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Immunology and Infection

Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Aquí se describe un protocolo para estudiar cómo el extracto de humo de cigarrillo afecta la colonización bacteriana en las células epiteliales pulmonares.

Abstract

El tabaquismo es la principal causa etiológica para el enfisema pulmonar y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Fumar cigarrillos también promueve la susceptibilidad a las infecciones bacterianas en el sistema respiratorio. Sin embargo, los efectos del tabaquismo en infecciones bacterianas en células epiteliales pulmonares humanas aún no se han estudiado a fondo. Aquí se describe un protocolo detallado para la preparación de extractos para fumar cigarrillos (CSE), tratamiento de células epiteliales pulmonares humanas con EEB, y la determinación de infecciones bacterianas e infecciones. CSE se preparó con un método convencional. Las células epiteliales pulmonares fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células tratadas con CSE fueron, entonces, infectadas con Pseudomonas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las cargas bacterianas de las células fueron determinadas por tres métodos diferentes. Los resultados mostraron que la EEB aumentó la carga de Pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este protocolo, por lo tanto, proporciona un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

Introduction

El tabaquismo afecta la salud pública de millones de personas en todo el mundo. Muchas enfermedades notorias, incluyendo el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se han notificado relacionadas con el tabaquismo1,2. Fumar cigarrillos aumenta la susceptibilidad a las infecciones microbianas agudas en el sistema respiratorio3,4,5. Además, la creciente evidencia demuestra que fumar cigarrillos mejora la patogénesis de muchos trastornos crónicos6,,7,,8. Por ejemplo, fumar cigarrillos puede aumentar las infecciones virales o bacterianas que causan exacerbación de la EPOC9. Entre los patógenos bacterianos que contribuyen etiológicamente a la exacerbación aguda de la EPOC, un patógeno del bacilo gramnegativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,provoca infecciones que se correlacionan con los malos pronósticos y las mayores mortalidades10,11. La exacerbación de la EPOC empeora la enfermedad al acelerar la progresión patológica. No existen terapias eficaces contra la exacerbación de la EPOC, excepto para el manejo antisintomático12. La exacerbación de la EPOC promueve la mortalidad de los pacientes, disminuye la calidad de vida y aumenta la carga económica para la sociedad13.

Las vías respiratorias son un sistema abierto, sometido continuamente a diversos patógenos microbianos presentes externamente. Los patógenos bacterianos oportunistas se detectan generalmente en las vías respiratorias superiores, pero a veces se observan en las vías respiratorias inferiores14,15. En los modelos animales P. aeruginosa se puede detectar en sacos alveolares tan pronto como 1 h después de la infección16. Como un mecanismo de defensa importante, las células inmunitarias como los macrófagos o los neutrófilos eliminan las bacterias de las vías respiratorias. Las células epiteliales pulmonares, como la primera barrera fisiológica, desempeñan un papel único en la defensa del huésped contra las infecciones microbianas. Las células epiteliales pulmonares pueden regular la invasión microbiana, la colonización o la replicación independientemente de las células inmunitarias17. Algunas moléculas encontradas en las células epiteliales, incluyendo PPARg, ejercen funciones antibacterianas, regulando así la colonización bacteriana y la replicación en las células epiteliales pulmonares18. Fumar cigarrillos puede alterar las moléculas y afectar la función normal de defensa en las células epiteliales pulmonares19,20. Estudios recientes informaron de la exposición directa del humo del cigarrillo a las células epiteliales pulmonares utilizando el aparato robótico de fumar21,22. Sin embargo, la exposición al humo se puede realizar de otras maneras, incluida la aplicación de la EEB. La preparación de la EEB es un enfoque reproducible con posibles aplicaciones en otros tipos de células, incluidas las células endoteliales vasculares que están indirectamente expuestas al humo del cigarrillo.

Este informe describe un protocolo para generar extracto de humo de cigarrillo para alterar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. La EEB aumenta la carga bacteriana de P. aeruginosa,y puede contribuir a la recurrencia de infecciones bacterianas generalmente observadas en la exacerbación de la EPOC. Se utiliza un método convencional para la preparación de la EEB. Las células epiteliales pulmonares, en su etapa de crecimiento exponencial, se tratan con 4% de EEB durante 3 h. Alternativamente, las células epiteliales pulmonares cultivadas en monocapa pueden exponerse directamente al humo del cigarrillo en una interfaz aire-líquido. Las células tratadas con CSE se enfrentan a los desafíos con Pseudomonas en una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las bacterias se propagan a una velocidad de agitación particular para asegurar que la morfología de su flagela permanezca intacta para conservar toda su capacidad invasiva. La gentamicina se emplea para matar las bacterias que quedan en el medio de cultivo, reduciendo así la contaminación potencial durante la posterior determinación de la carga bacteriana. El protocolo también utiliza Pseudomonasetiquetada por GFP, que ha sido utilizado como una poderosa herramienta en el estudio de la infección por Pseudomonas en diferentes modelos. Una cepa representativa es Migula23de P. fluorescen. El grado de infección o carga bacteriana después del tratamiento de la CSE se determina de tres maneras: el método de placa de caída con recuento de colonias, PCR cuantitativo utilizando imprimaciones específicas de Pseudomonas 16S rRNA, o citometría de flujo en células infectadas con Pseudomonasfluorescentes. Este protocolo es un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

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Protocol

1. Preparación 100% CSE

  1. Dibuje 10 ml de medios de cultivo celulares libres de suero (DMEM/F12 para células BEAS-2B; medio basal de células epiteliales de las vías respiratorias para células HSAEC) en una jeringa de 60 ml.
  2. Fi reversely attach an appropriately trimmed 1 mL pipette tip to the nozzle of the syringe as an adapter to hold the cigarette (3R4F).
  3. Retire el filtro del cigarrillo. Coloque un cigarrillo en el adaptador de punta y peina el cigarrillo.
  4. Dibuje 40 ml de aire que contenga humo en 10 ml de medios libres de suero. Mezclar el humo con el medio agitando vigorosamente (30 s por dibujo).
  5. Repita el paso 1.4 aproximadamente 11x en 7 min hasta que el cigarrillo se queme por completo.
  6. Filtrar los 10 ml de medios ahumados con un filtro de 0,22 m para excluir cualquier microorganismo y partículas insolubles. Transfiera a un tubo estéril cerrado. Preparar el 100% CSE no más de 30 min antes del ensayo posterior.

2. Cultura Pseudomonas

  1. Inocular congelado P. aeruginosa (deformación PAO1) o P. fluorescens Migula (desgasitar PAO143) en una placa de agar de caldo de soja tríptico (TSB) para cultivo nocturno a 37oC.
    NOTA: Para obtener suficientes bacterias para el cultivo, esparza tantas bacterias en la placa de agar TSB como sea posible.
  2. Recoger un frotis bacteriano e incubar en 20 ml de TSB con 5% de glicerol como fuente de carbono.
  3. Agitar la suspensión bacteriana en una incubadora de 37oC a 200 rpm durante 1 h hasta que el OD600 valor sea 0,6.
    ADVERTENCIA: No deje que la velocidad de agitación supere las 200 rpm. Las velocidades de agitación más altas pueden dañar la morfología de la flagela bacteriana e impactar la invasión bacteriana en la epitelia pulmonar. Del mismo modo, limitar el tiempo de agitación a 1 h para obtener bacterias altamente invasivas. Mida el valor deOD 600 para estimar el número de bacterias. Un OD600 a 1 corresponde a 10unidades formadoras de colonias (CFU)/ml.

3. Cultivo celular epitelial pulmonar humano y tratamiento con EEB

  1. Cultivo de células BEAS-2B humanas en medio HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg de insulina, 2,5 mg de transferrina, 2,5 mg de selenita sódica, 2,5 mg de transferrina, 10 m de hidrocortisona, 10 m β-estradiol, 10 mM HEPES y 2 mM de L-glutamina) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) descrito anteriormente24.
  2. Cultivo de células epiteliales de vías respiratorias primarias humanas (HSAEC) en el medio de cultivo de células epiteliales de las vías respiratorias (500 ml de medio basal de células de las vías respiratorias, 500 g/ml de HSA, ácido linoleico de 0,6 m, Lecitina de 0,6 g/ml, 6 mM de L-glutamina, 0,4% de extracto P, 1,0 m de epinefrina, 5 g/ml de transferrina, 10 nM T3, hidrocortisona de 1 g/ml, ng ng/ml de rh/ mL y insulina de 5 g/ml). Incubar las células a 37oC en un 5% de CO2.
  3. Disociar las células con 1 ml de 0,25% de trippsina durante 5 min hasta que las células se desprenden completamente de la parte inferior de la placa.
  4. Añadir 10 ml de medio HITES completo para neutralizar la trippsina y recoger las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar a 4oC a 300 x g durante 5 min.
    ADVERTENCIA: Controle cuidadosamente el tiempo para la digestión de la trippsina por microscopía, ya que la sobredigestión puede causar la muerte celular.
  5. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 2 ml de medio HITES con 10% de FBS.
  6. Pipetear 10 l de la suspensión celular anterior sobre la placa e insertarla en un contador de células automatizado para obtener la concentración en células/ml.
  7. Placa BEAS-2B células a una concentración de 3 × 105 células/ml en 6 placas de pozo en un volumen total de 2 ml en medio HITES complementado con 10% de FBS para cultivo nocturno.
  8. Tratar las células a aproximadamente 80% de confluencia, o 5 x 105 células/ml, con 4% CSE durante 3 h. Antes del tratamiento con CSE, cambie el medio con el medio HITES con el 1% de FBS.

4. Infección bacteriana

  1. Añadir P. aeruginosa o P. fluorescens Migula (1 ×10 7 CFU/mL) a cada pozo de las células tratadas con CSE e incubar durante 1 h a 37oC en 5% co2.
  2. Aspirar los sobrenadantes y reemplazarlos con 2 ml de medio HITES fresco para tratar con 4% de CSE y 100 g/ml de gentamicina.
    NOTA: La gentamicina se utiliza porque no puede penetrar las membranas celulares epiteliales pulmonares humanas. Por lo tanto, puede matar todas las bacterias en el medio, pero no las que invadieron las células epiteliales pulmonares.
  3. Después de 1 h de tratamiento con CSE/gentamicina a 37oC en 5% de CO2,aspirar los sobrenadantes y lavar las células 3x con PBS para la posterior determinación de la concentración bacteriana.
    NOTA: Para confirmar las bacterias internalizadas, se observaron células infectadas con P. fluorescens Migula con etiqueta GFP bajo microscopía fluorescente.

5. Determinación de la concentración bacteriana utilizando el método de placa de caída

  1. Para determinar la carga bacteriana en las células infectadas con el método de placa de gota, lave las células tratadas con gentamicina 2x con 2 ml de PBS frío.
  2. Agregue 1 ml de búfer de lelisis de celda (0,5% tritón X-100 en PBS) a cada pozo.
  3. Diluir los lysates celulares que contienen las bacterias internalizadas en un gradiente (1:10, 1:100, 1:1,000 y 1:10,000) para la siguiente inoculación a la placa de agar TSB.
  4. Después de 16 h de incubación, obtener los resultados de la CFU mediante el conteo de las colonias bacterianas.

6. Detección RT-qPCR de rRNA bacteriana 16S

  1. Tratar las células epiteliales pulmonares infectadas por Pseudomonas(1 x 106 células/ml) con gentamicina como se ha descrito anteriormente. Aspirar el medio y lavar las células 2x con 2 ml de PBS frío.
  2. Añadir 0,35 ml del tampón de lelisis de tiocianato de guanidiodium por pozo de una placa de 6 pozos. Recoger las células con un rascador de células. Pipetear el licate en un tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente con la pipeta.
  3. Añadir el mismo volumen (0,35 ml) de etanol recién preparado al 70% de etanol en el izado y mezclar bien. Transfiera todas las muestras a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar a 10.000 g para 30 s a 20–25 oC. A continuación, deseche el búfer en el tubo de recogida.
  4. Lave la columna con 0,7 ml de tampón de lavado 1. Centrifugar la columna a 10.000 x g durante 30 s. Lavar la columna 2x con 0,5 ml de tampón para lavar el ARN ligado a la membrana. Repita la centrifugación a 10.000 x g durante 2 min.
  5. Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Añadir de 30 a 50 l de agua libre de RNase. Centrífuga a 10.000 g g durante 1 min. Recoger el flujo a través y medir la concentración de ARN.
  6. Realizar una reacción de transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mezclar 1 g de ARN total con 10 ml de tampón de reacción, 1 ml de transcriptasa inversa y agua libre de RNase para una reacción de 20 ml. Llevar a cabo la reacción de transcripción inversa a 37 oC durante 1 h y luego 95 oC durante 5 min.
  7. Mezclar las plantillas de ADNc (1 l de cada reacción de transcripción inversa anterior), 5 l de la mezcla maestra que contiene tinte SYBR, 1 l de cada imprimación específica de 200 nM y agua en una mezcla de 20 ml para el siguiente análisis de PCR, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    NOTA: Las siguientes son las imprimaciones dirigidas al rRNA 16S de P. aeruginosa:adelante 5o-CAAAACTACTGATATAGAGTACG-3o; reverso 5o-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3o. GAPDH se utilizó como control de carga con los siguientes imprimadores: adelante: 5o-GGCATGGACTGGTCATGA-3o; reverso: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3o.
  8. Utilice el método de TC comparativo para determinar la expresión.

7. Detección de Pseudomonas fluorescentes con citometría de flujo

  1. Tratar las células epiteliales pulmonares infectadas por Pseudomonasfluorescentes anteriores (1 x 106 células/ml) con gentamicina como se describió anteriormente. Aspirar el medio y lavar las células 2x con 2 ml de PBS frío.
  2. Analice las muestras con un citómetro de flujo a una longitud de onda de 509 nm para la detección de GFP. Termine cada lectura en 100.000 recuentos. Analizar los datos adquiridos con software relacionado.

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Representative Results

Un diagrama se utiliza para ilustrar el protocolo en la figura 1. Las células EPIteliales pulmonares BEAS-2B fueron tratadas con CSE y desafiadas con Pseudomonas. Pseudomonas en el medio de cultivo fueron asesinados por la gentamicina añadida y las células fueron sometidas al ensayo de placa de caída, la detección RT-qPCR de Pseudomonas ribosoma 16S ARN, y la citometría de flujo. En comparación con el control, el tratamiento con EEB aumentó sustancialmente la infección bacteriana en los métodos de placas de caída(Figura 2). En consecuencia, CSE afectó la carga bacteriana en HSAEC (Figura 3). La viabilidad celular no cambió considerablemente después de 3 h del tratamiento con 4% de CSE, en 1 h de infección por Pseudomonas, o en 1 h de tratamiento con gentamicina(Figura 4 Figura 5 Figura 6). El método RT-qPCR de rRNA-destino 16S (Figura 7) y la citometría de flujo (Figura 8) demostraron resultados similares. Los resultados de la microscopía fluorescente mostraron que las bacterias etiquetadas por GFP se colocaban con células BEAS-2B en un experimento de infección de P. fluorescens Migula (Figura 9). Estos resultados sugieren que fumar cigarrillos aumentó la carga de Pseudomonas en las células BEAS-2B.

Figure 1
Figura 1: Presentación esquemática del protocolo para estudiar los efectos del humo del cigarrillo en la infección por Pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Las células epiteliales pulmonares cultivadas en inserciones de cultivo celular o placas de cultivo convencionales o organoides pulmonares estuvieron expuestas al humo del cigarrillo durante 16 minutos a través de un robot humeante o tratadas con CSE preparado al 4% durante 3 h. Estas células se infectaron entonces con P. aeruginosa durante 1 h (MOI a 10). La gentamicina se utilizó para eliminar Pseudomonas vivas en el medio de cultivo. Las células anteriores estaban sujetas al método de placa de caída, qRT-PCR, o enfoques de citometría de flujo para determinar la carga bacteriana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Método de placa de caída para determinar la carga bacteriana en las células BEAS-2B epiteliales pulmonares. Las células BEAS-2B fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células fueron sometidas a la infección por P. aeruginosa (strain PAO1) durante 1 h seguida de tratamiento con gentamicina durante otra 1 h. Las células fueron lanzadas y los lysates celulares se diluyeron para inocular placas TSB durante 16 h. Se contaron las colonias; los números de la CFU se ilustran en la trama. El gráfico muestra la media ± SD, y "*" denota P < 0.05. Los resultados son representativos de los experimentos n.o 3. Se utilizó la prueba de dos vías nopares Student t -test para grupos tratados con humo y no tratados. P < 0.05 indica significancia estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Método de placa de caída para determinar la carga bacteriana en las células HSAEC. Las células epiteliales pequeñas de las vías respiratorias primarias humanas fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células fueron sometidas a la infección por P. aeruginosa (strain PAO1) durante 1 h seguida de tratamiento con gentamicina durante otra 1 h. Las células fueron lanzadas y los lysates celulares se diluyeron para inocular en placas TSB durante 16 h. Se contaron las colonias; los números de la CFU se ilustran en la trama. El gráfico muestra la media ± SD, y "*" denota P < 0.05. Los resultados son representativos de los experimentos n.o 3. Se utilizó la prueba de dos vías nopares Student t -test para grupos tratados con humo y no tratados. P < 0.05 indica significancia estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Determinación de la viabilidad celular en células BEAS-2B epiteliales pulmonares tratadas con CSE. Las células BEAS-2B epiteliales pulmonares fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células se tiñeron con tripano azul y la viabilidad celular se midió con contador celular. El gráfico muestra la media ± SD. Los resultados son representativos de los experimentos n.o 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Determinación de la viabilidad celular en las células BEAS-2B epiteliales pulmonares infectadas por Pseudomonas. Las células BEAS-2B epiteliales pulmonares se infectaron con P. aeruginosa (MOI a 10) durante 1 h. Las células se tiñeron con tripano azul y la viabilidad celular se midió con un contador celular. El gráfico muestra la media ± SD. Los resultados son representativos de los experimentos n.o 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Determinación de la viabilidad celular en células BEAS-2B pulmonares tratadas con gentamicina. Las células BEAS-2B epiteliales pulmonares fueron tratadas con gentamicina de 100 g/ml durante 1 h. Las células se tiñeron con tripano azul y la viabilidad celular se midió con un contador celular. El gráfico muestra la media ± SD. Los resultados son representativos de los experimentos n.o 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: qRT-PCR para determinar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. Las células tratadas en la Figura 2 fueron sometidas a la extracción total de ARN. Una cantidad equivalente de ARN de cada muestra se transcribió inversamente en ADNc, y la cantidad de ARN 16S de P. aeruginosa se determinó con PCR cuantitativo utilizando pares de imprimación específicos. Los resultados de qPCR se trazan en el gráfico. El gráfico muestra la media ± SD, y "*" denota P < 0.05. Los resultados son representativos de los experimentos n.o 3. Se utilizó la prueba de dos vías nopares Student t -test para grupos tratados con humo y no tratados. P < 0.05 indica significancia estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Citometría de flujo para determinar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. Las células BEAS-2B fueron tratadas con CSE e infectadas con P. fluorescens Migula (strain PAO143). Las células infectadas fueron tratadas con gentamicina y digeridas con trippsina para hacer una suspensión celular. Las suspensiones celulares pasaron a través del citómetro de flujo y las células fluorescentes Pseudomonas -positivasse determinaron a una longitud de onda de 509 nm. Los resultados de la citometría de flujo se trazan en el gráfico. El gráfico muestra la media ± SD, y "*" denota P < 0.05. Los resultados son representativos de los experimentos n.o 3. Se utilizó la prueba de dos vías nopares Student t -test para los grupos tratados con humo y no tratados. P < 0.05 indica significancia estadística. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Observación de la infección bacteriana con microscopía fluorescente. Las células BEAS-2B se infectaron con P. fluorescens Migula (strain PAO143) durante 1 h. Las células fueron tratadas con gentamicina durante otra 1 h y lavadas 2 veces con PBS frío. Las bacterias etiquetadas por GFP se observaron bajo un microscopio fluorescente a una longitud de onda de 480 nm y las células BEAS-2B se visualizaron con una imagen de fase. Las imágenes se fusionaron y se muestra el resultado representativo. Barra de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La invasión bacteriana en células epiteliales pulmonares es un paso crucial en la patogénesis de las infecciones bacterianas. El proceso de invasión bacteriana en las células se puede dividir en los tres pasos siguientes: En primer lugar, las bacterias entran en contacto y se adhieren a la superficie de la célula epitelial utilizando su flagelo. En segundo lugar, las bacterias se someten a interiorización o penetran en la membrana celular. Finalmente, las bacterias replican y colonizan las células si escapan con éxito de los mecanismos de defensa celular25,,26. Durante mucho tiempo se han desarrollado enfoques para la observación de infecciones bacterianas en microfagos pulmonares, pero con un conocimiento limitado de las células epiteliales pulmonares27,,28. Este estudio determinó la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares a través de tres enfoques: un ensayo de placa de caída, RT-qPCR para Pseudomonas ribosoma 16S ARN, y citometría de flujo. Los tres enfoques funcionan bien con sensibilidades similares. La elección de los enfoques para determinar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares depende de la disponibilidad del equipo y el tiempo. En estos experimentos, mantener la flagela bacteriana intacta e intacta es crucial para una infección epitelial pulmonar exitosa29. Un tiempo de agitación más corto con velocidad limitada puede ayudar a promover aún más la capacidad de invasión bacteriana30.

Un obstáculo importante en la determinación de la concentración bacteriana en las células epiteliales pulmonares es la contaminación bacteriana del medio de cultivo. En los experimentos de infección celular, las bacterias se añaden al medio de cultivo durante un período de tiempo específico (es decir, 1 h). Dentro de ese tiempo, parte de esa carga bacteriana invade con éxito el compartimento citoplasmático, pero los residuos pueden adherirse a la membrana externa de las células. Un antibiótico, la gentamicina, se utiliza para matar las bacterias en el medio de cultivo y los residuos que se unen a la membrana externa de las células31. La gentamicina se considera no permeable a la membrana celular y por lo tanto no afectará a las bacterias ya dentro de las células. El tratamiento con gentamicina hace que sea ideal para este sistema excluir la posible contaminación de fuera de las células epiteliales pulmonares infectadas.

Para estudiar los efectos del humo del cigarrillo en la infección bacteriana en las células epiteliales pulmonares, las células pulmonares deben estar expuestas al humo del cigarrillo antes de la infección bacteriana en los modelos celulares. Un enfoque convencional es preparar la EC fresca para tratar las células. La generación de CSE es un método rentable para los estudios. CSE es fácil de manejar, el proceso de fabricación de CSE es simple, y la inyección intratraqueal CSE es eficaz en la generación de enfisema en modelos animales en un corto período de tiempo32. También se han desarrollado enfoques de exposición directa al cigarrillo tanto para modelos celulares in vitro como para modelos de roedores in vivo. Seis meses de exposición diaria al humo del cigarrillo a ratones se utiliza ampliamente para generar enfisema33. La exposición directa al humo del cigarrillo requiere equipos complicados que combinen sistemas de quema de cigarrillos y de cultivo celular. La combustión de cigarrillos produce humo de cigarrillo, pero también genera una cantidad total de calor que puede afectar la temperatura y la humedad de la cámara de cultivo. Afortunadamente, las técnicas recientes facilitan la exposición directa al humo del cigarrillo21. Se ha implementado un protocolo de la Organización Internacional de Normalización (ISO) para los experimentos directos de exposición al humo del humo del cigarrillo22. La exposición al humo del cigarrillo se puede realizar una o varias veces. Además, junto con el progreso de las técnicas de cultivo celular, las células epiteliales primarias pulmonares también podrían cultivarse en inserciones transparentes para obtener una monocapa de células epiteliales pulmonares confluentes34. Las monocapas de células epiteliales pulmonares imitan estructuralmente las condiciones fisiológicas en los tejidos pulmonares. Las células pueden entonces ser expuestas a humo gaseoso apical o aire en la interfaz aire-líquido35. Además, el cultivo de organoides pulmonares ha surgido en los estudios pulmonares actuales36,,37. Será interesante saber cómo el humo del cigarrillo afecta la infección bacteriana en los organoides pulmonares. El enfoque descrito puede imitar la infección humana en los tejidos en lugar de las células cultivadas y puede hacer posible más información sobre la infección bacteriana de las vías respiratorias inferiores.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud R01 HL125435 y HL142997 (a CZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por <em>pseudomonas</em> en células epiteliales pulmonares
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Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

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