Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Studere effekter av sigarettrøyk på Pseudomonas infeksjon i lunge epitelceller

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Beskrevet her er en protokoll for å studere hvordan sigarettrøyk ekstrakt påvirker bakteriell kolonisering i lunge epitelceller.

Abstract

Sigarettrøyking er den viktigste etiologiske årsaken til lungeembosem og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Sigarettrøyking fremmer også følsomhet for bakterielle infeksjoner i luftveiene. Effekten av sigarettrøyking på bakterielle infeksjoner i humane lungeepitelceller er imidlertid ennå ikke grundig undersøkt. Beskrevet her er en detaljert protokoll for fremstilling av sigarettrøykeekstrakter (CSE), behandling av humane lungeepitelceller med CSE, og bakteriell infeksjon og infeksjonsbestemmelse. CSE ble utarbeidet med en konvensjonell metode. Lungeepitelceller ble behandlet med 4 % CSE i 3 timer CSE-behandlede celler var da infisert med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakterielle belastninger av cellene ble bestemt av tre forskjellige metoder. Resultatene viste at CSE økte Pseudomonas belastning i lunge epitelceller. Denne protokollen gir derfor en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.

Introduction

Sigarettrøyking påvirker den offentlige helsen til millioner av mennesker over hele verden. Mange skadelige sykdommer, inkludert lungekreft og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), er rapportert å være relatert til sigarettrøyking1,2. Sigarettrøyking øker mottakeligheten for akutte mikrobielle infeksjoner iluftveiene 3,4,5. Videre viser monteringsbevis at sigarettrøyking forbedrer patogenesen av mange kroniske lidelser6,7,8. Sigarettrøyking kan for eksempel øke virus- eller bakterieinfeksjoner som forårsaker KOLS-eksacerbasjon9. Blant de bakterielle patogener som etiologisk bidrar til akutt forverring av KOLS, forårsaker et opportunistisk gram-negativt bacillus patogen, Pseudomonas aeruginosa, infeksjoner som korrelerer med dårlige prognoser og høyeredødelighet 10,11. KOLS-forverring forverrer sykdommen ved å akselerere patologisk progresjon. Det finnes ingen effektive behandlinger mot KOLS-eksacerbasjon bortsett fra antisymptomatisk styring12. KOLS-forverring fremmer pasientdødelighet, reduserer livskvaliteten og øker den økonomiske byrden på samfunnet13.

Luftveiene er et åpent system, kontinuerlig utsatt for ulike mikrobielle patogener tilstede eksternt. Opportunistiske bakterielle patogener oppdages vanligvis i de øvre luftveiene, men noen ganger observeres i de nedre luftveiene14,15. I dyremodeller P. aeruginosa kan detekters i alveolr sacs så snart som 1 time etter infeksjon16. Som en viktig forsvarsmekanisme eliminerer immunceller som makrofager eller nøytrofiler bakteriene i luftveiene. Lungeepitelceller, som den første fysiologiske barrieren, utfører en unik rolle i vertsforsvaret mot mikrobielle infeksjoner. Lungeepitelceller kan regulere mikrobiell invasjon, kolonisering eller replikering uavhengig av immunceller17. Noen molekyler som finnes i epitelceller, inkludert PPARg, utøver antibakterielle funksjoner, og regulerer dermed bakteriell kolonisering og replikering i lungeepitelceller18. Sigarettrøyking kan endre molekylene og svekke normal forsvarsfunksjon i lungeepitelceller19,20. Nyere studier rapporterte direkte eksponering av sigarettrøyk til lungeepitelceller ved hjelp av robotrøykeapparat21,22. Eksponering for røyk kan utføres på andre måter, men inkludert bruk av CSE. Fremstilling av CSE er en reproduserbar tilnærming med potensielle applikasjoner i andre celletyper, inkludert vaskulære endotelceller som indirekte utsettes for sigarettrøyk.

Denne rapporten beskriver en protokoll for å generere sigarettrøyk ekstrakt for å endre bakteriell belastning i lunge epitelceller. CSE øker bakteriebelastningen av P. aeruginosa, og det kan bidra til tilbakefall av bakterielle infeksjoner vanligvis sett i KOLS-forverring. En konvensjonell metode brukes til fremstilling av CSE. Lungeepitelceller, på deres eksponentielle vekststadium, behandles med 4% CSE i 3 timer. Alternativt kan monolayer-kultiverte lungeepitelceller bli direkte utsatt for sigarettrøyk i et luftvæskegrensesnitt. CSE-behandlede celler blir deretter utfordret med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakteriene spres med en bestemt ristingshastighet for å sikre at morfologien til deres flagella forblir intakt for å beholde sin fulle invasive kapasitet. Gentamycin er ansatt for å drepe bakteriene som er igjen i kulturmediet, og reduserer dermed den potensielle forurensningen under den påfølgende fastsettelsen av bakteriebelastningen. Protokollen bruker også GFP-merket Pseudomonas, som har blitt brukt som et kraftig verktøy i å studere Pseudomonas infeksjon i ulike modeller. En representativ stamme er P. fluorescens Migula23. Graden av infeksjon eller bakteriell belastning etter CSE-behandling bestemmes på tre måter: drop plate-metoden med kolonitelling, kvantitativ PCR ved hjelp av Pseudomonas 16S rRNA-spesifikke primere, eller strømningscytometri i celler infisert med fluorescerende Pseudomonas. Denne protokollen er en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 100% CSE forberedelse

  1. Tegn 10 ml serumfri cellekulturmedier (DMEM/F12 for BEAS-2B-celler, luftveisepitelcellebasal medium for HSAEC-celler) inn i en 60 ml sprøyte.
  2. Fest en passende trimmet 1 ml pipettespiss til dysen på sprøyten som en adapter for å holde sigaretten (3R4F).
  3. Fjern filteret på sigaretten. Fest en sigarett til tuppadapteren og kombust sigaretten.
  4. Trekk 40 ml røykholdig luft i 10 ml serumfritt medium. Bland røyken med mediet ved kraftig risting (30 s per trekning).
  5. Gjenta trinn 1.4 ca 11x i ~ 7 min til sigaretten er helt utbrent.
  6. Filtrer 10 ml røkt medium med et 0,22 μm filter for å utelukke mikroorganismer og uoppløselige partikler. Overfør til et lukket sterilt rør. Forbered 100% CSE ikke mer enn 30 min før den påfølgende analysen.

2. Pseudomonas kultur

  1. Inokuler frossen P. aeruginosa (stamme PAO1) eller P. fluorescens Migula (stamme PAO143) inn i en Tryptisk soy buljong (TSB) agarplate for overnattingskultur ved 37 °C.
    MERK: For å oppnå nok bakterier til å kultere, spre så mye bakterier på TSB agarplaten som mulig.
  2. Samle en bakteriell smøre og inkubere i 20 ml TSB med 5% av glyserol som karbonkilde.
  3. Rist bakteriesuspensjonen i en 37 °C inkubator ved 200 o/min i 1 time til OD600-verdien = 0,6.
    FORSIKTIG: Ikke la ristehastigheten overstige 200 o/min. Høyere risting hastigheter kan skade morfologien til bakteriell flagella og påvirke bakteriell invasjon i lunge epithelia. På samme måte begrenser du ristingstiden til 1 time for å oppnå svært invasive bakterier. Mål OD600-verdien for å estimere antall bakterier. En OD600 = 1 tilsvarer ~109 kolonidanneenheter (CFU)/ml.

3. Human lungeepitelcellekultur og CSE-behandling

  1. Kultur humane BEAS-2B-celler i HITES medium (500 ml DMEM/F12, 2,5 mg insulin, 2,5 mg transferrin, 2,5 mg natriumselenitt, 2,5 mg transferrin, 10 μM hydrokortison, 10 μM β-østradiol, 10 mM HEPES og 2 mM L-glutamin) supplert med 10 % fostersvinserum (FBS) som tidligere beskrevet24.
  2. Kultur humane primære små luftveisepitelceller (HSAEC) i luftveienes epitelcellekulturmedium (500 ml luftveiscelle basalmedium, 500 μg/ml HSA, 0,6 μM linolsyre, 0,6 μg/ml lecitin, 6 mM L-glutamin, 0,4 % ekstrakt P, 1,0 μM adrenalin, 5 μg/ml transferrin, 10 nM T3, 1 μg/ml hydrokortison, rh EGF 5 ng/ml og 5 μg/ml insulin). Inkuber cellene ved 37 °C i 5 % CO2.
  3. Dissosier cellene med 1 ml 0,25% trypsin i 5 min til cellene løsner helt fra bunnen av platen.
  4. Tilsett 10 ml komplett HITES-medium for å nøytralisere trypsin og samle cellene i et 15 ml rør. Sentrifuge ved 4 °C ved 300 x g i 5 min.
    FORSIKTIG: Overvåk nøye tiden for trypsin fordøyelsen av mikroskopi, fordi overbesvær kan forårsake celledød.
  5. Kast de supernatante og gjenoppuss cellene i 2 ml HITES medium med 10% FBS.
  6. Pipette 10 μL av den ovennevnte cellefjæringen på platen og sett den inn i en automatisert celleteller for å oppnå konsentrasjonen i celler/ml.
  7. Plate BEAS-2B celler med en konsentrasjon på 3 × 105 celler / ml i 6 brønnplater i et totalt volum på 2 ml i HITES medium supplert med 10% av FBS for overnatting kultur.
  8. Behandle cellene ved ca. 80 % samløpet, eller 5 x 105 celler/ml, med 4 % CSE i 3 timer. Før CSE-behandling, endre mediet med HITES medium med 1% av FBS.

4. Bakteriell infeksjon

  1. Legg til P. aeruginosa eller P. fluorescens Migula (~ 1 × 107 CFU / ml) til hver brønn av cse-behandlede celler og inkubere i 1 time ved 37 ° C i 5% CO2.
  2. Aspirer supernativa og erstatt med 2 ml friskt HITES-medium for å behandle med 4 % CSE og 100 μg/ml gentamicin.
    MERK: Gentamicin brukes fordi den ikke er i stand til å trenge inn i humane lungeepitelmembraner. Dermed kan det drepe alle bakteriene i mediet, men ikke de som invaderte lungeepitelcellene.
  3. Etter 1 time cse/gentamicinbehandling ved 37 °C i 5 % CO2,aspirer supernativane og vask cellene 3x med PBS for påfølgende bestemmelse av bakteriell konsentrasjon.
    MERK: For å bekrefte de internaliserte bakteriene ble celler infisert med GFP-merket P. fluorescens Migula observert under fluorescerende mikroskopi.

5. Bestemmelse av bakteriell konsentrasjon ved hjelp av drop plate-metoden

  1. For å bestemme bakteriell belastning i infiserte celler med drop plate-metoden, vask de gentamycinbehandlede cellene 2x med 2 ml kald PBS.
  2. Tilsett 1 ml cellelysbuffer (0,5 % triton X-100 i PBS) i hver brønn.
  3. Fortynn cellelylatene som inneholder de internaliserte bakteriene i en gradient (1:10, 1:100, 1:1,000 og 1:10,000) for følgende inokulasjon til TSB agar plate.
  4. Etter 16 timer inkubasjon, oppnå resultatene av CFU ved å telle bakterielle kolonier.

6. RT-qPCR påvisning av bakteriell 16S rRNA

  1. Behandle Pseudomonas-infisertelungeepitelceller (~1 x 106 celler/ml) med gentamycin som beskrevet ovenfor. Aspirer mediet og vask cellene 2x med 2 ml kald PBS.
  2. Tilsett 0,35 ml guanidium tiocyanat lysis buffer per brønn av en 6 brønnplate. Samle cellene med en celleskraper. Pipette lysatet inn i et mikrocentrifugerør og bland forsiktig med pipetten.
  3. Tilsett samme volum (0,35 ml) nylaget 70% etanol i lysatet og bland godt. Overfør alle eksemplene til en spin-kolonne plassert i et 2 ml oppsamlingsrør. Sentrifuge ved 10 000 x g for 30 s ved 20–25 °C. Kast deretter bufferen i oppsamlingsrøret.
  4. Vask kolonnen med 0,7 ml vaskebuffer 1. Sentrifuger kolonnen på 10.000 x g for 30 s. Vask søylen 2x med 0,5 ml buffer for å vaske den membranbundne RNA. Gjenta sentrifugeringen ved 10 000 x g i 2 min.
  5. Plasser kolonnen i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør. Tilsett 30–50 μL RNasefritt vann. Sentrifuge ved 10.000 x g i 1 min. Samle gjennomstrømningen og mål RNA-konsentrasjonen.
  6. Utfør en omvendt transkripsjonsreaksjon i henhold til produsentens protokoll. Bland 1 μg totalt RNA med 10 ml reaksjonsbuffer, 1 μL reverstranskriptase og RNasefritt vann for en 20 μL reaksjon. Utfør reaksjonen ved reverstranskripsjon ved 37 °C i 1 time og deretter 95 °C i 5 min.
  7. Bland sammen cDNA-malene (1 μL av hver omvendt transkripsjonsreaksjon ovenfor), 5 μL av Master Mix som inneholder SYBR-fargestoff, 1 μL av hver 200 nM spesifikke primere og vann i en 20 μL blanding for følgende PCR-analyse, i henhold til produsentens anbefalinger.
    MERK: Følgende er primere rettet mot 16S rRNA av P. aeruginosa: fremover 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3'; omvendt 5'-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3'. GAPDH ble brukt som en lastekontroll med følgende primere: fremover: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3'; omvendt: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3'.
  8. Bruk den komparative CT-metoden til å bestemme uttrykket.

7. Påvisning av fluorescerende Pseudomonas med strømningscytometri

  1. Behandle de ovennevnte fluorescerende Pseudomonas-infisertelungeepitelceller (~ 1 x10 6 celler / ml) med gentamycin som tidligere beskrevet. Aspirer mediet og vask cellene 2x med 2 ml kald PBS.
  2. Analyser prøvene med et strømningssytometer ved en bølgelengde på 509 nm for påvisning av GFP. Avslutt hver lesing ved 100.000 tellinger. Analyser de anskaffede dataene med relatert programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et diagram brukes til å illustrere protokollen i figur 1. Lungeepitelceller beas-2B ble behandlet med CSE og utfordret med Pseudomonas. Pseudomonas i kulturmediet ble drept av den ekstra gentamycin og cellene ble utsatt for drop plate analyse, RT-qPCR påvisning av Pseudomonas ribosom 16S RNA, og flyt cytometri. Sammenlignet med kontroll, CSE behandling betydelig økt bakteriell infeksjon i drop plate metoder (Figur 2). Tilsvarende påvirket CSE bakteriebelastning i HSAEC (figur 3). Celle levedyktighet endret seg ikke betydelig etter 3 timer av 4% CSE behandling, i 1 time pseudomonas infeksjon, eller i 1 time gentamycin behandling (Figur 4 Figur 5 Figur 6). 16S rRNA-mål RT-qPCR-metoden (figur 7) og strømningscytometri (figur 8) viste lignende resultater. Resultater fra fluorescerende mikroskopi viste at GFP-merkede bakterier colocalized med BEAS-2B celler i en P. fluorescens Migula infeksjon eksperiment (Figur 9). Disse resultatene tyder på at sigarettrøyking økt Pseudomonas belastning i BEAS-2B celler.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk presentasjon av protokollen for å studere sigarettrøyk effekter på Pseudomonas infeksjon i lunge epitelceller. Lungeepitelceller dyrket i cellekulturinnlegg eller konvensjonelle kulturplater eller lungeorganoider ble utsatt for sigarettrøyk i 16 min via røykerobot eller behandlet med forberedt 4% CSE i 3 timer. Disse cellene ble deretter infisert med P. aeruginosa i 1 time (MOI = 10). Gentamycin ble brukt til å eliminere levende Pseudomonas i kulturmediet. De ovennevnte cellene var underlagt drop plate-metoden, qRT-PCR eller strømningscytometri tilnærminger for å bestemme bakteriell belastning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Drop plate metode for å bestemme bakteriell belastning i lunge epitel beas-2B celler. BEAS-2B-celler ble behandlet med 4 % CSE i 3 timer. Celler ble deretter utsatt for P. aeruginosa (stamme PAO1) infeksjon i 1 time etterfulgt av gentamycinbehandling i ytterligere 1 time. Cellene ble lyset og cellelylatene ble fortynnet for å inokulere TSB-plater i 16 timer. Kolonier ble talt; CFU-tallene er illustrert i plottet. Grafen viser ± SD, og "*" angir P < 0,05. Resultatene er representative for n = 3 eksperimenter. Toveis ulønnet Student t-testble brukt til røykbehandlede og ubehandlede grupper. P < 0,05 indikerer statistisk signifikans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Drop plate metode for å bestemme bakteriell belastning i HSAEC celler. Humane primære små luftveisepitelceller ble behandlet med 4 % CSE i 3 timer. Celler ble deretter utsatt for P. aeruginosa (stamme PAO1) infeksjon i 1 time etterfulgt av gentamycinbehandling i ytterligere 1 time. Cellene ble lyset og cellelylatene ble fortynnet for å inokulere på TSB-plater i 16 timer. Kolonier ble talt; CFU-tallene er illustrert i plottet. Grafen viser ± SD, og "*" angir P < 0,05. Resultatene er representative for n = 3 eksperimenter. Toveis ulønnet Student t-testble brukt til røykbehandlede og ubehandlede grupper. P < 0,05 indikerer statistisk signifikans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bestemmelse av celle levedyktighet i CSE-behandlet lunge epitel BEAS-2B celler. Lungeepitelceller beas-2B ble behandlet med 4 % CSE i 3 timer. Cellene ble farget med trypan blå og celle levedyktighet ble målt med celleteller. Grafen viser ± SD. Resultatene er representative for n = 3 eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bestemmelse av celle levedyktighet i Pseudomonas-infisertlungepitel BEAS-2B celler. Pseudomonas Lungeepitelceller beas-2B ble infisert med P. aeruginosa (MOI = 10) i 1 time. Cellene ble farget med trypan blå og celle levedyktighet ble målt med en celle teller. Grafen viser ± SD. Resultatene er representative for n = 3 eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Bestemmelse av celle levedyktighet i gentamycin-behandlet lunge epitel BEAS-2B celler. Lungeepitelceller beas-2B ble behandlet med 100 μg/ml gentamycin i 1 time. Cellene ble farget med trypan blå og celle levedyktighet ble målt med en celle teller. Grafen viser ± SD. Resultatene er representative for n = 3 eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: qRT-PCR for å bestemme bakteriell belastning i lungeepitelceller. Behandlede celler i figur 2 ble utsatt for total RNA-ekstraksjon. En tilsvarende mengde RNA fra hver prøve ble omvendt transkribert til cDNA, og mengden 16S RNA av P. aeruginosa ble bestemt med kvantitative PCR ved hjelp av bestemte primerpar. Resultater fra qPCR tegnes inn i diagrammet. Grafen viser ± SD, og "*" angir P < 0,05. Resultatene er representative for n = 3 eksperimenter. Toveis ulønnet Student t-testble brukt til røykbehandlede og ubehandlede grupper. P < 0,05 indikerer statistisk signifikans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Strømningscytometri for å bestemme bakteriell belastning i lungeepitelceller. BEAS-2B-celler ble behandlet med CSE og infisert med P. fluorescens Migula (stamme PAO143). Infiserte celler ble behandlet med gentamycin og fordøyd med trypsin for å lage en celleuspensjon. Celle suspensjoner ble passert gjennom strømningscytometer og fluorescerende Pseudomonas-positiveceller ble bestemt ved en bølgelengde på 509 nm. Resultater fra strømningscytometri plottes i grafen. Grafen viser ± SD, og "*" angir P < 0,05. Resultatene er representative for n = 3 eksperimenter. Toveis ulønnet Student t-testble brukt til røykbehandlet og ubehandlede grupper. P < 0,05 indikerer statistisk signifikans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Observasjon av bakteriell infeksjon med fluorescerende mikroskopi. BEAS-2B-celler ble infisert med P. fluorescens Migula (stamme PAO143) i 1 time. Cellene ble behandlet med gentamycin i ytterligere 1 time og vasket 2x med kald PBS. De GFP-merkede bakteriene ble observert under et fluorescerende mikroskop ved en bølgelengde på 480 nm og BEAS-2B-celler ble visualisert med et fasebilde. Bildene ble slått sammen, og det representative resultatet vises. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakteriell invasjon i lungeepitelceller er et avgjørende skritt i patogenesen av bakterielle infeksjoner. Prosessen med bakteriell invasjon i cellene kan brytes ned i følgende tre trinn: Først kontakter bakteriene og holder seg til overflaten av epitelcellen ved hjelp av deres flagella. For det andre gjennomgår bakteriene enten internalisering eller trenger inn i cellulær membran. Til slutt replikerer og koloniserer bakteriene cellene hvis de klarer å unnslippe cellulæreforsvarsmekanismer 25,26. Tilnærminger for observasjon av bakterielle infeksjoner i lungemikrofager har lenge vært utviklet, men med begrenset kunnskap om lungeepitelceller27,28. Denne studien bestemte bakteriell belastning i lungeepitelceller via tre tilnærminger: en drop plate analyse, RT-qPCR for Pseudomonas ribosom 16S RNA, og flyt cytometri. Alle tre tilnærmingene fungerer godt med lignende følsomheter. Velge tilnærminger for å bestemme bakteriell belastning i lunge epitelceller avhenger av tilgjengeligheten av utstyr og tid. I disse eksperimentene er det avgjørende å holde bakteriell flagella uskadet og intakt for vellykket lungeepitelcelleinfeksjon29. En kortere ristingstid med begrenset hastighet kan bidra til å fremme bakteriell invaderendekapasitet 30.

Et stort hinder for bestemmelse av bakteriekonsentrasjonen i lungeepitelceller er bakteriell forurensning fra kulturmediet. I celleinfeksjonseksperimenter legges bakteriene inn i kulturmediet i en bestemt tidsperiode (f.eks. 1 t). Innen den tiden invaderer en del av den bakterielle belastningen det cytoplasmatiske rommet, men rester kan festes til cellenes ytre membran. Et antibiotikum, gentamycin, brukes til å drepe bakteriene i kulturmediet og rester som er festet til cellenes ytre membran31. Gentamycin anses ikke gjennomtrengelig for cellulær membran og vil dermed ikke påvirke bakteriene som allerede er i cellene. Behandling med gentamycin gjør det ideelt for dette systemet å utelukke potensiell forurensning fra utenfor de infiserte lungeepitelcellene.

For å studere effekten av sigarettrøyk på bakteriell infeksjon i lungeepitelceller, må lungeceller bli utsatt for sigarettrøyk før bakteriell infeksjon i cellulære modeller. En konvensjonell tilnærming forbereder fersk CSE for å behandle celler. Generering av CSE er en kostnadseffektiv metode for studier. CSE er lett å håndtere, prosessen med å lage CSE er enkel, og CSE intratrakeal injeksjon er effektiv i generering av emfysem i dyremodeller på kort tid32. Tilnærminger til direkte sigaretteksponering er også utviklet for både in vitro cellulære modeller og in vivo gnagermodeller. Seks måneder med daglig sigarettrøykeksponering for mus er mye brukt til å generere emfysem33. Direkte sigarettrøyk eksponering krever komplisert utstyr som kombinerer sigarett forbrenning og celle kultur systemer. Sigarettforbrenning produserer sigarettrøyk, men genererer også en sum mengde varme som kan påvirke kulturkammerets temperatur og fuktighet. Heldigvis gjør nyere teknikker direkte sigarettrøykeksponering lettere21. En internasjonal organisasjon for standardisering (ISO) protokoll er implementert for direkte sigarettrøyk eksponering eksperimenter22. Eksponering for sigarettrøyken kan utføres en eller flere ganger. I tillegg, sammen med fremdriften av cellekulturteknikker, kan lunge primære epitelceller også dyrkes på gjennomsiktige innsatser for å oppnå en samtidig lunge epitelcelle monolayer34. Lunge epitelceller monolag strukturelt etterligne fysiologiske forhold i lungevev. Celler kan deretter bli utsatt for aktisk gassrøyk eller luft i luftvæskegrensesnittet35. Videre har kultur av lunge organoider dukket opp i gjeldende lungestudier36,37. Det vil være interessant å vite hvordan sigarettrøyk påvirker bakteriell infeksjon i lungeorganoider. Tilnærmingen beskrevet kan etterligne menneskelig infeksjon i vev i stedet for kultiverte celler og kan gjøre mulig ytterligere innsikt i lavere respiratorisk bakteriell infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av en National Institutes of Health R01 tilskudd HL125435 og HL142997 (til CZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

Tags

Denne måneden i JoVE Utgave 159 sigarettrøyk eksponering sigarettrøyk ekstrakt Pseudomonas infeksjon bakteriell belastning lunge epitelcelle lungeskade
Studere effekter av sigarettrøyk på <em>Pseudomonas</em> infeksjon i lunge epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter