지 않은 그룹에 사용되었습니다. P< 0.05는 통계적 유의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 형광 현미경 검사법을 가진 세균성 감염의 관찰. BEAS-2B 세포는 P. 형광 미굴라(균주 PAO143)에 1h에 감염되었다. 세포는 또 다른 1 h를 위해 gentamycin로 취급되고 차가운 PBS로 2x를 세척했습니다. GFP 표지된 박테리아는 480nm의 파장에서 형광 현미경으로 관찰되었고 BEAS-2B 세포는 상 영상으로 시각화되었다. 이미지가 병합되고 대표 결과가 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
폐 상피 세포로 세균성 침입은 세균 감염의 병인에 있는 결정적인 단계입니다. 세포내 세균 성 침입 과정은 다음 세 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 박테리아접촉및 그들의 기색 세포를 사용하여 상피 세포의 표면에 부착. 둘째, 박테리아는 내산화를 거치거나 세포막을 관통한다. 마지막으로, 박테리아는 세포 방어 메커니즘25,,26을성공적으로 탈출하면 세포를 복제하고 식민지화한다. 폐 미세 파기에서 세균 감염의 관찰을 위한 접근은 오래 개발되었지만 폐 상피 세포에 대한 제한된 지식으로27,,28. 이 연구는 세 가지 접근법을 통해 폐 상피 세포에 있는 세균부하를 결정했습니다: 낙하 판 분석, 슈도모나스 리보솜 16S RNA를 위한 RT-qPCR, 및 유동 세포측정법. 세 가지 접근 방식은 모두 비슷한 민감도와 잘 어우아지며 잘 작동합니다. 폐 상피 세포에서 세균 부하를 결정하는 접근 법을 선택하는 것은 장비와 시간의 가용성에 따라 달라집니다. 이러한 실험에서 세균성 플래그렐라를 손상되지 않고 손상시키지 않고 손상시키지 않는 것은 성공적인 폐 상피 세포감염(29)에매우 중요합니다. 제한된 속도로 짧은 흔들림 시간은 세균 침입 용량30을더욱 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.
폐 상피 세포에서 세균 농도의 결정에 큰 장애물은 배양 배지에서 세균 오염이다. 세포 감염 실험에서, 박테리아는 특정 기간 동안 배양 배지에 첨가된다(즉, 1h). 그 시간 안에, 그 세균성 하중의 일부는 성공적으로 세포질 구획을 침략하지만, 잔류물은 세포의 외부 막에 부착 할 수 있습니다. 항생제, 젠타마이신은,세포(31)의외부 막에 부착된 배양 배지 및 잔류물에서 박테리아를 죽이는 데 사용된다. 겐타마이신은 세포막에 투과할 수 없는 것으로 간주되므로 세포 내의 박테리아에 이미 영향을 미치지 않습니다. 젠타마이신을 가진 처리는 감염한 폐 상피 세포 외부에서 잠재적인 오염을 제외하기 위하여 이 시스템에 이상적으로 만듭니다.
폐 상피 세포에서 세균 감염에 담배 연기의 효력을 공부하기 위하여는, 폐 세포는 세포 모형에 있는 세균성 감염의 앞에 담배 연기에 드러져야 합니다. 기존의 접근법은 세포를 치료하기 위해 신선한 CSE를 준비하고 있습니다. CSE의 생성은 연구를 위한 비용 효율적인 방법입니다. CSE는 다루기 쉽고, CSE를 만드는 과정은 간단하며, CSE 내내 주사는 짧은 기간32에동물 모델에서 폐기종의 생성에 효과적이다. 직접 담배 노출의 접근은 또한 체외 세포 모델과 생체 내 설치류 모델 모두를 위해 개발되었습니다. 생쥐에 매일 담배 연기 노출의 6 개월 널리 폐기종을 생성하는 데사용된다 33. 직접 담배 연기 노출은 담배 연소 및 세포 배양 시스템을 결합하는 복잡한 장비가 필요합니다. 담배 연소는 담배 연기를 생성하지만, 또한 문화 실의 온도와 습도에 영향을 미칠 수있는 열의 합계를 생성합니다. 다행히도, 최근의 기술은 직접 담배 연기 노출을 쉽게21. 직접 담배 연기 노출 실험(22)에대한 국제 표준화 기구 (ISO) 프로토콜이 구현되었습니다. 담배 연기에 노출되면 한 번 또는 여러 번 수행 될 수 있습니다. 또한, 세포 배양 기술의 진행과 함께, 폐 1차 상피 세포는 또한 컨리치 폐 상피 세포단층(34)을얻기 위해 투명한 인서츠에서 재배될 수 있었다. 폐 상피 세포 단층은 구조적으로 폐 조직에 있는 생리적인 조건을 모방합니다. 그런 다음 세포는 공기-액체인터페이스(35)에서기체 연기 나 공기에 노출될 수 있다. 더욱이, 폐 오르가노이드의 문화는 현재 폐 연구에서 등장하고있다36,,37. 담배 연기가 폐 오르가노이드의 세균 감염에 어떻게 영향을 미치는지 아는 것은 흥미로울 것입니다. 설명된 접근은 배양된 세포 대신 조직에 있는 인간적인 감염을 모방할 수 있고 더 낮은 호흡기 세균성 감염에 있는 가능하게 추가 통찰력을 만들 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 R01의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었다 HL125435 및 HL142997 (CZ에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
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