Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Akciğer Epitel Hücrelerinde Sigara Dumanının Pseudomonas Enfeksiyonu Üzerine Etkilerinin İncelanması

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Burada açıklanan sigara dumanı ekstresi akciğer epitel hücrelerinde bakteri kolonizasyonu nasıl etkilediğini incelemek için bir protokoldür.

Abstract

Sigara, akciğer amfizemi ve kronik obstrüktif akciğer hastalığının (KOAH) başlıca etiyolojik nedenidir. Sigara içmek aynı zamanda solunum sistemindeki bakteriyel enfeksiyonlara yatkınlığı da teşvik eder. Ancak, sigaranın insan akciğer epitel hücrelerindeki bakteriyel enfeksiyonlar üzerindeki etkileri henüz iyice incelenmemiştir. Burada açıklanan sigara ekstrelerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol (CSE), CSE ile insan akciğer epitel hücrelerinin tedavisi, ve bakteriyel enfeksiyon ve enfeksiyon tayini. CSE geleneksel bir yöntemle hazırlanmıştır. Akciğer epitel hücreleri 3 h. CSE tedavi hücreleri için% 4 CSE ile tedavi edildi, daha sonra, enfeksiyon çokluğu pseudomonas ile enfekte edildi (MOI) 10. Hücrelerin bakteri yükleri üç farklı yöntemle belirlendi. Sonuçlar, CSE'nin akciğer epitel hücrelerinde Pseudomonas yükünü artırdığını gösterdi. Bu protokol, bu nedenle, akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel enfeksiyonlar üzerinde sigara dumanı etkisini incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Sigara içmek dünya çapında milyonlarca insanın halk sağlığını etkiler. Akciğer kanseri ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere birçok zararlı hastalık, sigara ile ilgili olduğu bildirilmiştir1,2. Sigara solunum sisteminde akut mikrobiyal enfeksiyonlara yatkınlığı artırır3,4,5. Ayrıca, montaj kanıtlar sigara birçok kronik bozuklukların patogenezini artırır kanıtlıyor6,7,8. Örneğin, sigara içme KOAH alevlenme neden viral veya bakteriyel enfeksiyonları artırabilir9. Etyolojik KOAH akut alevlenme katkıda bakteriyel patojenler arasında, fırsatçı bir gram-negatif bacillus patojen, Pseudomonas aeruginosa, kötü prognoses ve yüksek mortalite ile ilişkili enfeksiyonlara neden olur10,11. KOAH alevlenmepatolojisi patolojik ilerlemeyi hızlandırarak hastalığı kötüleştirir. Koah alevlenmelerine karşı antisemptomatik tedavi dışında etkili bir tedavi yoktur12. KOAH alevlenmesi hasta ölümlerini teşvik eder, yaşam kalitesini düşürür ve toplum üzerindeki ekonomik yükü artırır13.

Solunum yolu açık bir sistemdir, sürekli olarak çeşitli mikrobiyal patojenlere maruz kalırlar. Fırsatçı bakteriyel patojenler genellikle üst solunum yollarında tespit edilir ancak bazen alt hava yollarında gözlenir14,15. Hayvan modellerinde P. aeruginosa en kısa sürede alveoler keselerde tespit edilebilir 1 saat enfeksiyonsonra 16. Önemli bir savunma mekanizması olarak, makrofajlar veya nötrofiller gibi bağışıklık hücreleri hava yollarında bakterileri ortadan kaldırır. Akciğer epitel hücreleri, ilk fizyolojik bariyer olarak, mikrobiyal enfeksiyonlara karşı konak savunma benzersiz bir rol oynamaktadır. Akciğer epitel hücreleri mikrobiyal invazyonu, kolonizasyon, ya da bağışıklık hücrelerinden bağımsız çoğaltma düzenleyebilir17. PpARg da dahil olmak üzere epitel hücrelerinde bulunan bazı moleküller, antibakteriyel fonksiyonlar uygulamak, bu nedenle akciğer epitel hücrelerinde bakteri kolonizasyonu ve replikasyon düzenleyen18. Sigara içme molekülleri değiştirebilir ve akciğer epitel hücrelerinde normal savunma fonksiyonu bozabilir19,20. Son çalışmalar da sigara dumanının akciğer epitel hücrelerine robot sigara aleti kullanarak doğrudan maruz kaldıktan sonra21,22. Dumana maruz kalma, CSE uygulaması da dahil olmak üzere başka şekillerde yapılabilir. CSE hazırlanması dolaylı olarak sigara dumanına maruz kalan vasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinde potansiyel uygulamalar ile tekrarlanabilir bir yaklaşımdır.

Bu rapor akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel yükü değiştirmek için sigara dumanı ekstresi oluşturmak için bir protokol açıklar. CSE P. aeruginosabakteriyel yükünü artırır , ve genellikle KOAH alevlenme görülen bakteriyel enfeksiyonların nüks katkıda bulunabilir. CSE'nin hazırlanmasında geleneksel bir yöntem kullanılmaktadır. Akciğer epitel hücreleri, üstel büyüme aşamasında, 3 saat için% 4 CSE ile tedavi edilir. Alternatif olarak, monolayer kültürlü akciğer epitel hücreleri doğrudan bir hava-sıvı arayüzü sigara dumanı maruz kalınabilir. CSE ile tedavi edilen hücreler daha sonra 10 enfeksiyon (MOI) bir çokluk pseudomonas ile meydan. Bakteriler, kamçılarının morfolojisinin tam invaziv kapasitelerini korumak için bozulmadan kalmasını sağlamak için belirli bir sallayarak yayılır. Gentamisin kültür ortamında kalan bakterileri öldürmek için kullanılır, böylece bakteri yükünün sonraki belirlenmesi sırasında potansiyel kontaminasyon azaltarak. Protokol aynı zamanda GFP etiketli Pseudomonaskullanır , hangi farklı modellerde Pseudomonas enfeksiyon çalışmalarında güçlü bir araç olarak kullanılmıştır. Bir temsilcisi suşu P. fluorescens Migula23olduğunu. CSE tedavisinden sonra enfeksiyon veya bakteriyel yük derecesi üç şekilde belirlenir: koloni sayma ile damla plaka yöntemi, Pseudomonas 16S rRNA özgü astarlar kullanarak kantitatif PCR, veya floresan Pseudomonasile enfekte hücrelerde akış sitometri . Bu protokol, sigara dumanının akciğer epitel hücrelerindeki bakteriyel enfeksiyonlar üzerindeki etkisini incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşımdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. %100 CSE hazırlığı

  1. 10 mL serumsuz hücre kültürü ortamını (BEAS-2B hücreleri için DMEM/F12; HSAEC hücreleri için hava yolu epitel hücre bazal orta) 60 mL şırıngaya çekin.
  2. Sigarayı (3R4F) tutmak için adaptör olarak şırınganın nojesine uygun şekilde kesilmiş 1 mL pipet ucu takın.
  3. Sigaranın filtresini çıkarın. Uç adaptörüne bir sigara takın ve sigarayı yakın.
  4. 10 mL serumsuz ortama 40 mL duman içeren hava çekin. Şiddetle sallayarak orta ile duman karıştırın (beraberlik başına 30 s).
  5. Sigara tamamen yanmış kadar ~ 7 dakika 11x hakkında adım 1.4 tekrarlayın.
  6. Herhangi bir mikroorganizmayı ve çözünmez parçacıkları dışlamak için füme ortamın 10 mL'ini 0,22 m filtreyle filtreleyin. Kapalı steril bir tüpe aktarın. Sonraki tramadan önce %100 CSE'yi en fazla 30 dakika hazırlayın.

2. Pseudomonas kültürü

  1. 37 °C'de gece kültürü için tryptic Soya Suyu (TSB) agar plakaiçine dondurulmuş P. aeruginosa (zorlanma PAO1) veya P. fluorescens Migula (zorlanma PAO143) aşılamak.
    NOT: Kültür için yeterli bakteri elde etmek için, mümkün olduğunca TSB agar plaka üzerine çok bakteri yayılır.
  2. Karbon kaynağı olarak gliserol% 5 ile TSB 20 mL bir bakteriyel yayma ve kuluçka toplamak.
  3. OD600 değeri = 0.6 kadar 1 saat için 200 rpm bir 37 °C inkübatör bakteriyel süspansiyon çalkalayın.
    DİkKAT: Sallanma hızının 200 rpm'yi aşmasına izin vermeyin. Daha yüksek titreme hızları bakteriyel flagella morfolojisine zarar verebilir ve akciğer epitel içine bakteri istilası etkileyebilir. Aynı şekilde, son derece invaziv bakteriler elde etmek için 1 saat sallayarak süresini sınırlayın. Bakteri sayısını tahmin etmek için OD600 değerini ölçün. Bir OD600 = 1 ~ 109 koloni oluşturan birimleri (CFU)/mL karşılık gelir.

3. İnsan akciğer epitel hücre kültürü ve KSE tedavisi

  1. HITES orta kültüründe insan BEAS-2B hücreleri (500 mL DMEM/F12, 2.5 mg insülin, 2.5 mg transferrin, 2.5 mg sodyum selenit, 2.5 mg transferrin, 10 μM hidrokortizon, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES ve 2 mM L-glutamin) ile takviye 10% fetal sığır serumu (FBS) daha önce açıklandığı gibi24.
  2. Kültür insan birincil küçük hava yolu epitel hücreleri (HSAEC) hava yolu epitel hücre kültür orta (500 mL Airway Cell Bazal Orta, 500 μg/mL HSA, 0.6 μM linoleik asit, 0.6 μg/mL lesitin, 6 mM L-glutamin, %0.4 ekstresi P, 1.0 μM epinefrin, 5 μg/mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL hidrokortizon, rh EGF 5 ng/mL ve 5 g/mL r insülin). Hücreleri %5 CO2'de37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. Hücreler plakanın altından tamamen ayrışana kadar hücreleri 5 dk için %0,25 tripsin ile 1 mL ayırın.
  4. Tripsinnötralize etmek ve 15 mL tüp hücreleri toplamak için tam HITES orta 10 mL ekleyin. Santrifüj 4 °C'de 300 x g 5 dk.
    DİkKAT: Mide burdası ile tripsin sindirim süresini dikkatle izleyin, çünkü aşırı hazım hücre ölümüne neden olabilir.
  5. Supernatant atın ve% 10 FBS ile HITES orta 2 mL hücreleri yeniden askıya.
  6. Yukarıdaki hücre süspansiyonunun 10 μL'lik pipeti plakaya takın ve hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için otomatik bir hücre sayacına takın.
  7. Plate BEAS-2B hücreleri 3 × 105 hücre/mL konsantrasyonu ile 6 kuyu plakası içine hites ortamda 2 mL toplam hacmi gecede kültür için FBS% 10 ile desteklenmektedir.
  8. Hücreleri yaklaşık %80 birleştirme veya 5 x 105 hücre/mL,% 4 CSE ile 3 saat tedavi. CSE tedavisinden önce, FBS'nin %1'i ile HITES ortamı ile orta yı değiştirin.

4. Bakteriyel enfeksiyon

  1. CSE ile tedavi edilen hücrelerin her kuyusuna P. aeruginosa veya P. fluorescens Migula (~1 × 107 CFU/mL) ekleyin ve %5 CO2'de37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Süpernatantları aspire edin ve %4 CSE ve 100 μg/mL gentamicin ile tedavi etmek için 2 mL taze HITES ortamı ile değiştirin.
    NOT: Gentamisin insan akciğer epitel hücre zarlarına nüfuz edemediği için kullanılır. Böylece, bu ortamda tüm bakterileri öldürebilir ama bu akciğer epitel hücreleri işgal değil.
  3. 37 °C'de %5 CO2'de1 saat CSE/gentamicin tedavisinden sonra süpernatantları aspire edin ve sonraki bakteriyel konsantrasyon tayini için hücreleri 3 kat PBS ile yıkayın.
    NOT: İçselleştirilmiş bakterileri doğrulamak için, GFP etiketli P. fluorescens Migula ile enfekte hücreler floresan mikroskopi altında gözlendi.

5. Damla plaka yöntemi ile bakteri konsantrasyonunun belirlenmesi

  1. Damla plaka yöntemi ile enfekte hücrelerde bakteriyel yükü belirlemek için, soğuk PBS 2 mL ile gentamisin tedavi hücreleri 2x yıkayın.
  2. Her kuyuya hücre lisis tamponu (PBS'de %0,5 triton X-100) 1 mL ekleyin.
  3. TSB agar plakasına aşağıdaki aşılama için içselleştirilmiş bakterileri içeren hücre lisatlarını bir degradede (1:10, 1:100, 1:1000 ve 1:10,000) seyreltin.
  4. Kuluçka 16 saat sonra, bakteri kolonileri sayarak CFU sonuçlarını elde.

6. Bakteriyel 16S rRNA RT-qPCR tespiti

  1. Pseudomonas-enfekteakciğer epitel hücreleri tedavi (~ 1 x 106 hücreleri / mL) yukarıda açıklandığı gibi gentamisin ile. Orta aspire ve 2 mL soğuk PBS hücreleri 2x yıkayın.
  2. Guanidium tiyokrit lysis tampon 0.35 mL ekleyin iyi bir 6 iyi plaka başına. Bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak. Pipet bir mikrocentrifuge tüp içine lysate ve pipet ile yavaşça karıştırın.
  3. Lysate içine taze hazırlanmış % 70 etanol aynı hacim (0,35 mL) ekleyin ve iyice karıştırın. Tüm örnekleri 2 mL toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktarın. 20-25 °C'de 30 s için 10.000 x g santrifüj. Ardından, arabelleği toplama tüpüne atın.
  4. Kolonu 0,7 mL yıkama tamponu 1 ile yıkayın. 30 s için 10.000 x g sütun santrifüj. Membrana bağlı RNA'yı yıkamak için kolon 2x'i 0,5 mL tamponla yıkayın. Santrifüj10.000 x g 2 dk için tekrarlayın.
  5. Sütunu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirin. 30-50 μL RNase içermeyen su ekleyin. 1 dk için 10.000 x g santrifüj. Akış yoluyla toplamak ve RNA konsantrasyonu ölçmek.
  6. Üreticinin protokolüne göre ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirin. Toplam RNA'nın 1 μg'sini 10 mL reaksiyon tamponu, 1 μL ters transkriptaz ve 20 μL'lik reaksiyon için RNa içermeyen suyu karıştırın. Ters transkripsiyon reaksiyonu 37 °C'de 1 saat, 95 °C'de 5 dakika süreyle gerçekleştirin.
  7. Üreticinin tavsiyelerine göre cDNA şablonlarını (yukarıdaki her ters transkripsiyon reaksiyonunun 1 μL'i), SYBR boyası içeren Master Mix'in 5 μL'sini, her 200 nM'ye özgü astarı 1 μL'lik kısmını ve aşağıdaki PCR analizi için 20°L'lik bir karışımdaki suyu karıştırın.
    NOT: P. aeruginosa16S rRNA hedefleyen astarlar şunlardır: ileri 5′-CAAAACTGAGCTAGAGTACG-3′; ters 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH aşağıdaki astarlar ile bir yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır: ileri: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; ters: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
  8. İfadeyi belirlemek için karşılaştırmalı BT yöntemini kullanın.

7. Akış sitometrisi ile floresan Pseudomonas tespiti

  1. Yukarıdaki floresan Pseudomonas-enfekteakciğer epitel hücreleri (~ 1 x 106 hücreleri / mL) daha önce açıklandığı gibi gentamisin ile tedavi. Orta aspire ve 2 mL soğuk PBS hücreleri 2x yıkayın.
  2. GFP tespiti için örnekleri 509 nm dalga boyunda akış sitometresi ile analiz edin. Her okumayı 100.000 sayar'da sonlandırın. Elde edilen verileri ilgili yazılımla analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1'dekiprotokolü göstermek için bir diyagram kullanılır. Akciğer epitelyal BEAS-2B hücreleri CSE ile tedavi edildi ve Pseudomonasile meydan okudu. Kültür ortamındaki pseudomonas ilave gentamisin tarafından öldürüldü ve hücreler damla plaka sınaması, Pseudomonas ribozom 16S RNA RT-qPCR tespiti ve akış sitometrisine tabi tutuldu. Kontrol ile karşılaştırıldığında, CSE tedavisi damla plaka yöntemlerinde bakteriyel enfeksiyonu önemli ölçüde artırmıştır(Şekil 2). Buna karşılık, CSE HSAEC'deki bakteriyel yükü etkilemiştir(Şekil 3). Hücre canlılığı 3 saat 4% CSE tedavisinden sonra, Pseudomonas enfeksiyonunun 1 saat inden sonra veya 1 saat gentamisin tedavisinde önemli ölçüde değişmedi(Şekil 4 Şekil 5 Şekil 6). 16S rRNA hedef RT-qPCR yöntemi(Şekil 7) ve akış sitometrisi (Şekil 8) benzer sonuçlar gösterdi. Floresan mikroskopi sonuçları, P. fluorescens Migula enfeksiyon deneyinde GFP etiketli bakterilerin BEAS-2B hücreleri ile birlikte lokalize olduğunu göstermiştir(Şekil 9). Bu sonuçlar sigara nın BEAS-2B hücrelerinde Pseudomonas yükünü artırdığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Akciğer epitel hücrelerinde Pseudomonas enfeksiyonu üzerine sigara dumanı etkilerini incelemek için protokolün şematik sunumu. Hücre kültürü uçlarında veya geleneksel kültür tabakalarında veya akciğer organoidlerinde yetişen akciğer epitel hücreleri, sigara robotu ile 16 dakika boyunca sigara dumanına maruz kaldı veya 3 saat için hazırlanmış %4 CSE ile tedavi edildi. Bu hücreler daha sonra 1 saat (MOI = 10) için P. aeruginosa ile enfekte edildi. Gentamycin kültür ortamda canlı Pseudomonas ortadan kaldırmak için kullanılmıştır. Yukarıdaki hücreler damla plaka yöntemine, qRT-PCR veya akış sitometri yaklaşımlarına tabi idi bakteriyel yükü belirlemek için. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Akciğer epitel beas-2B hücrelerinde bakteri yükünü belirlemek için levha bırakma yöntemi. BEAS-2B hücreleri 3 saat süreyle %4 CSE ile tedavi edildi. Hücreler daha sonra P. aeruginosa (suş PAO1) enfeksiyonuna maruz kaldı 1 saat sonra başka bir 1 saat için gentamisin tedavisi takip. Hücreler lysed ve hücre lysates 16 saat için TSB plakaları aşılamak için seyreltildi. Koloniler sayıldı; CFU numaraları arsa gösterilmiştir. Grafik, SD ± anlamına gelir ve "*" P < 0,05'i gösterir. Sonuçlar n = 3 deneylerini temsil eder. Dumanla tedavi edilen ve tedavi edilmeyen gruplar için çift yönlü eşleşmesiz Öğrenci t-testikullanılmıştır. P < 0.05 istatistiksel anlamlılık gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: HSAEC hücrelerindeki bakteri yükünü belirlemek için levha bırakma yöntemi. İnsan primer küçük hava yolu epitel hücreleri 3 saat süreyle %4 CSE ile tedavi edildi. Hücreler daha sonra P. aeruginosa (suş PAO1) enfeksiyonuna maruz kaldı 1 saat sonra başka bir 1 saat için gentamisin tedavisi takip. Hücreler lysed ve hücre lysates 16 saat için TSB plakaları inoculate seyreltilmiş edildi. Koloniler sayıldı; CFU numaraları arsa gösterilmiştir. Grafik, SD ± anlamına gelir ve "*" P < 0,05'i gösterir. Sonuçlar n = 3 deneylerini temsil eder. Dumanla tedavi edilen ve tedavi edilmeyen gruplar için çift yönlü eşleşmesiz Öğrenci t-testikullanılmıştır. P < 0.05 istatistiksel anlamlılık gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: KSE ile tedavi edilen akciğer epitel iyitsel BEAS-2B hücrelerinde hücre canlılığının belirlenmesi. Akciğer epitel idamı BEAS-2B hücreleri 3 saat süreyle %4 CSE ile tedavi edildi. Hücreler trypan mavisi ile boyandı ve hücre canlılığı hücre sayacı ile ölçüldü. Grafik, ± SD. Sonuçların n = 3 deneylerini temsil ediyor anlamına geldiğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Pseudomonas-enfekteakciğer epitel BEAS-2B hücrelerinde hücre canlılığının belirlenmesi. Akciğer epitel beas-2B hücreleri 1 saat boyunca P. aeruginosa (MOI = 10) ile enfekte edildi. Hücreler trypan mavisi ile boyandı ve hücre canlılığı bir hücre sayacı ile ölçüldü. Grafik, ± SD. Sonuçların n = 3 deneylerini temsil ediyor anlamına geldiğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Gentamisin ile tedavi edilen akciğer epitel beas-2B hücrelerinde hücre canlılığının belirlenmesi. Akciğer epitel beas-2B hücreleri 1 00 g/mL gentamisin ile 1 saat tedavi edildi. Hücreler trypan mavisi ile boyandı ve hücre canlılığı bir hücre sayacı ile ölçüldü. Grafik, ± SD. Sonuçların n = 3 deneylerini temsil ediyor anlamına geldiğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: akciğer epitel hücrelerinde bakteri yükünü belirlemek için qRT-PCR. Şekil 2'de tedavi edilen hücreler total RNA ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Her örnekten eşdeğer miktarda RNA cDNA'ya dönüştürüldü ve 16S RNA P. aeruginosa miktarı belirli astar çiftleri kullanılarak nicel PCR ile belirlendi. QPCR sonuçları grafikte çizilir. Grafik, SD ± anlamına gelir ve "*" P < 0,05'i gösterir. Sonuçlar n = 3 deneylerini temsil eder. Dumanla tedavi edilen ve tedavi edilmeyen gruplar için çift yönlü eşleşmesiz Öğrenci t-testikullanılmıştır. P < 0.05 istatistiksel anlamlılık gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Akciğer epitel hücrelerindeki bakteri yükünü belirlemek için sitometri akışı. BEAS-2B hücreleri CSE ile tedavi edildi ve P. floresan Migula (suş PAO143) ile enfekte edildi. Enfekte hücreler gentamisin ile tedavi edildi ve bir hücre süspansiyon yapmak için tripsin ile sindirilir. Hücre süspansiyonları akış sitometreden geçti ve floresan Pseudomonas-pozitif hücreler 509 nm dalga boyunda belirlendi. Akış sitometrisinin sonuçları grafikte çizilir. Grafik, SD ± anlamına gelir ve "*" P < 0,05'i gösterir. Sonuçlar n = 3 deneylerini temsil eder. Duman tedavisi gören ve tedavi edilmeyen gruplar için çift yönlü eşleşmesiz Öğrenci t-testikullanılmıştır. P < 0.05 istatistiksel anlamlılık gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Floresan mikroskopi ile bakteriyel enfeksiyonun gözlemi. BEAS-2B hücreleri 1 saat boyunca P. floresan Migula (suş PAO143) ile enfekte edildi. Hücreler başka bir 1 saat için gentamisin ile tedavi edildi ve soğuk PBS ile 2x yıkandı. GFP etiketli bakteriler floresan mikroskop altında 480 nm dalga boyunda gözlendi ve BEAS-2B hücreleri faz görüntüsü ile görselleştirildi. Görüntüler birleştirildi ve temsili sonuç gösterilir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Akciğer epitel hücrelerine bakteriyel invazyon bakteriyel enfeksiyonların patogenezinde önemli bir adımdır. Hücrelere bakteri istilası süreci aşağıdaki üç adıma ayrılabilir: Birincisi, bakteriler temas ve onların kamçı kullanarak epitel hücre yüzeyine yapışır. İkinci olarak, bakteriler ya içselleştirme den geçer ya da hücre zarına nüfuz eder. Son olarak, bakteriler çoğalTabilir ve başarılı hücresel savunma mekanizmaları kaçarsanız hücreleri kolonize25,26. Akciğer mikrofajlarında bakteriyel enfeksiyonların gözlemi için yaklaşımlar uzun süre geliştirilmiştir ancak akciğer epitel hücrelerinin sınırlı bilgisi ile27,28. Bu çalışmada akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel yük üç yaklaşımla belirlendi: bir damla plaka sedye, Pseudomonas ribozom 16S RNA için RT-qPCR ve akış sitometrisi. Her üç yaklaşım da benzer hassasiyetlerle işe yarar. Akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel yükü belirlemek için yaklaşımların seçilmesi ekipman ve zaman durumuna bağlıdır. Bu deneylerde, bakteriyel flagella hasarsız ve bozulmamış tutmak başarılı akciğer epitel hücre enfeksiyonu29için çok önemlidir. Sınırlı hız ile daha kısa bir sallayarak zaman daha bakteriyel işgal kapasitesi teşvik etmek için yardımcı olabilir30.

Akciğer epitel hücrelerindeki bakteri konsantrasyonunun belirlenmesinde en büyük engel kültür ortamının bakteriyel kontaminasyonudur. Hücre enfeksiyonu deneylerinde bakteriler belirli bir süre için kültür ortamına eklenir (örn. 1 saat). Bu süre içinde, bu bakteri yükünün bir kısmı sitoplazmik bölmeyi başarıyla istila eder, ancak kalıntılar hücrelerin dış zarına bağlanabilir. Bir antibiyotik, gentamisin, kültür orta bakteri ve hücrelerin dış zarına bağlı kalıntılar öldürmek için kullanılır31. Gentamisin hücre zarına geçirilemez olarak kabul edilir ve bu nedenle hücreler içinde zaten bakterileri etkilemez. Gentamisin ile tedavi enfekte akciğer epitel hücrelerinin dışından potansiyel kontaminasyon dışlamak için bu sistem için idealdir.

Akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel enfeksiyon sigara dumanı üzerindeki etkilerini incelemek için, akciğer hücreleri hücresel modellerde bakteriyel enfeksiyon önce sigara dumanı maruz olmalıdır. Geleneksel bir yaklaşım hücreleri tedavi etmek için taze CSE hazırlanıyor. CSE üretimi çalışmalar için uygun maliyetli bir yöntemdir. CSE işlemek kolaydır, CSE yapma süreci basittir, ve CSE intratrakeal enjeksiyon kısa bir süre içinde hayvan modellerinde amfizem üretiminde etkilidir32. Doğrudan sigaraya maruz kalma yaklaşımları hem in vitro hücresel modeller hem de in vivo kemirgen modelleri için geliştirilmiştir. Farelere günlük sigara dumanı maruz altı ay yaygın amfizem oluşturmak için kullanılır33. Doğrudan sigara dumanına maruz kalma sigara yanma ve hücre kültürü sistemleri birleştiren karmaşık ekipman gerektirir. Sigara yanma sigara dumanı üretir, ama aynı zamanda kültür odasının sıcaklık ve nem etkileyebilir ısı toplam miktarda üretir. Neyse ki, son teknikler doğrudan sigara dumanı maruz kalma daha kolay21olun. Uluslararası Standardizasyon Örgütü (ISO) protokolü doğrudan sigara dumanına maruz kalma deneyleri için uygulanmıştır22. Sigara dumanına maruz kalma bir veya birden fazla kez yapılabilir. Buna ek olarak, hücre kültürü teknikleri ilerleme ile birlikte, akciğer primer epitel hücreleri de bir confluent akciğer epitel hücre monolayer elde etmek için şeffaf ekler üzerinde yetiştirilen olabilir34. Akciğer epitel hücre monokatmanları yapısal akciğer dokularında fizyolojik koşulları taklit. Hücreler daha sonra hava-sıvı arayüzü35apikal gaz duman veya havaya maruz kalınabilir. Ayrıca, akciğer organoidkültürü mevcut akciğer çalışmalarında ortaya çıkmıştır36,37. Sigara dumanının akciğer organoidlerinde bakteriyel enfeksiyonu nasıl etkilediğini bilmek ilginç olacaktır. Açıklanan yaklaşım kültürlü hücreler yerine dokularda insan enfeksiyonu taklit edebilir ve düşük solunum bakteriyel enfeksiyon mümkün daha fazla anlayışlar yapabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Tarafından desteklenmiştir R01 HL125435 ve HL142997 (CZ) hibe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

Tags

JoVE Bu Ay Sayı 159 sigara dumanı maruz kalma sigara dumanı özü Pseudomonas enfeksiyon bakteriyel yük akciğer epitel hücre akciğer hasarı
Akciğer Epitel Hücrelerinde Sigara Dumanının <em>Pseudomonas</em> Enfeksiyonu Üzerine Etkilerinin İncelanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter