Summary
Описано здесь протокол для изучения того, как экстракт сигаретного дыма влияет на бактериальную колонизацию эпителиальных клеток легких.
Abstract
Курение сигарет является основной этиологической причиной эмфиземы легких и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Курение сигарет также способствует восприимчивости к бактериальным инфекциям в дыхательной системе. Тем не менее, влияние курения сигарет на бактериальные инфекции в клетках эпителия легких человека до сих пор тщательно не изучены. Описано здесь подробный протокол для подготовки экстрактов курения сигарет (CSE), лечение эпителиальных клеток легких человека с CSE, и бактериальной инфекции и определения инфекции. CSE был подготовлен обычным методом. Легкие эпителиальные клетки лечились с 4% CSE для 3 ч. CSE-обработанные клетки были, то, инфицированных Pseudomonas при множественности инфекции (MOI) 10. Бактериальные нагрузки клеток определялись тремя различными методами. Результаты показали, что CSE увеличила нагрузку Pseudomonas в легких эпителиальных клеток. Таким образом, этот протокол обеспечивает простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.
Introduction
Курение сигарет влияет на здоровье населения миллионов людей во всем мире. Многие вредные заболевания, в том числе рак легких и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), как сообщается, связаныс курением сигарет 1,2. Курение сигарет повышает восприимчивость к острым микробным инфекциям в дыхательной системе3,,4,,5. Кроме того, растущие доказательства доказывают, что курение сигарет усиливает патогенез многих хронических расстройств6,,7,,8. Например, курение сигарет может увеличить вирусные или бактериальные инфекции, которые вызывают обострение ХОБЛ9. Среди бактериальных патогенов, которые этиологически способствуют острому обострению ХОБЛ, оппортунистический грамотрицатель бактерий патоген, Pseudomonas aeruginosa, вызывает инфекции, которые коррелируют с плохими прогнозами и более высокойсмертности 10,11. Обострение ХОБЛ ухудшает болезнь за счет ускорения патологического прогрессирования. Нет эффективных методов лечения обострения ХОБЛ, за исключением антисимптомного управления12. Обострение ХОБЛ способствует смертности пациентов, снижает качество жизни и увеличивает экономическую нагрузку на общество13.
Дыхательные пути представляют если вылазаемые дыхательные пути, то есть открытые системы, постоянно подвергаемые различным микробным патогенам, присутствующим за пределами страны. Оппортунистические бактериальные патогены обычно обнаруживаются в верхних дыхательных путях, но иногда наблюдаются в нижнихдыхательных путях 14,,15. В животных моделях P. aeruginosa могут быть обнаружены в альвеолярных мешках уже через 1 ч после заражения16. Как основной защитный механизм, иммунные клетки, такие как макрофаги или нейтрофилов устранить бактерии в дыхательных путях. Эпителиальные клетки легких, как первый физиологический барьер, выполняют уникальную роль в защите хозяина от микробных инфекций. Легкие эпителиальные клетки могут регулировать микробное вторжение, колонизацию или репликацию независимо от иммунных клеток17. Некоторые молекулы, найденные в эпителиальных клетках, включая PPARg, оказывают антибактериальные функции, тем самым регулируя бактериальную колонизацию и репликацию в эпителиальных клеткахлегких 18. Курение сигарет может изменить молекулы и ухудшить нормальную функцию защиты в легких эпителиальныхклеток 19,20. Недавние исследования сообщили о прямом воздействии сигаретного дыма на легочные эпителиальные клетки с помощьюробота курительного аппарата 21,22. Воздействие дыма может быть выполнено другими способами, однако, в том числе применение CSE. Подготовка CSE является воспроизводимым подходом с потенциальным применением в других типах клеток, включая сосудистые эндотелиальные клетки, которые косвенно подвергаются воздействию сигаретного дыма.
В этом докладе описывается протокол для создания экстракта сигаретного дыма для изменения бактериальной нагрузки в клетках эпителия легких. CSE увеличивает бактериальную нагрузку P. aeruginosa, и это может способствовать рецидиву бактериальных инфекций, как правило, наблюдается при обострении ХОБЛ. Для подготовки CSE используется обычный метод. Легкие эпителиальные клетки, на их экспоненциальной стадии роста, лечатся с 4% CSE для 3 ч. Кроме того, монослойные эпителиальные клетки легких могут быть непосредственно подвержены воздействию сигаретного дыма в воздухо-жидком интерфейсе. CSE-обработанные клетки после этого оспорены с Pseudomonas на разносторонности инфекции (MOI) 10. Бактерии распространяются с определенной скоростью встряхивания, чтобы обеспечить морфологию их flagella остается нетронутым, чтобы сохранить их полную инвазивную способность. Гентамицин используется для уничтожения бактерий, оставшихся в среде культуры, тем самым уменьшая потенциальное загрязнение во время последующего определения бактериальной нагрузки. Протокол также использует GFP помечены Pseudomonas, который был использован в качестве мощного инструмента в изучении инфекции Pseudomonas в различных моделях. Репрезентативным штаммом является P. fluorescens Migula23. Степень инфекции или бактериальной нагрузки после лечения CSE определяется тремя способами: метод drop plate с подсчетом колоний, количественный ПЦР с использованием Pseudomonas 16S rRNA-специфических грунтовок, или цитометрия потока в клетках, инфицированных флуоресцентными Pseudomonas. Этот протокол представляет можно простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 100% подготовка CSE
- Нарисуйте 10 мл носителя культуры клеток, свободных от сыворотки (DMEM/F12 для клеток BEAS-2B; базальная среда эпителиальной клетки дыхательных путей для клеток HSAEC) в шприц 60 мл.
- Обратно прикрепите соответствующим образом подстриженный наконечник пипетки 1 мл к соплу шприца в качестве адаптера для удержания сигареты (3R4F).
- Снимите фильтр сигареты. Прикрепите сигарету к адаптеру наконечника и сголите сигарету.
- Нарисуйте 40 мл дымосодержащего воздуха в 10 мл безотхвных средств массовой информации. Смешайте дым со средой, энергично встряхивая (30 с за ничью).
- Повторите шаг 1.4 около 11x в 7 мин, пока сигарета полностью выгорела.
- Фильтр 10 мл копченых средств массовой информации с фильтром 0,22 мкм, чтобы исключить любые микроорганизмы и нерастворимые частицы. Перенесите в закрытую стерильную трубку. Подготовьте 100% CSE не более чем за 30 минут до последующего анализа.
2. Псевдомонас культуры
- Прививка замороженных P. aeruginosa (напряжение PAO1) или P. fluorescens Migula (напряжение PAO143) в триптический соевый бульон (TSB) агар пластины для ночной культуры при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество бактерий для культивирования, распространение как можно больше бактерий на TSB агар пластины, как это возможно. - Соберите бактериальный мазок и инкубировать в 20 мл TSB с 5% глицерола в качестве источника углерода.
- Встряхните бактериальную суспензию в инкубаторе 37 градусов по Цельсию при 200 об/мин за 1 ч до значения OD600 и 0,6.
ВНИМАНИЕ: Не позволяйте скорости встряхивания превышать 200 об/мин. Более высокие скорости встряхивания могут повредить морфологию бактериальной флагеллы и повлиять на бактериальное вторжение в эпителию легких. Аналогичным образом, ограничить время встряхивания до 1 ч для получения высокоинвазивных бактерий. Измерьте значение OD600 для оценки количества бактерий. OD600 No 1 соответствует 109 единицам формирования (CFU)/mL.
3. Культура эпителиальных клеток легких человека и лечение CSE
- Культура человеческих клеток BEAS-2B в среде HITES (500 мл DMEM/F12, 2,5 мг инсулина, 2,5 мг трансферрина, 2,5 мг натрия селенит, 2,5 мг трансферрина, 10 МК гидрокортизон, 10 МКМ β-эстрадиол, 10 мМ HEPES, и 2 мМ L-глутамин) дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), какранее описано 24.
- Культура человека первичных малых дыхательных путей эпителиальных клеток (HSAEC) в дыхательных путей эпителиальной клеточной культуры среды (500 мл airway Cell Базал Средний, 500 мкг / мл HSA, 0,6 МКМ линолевая кислота, 0,6 мкг/мл лецитина, 6 мм L-глутамина, 0,4% экстракта P, 1,0 мкг эпинефрина, 5 мкг/мл трансферрина, 10 нм Т3, 1 мкг/мл гидрокортизона, rh EGF 5 нг/мл и 5 мкг/мл инсулина). Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2.
- Разобщить клетки с 1 мл 0,25% трипсина в течение 5 мин, пока клетки полностью отделиться от нижней части пластины.
- Добавьте 10 мл полной среды HITES, чтобы нейтрализовать трипсин и собрать клетки в 15 мл трубки. Центрифуга при 4 градусов по Цельсию при 300 х г в течение 5 мин.
ВНИМАНИЕ: Тщательно контролировать время для переваривания трипсина с помощью микроскопии, потому что переварение желудка может привести к гибели клеток. - Отбросьте супернатант и ресуссуйте клетки в 2 мл среды HITES с 10% FBS.
- Pipette 10 йл вышеуказанной клеточной подвески на пластину и вставить его в автоматизированный счетчик ячейки для получения концентрации в клетках / мл.
- Плита BEAS-2B клетки в концентрации 3 × 105 клеток / мл в 6 пластин хорошо в общем объеме 2 мл в HITES среды дополняется 10% FBS для ночной культуры.
- Лечить клетки примерно на 80% слияния, или 5 х 105 клеток / мл, с 4% CSE для 3 ч. Перед лечением CSE, изменить средний с HITES среды с 1% от FBS.
4. Бактериальная инфекция
- Добавить P. aeruginosa или P. fluorescens Migula (No 1 × 107 CFU/mL) к каждой колодец клеток, обработанных CSE, и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах по Цельсию в 5% CO2.
- Аспирировать супернатанты и заменить 2 мл свежей среды HITES для лечения с 4% CSE и 100 мкг / мл гентамицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гентамицин используется, потому что он не в состоянии проникнуть человека легких эпителиальных клеточных мембран. Таким образом, он может убить все бактерии в среде, но не те, которые вторглись в легких эпителиальных клеток. - После 1 ч CSE/ gentamicin лечения при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2, аспирировать супернатанты и мыть клетки 3x с PBS для последующего определения бактериальной концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения интернализированных бактерий, клетки, инфицированные GFP помечены P. fluorescens Migula наблюдались под флуоресцентной микроскопии.
5. Определение бактериальной концентрации с помощью метода drop plate
- Чтобы определить бактериальную нагрузку в инфицированных клетках методом drop plate, промыть гентамицин-обработанные клетки 2x с 2 мл холодного PBS.
- Добавьте 1 мл буфераеслиса клеток (0,5% тритона X-100 в PBS) к каждой хорошо.
- Разбавить лизаты клеток, содержащие интернализированные бактерии в градиенте (1:10, 1:100, 1:1000 и 1:10,000) для следующей прививки к пластине TSB agar.
- После 16 ч инкубации, получить результаты CFU путем подсчета бактериальных колоний.
6. Обнаружение РТ-кПКР бактериальной 16S рРНК
- Лечить Pseudomonas-инфицированныхлегких эпителиальных клеток (No 1 х 106 клеток / мл) с гентамицином, как описано выше. Аспирировать средний и мыть клетки 2x с 2 мл холодного PBS.
- Добавьте 0,35 мл буфера тиоцианата гуанидия на колодец 6 хорошо пластины. Соберите клетки с помощью клеточного скребка. Pipette лизатье в микроцентрифуг трубки и аккуратно перемешать с пипеткой.
- Добавьте тот же объем (0,35 мл) свежеприготовленного 70% этанола в лизат и хорошо перемешайте. Перенесите все образцы в колонку спина, помещенную в трубку для сбора 2 мл. Центрифуга при 10 000 х г при 30 с при 20-25 градусах Цельсия. Затем отбросьте буфер в трубке сбора.
- Вымойте столбец с 0,7 мл буфера мытья 1. Центрифуга колонны на 10 000 х г на 30 с. Вымойте колонку 2x с 0,5 мл буфера для мытья мембраны связаны РНК. Повторите центрифугу при 10 000 х г в течение 2 мин.
- Поместите колонку в новую трубку для сбора 1,5 мл. Добавьте воду без 30-50 йл RNase. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин. Соберите поток через и измерить концентрацию РНК.
- Выполните обратную реакцию транскрипции в соответствии с протоколом производителя. Смешайте 1 мкг общей РНК с 10 мл буфера реакции, 1 йл обратной транскриптазы, и RNase-свободной воды для 20 йл реакции. Проведи обратную транскрипцию при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, а затем 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- Смешайте шаблоны cDNA (1 йл каждой обратной транскрипционной реакции выше), 5 МКЛ Мастер Микс, содержащий краситель SYBR, 1 йл каждых 200 нМ конкретных грунтовок, и воды в 20 йл смеси для следующего анализа ПЦР, в соответствии с рекомендациями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены праймеры ориентации 16S рРНК P. aeruginosa: вперед 5 "-CAAAACTGAGCAGTACG-3"; обратный 5"-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3 ". GAPDH использовался в качестве управления погрузкой со следующими грунтовки: вперед: 5 "-GGCATGGACTGGTCATGA-3"; обратный: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3 ". - Используйте сравнительный метод КТ для определения выражения.
7. Обнаружение флуоресцентных Псевдомонас с потоком цитометрии
- Лечить выше флуоресцентных Pseudomonas-инфицированныхлегких эпителиальных клеток (No 1 х10 6 клеток / мл) с гентамицином, как описано ранее. Аспирировать средний и мыть клетки 2x с 2 мл холодного PBS.
- Проанализируйте образцы с цитометром потока на длине волны 509 нм для обнаружения GFP. Прекратите каждое чтение на 100 000 пунктов. Проанализируйте приобретенные данные с помощью связанного программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Диаграмма используется для иллюстрации протокола на рисунке 1. Легкие эпителиальные клетки BEAS-2B лечились CSE и оспаривается с Pseudomonas. Псевдомоны в среде культуры были убиты добавленным гентамицином, и клетки подверглись анализу капли пластины, обнаружению RT-qPCR рибосомы Pseudomonas 16S РНК и цитометрии потока. По сравнению с контролем, лечение CSE значительно увеличилось бактериальной инфекции в методы капли пластины (Рисунок 2). Соответственно, CSE повлияла на бактериальную нагрузку в HSAEC(рисунок 3). Жизнеспособность клеток не изменилась значительно после 3 ч 4% лечения CSE, в 1 ч инфекции Pseudomonas, или в 1 ч лечения гентамицина(рисунок 4 Рисунок 5 Рисунок 6). 16S rRNA-целевой метод RT-qPCR(рисунок 7)и цитометрия потока(рисунок 8)продемонстрировали аналогичные результаты. Результаты флуоресцентной микроскопии показали, что бактерии с маркировкой GFP, колокализованные с клетками BEAS-2B в эксперименте по заражению P. fluorescens Migula (рисунок 9). Эти результаты свидетельствуют о том, что курение сигарет увеличило нагрузку Pseudomonas в клетках BEAS-2B.
Рисунок 1: Схематическое представление протокола для изучения воздействия сигаретного дыма на инфекцию Pseudomonas в эпителиальных клетках легких. Легкие эпителиальные клетки, выращенные в вставки клеточной культуры или обычные пластины культуры или легких органоидов подвергались воздействию сигаретного дыма в течение 16 минут с помощью курящего робота или лечение подготовленным 4% CSE в течение 3 ч. Эти клетки были затем инфицированы P. aeruginosa в течение 1 ч (МВД No 10). Гентамыцин использовался для ликвидации живых Псевдомон в культурной среде. Вышеуказанные клетки были подвержены методу капли пластины, qRT-PCR, или поток цитометрии подходов для определения бактериальной нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Метод drop plate для определения бактериальной нагрузки в клетках легочной эпителиальной BEAS-2B. Клетки BEAS-2B лечили 4% CSE в течение 3 ч. Клетки были затем подвергнуты P. aeruginosa (напряжение PAO1) инфекции в течение 1 ч с последующим лечением гентамицина еще 1 ч. Клетки были лисированы и ликаты клетки были разбавлены, чтобы привить пластины TSB в течение 16 часов. Колонии были подсчитаны; цифры CFU иллюстрируются в сюжете. На графике показано ± SD, а "я" означает P lt; 0.05. Результаты являются репрезентативными для экспериментов n No 3. Двухголохий неоплаченный Студенческий т-тестиспользовался для обработанных дымом и необработанных групп. P lt; 0.05 указывает на статистическую значимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Метод drop plate для определения бактериальной нагрузки в клетках HSAEC. Первичные небольшие эпителиальные клетки дыхательных путей человека обработались 4% CSE в течение 3 ч. Клетки были затем подвергнуты P. aeruginosa (напряжение PAO1) инфекции в течение 1 ч с последующим лечением гентамицина еще 1 ч. Клетки были облились и лисаты клеток были разбавлены, чтобы привить на пластинах TSB в течение 16 часов. Колонии были подсчитаны; цифры CFU иллюстрируются в сюжете. На графике показано ± SD, а "я" означает P lt; 0.05. Результаты являются репрезентативными для экспериментов n No 3. Двухголохий неоплаченный Студенческий т-тестиспользовался для обработанных дымом и необработанных групп. P lt; 0.05 указывает на статистическую значимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Определение жизнеспособности клеток в клетках CSE, обработанных легкими, эпителиальными BEAS-2B. Легкие эпителиальные клетки BEAS-2B лечили 4% CSE в течение 3 ч. Клетки были окрашены трипан синий и клеточной жизнеспособности измеряется с счетчиком клеток. График показывает, ± и SD. Результаты являются репрезентативными n No 3 экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Определение жизнеспособности клеток в Pseudomonas-инфицированныхлегких эпителиальных BEAS-2B клеток. Клетки легочного эпителиального BEAS-2B были инфицированы P. aeruginosa (МВД No 10) в течение 1 ч. Клетки были окрашены трипан синий и клеточной жизнеспособности измеряется с счетчиком клеток. График показывает, ± и SD. Результаты являются репрезентативными n No 3 экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Определение жизнеспособности клеток в клетках гентамицина, обработанных легкими, эпителиальными клетками BEAS-2B. Легкие эпителиальные клетки BEAS-2B лечились 100 мкг/мл гентамицина в течение 1 ч. Клетки были окрашены трипан синий и клеточной жизнеспособности измеряется с счетчиком клеток. График показывает, ± и SD. Результаты являются репрезентативными n No 3 экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: qRT-PCR для определения бактериальной нагрузки в эпителиальных клетках легких. Обработанные клетки на рисунке 2 подвергались полной экстракции РНК. Эквивалентное количество РНК из каждой выборки было обратно транскрибировано в cDNA, и количество 16S РНК P. aeruginosa было определено с количественным ПЦР с использованием конкретных грунтовок пар. Результаты qPCR приведены в графике. На графике показано ± SD, а "я" означает P lt; 0.05. Результаты являются репрезентативными для экспериментов n No 3. Двухголохий неоплаченный Студенческий т-тестиспользовался для обработанных дымом и необработанных групп. P lt; 0.05 указывает на статистическую значимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Поток цитометрии для определения бактериальной нагрузки в легких эпителиальных клеток. Клетки BEAS-2B лечились CSE и заражались P. fluorescens Migula (напряжение PAO143). Зараженные клетки лечили гентамицином и переваривали трипсином, чтобы сделать подвес клеток. Клеточные суспензии проходили через поток цитометра и флуоресцентных Pseudomonas-положительные клетки определялись на длине волны 509 нм. Результаты цитометрии потока замысяты на графике. На графике показано ± SD, а "я" означает P lt; 0.05. Результаты являются репрезентативными для экспериментов n No 3. Двухголое неоплаченный Студенческий т-тестиспользовался для обработанных дымом и необработанных групп. P lt; 0.05 указывает на статистическую значимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Наблюдение бактериальной инфекции флуоресцентной микроскопией. Клетки BEAS-2B были инфицированы P. fluorescens Migula (напряжение PAO143) в течение 1 ч. Клетки лечили гентамицином еще 1 ч и промыли 2x с холодным PBS. Бактерии с маркировкой GFP наблюдались под флуоресцентным микроскопом на длине волны 480 нм, а клетки BEAS-2B визуализировались с фазовым изображением. Изображения были объединены, и репрезентативный результат показан. Масштабная планка 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Бактериальное вторжение в легочные эпителиальные клетки является важным шагом в патогенеза бактериальных инфекций. Процесс бактериального вторжения в клетки может быть разбит на следующие три шага: во-первых, бактерии контакт и придерживаться поверхности эпителиальной клетки, используя их flagella. Во-вторых, бактерии либо проходят интернализацию, либо проникают в клеточную мембрану. Наконец, бактерии реплицируют и колонизируют клетки, если они успешно избежать клеточной защитымеханизмов 25,26. Подходы к наблюдению бактериальных инфекций в микрофагах легких уже давно разработаны, но с ограниченным знанием легких эпителиальныхклеток 27,28. Это исследование определило бактериальную нагрузку в легких эпителиальных клеток с помощью трех подходов: анализ капли пластины, RT-qPCR для Pseudomonas рибосомы 16S РНК, и поток цитометрии. Все три подхода хорошо работают с аналогичной чувствительностью. Выбор подходов к определению бактериальной нагрузки в эпителиальных клетках легких зависит от наличия оборудования и времени. В этих экспериментах, сохраняя бактериальной флагеллы неповрежденной и нетронутой имеет решающее значение для успешного легочной эпителиальной инфекцииклеток 29. Более короткое время встряхивания с ограниченной скоростью может способствовать дальнейшему развитию бактериальной способностивторжения 30.
Основным препятствием в определении бактериальной концентрации в легких эпителиальных клеток является бактериальное загрязнение из среды культуры. В экспериментах с клеточной инфекцией бактерии добавляются в культурную среду в течение определенного периода времени (т.е. 1 ч). За это время часть этой бактериальной нагрузки успешно вторгается в цитоплазмический отсек, но остатки могут прикрепляться к внешней мембране клеток. Антибиотик, гентамицин, используется для уничтожения бактерий в среде культуры и остатков, которые прилагаются к внешней мембране клеток31. Гентамицин считается не проницаемым для клеточной мембраны и, таким образом, не повлияет на бактерии уже в клетках. Лечение гентамицином делает его идеальным для этой системы, чтобы исключить потенциальное загрязнение из-за пределов инфицированных клеток эпителия легких.
Для изучения влияния сигаретного дыма на бактериальную инфекцию в клетках эпителия легких, клетки легких должны подвергаться воздействию сигаретного дыма до бактериальной инфекции в клеточных моделях. Обычный подход готовит свежие CSE для лечения клеток. Поколение CSE является экономически эффективным методом для исследований. CSE прост в обращении, процесс изготовления CSE прост, и csE интратрахеальной инъекции эффективен в генерации эмфиземы в животных моделях в короткийпериод времени 32. Подходы прямого воздействия сигарет были также разработаны как для моделей клеток in vitro, так и для моделей грызунов in vivo. Шесть месяцев ежедневного воздействия сигаретного дыма на мышей широко используется для создания эмфиземы33. Прямое воздействие сигаретного дыма требует сложного оборудования, которое сочетает в себе системы сгорания сигарет и клеточной культуры. Сигаретный сгорание производит сигаретный дым, но также генерирует количество тепла, которое может повлиять на температуру и влажность камеры культуры. К счастью, последние методы делают прямое воздействие сигаретного дымалегче 21. Для экспериментов по прямому воздействию сигаретного дыма 22 был внедрен протокол Международной организации постандартизации (ISO). Воздействие сигаретного дыма может быть выполнено один или несколько раз. Кроме того, наряду с прогрессом методов клеточной культуры, легких первичных эпителиальных клеток также могут быть выращены на прозрачных вставок для получения слияния легких эпителиальной клеткимонослой 34. Монослойные клетки легких структурно имитируют физиологические условия в тканях легких. Клетки могут подвергаться воздействию апического газого дыма или воздуха в воздухо-жидком интерфейсе35. Кроме того, культура органоидов легких возникла в текущих исследованияхлегких 36,37. Будет интересно узнать, как сигаретный дым влияет на бактериальную инфекцию в органах легких. Описанный подход может имитировать инфекцию человека в тканях, а не культурных клеток и может сделать возможным дальнейшее понимание в нижних дыхательных бактериальных инфекций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения R01 гранты HL125435 и HL142997 (к СЗ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F.
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M.
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
