Summary
ここで説明する、タバコの煙抽出物が肺上皮細胞における細菌のコロニー形成にどのように影響するかを研究するプロトコルである。
Abstract
タバコの喫煙は肺肺気腫や慢性閉塞性肺疾患(COPD)の主要な病因である。タバコの喫煙はまた、呼吸器系における細菌感染に対する感受性を促進する。しかし、タバコの喫煙がヒト肺上皮細胞の細菌感染に及ぼす影響は、まだ十分に研究されていない。ここで説明するのは、タバコ喫煙抽出物(CSE)の調製、ヒト肺上皮細胞のCSEによる治療、および細菌感染および感染判定の詳細なプロトコルである。CSEは、従来の方法で調製した。肺上皮細胞は、CSE処理細胞を3hに対して4%CSEで処理し、その後、10の多重性の感染(MOI)で シュードモナス に感染した。細胞の細菌負荷は、3つの異なる方法によって決定した。その結果、CSEは肺上皮細胞における シュードモナス 負荷を増加させる。したがって、このプロトコルは、肺上皮細胞における細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチを提供する。
Introduction
タバコの喫煙は、世界中の何百万人もの人々の公衆衛生に影響を与えます。肺癌や慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む多くの有害性疾患は、タバコの喫煙11,22に関連していると報告されている。タバコの喫煙は、呼吸器系,3、4、54における急性微生物感染に対する3感受性を高める。5さらに、取り付け証拠は、タバコの喫煙が多くの慢性疾患66、7、87,8の病因を高めることを証明する。例えば、タバコの喫煙は、COPDの悪化を引き起こすウイルスまたは細菌感染を増加させる可能性があります9.COPDの急性増悪に病因となる細菌病原体の中で、日和見グラム陰性バチルス病原体である緑膿菌は、予後不良および死亡率の高い10,11,11と相関する感染症を引き起こす。COPD増悪は病理学的進行を加速することによって病気を悪化させる。COPDの悪化に対する有効な治療法は、抗無症候性管理12を除いてはない。COPDの悪化は患者の死亡率を促進し、生活の質を低下させ、社会13の経済的負担を増大させる。
呼吸器気道は開放系であり、外部に存在する種々の微生物病原体に連続的に供される。日和見細菌病原体は、通常、上気道で検出されるが、時には下気道14、15,15で観察される。動物モデルではP.緑素吸虫は、感染16後1時間と速やかに肺胞嚢で検出することができる。主要な防御機構として、マクロファージや好中球などの免疫細胞は、気道内の細菌を排除する。肺上皮細胞は、第1の生理学的障壁として、微生物感染に対する宿主防御において独特の役割を果たす。肺上皮細胞は、免疫細胞17から独立した微生物の浸潤、コロニー形成、または複製を調節することができる。PPARgを含む上皮細胞に見られるいくつかの分子は、抗菌機能を発揮し、それによって肺上皮細胞18における細菌コロニー形成および複製を調節する。タバコの喫煙は、分子を変化させ、肺上皮細胞19,20,20における正常な防御機能を損なう可能性がある。最近の研究では、ロボット喫煙装置21,22を用いて肺上皮細胞へのタバコの煙の直接暴露が22報告された。しかし、煙への暴露は、CSEの適用を含む他の方法で行うことができます。CSEの調製は、間接的にタバコの煙にさらされている血管内皮細胞を含む他の細胞タイプの潜在的な用途を有する再現可能なアプローチである。
本報告書は、肺上皮細胞の細菌負荷を変化させるタバコの煙抽出物を生成するプロトコルについて説明する。CSEは 、緑内科の細菌負荷を増加させ、COPD悪化に通常見られる細菌感染の再発に寄与する可能性がある。CSEの調製には、従来の方法が使用されます。肺上皮細胞は、その指数成長段階で、3時間の4%CSEで処理される。あるいは、単層培養肺上皮細胞は、空気液体界面でタバコの煙に直接曝すことができる。CSE処理細胞は、その後、10の感染の多重性(MOI)で シュードモナス で挑戦されます。細菌は、そのフラゲラの形態が完全な侵襲能力を保持するためにそのまま残っていることを確認するために、特定の揺れの速度で伝播されます。ゲンタマイシンは、培養培地に残された細菌を殺すために採用され、それにより、細菌負荷のその後の判定時に潜在的な汚染を低減する。このプロトコルはまた、さまざまなモデルで シュードモナス感染を研究する強力なツールとして利用されているGFPラベル付き シュードモナスを 使用しています。代表的な株は 、P.フルオレセンの ミグラ23です。CSE治療後の感染性または細菌負荷の程度は、コロニー計数を伴うドロッププレート法、 シュードモナス 16S rRNA特異的プライマーを用いた定量PCR、または蛍光 シュードモナスに感染した細胞におけるフローサイトメトリーの3つの方法で決定される。このプロトコルは、肺上皮細胞の細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチです。
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Protocol
1. 100% CSEの準備
- 10 mL の無血清細胞培養培地(BeAS-2B 細胞の DMEM/F12、HSAEC 細胞用の気道上皮細胞基底培地)を 60 mL シリンジに引き出します。
- 適切にトリミングした1mLピペットチップをシガレット(3R4F)を保持するアダプターとしてシリンジのノズルに取り付けます。
- タバコのフィルターを取り外します。チップアダプターにタバコを取り付け、タバコを燃焼させます。
- 無血清培地の10mLに40mLの煙含有空気を引き込む。激しく揺れる(1回の引き分けにつき30秒)と煙を混ぜます。
- 約11倍のステップ11xを、タバコが完全に燃え尽きるまで7分ほど繰り返します。
- 10 mLのスモークメディアを0.22 μmフィルターで濾過し、微生物や不溶性粒子を除外します。閉じた無菌チューブに移します。100%CSEを30分以下で準備してから、その後のアッセイを行ってください。
2. シュードモナス 文化
- 凍結した P.緑素吸い( 株PAO1)または P.フルオレセンスミグラ (株PAO143)をトリプティック大豆ブロス(TSB)寒天プレートに接種し、37°Cで一晩培養する。
注:培養に十分な細菌を得るために、できるだけ多くの細菌をTSB寒天プレートに広げます。 - 細菌の汚れを収集し、炭素源としてグリセロールの5%とTSBの20 mLでインキュベート。
- 37°Cインキュベーターで37°Cインキュベーターで1時間、OD600 値=0.6になるまで振ります。
注意: 揺れの速度が200 rpmを超えないようにしてください。より高い揺れ速度は、細菌のバテラの形態を損傷し、肺上皮への細菌の侵入に影響を与える可能性があります。同様に、高侵襲性細菌を得るために揺れ時間を1時間に制限する。OD600 値を測定して、細菌の数を推定する。OD600 = 1 は、〜109 コロニー形成単位(CFU)/mL に対応します。
3. ヒト肺上皮細胞培養とCSE治療
- ヒトBEAS-2B細胞をHITES培地で培養(500 mLのDMEM/F12、 2.5 mgインスリン、2.5mgトランスフェリン、2.5mgセレニン、2.5mgトランスフェリン、10μMヒドロコルチゾン、10μM βエストラジオール、10mM HEPES、および2mM L-グルタミン)を10%のウシ血清(FB)を補った。
- 培養ヒト一次小気道上皮細胞(HSAEC)の気道上皮細胞培地(気道細胞基底培地の500mL、 500 μg/mL HSA, 0.6 μM リノール酸, 0.6 μg/mL レシチン, 6 mM L-グルタミン, 0.4% エキス P, 1.0 μM エピネフリン, 5 μg/mL トランスフェリン, 10 nM T3, 1 μg/mL ヒドロコルチゾン, rhGF 5 g/m/m, インスリン).5%CO2で37°Cで細胞をインキュ2ベートする。
- 細胞がプレートの底から完全に剥離するまで、0.25%のトリプシンを1 mLで5分間解離します。
- 完全なHITES培地の10 mLを加えてトリプシンを中和し、15 mLチューブ内の細胞を集めます。遠心分離機 300 x g で 4 °C で 5 分間
注意:過剰消化は細胞死を引き起こす可能性があるため、顕微鏡によるトリプシン消化の時間を注意深く監視する。 - 上清を捨て、10%FBSでHITES培地2mLの細胞を再懸濁します。
- 上記の細胞懸濁液のピペット10μLをプレートに挿入し、自動セルカウンターに挿入して細胞/mLの濃度を得る。
- BEAS-2B細胞を3×10個 の5細胞/mLの濃度で6ウェルプレートにプレートし、一晩培養のためにFBSの10%を添加したHITES培地で2mLの総体積を2mLにした。
- 約80%の合流度、または5 x 105 細胞/mLで細胞を、3時間CSEの4%で治療します。CSE処理の前に、FBSの1%でHITES培地で媒体を交換してください。
4. 細菌感染
- P.エルギノーザまたはP.フルオレセンスミグラ(1×17 CFU/mL)をCSE処理細胞の各ウェルに加え、5%CO2で37°Cで1時間インキュベートする。7 2
- 上清を吸引し、4%CSEおよび100 μg/mLのゲンタマイシンと扱うために2 mLの新鮮なHITES媒体と交換してください。
注:ゲンタマイシンは、ヒト肺上皮細胞膜に浸透することができないので使用されます。したがって、それは培地内のすべての細菌を殺すことができるが、肺上皮細胞に侵入したものではない。 - CSE/ゲンタマイシン処理を5%CO2で37°Cで1時間2処理した後、上清を吸引し、その後の細菌濃度決定のために細胞3xをPBSで洗浄した。
注:内在菌を確認するために、GFP標識 P.フルオレセンスミグラに感染した細胞は、蛍光顕微鏡下で観察されました。
5. ドロッププレート法による細菌濃度の測定
- ドロッププレート法で感染した細胞の細菌負荷を判定するには、ゲンタマイシン処理した細胞を2mLの冷たいPBSで洗浄します。
- 各ウェルに細胞溶菌バッファー(PBSで0.5%トリトンX-100)の1 mLを加えます。
- TSB寒天板への次の接種のために、内在化した細菌を含む細胞ライセートを勾配(1:10、1:100、1:1,000、および1:10,000)で希釈します。
- 16時間のインキュベーション後、細菌コロニーをカウントしてCFUの結果を得る。
細菌16S rRNAのRT-qPCR検出
- 上述のようにゲタマイシンを用いて、シュードモナス感染肺上皮細胞(〜1 x 106細胞/mL)を治療する。6培地を吸引し、2mLの冷たいPBSで細胞2倍を洗浄する。
- 6ウェルプレートのウェルあたりグアニジウムチオシアネートライシスバッファーの0.35 mLを追加します。セルスクレーパーでセルを収集します。ライゼートをマイクロ遠心分離チューブにピペットし、ピペットとやさしく混ぜます。
- 作りたての70%エタノールを同じボリューム(0.35mL)をlysateに加え、よく混ぜます。すべてのサンプルを 2 mL コレクションチューブに配置されたスピンカラムに移します。20~25 °Cで30sの10,000 x g で遠心分離機。 その後、コレクションチューブ内のバッファを廃棄します。
- 0.7 mLの洗浄バッファー 1 でカラムを洗浄します。30 s の場合、10,000 x g の列を遠心分離します。0.5 mLのバッファーでカラム2xを洗浄し、膜結合RNAを洗浄します。10,000 x g で 2 分間遠心分離を繰り返します。
- 柱を新しい 1.5 mL コレクションチューブに配置します。30~50 μL のRNaseフリーウォーターを追加します。10,000 x g で1分間遠心分離機。フロースルーを収集し、RNA濃度を測定します。
- 製造者のプロトコルに従って逆転写反応を行います。全RNAの1μgを10 mLの反応バッファー、1μLの逆転写酵素、RNaseフリー水と混合して20μLの反応を行います。37°Cで1時間、95°Cで5分間逆転写反応を行います。
- cDNAテンプレート(上記の各逆転写反応の1 μL)、SYBR色素を含むマスターミックスの5 μL、200 nM特異的プライマーのそれぞれ1μL、および20μL混合物中の水を混ぜ合わせて、以下のPCR分析を行います。
注:以下は 、P.エルギノーザの16S rRNAを標的とするプライマーです: フォワード5'-CAAACTGAGCTAGAGTACG-3';逆5'-TAAGATCTCAAGガタクタCGGC-3′。 GAPDH は、次のプライマーを持つ負荷制御として使用されました: 前方: 5'-GGCATGGACTGGTCATGA-3′;逆:5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′。 - 比較CT法を用い、式を決定します。
7. フローサイトメトリーを用いた蛍光 シュードモナス の検出
- 上記の蛍光 シュードモナス-感染肺上皮細胞(〜1 x 106 細胞/mL)を前に述べたようにゲンタマイシンで治療する。培地を吸引し、2mLの冷たいPBSで細胞2倍を洗浄する。
- GFPの検出のために509 nmの波長のフローサイトメーターでサンプルを分析しなさい。各読み取り値を 100,000 カウントで終了します。取得したデータを関連ソフトウェアで分析します。
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Representative Results
図を使用して、図 1にプロトコルを示します。肺上皮BEAS-2B細胞はCSEで治療され、シュードモナスで挑戦した。培地中のシュードモナスを添加したゲンタマイシンによって殺され、細胞はドロッププレートアッセイ、シュードモナスリボソーム16S RNAのRT-qPCR検出、およびフローサイトメトリーを行った。対照と比較して、CSE治療は、ドロッププレート法における細菌感染を実質的に増加させた(図2)。これに対応して、CSEはHSAECにおける細菌負荷に影響を与えた(図3)。細胞生存率は、3時間4%CSE処置後、シュードモナス感染の1時間、または1時間のゲンタマイシン治療で大きく変化しなかった(図4図6)。 Figure 516S rRNA標的RT-qPCR法(図7)およびフローサイトメトリー(図8)は同様の結果を示した。蛍光顕微鏡の結果、P.フルオレセンスミグラ感染実験において、GFP標識菌がBEAS-2B細胞と同局化することが示された(図9)。これらの結果は、タバコの喫煙がBEAS-2B細胞のシュードモナス負荷を増加させたことを示唆している。
図1:肺上皮細胞における シュードモナス 感染に対するタバコの煙の影響を研究するためのプロトコルの概略的な提示。 細胞培養インサートまたは従来の培養プレートまたは肺オルガノイドで増殖した肺上皮細胞を、喫煙ロボットを介して16分間タバコの煙にさらされたか、または調製4%CSEで3時間処理した。これらの細胞は、その後、1時間(MOI = 10)の P.緑素吸いで 感染した。ゲンタマイシンは、培養培地中の生きた シュードモナス を排除するために使用された。上記細胞は、細菌負荷を決定するために、ドロッププレート法、qRT-PCR、またはフローサイトメトリーアプローチを行った。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:肺上皮BEAS-2B細胞における細菌負荷を測定するドロッププレート法。 BEAS-2B細胞を3時間4%CSEで処理した。その後、細胞は P.緑素吸い( 株PAO1)感染を1時間行い、続いてゲンタマイシン治療を1時間行った。細胞をリセートし、細胞ライセートを16時間TSBプレートに接種するために希釈した。コロニーは数えられました。CFU 番号はプロットに示されています。グラフは平均±SDを示し、「*」はP<0.05を示します。結果はn=3実験の代表である。双方向のペアでない Student t-test は、煙処理および未処理のグループに使用されました。P < 0.05 は統計的有意性を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HSAEC細胞における細菌負荷を測定するドロッププレート法。 ヒトの一次小気道上皮細胞を3時間4%CSEで処理した。その後、細胞は P.緑素吸い( 株PAO1)感染を1時間行い、続いてゲンタマイシン治療を1時間行った。細胞をリセートし、細胞ライセートをTSBプレート上で16時間接種するように希釈した。コロニーは数えられました。CFU 番号はプロットに示されています。グラフは平均±SDを示し、「*」はP<0.05を示します。結果はn=3実験の代表である。双方向のペアでない Student t-test は、煙処理および未処理のグループに使用されました。P < 0.05 は統計的有意性を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CSE処理肺上皮BEAS-2B細胞における細胞生存率の測定 肺上皮BEAS-2B細胞を3時間4%CSEで処理した。細胞をトリパンブルーで染色し、細胞の生存率を細胞カウンターで測定した。グラフは平均±SDを示し、結果はn=3実験を代表する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: シュードモナス感染肺上皮BEAS-2B細胞における細胞生存率の測定 肺上皮BEAS-2B細胞は 、1時間の間、P.緑素吸皮 (MOI=10)に感染した。細胞をトリパンブルーで染色し、細胞の生存率を細胞カウンターで測定した。グラフは平均±SDを示し、結果はn=3実験を代表する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ゲンタマイシン処理肺上皮BEAS-2B細胞における細胞生存率の測定 肺上皮BEAS-2B細胞を100μg/mLゲンタマイシンで1時間処理した。細胞をトリパンブルーで染色し、細胞の生存率を細胞カウンターで測定した。グラフは平均±SDを示し、結果はn=3実験を代表する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:qRT-PCRは肺上皮細胞における細菌負荷を決定する。図2の処置細胞は、全RNA抽出を行った。各試料からのRNAの量を逆にcDNAに転写し、緑素吸盤の16S RNAの量を特異的プライマーペアを用いて定量PCRで求めた。qPCR の結果はグラフにプロットされます。グラフは平均±SDを示し、「*」はP<0.05を示します。結果はn=3実験の代表である。双方向のペアでない Student t-test は、煙処理および未処理のグループに使用されました。P < 0.05 は統計的有意性を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:フローサイトメトリーは、肺上皮細胞における細菌負荷を決定する。 BEAS-2B細胞をCSEで処理し 、P.フルオレセンス・ミグラ (株PAO143)に感染した。感染した細胞をゲンタマイシンで処理し、トリプシンで消化して細胞懸濁液を作った。細胞懸濁液をフローサイトメーターを通過し、蛍光 シュードモナス陽性細胞を波長509nmで決定した。フローサイトメトリーの結果はグラフにプロットされます。グラフは平均±SDを示し、「*」はP<0.05を示します。結果はn=3実験の代表である。双方向のペアでない Student t-test は、煙処理グループと未処理グループに使用されました。P < 0.05 は統計的有意性を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:蛍光顕微鏡による細菌感染の観察 BEAS-2B細胞は 、P.フルオレセンスミグラ (株PAO143)に1時間感染した。細胞をゲンタマイシンでさらに1時間処理し、2倍を冷たいPBSで洗浄した。GFP標識菌を蛍光顕微鏡下で480nmの波長で観察し、BEAS-2B細胞を位相画像で可視化した。画像がマージされ、代表的な結果が表示されます。スケールバー= 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
肺上皮細胞への細菌の侵入は、細菌感染の病因における重要なステップである。細菌の細胞への侵入のプロセスは、次の3つのステップに分けることができます:まず、細菌が接触し、それらのフラゲラを使用して上皮細胞の表面に付着します。第二に、細菌は内在化を受けるか、細胞膜に浸透する。最後に、細菌は細胞防御機構25,26を正常に脱出すれば細胞を複製し、コロニー形成する。肺ミクロファージにおける細菌感染の観察のためのアプローチは長い間開発されてきたが、肺上皮細胞27,28,28の限られた知識を有する。この研究は、ドロッププレートアッセイ、シュードモナスリボソーム16S RNAのRT-qPCR、フローサイトメトリーの3つのアプローチを介して肺上皮細胞の細菌負荷を決定した。3 つのアプローチはすべて、同様の感度でうまく機能します。肺上皮細胞における細菌負荷を決定するアプローチを選択することは、機器の可用性と時間に依存する。これらの実験では、細菌のフラゲラを損傷を受けずに無傷に保つことは、肺上皮細胞感染の成功のために重要である29。速度が制限された短い揺れ時間は、細菌の侵入能力30をさらに促進するのに役立つかもしれない。
肺上皮細胞における細菌濃度の決定における主要な障害は、培養培地からの細菌汚染である。細胞感染実験では、細菌は特定の期間(すなわち、1時間)培養培地に添加される。その時間内に、その細菌負荷の一部が細胞質コンパートメントに侵入することに成功したが、残基は細胞の外膜に付着する可能性がある。抗生物質を、ゲンタマイシンは、培養培地中の細菌および細胞31の外膜に付着した残基中の細菌を殺すために使用される。ゲンタマイシンは細胞膜に透過性ではないと考えられ、したがって、細胞内の既に細菌に影響を与えない.ゲンタマイシンによる治療は、このシステムが感染した肺上皮細胞の外側からの潜在的な汚染を排除するのに理想的です。
タバコの煙が肺上皮細胞の細菌感染に及ぼす影響を調べるためには、肺細胞は細胞モデルで細菌感染する前にタバコの煙にさらされる必要があります。従来のアプローチは、細胞を治療するための新鮮なCSEを準備しています。CSEの生成は、研究のための費用対効果の高い方法です。CSEは取り扱いが容易であり、CSEを作る工程は簡単であり、CSE気管内注射は短時間32で動物モデルにおける肺気腫の発生に有効である。直接タバコ暴露のアプローチは、インビトロ細胞モデルと生体内げっ歯類モデルの両方のために開発されています。マウスへの毎日のタバコの煙暴露の6ヶ月は、肺気腫33を生成するために広く使用されている。直接タバコの煙暴露はタバコの燃焼および細胞培養システムを結合する複雑な装置を要求する。タバコの燃焼はタバコの煙を生成しますが、また、培養室の温度と湿度に影響を与える可能性のある熱の合計量を生成します。幸いなことに、最近の技術は、直接タバコの煙暴露を容易にする21.国際標準化機構(ISO)プロトコルが、直接タバコの煙暴露実験22のために実施されました。タバコの煙への暴露は、一度または複数回行うことができます。また、細胞培養技術の進歩に伴い、肺初代上皮細胞を透明な挿入物上で増殖させることもでき、コンフルエント肺上皮細胞単層34を得ることができる。肺上皮細胞単層は、構造的に肺組織における生理学的状態を模倣する。セルは、空気液体界面35で、空気状の気体の煙や空気にさらされる可能性があります。さらに、肺オルガノイドの培養は、現在の肺研究3636,3737で出現している。タバコの煙が肺オルガノイドの細菌感染にどのような影響を与えるかを知るのは興味深いでしょう。記載されたアプローチは、培養細胞の代わりに組織におけるヒト感染を模倣し、下気道細菌感染におけるさらなる洞察を可能にするかもしれない。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所R01がHL125435とHL142997(CZに)を付与することによって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
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