Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersøgelse virkninger af cigaretrøg på Pseudomonas infektion i lung epitelceller

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Beskrevet her er en protokol til at undersøge, hvordan cigaretrøg ekstrakt påvirker bakteriel kolonisering i lunge epitelceller.

Abstract

Cigaretrygning er den vigtigste ætiv årsag til lungeemfysem og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). Cigaretrygning fremmer også modtagelighed for bakterielle infektioner i åndedrætssystemet. Men, virkningerne af cigaretrygning på bakterielle infektioner i menneskelige lunge epitelceller er endnu ikke blevet grundigt undersøgt. Beskrevet her er en detaljeret protokol for fremstilling af cigaretrygning ekstrakter (CSE), behandling af menneskelige lunge epitelceller med CSE, og bakteriel infektion og infektion bestemmelse. CSE blev udarbejdet med en konventionel metode. Lungeepitelceller blev behandlet med 4% CSE i 3 timer CSE-behandlede celler blev derefter smittet med Pseudomonas ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10. Bakteriebelastninger af cellerne blev bestemt ved tre forskellige metoder. Resultaterne viste, at CSE øget Pseudomonas belastning i lunge epitelceller. Denne protokol, derfor, giver en enkel og reproducerbar tilgang til at undersøge effekten af cigaretrøg på bakterielle infektioner i lunge epitelceller.

Introduction

Cigaretrygning påvirker folkesundheden for millioner af mennesker verden over. Mange skadelige sygdomme, herunder lungekræft og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), er rapporteret at være relateret tilcigaretrygning 1,,2. Cigaretrygning øger modtageligheden af akutte mikrobielle infektioner i åndedrætssystemet3,4,5. Desuden, stigende beviser viser, at cigaretrygning øger patogenese af mange kroniske lidelser6,7,8. For eksempel, cigaretrygning kan øge virale eller bakterielle infektioner, der forårsager KOL forværring9. Blandt de bakterielle patogener, der etiologisk bidrager til akut forværring af KOL, en opportunistisk gram-negative bacillus patogen, Pseudomonas aeruginosa, forårsager infektioner, der korrelerer med dårlige prognoser og højere dødelighed10,11. KOL-forværring forværrer sygdommen ved at accelerere patologisk progression. Der findes ingen effektive behandlinger mod COPD-forværring bortset fra den antisymptomatiske ledelse12. KOL-forværring fremmer patientdødelighed, sænker livskvaliteten og øger den økonomiske byrde for samfundet13.

Luftvejene er et åbent system, kontinuerligt udsat for forskellige mikrobielle patogener til stede eksternt. Opportunistiske bakteriepatogener påvises normalt i de øvre luftveje, men observeres nogle gange i de nedreluftveje 14,15. I dyremodeller kan P. aeruginosa påvises i alveolær sække, så snart 1 time efter infektion16. Som en stor forsvarsmekanisme, immunceller såsom makrofager eller neutrofiler fjerne bakterier i luftvejene. Lunge epitelceller, som den første fysiologiske barriere, udføre en unik rolle i værten forsvar mod mikrobielle infektioner. Lunge epitelceller kan regulere mikrobiel invasion, kolonisering, eller replikation uafhængig af immunceller17. Nogle molekyler findes i epitelceller, herunder PPARg, udøve antibakterielle funktioner, og dermed regulere bakteriel kolonisering og replikation i lunge epitelceller18. Cigaretrygning kan ændre molekylerne og forringe den normale forsvarsfunktion i lunge epitelceller19,20. Nylige undersøgelser rapporterede direkte eksponering af cigaretrøg til lunge epitelceller ved hjælp af robot rygningapparat 21,22. Eksponering for røg kan udføres på andre måder, dog, herunder anvendelse af CSE. Fremstilling af CSE er en reproducerbar tilgang med potentielle anvendelser i andre celletyper, herunder vaskulære endotelceller, der indirekte udsættes for cigaretrøg.

Denne rapport beskriver en protokol til at generere cigaretrøg ekstrakt til at ændre bakteriel belastning i lunge epitelceller. CSE øger bakteriel belastning af P. aeruginosa, og det kan bidrage til en gentagelse af bakterielle infektioner normalt ses i KOL-forværring. Der anvendes en konventionel metode til fremstilling af cse. Lunge epitelceller, på deres eksponentielle vækstfase, behandles med 4% CSE i 3 timer. Alternativt kan monolag-kultiverede lunge epitelceller være direkte udsat for cigaretrøg i en luft-væske interface. CSE-behandlede celler udfordres derefter med Pseudomonas ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10. Bakterierne formeres med en særlig rystehastighed for at sikre, at morfologien af deres flagella forbliver intakt for at bevare deres fulde invasive kapacitet. Gentamycin er ansat til at dræbe de bakterier tilbage i kulturmediet, hvilket reducerer den potentielle forurening under den efterfølgende bestemmelse af bakteriebelastningen. Protokollen bruger også GFP-mærket Pseudomonas, som er blevet udnyttet som et kraftfuldt værktøj til at studere Pseudomonas infektion i forskellige modeller. En repræsentativ stamme er P. fluorescens Migula23. Graden af infektion eller bakteriel belastning efter CSE behandling bestemmes på tre måder: drop plade metode med koloni optælling, kvantitativ PCR ved hjælp af Pseudomonas 16S rRNA-specifikke primere, eller flow cytometri i celler inficeret med fluorescerende Pseudomonas. Denne protokol er en enkel og reproducerbar tilgang til at studere effekten af cigaretrøg på bakterielle infektioner i lunge epitelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 100% CSE forberedelse

  1. Tegn 10 ml serumfrit cellekulturmedie (DMEM/F12 for BEAS-2B-celler; luftvejsepitelcelles basalmedium til HSAEC-celler) i en 60 ml sprøjte.
  2. Sæt en passende trimmet 1 ml pipettespids på sprøjtens dyse som adapter til at holde cigaretten (3R4F) på en passende trimmet pipettespids.
  3. Fjern filteret af cigaretten. Fastgør en cigaret til spidsen adapter og forbrænde cigaretten.
  4. Tegn 40 ml røgholdig luft i 10 ml serumfrit medie. Bland røgen med mediet ved kraftigt at ryste (30 s pr. træk).
  5. Gentag trin 1,4 omkring 11x i ~ 7 min, indtil cigaretten er helt brændt ud.
  6. Røget mediets 10 ml røget medie filtreres med et 0,22 μm-filter for at udelukke mikroorganismer og uopløselige partikler. Overføres til et lukket sterilt rør. Forbered 100% CSE ikke mere end 30 min før den efterfølgende analyse.

2. Pseudomonas kultur

  1. Inokuler frosset P. aeruginosa (stamme PAO1) eller P. fluorescens Migula (stamme PAO143) i en tryptisk sojstbouillon (TSB) agarplade til nattens kultur ved 37 °C.
    BEMÆRK: For at opnå nok bakterier til dyrkning, spredes så mange bakterier på TSB agar plade som muligt.
  2. Opsaml en bakteriel udtværing og inkuber i 20 ml TSB med 5% af glycerol som kulstofkilde.
  3. Bakteriesuspensionen rystes i en 37 °C-inkubator ved 200 omdr./min. i 1 time, indtil OD600-værdien = 0,6.
    FORSIGTIG: Lad ikke rystehastigheden overstige 200 omdr./min. Højere rystehastigheder kan beskadige bakterieflagellaens morfologi og påvirke bakterieinvasionen i lungeepithelia. Ligeledes begrænse rystetiden til 1 h for at opnå meget invasive bakterier. Mål OD600-værdien for at anslå antallet af bakterier. En OD600 = 1 svarer til ~ 109 kolonidannende enheder (CFU)/ml.

3. Human lunge epitelcellekultur og CSE behandling

  1. Human BEAS-2B-celler i HITES-mediet (500 ml DMEM/F12, 2,5 mg insulin, 2,5 mg transferrin, 2,5 mg natrium selenit, 2,5 mg transferrin, 10 μM hydrocortison, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES og 2 mM L-glutamin) suppleret med 10% føtal kvægseum (FBS) som tidligere beskrevet24.
  2. Humane primære luftvejsepitelceller (HSAEC) i luftvejenes epitelcellekulturmedium (500 ml luftvejscellef basalt medium, 500 μg/ml HSA, 0,6 μM linolsyre 0,6 μg/mL lecithin, 6 mM L-glutamin, 0,4% ekstrakt P, 1,0 μM adrenalin, 5 μg/mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL hydrocortison, rh EGF 5 ng/mL og 5 μg/mL rh insulin). Cellerne inkuberes ved 37 °C i 5 % CO2.
  3. Dissocier cellerne med 1 ml 0,25% trypsin i 5 min, indtil cellerne helt løsne fra bunden af pladen.
  4. Tilsæt 10 ml komplet HITES medium for at neutralisere trypsin og indsamle cellerne i et 15 ml rør. Centrifuge ved 4 °C ved 300 x g i 5 min.
    FORSIGTIG: Overvåg omhyggeligt tiden for trypsinfordring ved mikroskopi, da overdigestion kan forårsage celledød.
  5. Kassér supernatanten og opspjæn dine celler i 2 ml HITES-medium med 10% FBS.
  6. Pipette 10 μL af ovenstående cellesuspension på pladen og sætte den i en automatiseret celletæller for at opnå koncentrationen i celler/ml.
  7. Plade BEAS-2B celler i en koncentration på 3 × 105 celler / ml i 6 brøndplader i et samlet volumen på 2 ml i HITES medium suppleret med 10% af FBS for natten kultur.
  8. Behandl cellerne ved ca. 80% sammenløb, eller 5 x 105 celler/ml, med 4% CSE i 3 timer. Før CSE behandling, ændre mediet med HITES medium med 1% af FBS.

4. Bakteriel infektion

  1. Der tilsættes P. aeruginosa eller P. fluorescens Migula (~1 × 107 CFU/ml) til hver brønd af CSE-behandlede celler og inkuberes i 1 time ved 37 °C i 5 % CO2.
  2. Inspirer supernatanterne og udskift med 2 ml frisk HITES-medium til behandling med 4% CSE og 100 μg/mL gentamicin.
    BEMÆRK: Gentamicin anvendes, fordi det ikke er i stand til at trænge ind i humane lunge epitelcellulære membraner. Således kan det dræbe alle de bakterier i mediet, men ikke dem, der invaderede lunge epitelceller.
  3. Efter 1 time CSE/gentamicin behandling ved 37 °C i 5% CO2,aspirere supernatanterne og vask cellerne 3x med PBS for den efterfølgende bakterielle koncentration bestemmelse.
    BEMÆRK: For at bekræfte de internaliserede bakterier blev celler inficeret med GFP-mærket P. fluorescens Migula observeret under fluorescerende mikroskopi.

5. Bestemmelse af bakteriekoncentration ved hjælp af dråbeplademetoden

  1. For at bestemme bakteriebelastningen i inficerede celler med dropplademetoden vaskes de gentamycinbehandlede celler 2x med 2 ml kold PBS.
  2. Der tilsættes 1 ml cellelysisbuffer (0,5 % triton X-100 i PBS) til hver brønd.
  3. Cellelysater, der indeholder de internaliserede bakterier i et gradient (1:10, 1:100, 1:1.000 og 1:10.000) for følgende vaccination mod TSB agarpladen.
  4. Efter 16 timers inkubation opnås resultaterne af CFU ved at tælle bakteriekolonierne.

6. RT-qPCR-påvisning af bakteriel 16S rRNA

  1. Genbehandl pseudomonas-inficeredelungeepitelceller (~1 x 106 celler/ml) med gentamycin som beskrevet ovenfor. Aspirere mediet og vask cellerne 2x med 2 ml kold PBS.
  2. Der tilsættes 0,35 ml af guanidium thiocyanate lysis buffer pr. brønd af en 6 brøndplade. Saml cellerne med en celleskraber. Pipette lysatet i et mikrocentrifugerør og bland forsigtigt med pipetten.
  3. Tilsæt det samme volumen (0,35 ml) frisklavet 70% ethanol i lysatet og bland godt. Overfør alle prøver til en spin kolonne placeret i en 2 ml opsamlingsrør. Centrifuge ved 10.000 x g for 30 s ved 20-25 °C. Kassér derefter bufferen i opsamlingsrøret.
  4. Kolonnen vaskes med 0,7 ml vaskepude 1. Centrifuge kolonnen ved 10.000 x g for 30 s. Kolonne 2x vaskes med 0,5 ml buffer for at vaske det membranbundne RNA. Centrifugering ved 10.000 x g gentages i 2 min.
  5. Kolonnen anbringes i et nyt 1,5 ml opsamlingsrør. Der tilsættes 30-50 μL RNase-frit vand. Centrifuge ved 10.000 x g i 1 min. Opsaml flow-through og måle RNA-koncentrationen.
  6. Udfør en omvendt transskriptionsreaktion i henhold til producentens protokol. Bland 1 μg total RNA med 10 ml reaktionsbuffer, 1 μL omvendt transskription og RNase-frit vand for en 20 μL reaktion. Den omvendte transskriptionsreaktion udføres ved 37 °C i 1 time og derefter 95 °C i 5 min.
  7. CDNA-skabelonerne (1 μL af hver omvendt transskriptionsreaktion ovenfor), 5 μL af Master Mix, der indeholder SYBR-farvestof, 1 μL af hver 200 nM-specifikke primere og vand i en 20 μL blanding til følgende PCR-analyse i henhold til fabrikantens anbefalinger.
    BEMÆRK: Følgende er primere rettet mod 16S rRNA af P. aeruginosa: fremad 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3′; omvendt 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH blev brugt som en lastning kontrol med følgende primere: fremad: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; omvendt: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
  8. Brug den sammenlignende CT-metode til at bestemme udtrykket.

7. Påvisning af fluorescerende Pseudomonas med flowcytometri

  1. Overbevis ovenstående fluorescerende Pseudomonas-inficeredelungeepitelceller (~1 x 106 celler/ml) med gentamycin som tidligere beskrevet. Aspirere mediet og vask cellerne 2x med 2 ml kold PBS.
  2. Prøverne analyseres med et flowcytometer ved en bølgelængde på 509 nm til påvisning af GFP. Afslut hver aflæs med 100.000 tællinger. Analysér de erhvervede data med relateret software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der bruges et diagram til at illustrere protokollen i figur 1. Lunge epitel BEAS-2B celler blev behandlet med CSE og udfordret med Pseudomonas. Pseudomonas i kulturmediet blev dræbt af den tilsat gentamycin, og cellerne blev udsat for drop pladeanalyse, RT-qPCR-påvisning af Pseudomonas ribosom 16S RNA og flowcytometri. Sammenlignet med kontrol, CSE behandling væsentligt øget bakteriel infektion i drop plade metoder (Figur 2). Tilsvarende cse påvirket bakteriel belastning i HSAEC (Figur 3). Cellernes levedygtighed blev ikke ændret betydeligt efter 3 timers behandling med 4 % cse, i 1 h Pseudomonas-infektion eller i 1 time af behandling med gentamycin (figur 4 Figur 5 Figur 6). 16S rRNA-target RT-qPCR-metoden (Figur 7) og flowcytometri (Figur 8) viste lignende resultater. Resultater fra fluorescerende mikroskopi viste, at GFP-mærkede bakterier colocalized med BEAS-2B celler i en P. fluorescens Migula infektion eksperiment (Figur 9). Disse resultater tyder på, at cigaretrygning øget Pseudomonas belastning i BEAS-2B celler.

Figure 1
Figur 1: Skematisk præsentation af protokollen for at undersøge cigaretrøg virkninger på Pseudomonas infektion i lunge epitelceller. Lunge epitelceller dyrket i cellekultur skær eller konventionelle kultur plader eller lunge organoids blev udsat for cigaretrøg i 16 min via rygning robot eller behandlet med forberedt 4% CSE i 3 timer. Disse celler blev derefter inficeret med P. aeruginosa i 1 time (MOI = 10). Gentamycin blev brugt til at eliminere levende Pseudomonas i kulturmediet. Ovenstående celler var underlagt drop plade metode, qRT-PCR, eller flow cytometri tilgange til at bestemme bakteriebelastningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dråbeplademetode til bestemmelse af bakteriebelastning i lungeepitel-BEAS-2B-celler. BEAS-2B celler blev behandlet med 4% CSE i 3 timer. Cellerne blev derefter udsat for P. aeruginosa (stamme PAO1) infektion i 1 time efterfulgt af gentamycin behandling i yderligere 1 time. Cellerne blev lyset, og cellerneslysater blev fortyndet for at vaccinere TSB-plader i 16 timer. Kolonier blev talt; CFU-tallene er illustreret i plottet. Graf viser ± SD, og "*" betegner P < 0,05. Resultaterne er repræsentative for n = 3 eksperimenter. Tovejs-parerede Student t-testblev anvendt til røgbehandlede og ubehandlede grupper. P < 0,05 angiver statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dråbeplademetode til bestemmelse af bakteriebelastning i HSAEC-celler. Humane primære små luftvejs epitelceller blev behandlet med 4% CSE i 3 timer. Cellerne blev derefter udsat for P. aeruginosa (stamme PAO1) infektion i 1 time efterfulgt af gentamycin behandling i yderligere 1 time. Cellerne blev lyset og cellelysater blev fortyndet til at inokulere på TSB plader i 16 timer. Kolonier blev talt; CFU-tallene er illustreret i plottet. Graf viser ± SD, og "*" betegner P < 0,05. Resultaterne er repræsentative for n = 3 eksperimenter. Tovejs-parerede Student t-testblev anvendt til røgbehandlede og ubehandlede grupper. P < 0,05 angiver statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Bestemmelse af cellernes levedygtighed i CSE-behandlede lungeepitel-BEAS-2B-celler. Lunge epitel BEAS-2B celler blev behandlet med 4% CSE i 3 timer. Cellerne blev plettet med trypanblå og celle levedygtighed blev målt med celle tæller. Graf viser gennemsnitlige ± SD. Resultaterne er repræsentative for n = 3 eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Bestemmelse af cellernes levedygtighed i Pseudomonas-inficeredelungeepitel-BEAS-2B-celler. Lungeepitel-BEAS-2B-celler blev inficeret med P. aeruginosa (MOI = 10) i 1 time. Cellerne blev plettet med trypanblå og celle levedygtighed blev målt med en celle tæller. Graf viser gennemsnitlige ± SD. Resultaterne er repræsentative for n = 3 eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Bestemmelse af cellernes levedygtighed i cellerne i gentamycinbehandlet lungeepitel BEAS-2B. Lungeepitel-BEAS-2B-celler blev behandlet med 100 μg/ml gentamycin i 1 time. Cellerne blev plettet med trypanblå og celle levedygtighed blev målt med en celle tæller. Graf viser gennemsnitlige ± SD. Resultaterne er repræsentative for n = 3 eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: qRT-PCR for at bestemme bakteriebelastningen i lungeepitelceller. Behandlede celler i figur 2 blev udsat for total RNA-ekstraktion. En tilsvarende mængde RNA fra hver prøve blev omvendt transskriberet til cDNA, og mængden af 16S RNA P. aeruginosa blev bestemt med kvantitativ PCR ved hjælp af specifikke primerpar. Resultater fra qPCR afbildes i grafen. Graf viser ± SD, og "*" betegner P < 0,05. Resultaterne er repræsentative for n = 3 eksperimenter. Tovejs-parerede Student t-testblev anvendt til røgbehandlede og ubehandlede grupper. P < 0,05 angiver statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Flowcytometri til bestemmelse af bakteriebelastning i lungeepitelceller. BEAS-2B celler blev behandlet med CSE og inficeret med P. fluorescens Migula (stamme PAO143). Inficerede celler blev behandlet med gentamycin og fordøjet med trypsin at gøre en celle suspension. Cellesuspensioner blev passeret gennem flow cytometer og fluorescerende Pseudomonas-positiveceller blev bestemt ved en bølgelængde på 509 nm. Resultater fra flowcytometri afbildes i grafen. Graf viser ± SD, og "*" betegner P < 0,05. Resultaterne er repræsentative for n = 3 eksperimenter. Tovejs-uophandlet Student t-testblev brugt til røgbehandlede og ubehandlede grupper. P < 0,05 angiver statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Observation af bakteriel infektion med fluorescerende mikroskopi. BEAS-2B celler blev inficeret med P. fluorescens Migula (stamme PAO143) i 1 time. Cellerne blev behandlet med gentamycin i yderligere 1 time og vasket 2x med kold PBS. De GFP-mærkede bakterier blev observeret under et fluorescerende mikroskop ved en bølgelængde på 480 nm, og BEAS-2B-celler blev visualiseret med et fasebillede. Billederne blev flettet, og det repræsentative resultat vises. Skalalinje = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakteriel invasion i lunge epitelceller er et afgørende skridt i patogenesen af bakterielle infektioner. Processen med bakteriel invasion i cellerne kan opdeles i følgende tre trin: For det første, bakterierne kontakt og holde sig til overfladen af epitelcellen ved hjælp af deres flagella. For det andet, bakterierne enten gennemgå internalisering eller trænge ind i cellulære membran. Endelig bakterier replikere og kolonisere cellerne, hvis de med held undslippe cellulæreforsvarsmekanismer 25,26. Der har længe været udviklet metoder til observation af bakterielle infektioner i lungemikrofager, men med begrænset kendskab til lungeepitelceller27,28. Denne undersøgelse bestemmes bakteriel belastning i lunge epitelceller via tre tilgange: en drop plade assay, RT-qPCR for Pseudomonas ribosom 16S RNA, og flow cytometri. Alle tre tilgange fungerer godt med lignende følsomheder. Valg af tilgange til at bestemme bakteriel belastning i lunge epitelceller afhænger af tilgængeligheden af udstyr og tid. I disse eksperimenter, holde bakterielle flagella ubeskadiget og intakt er afgørende for en vellykket lunge epitelcelleinfektion29. En kortere rystetid med begrænset hastighed kan bidrage til yderligere at fremme bakterieinvaderende kapacitet30.

En væsentlig hindring ved bestemmelse af bakteriekoncentrationen i lungeepitelceller er den bakterielle forurening fra kulturmediet. I celleinfektionsforsøg tilsættes bakterierne i kulturmediet i en bestemt tidsperiode (dvs. 1 h). Inden for denne tid, en del af denne bakterielle belastning held invaderer det cytoplasmatiske rum, men rester kan knytte til den ydre membran af cellerne. Et antibiotikum, gentamycin, bruges til at dræbe bakterier i kulturmediet og de rester, der er knyttet til den ydre membran af cellerne31. Gentamycin anses ikke gennemtrængelig for cellulære membran og vil derfor ikke påvirke de bakterier, der allerede er i cellerne. Behandling med gentamycin gør det ideelt for dette system til at udelukke den potentielle forurening fra lande uden for de inficerede lunge epitelceller.

For at undersøge effekten af cigaretrøg på bakteriel infektion i lunge epitelceller, lungeceller skal udsættes for cigaretrøg før bakteriel infektion i cellulære modeller. En konventionel tilgang er ved at forberede frisk CSE til behandling af celler. Generering af cse er en omkostningseffektiv metode til undersøgelser. CSE er let at håndtere, processen med at gøre CSE er enkel, og CSE intratracheal injektion er effektiv i produktionen af emfysem i dyremodeller i en kort periode32. Der er også udviklet metoder til direkte cigareteksponering for både in vitro-cellemodeller og in vivo-gnavermodeller. Seks måneders daglig cigaretrøg eksponering for mus er almindeligt anvendt til at generere emfysem33. Direkte cigaretrøg eksponering kræver kompliceret udstyr, der kombinerer cigaretforbrænding og celle kultur systemer. Cigaretforbrænding producerer cigaretrøg, men genererer også en samlet mængde varme, der kan påvirke kulturkammerets temperatur og fugtighed. Heldigvis, de seneste teknikker gør direkte cigaretrøg eksponering lettere21. En international standardorganisation (ISO) protokol er blevet gennemført for direkte cigaretrøg eksponering eksperimenter22. Udsættelse for cigaretrøg kan udføres en eller flere gange. Desuden, sammen med udviklingen af cellekultur teknikker, lunge primære epitelceller kunne også dyrkes på gennemsigtige skær for at opnå et sammenløb lunge epitelcelle monolayer34. Lunge epitelcelle monolayers strukturelt efterligne de fysiologiske forhold i lungevæv. Celler kan derefter udsættes for apikale gasformig røg eller luft ved luft-væske interface35. Desuden er kulturen af lungeorganoider dukket op i de nuværende lungeundersøgelser36,37. Det bliver interessant at vide, hvordan cigaretrøg påvirker bakteriel infektion i lunge organoids. Den beskrevne fremgangsmåde kan efterligne human infektion i væv i stedet for dyrkede celler og kan gøre det muligt yderligere indsigt i lavere respiratorisk bakteriel infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvis støttet af et nationalt institut for sundhed R01 tilskud HL125435 og HL142997 (til CZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

Tags

Denne måned i JoVE cigaretrøg eksponering cigaretrøg ekstrakt Pseudomonas infektion bakteriel belastning lunge epitelcelle lungeskade
Undersøgelse virkninger af cigaretrøg på <em>Pseudomonas</em> infektion i lung epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter