Summary
Descritto qui è un protocollo per studiare come l'estratto di fumo di sigaretta influisce sulla colonizzazione batterica nelle cellule epiteliali polmonari.
Abstract
Il fumo di sigaretta è la principale causa eziologica per l'enfisema polmonare e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Il fumo di sigaretta promuove anche la suscettibilità alle infezioni batteriche nel sistema respiratorio. Tuttavia, gli effetti del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari umane devono ancora essere studiati a fondo. Descritto qui è un protocollo dettagliato per la preparazione di estratti di fumo di sigaretta (CSE), il trattamento delle cellule epiteliali polmonari umane con CSE, e l'infezione batterica e la determinazione dell'infezione. CSE è stato preparato con un metodo convenzionale. Le cellule epiteliali polmonari sono state trattate con 4% CSE per 3 cellule trattate con CSE sono state, quindi, infettate da Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I carichi batterici delle cellule sono stati determinati da tre diversi metodi. I risultati hanno mostrato che la CSE ha aumentato il carico di Pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Questo protocollo, quindi, fornisce un approccio semplice e riproducibile per studiare l'effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.
Introduction
Il fumo di sigaretta influisce sulla salute pubblica di milioni di persone in tutto il mondo. Molte malattie deleterie, tra cui il cancro ai polmoni e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono segnalate per essere correlate al fumo disigaretta 1,2. Il fumo di sigaretta aumenta la suscettibilità alle infezioni microbiche acute nel sistemarespiratorio 3,4,5. Inoltre, prove crescenti dimostrano che il fumo di sigaretta migliora la patogenesi di molti disturbicronici 6,7,8. Ad esempio, il fumo di sigaretta può aumentare le infezioni virali o batteriche che causano l'esacerbazione dellaBPCO 9. Tra i patogeni batterici che contribuiscono etiologicamente all'esacerbazione acuta della BPCO, un patogeno opportunistico del bacillo gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa, provoca infezioni che correlano con cattive prognosi e superiori morti10,11. L'esacerbazione della BPCO peggiora la malattia accelerando la progressione patologica. Non esistono terapie efficaci contro l'esacerbazione della BPCO ad eccezione della gestione antinfmatica12. L'esacerbazione della BPCO favorisce la mortalità dei pazienti, diminuisce la qualità della vita e aumenta l'onere economico per lasocietà 13.
Le vie respiratorie sono un sistema aperto, continuamente sottoposto a vari patogeni microbici presenti esternamente. I patogeni batterici opportunistici sono di solito rilevati nelle vie aeree superiori, ma a volte sono osservati nelle vieaeree inferiori 14,15. Nei modelli animali P. aeruginosa può essere rilevato nelle sacche di alveolar non appena 1 h dopo l'infezione16. Come principale meccanismo di difesa, le cellule immunitarie come macrofagi o neutrofili eliminano i batteri nelle vie aeree. Le cellule epiteliali polmonari, come prima barriera fisiologica, svolgono un ruolo unico nella difesa ospite contro le infezioni microbiche. Le cellule epiteliali polmonari possono regolare l'invasione microbica, la colonizzazione o la replicazione indipendentemente dalle celluleimmunitarie 17. Alcune molecole presenti nelle cellule epiteliali, tra cui PPARg, esercitano funzioni antibatteriche, regolando così la colonizzazione batterica e la replicazione nelle cellule epiteliali polmonari18. Il fumo di sigaretta può alterare le molecole e compromettere la normale funzione di difesa nelle cellule epitelialipolmonari 19,20. Recenti studi hanno segnalato l'esposizione diretta del fumo di sigaretta alle cellule epiteliali polmonari utilizzando l'apparato di fumo robot21,22. L'esposizione al fumo può essere eseguita in altri modi, tuttavia, compresa l'applicazione di CSE. La preparazione della CSE è un approccio riproducibile con potenziali applicazioni in altri tipi di cellule, comprese le cellule endoteliali vascolari che sono indirettamente esposte al fumo di sigaretta.
Questo rapporto descrive un protocollo per generare l'estratto di fumo di sigaretta per alterare il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari. CSE aumenta il carico batterico di P. aeruginosa, e può contribuire alla ricorrenza di infezioni batteriche di solito visto in esacerbazione BPCO. Un metodo convenzionale viene utilizzato per la preparazione di CSE. Le cellule epiteliali polmonari, nella loro fase di crescita esponenziale, sono trattate con 4% CSE per 3 h. In alternativa, le cellule epiteliali polmonari monostrato possono essere direttamente esposte al fumo di sigaretta in un'interfaccia aria-liquido. Le cellule trattate con CSE vengono quindi sfidate con Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I batteri vengono propagati ad una particolare velocità di agitazione per garantire che la morfologia dei loro flagelli rimanga intatta per mantenere la loro piena capacità invasiva. La gentamicina viene impiegata per uccidere i batteri lasciati nel mezzo di coltura, riducendo così la potenziale contaminazione durante la successiva determinazione del carico batterico. Il protocollo utilizza anche Pseudomonasetichettata GFP , che è stato utilizzato come potente strumento nello studio dell'infezione da Pseudomonas in diversi modelli. Un ceppo rappresentativo è P. fluorescens Migula23. Il grado di infezione o carico batterico dopo il trattamento della CSE è determinato in tre modi: il metodo della piastra di caduta con conteggio delle colonie, la PCR quantitativa che utilizza primer specifici di 16S o la citometria di flusso nelle cellule infettate da Pseudomonas fluorescenti. Questo protocollo è un approccio semplice e riproducibile per studiare l'effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione 100% CSE
- Disegnare 10 mL di supporti di coltura cellulare senza siero (DMEM/F12 per le cellule BEAS-2B; supporto basale epiteliale delle vie aeree per le cellule HSAEC) in una siringa da 60 mL.
- Attaccare inversamente una punta di pipetta da 1 mL tagliata in modo appropriato all'ugello della siringa come adattatore per contenere la sigaretta (3R4F).
- Rimuovere il filtro della sigaretta. Fissare una sigaretta all'adattatore della punta e bruciare la sigaretta.
- Disegnare 40 mL di aria contenente fumo in 10 mL di supporti senza siero. Mescolare il fumo con il mezzo agitando vigorosamente (30 s per pareggio).
- Ripetere il passaggio 1.4 circa 11x in 7 min fino a quando la sigaretta è completamente bruciata.
- Filtrare i 10 mL di supporti affumicati con un filtro da 0,22 m per escludere eventuali microrganismi e particelle insolubili. Trasferire in un tubo sterile chiuso. Preparare il CSE al 100% non più di 30 minuti prima del successivo saggio.
2. Cultura Pseudomonas
- Inoculare il P. aeruginosa (ceppo PAO1) o P. fluorescens Migula (ceppo PAO143) in un brodo di soia provata (TSB) per la coltura notturna a 37 gradi centigradi.
NOTA: Per ottenere abbastanza batteri per la tatura, diffondere quanti più batteri possibile sulla piastra di agar TSB. - Raccogliere uno striscio batterico e incubare in 20 mL di TSB con 5% di glicerolo come fonte di carbonio.
- Agitare la sospensione batterica in un'incubatrice di 37 gradi centigradi a 200 giri/min per 1 h fino a quando il valore OD600 è 0,6.
CAUTION: Non lasciare che la velocità di agitazione superi i 200 giri/min. Velocità di agitazione più elevate possono danneggiare la morfologia della flagella batterica e influenzare l'invasione batterica nell'epitelia polmonare. Allo stesso modo, limitare il tempo di agitazione a 1 h per ottenere batteri altamente invasivi. Misurare il valore OD600 per stimare il numero di batteri. Un OD600 - 1 corrisponde a 109 unità di formatura colonia (CFU)/mL.
3. Coltura delle cellule epiteliali polmonari umane e trattamento CSE
- Coltura cellule umane BEAS-2B in media HITES (500 mL di DMEM/F12, 2,5 mg di insulina, 2,5 mg di trasferina, 2,5 mg di selenite di sodio, 2,5 mg di transferrina, 10 idrocortisone da 10 M, 10 M β-estradiolo, 10 mM HEPES e 2 mM L-glutamine) integrato con siero bovino fetale (FBS) come descrittoin precedenza 24.
- Coltura umana primaria piccole cellule epiteliali delle vie aeree (HSAEC) nel mezzo di coltura delle cellule epiteliali delle vie aeree (500 mL di Airway Cell Basal Medium, 500 g/mL HSA, 0,6 M acido linoleico, 0,6 g/mL lecithin, 6 mM L-glutamina, 0,4% estratto P, 1,0 1,0 M epinefrina, 5 g/mL transferrin, 10 nM T3, 1 g/mL hydrocortisone, rh EGF 5 ng/mL e 5 g/mL di insulina). Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in 5% CO2.
- Dissociare le cellule con 1 mL di 0,25% di metapsina per 5 min fino a quando le cellule si staccano completamente dal fondo della piastra.
- Aggiungere 10 mL di mezzo HITES completo per neutralizzare la trypsina e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. Centrifuga a 4 gradi centigradi a 300 x g per 5 min.
CAUTION: Monitorare attentamente il tempo per la digestione della trypsina tramite microscopia, perché l'overdigestion può causare la morte delle cellule. - Scartare il supernata e risundere le cellule in 2 mL di media HITES con 10% FBS.
- Pipetta 10 L della sospensione cellulare di cui sopra sulla piastra e inserirla in un contatore di celle automatizzate per ottenere la concentrazione nelle cellule/mL.
- Piastra BEAS-2B cellule ad una concentrazione di 3 × 105 cellule/ mL in 6 piastre di pozzo in un volume totale di 2 mL in HITES medio integrato con 10% di FBS per la coltura notturna.
- Trattare le cellule con circa l'80% di confluenza, o 5 x 105 cellule/mL, con 4% CSE per 3 h. Prima del trattamento CSE, cambiare il mezzo con il supporto HITES con l'1% di FBS.
4. Infezione batterica
- Aggiungere P. aeruginosa o P. fluorescens Migula (n. 1 × 107 CFU/mL) a ciascuna delle cellule trattate con CSE e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2.
- Aspirare i supernatanti e sostituirli con 2 mL di mezzo HITES fresco da trattare con 4% di CSE e 100 g/mL di gentamicina.
NOTA: La gentamicina viene utilizzata perché non è in grado di penetrare le membrane cellulari epiteliali del polmone umano. Così, può uccidere tutti i batteri nel mezzo, ma non quelli che hanno invaso le cellule epiteliali polmonari. - Dopo 1 h di trattamento CSE/gentamicina a 37 gradi centigradi nel 5% CO2, aspirare i supernatanti e lavare le cellule 3x con PBS per la successiva determinazione della concentrazione batterica.
NOTA: Per confermare i batteri internalizzati, le cellule infettate con P. fluorescens Migula etichettate GFP sono state osservate sotto microscopia fluorescente.
5. Determinazione della concentrazione batterica utilizzando il metodo della piastra di caduta
- Per determinare il carico batterico nelle cellule infette con il metodo della piastra di rilascio, lavare le cellule trattate con gentamicina 2x con 2 mL di PBS freddo.
- Aggiungere 1 mL di buffer di lysi cellulare (0,5% triton X-100 in PBS) a ciascun pozzo.
- Diluire i lisati cellulari contenenti i batteri interiorizzati in un gradiente (1:10, 1:100, 1:1,000 e 1:10.000) per la seguente inoculazione alla piastra di agar TSB.
- Dopo 16 h di incubazione, ottenere i risultati della CFU contando le colonie batteriche.
6. Rilevamento RT-qPCR di rRNA batterico 16S
- Trattare le cellule epitelialipolmonari infettate da Pseudomonas (1 x 106 cellule/mL) con la gentamicina come descritto sopra. Aspirare il mezzo e lavare le cellule 2x con 2 mL di PBS freddo.
- Aggiungere 0,35 mL del tampone di lisi di diocianiato di guanidio per pozzo di una piastra di 6 possi. Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare. Pipetta il licosato in un tubo microcentrifuge e mescolare delicatamente con la pipetta.
- Aggiungere lo stesso volume (0,35 mL) di etanolo appena preparato 70% nel llito e mescolare bene. Trasferire tutti i campioni in una colonna di rotazione collocata in un tubo di raccolta di 2 mL. Centrifuga a 10.000 x g per 30 s a 20-25 gradi centigradi. Quindi, eliminare il buffer nel tubo di raccolta.
- Lavare la colonna con 0,7 mL di buffer di lavaggio 1. Centrifugare la colonna a 10.000 x g per 30 s. Lavare la colonna 2x con 0,5 mL di tampone per lavare l'RNA legato alla membrana. Ripetere la centrifugazione a 10.000 x g per 2 min.
- Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL. Aggiungere 30-50 L RNase-free acqua. Centrifuga a 10.000 x g per 1 min. Raccogliere il flusso e misurare la concentrazione di RNA.
- Eseguire una reazione di trascrizione inversa in base al protocollo del produttore. Mescolare 1 g di RNA totale con 10 mL di buffer di reazione, 1 L di trascrizione inversa e acqua senza RNase per una reazione di 20 L. Condurre la reazione di trascrizione inversa a 37 gradi centigradi per 1 h e poi a 95 gradi centigradi per 5 minuti.
- Mescolare i modelli di cDNA (1 L di ogni reazione di trascrizione inversa di cui sopra), 5 L del Master Mix contenente colorante SYBR, 1 L di ogni primer specifico da 200 nM e acqua in una miscela di 20 L per la seguente analisi PCR, secondo le raccomandazioni del produttore.
NOTA: I primi sono i primer che prendono di mira il 16S rRNA di P. aeruginosa: avanti 5 -CAAAACTGAGCTAGAGTACG-3; invertire 5-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3. GAPDH è stato utilizzato come controllo di carico con i seguenti primer: avanti: 5 -GGCATGGACTGGTCATGA-3; retromarcia: 5'-TTCACCATGGAGAGGC-3'. - Utilizzare il metodo
per determinare l'espressione.
7. Rilevamento di Pseudomonas fluorescenti con citometria di flusso
- Trattare le cellule epiteliali polmonariinfetti sopra (1 x 106 cellule/mL) con la gentamicina come descritto in precedenza. Aspirare il mezzo e lavare le cellule 2x con 2 mL di PBS freddo.
- Analizzare i campioni con un citometro di flusso ad una lunghezza d'onda di 509 nm per il rilevamento di GFP. Terminare ogni lettura a 100.000 conteggi. Analizzare i dati acquisiti con il software correlato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un diagramma viene utilizzato per illustrare il protocollo nella Figura 1. Le cellule beAS-2B epiteliali polmonari sono state trattate con CSE e sfidate con Pseudomonas. Pseudomonas nel mezzo di coltura sono stati uccisi dalla gentamicina aggiunta e le cellule sono state sottoposte al test della piastra di caduta, rt-qPCR rilevamento di Pseudomonas ribosome 16S RNA, e citometria di flusso. Rispetto al controllo, il trattamento CSE ha notevolmente aumentato l'infezione batterica nei metodi delle piastre di caduta(Figura 2). Di seguito è quanto è possibile che la CSE influimento del carico batterico nell'HSAEC(Figura 3). La vitalità cellulare non è cambiata considerevolmente dopo 3 h del 4% di trattamento CSE, in 1 h di infezione da Pseudomonas, o in 1 h di trattamento della gentamicina(Figura 4 Figura 5 Figura 6). Il metodo RT-qPCR di destinazione 16S (Figura 7) e la citometria di flusso (Figura 8) hanno dimostrato risultati simili. I risultati della microscopia fluorescente hanno mostrato che i batteri con etichetta GFP sono colocalizzati con cellule BEAS-2B in un esperimento di infezione da Migula di P. fluorescens ( Figura9). Questi risultati suggeriscono che il fumo di sigaretta ha aumentato il carico di Pseudomonas nelle cellule BEAS-2B.
Figura 1: Presentazione schematica del protocollo per studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da Pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Le cellule epiteliali polmonari coltivate in inserti per coltura cellulare o piastre di coltura convenzionali o organoidi polmonari sono state esposte al fumo di sigaretta per 16 minuti tramite robot fumante o trattate con CSE preparato per 3 h. Queste cellule sono state poi infettate da P. aeruginosa per 1 h (MOI - 10). Gentamicina è stato utilizzato per eliminare pseudomonas dal vivo nel mezzo di coltura. Le cellule di cui sopra erano soggette al metodo della piastra di rilascio, qRT-PCR, o approcci di citometria di flusso per determinare il carico batterico. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Metodo piastra di caduta per determinare il carico batterico nelle cellule BEAS-2B epiteliali polmonari. Le cellule BEAS-2B sono state trattate con il 4% di CSE per 3 h. Le cellule sono state poi sottoposte a infezione da P. aeruginosa (ceppo PAO1) per 1 h seguita da trattamento di gentamicina per un altro 1 h. Le cellule sono state litanti e le cellule litanti sono state diluite per inoculare piastre TSB per 16 h. Le colonie sono state contate; i numeri CFU sono illustrati nella trama. Il grafico mostra ± SD e il carattere "" indica P < 0,05. I risultati sono rappresentativi di n - 3 esperimenti. Il test t-studente non accoppiato adue metodi è stato utilizzato per gruppi trattati con fumo e non trattati. P < 0,05 indica la significatività statistica. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Metodo di caduta piastra per determinare il carico batterico nelle cellule HSAEC. Le cellule epiteliali di piccole vie aeree primarie umane sono state trattate con il 4% di CSE per 3 h. Le cellule sono state poi sottoposte a infezione da P. aeruginosa (ceppo PAO1) per 1 h seguita da trattamento di gentamicina per un altro 1 h. Le cellule sono state lliate e le litate cellulari sono state diluite per inoculare su piastre TSB per 16 h. Le colonie sono state contate; i numeri CFU sono illustrati nella trama. Il grafico mostra ± SD e il carattere "" indica P < 0,05. I risultati sono rappresentativi di n - 3 esperimenti. Il test t-studente non accoppiato adue metodi è stato utilizzato per gruppi trattati con fumo e non trattati. P < 0,05 indica la significatività statistica. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Determinazione della vitalità cellulare nelle cellule BEAS-2B epiteliali trattate con CSE. Le cellule epiteliali polmonari BEAS-2B sono state trattate con il 4% di CSE per 3 h. Le cellule sono state macchiate con blu di meta e la vitalità cellulare è stata misurata con il contatore delle cellule. Il grafico mostra la ± SD. I risultati sono rappresentativi di n - 3 esperimenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Determinazione della vitalità cellulare nelle cellule BEAS-2B epiteliali polmonari infettate da Pseudomonas. Le cellule epiteliali polmonari BEAS-2B sono state infettate da P. aeruginosa (MOI - 10) per 1 h. Le cellule erano macchiate di blu di meta e la vitalità cellulare è stata misurata con un contatore di cellule. Il grafico mostra la ± SD. I risultati sono rappresentativi di n - 3 esperimenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Determinazione della vitalità cellulare nelle cellule BEAS-2B epiteliali trattate con gentamicina. Le cellule beas-2B epiteliali polmonari sono state trattate con gentamicina da 100 g/mL per 1 h. Le cellule erano macchiate di blu di meta e la vitalità cellulare è stata misurata con un contatore di cellule. Il grafico mostra la ± SD. I risultati sono rappresentativi di n - 3 esperimenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: qRT-PCR per determinare il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari. Le cellule trattate nella Figura 2 sono state sottoposte all'estrazione totale dell'RNA. Una quantità equivalente di RNA da ogni campione è stata trascritta in retromarcia in cDNA, e la quantità di RNA 16S di P. aeruginosa è stata determinata con PCR quantitativa utilizzando specifiche coppie di primer. I risultati di qPCR vengono tracciati nel grafico. Il grafico mostra ± SD e il carattere "" indica P < 0,05. I risultati sono rappresentativi di n - 3 esperimenti. Il test t-studente non accoppiato adue metodi è stato utilizzato per gruppi trattati con fumo e non trattati. P < 0,05 indica la significatività statistica. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Citometria di flusso per determinare il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari. Le cellule BEAS-2B sono state trattate con CSE e infettate da P. fluorescens Migula (ceppo PAO143). Le cellule infette sono state trattate con gentamicina e digerite con la trypsina per fare una sospensione cellulare. Le sospensioni cellulari sono state passate attraverso il citometro di flusso e le cellule fluorescenti Pseudomonas-positive sono state determinate ad una lunghezza d'onda di 509 nm. I risultati della citometria di flusso vengono tracciati nel grafico. Il grafico mostra ± SD e il carattere "" indica P < 0,05. I risultati sono rappresentativi di n - 3 esperimenti. Due cose non accoppiate Student t-test è stato utilizzato per il fumo trattati e gruppi non trattati. P < 0,05 indica la significatività statistica. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Osservazione dell'infezione batterica con microscopia fluorescente. Le cellule BEAS-2B sono state infettate da P. fluorescens Migula (ceppo PAO143) per 1 h. Le cellule sono state trattate con gentamicina per un altro 1 h e lavate 2x con PBS freddo. I batteri etichettati GFP sono stati osservati al microscopio fluorescente ad una lunghezza d'onda di 480 nm e le cellule BEAS-2B sono state mostrate con un'immagine di fase. Le immagini sono state unite e viene visualizzato il risultato rappresentativo. Barra della scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'invasione batterica nelle cellule epiteliali polmonari è un passo cruciale nella patogenesi delle infezioni batteriche. Il processo di invasione batterica nelle cellule può essere suddiviso nei seguenti tre passaggi: In primo luogo, i batteri contatto e aderire alla superficie della cellula epiteliale utilizzando il loro flagella. In secondo luogo, i batteri subiscono l'internalizzazione o penetrano nella membrana cellulare. Infine, i batteri replicano e colonizzano le cellule se esfuggono con successo ai meccanismi didifesa cellulare 25,26. Sono stati a lungo sviluppati approcci per l'osservazione delle infezioni batteriche nei microfagipolmonari,ma con una conoscenza limitata delle cellule epiteliali polmonari27,28. Questo studio ha determinato il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari attraverso tre approcci: un saggio della piastra di caduta, RT-qPCR per Pseudomonas riboso 16S RNA e citometria di flusso. Tutti e tre gli approcci funzionano bene con sensibilità simili. La scelta degli approcci per determinare il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari dipende dalla disponibilità di attrezzature e tempo. In questi esperimenti, mantenere la flagella batterica intatta e intatta è fondamentale per un'infezione delle cellule epiteliali polmonaridi successo 29. Un tempo di agitazione più breve con velocità limitata può contribuire a promuovere ulteriormente la capacità di invasorebatterico 30.
Un ostacolo importante nella determinazione della concentrazione batterica nelle cellule epiteliali polmonari è la contaminazione batterica dal mezzo di coltura. Negli esperimenti sull'infezione cellulare, i batteri vengono aggiunti nel mezzo di coltura per un periodo di tempo specifico (cioè 1 h). Entro quel periodo, parte di tale carico batterico invade con successo il compartimento citoplasmico, ma i residui possono attaccarsi alla membrana esterna delle cellule. Un antibiotico, la gentamicina, viene utilizzato per uccidere i batteri nel mezzo di coltura e i residui che si attaccano alla membrana esterna dellecellule 31. La gentamicina è considerata non permeabile alla membrana cellulare e quindi non influenzerà i batteri già all'interno delle cellule. Il trattamento con gentamicina rende ideale per questo sistema escludere la potenziale contaminazione dall'esterno delle cellule epiteliali polmonari infette.
Per studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione batterica nelle cellule epiteliali polmonari, le cellule polmonari devono essere esposte al fumo di sigaretta prima dell'infezione batterica nei modelli cellulari. Un approccio convenzionale sta preparando una CSE fresca per il trattamento delle cellule. La generazione di CSE è un metodo conveniente per gli studi. CSE è facile da gestire, il processo di fare CSE è semplice, e CSE iniezione intratracheale è efficace nella generazione di enfisema nei modelli animali in un breve periodo ditempo 32. Sono stati sviluppati approcci di esposizione diretta alle sigarette sia per i modelli cellulari in vitro che per i modelli di roditori in vivo. Sei mesi di esposizione giornaliera al fumo di sigaretta ai topi sono ampiamente utilizzati per generare enfisema33. L'esposizione diretta al fumo di sigaretta richiede attrezzature complicate che combinano la combustione delle sigarette e i sistemi di coltura cellulare. La combustione di sigarette produce fumo di sigaretta, ma genera anche una somma di calore che può influenzare la temperatura e l'umidità della camera di coltura. Fortunatamente, le tecniche recenti rendono più facile l'esposizione diretta al fumo disigaretta 21. È stato implementato un protocollo ISO (International Organization for Standardization) per gli esperimenti diretti di esposizione al fumo disigaretta 22. L'esposizione al fumo di sigaretta può essere eseguita una o più volte. Inoltre, insieme al progresso delle tecniche di coltura cellulare, le cellule epiteliali primarie polmonari potrebbero anche essere coltivate su inserti trasparenti per ottenere un monostrato confluente della cellula polmonare epiteliale34. I monostrati delle cellule epiteliali polmonari imitano strutturalmente le condizioni fisiologiche nei tessuti polmonari. Le cellule possono quindi essere esposte a fumo o aria gassosa apica all'interfaccia aria-liquido35. Inoltre, la coltura degli organoidi polmonari è emersa negli attuali studipolmonari 36,37. Sarà interessante sapere come il fumo di sigaretta influisce sull'infezione batterica negli organoidi polmonari. L'approccio descritto può imitare l'infezione umana nei tessuti invece delle cellule colture e può rendere possibili ulteriori intuizioni nell'infezione batterica respiratoria inferiore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un National Institutes of Health R01 concede HL125435 e HL142997 (a C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F.
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M.
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
