Summary
这里描述的是一个协议，研究香烟烟雾提取物如何影响肺上皮细胞的细菌殖民化。
Abstract
吸烟是导致肺气肿和慢性阻塞性肺病（COPD）的主要病因。吸烟也会促进呼吸系统细菌感染的易感性。然而，吸烟对人类肺上皮细胞细菌感染的影响尚未得到彻底研究。这里描述的是一个详细的协议，用于准备吸烟提取物（CSE），用CSE治疗人类肺上皮细胞，以及细菌感染和感染测定。CSE 是用传统方法准备的。肺上皮细胞在3小时用4%的CSE治疗，然后，在10的多重感染（MOI）感染伪多Pseudomonas多体。细胞的细菌负荷由三种不同的方法确定。结果表明，CSE增加肺上皮细胞的伪多多体负荷。因此，该协议提供了一种简单且可重复的方法，用于研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响。
Introduction
吸烟影响全世界数百万人的公众健康。许多有害疾病，包括肺癌和慢性阻塞性肺病（COPD），据报与吸烟有关。,2吸烟会增加呼吸系统3、4、5中急性微生物,感染的易感性。此外，越来越多的证据表明，吸烟可以增强许多慢性疾病6、7、8,的,发病机制。例如，吸烟可能会增加病毒或细菌感染，导致慢性阻塞性肺病恶化9。在病因上导致慢性阻塞性肺病急性恶化的细菌病原体中，一种机会性克阴性杆菌病原体，伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨，导致感染与不良预知和较高的死亡10，11。,11慢性阻塞性肺病的恶化通过加速病理进展使疾病恶化。除了抗症状管理12，没有有效的治疗COPD恶化。慢性阻塞性肺病的恶化会加剧病人的死亡率，降低生活质量，增加社会的经济负担。
呼吸道是一个开放的系统，不断受到外部存在的各种微生物病原体的影响。机会性细菌病原体通常在上气道中检测到，但有时在下气道14，15,中被发现。在动物模型中，在感染16后，只要1小时，就可以在阿尔维拉尔囊中检测到P.aeruginosa。作为一种主要的防御机制，免疫细胞，如巨噬细胞或嗜中性粒细胞，可消除气道中的细菌。肺上皮细胞作为第一个生理屏障，在宿主防御微生物感染方面具有独特的作用。肺上皮细胞可以调节微生物入侵、殖民化或复制，独立于免疫细胞17。上皮细胞中发现的一些分子，包括PPARg，发挥抗菌功能，从而调节细菌殖民化和复制在肺上皮细胞18。吸烟可能会改变分子，损害肺上皮细胞的正常防御功能19，20。19,20最近的研究表明，使用机器人吸烟装置21，22,将香烟烟雾直接暴露在肺上皮细胞中。然而，接触烟雾可以通过其他方式进行，包括应用 CSE。CSE 的制备是一种可重复的方法，具有其他细胞类型的潜在应用，包括间接暴露在香烟烟雾中的血管内皮细胞。
本报告描述了一种产生香烟烟雾提取物以改变肺上皮细胞中细菌负荷的协议。CSE增加 P.aeruginosa的细菌负荷，它可能有助于在COPD恶化中通常看到的细菌感染的复发。一种常规方法用于制备 CSE。肺上皮细胞，在他们的指数生长阶段，用4%的CSE治疗3小时。或者，单层培养的肺上皮细胞可以在空气-液体界面中直接暴露在香烟烟雾中。然后，CSE治疗的 细胞在 10的多重感染（MOI）上接受伪多多纳斯的挑战。细菌以特定的摇动速度传播，以确保其旗杆菌的形态保持不变，以保持其全部的侵入能力。根霉素用于杀死培养基中留下的细菌，从而减少细菌负荷的后续测定过程中的潜在污染。该协议还使用GP标签的伪多 monas，这已被作为研究不同模型中 伪多多纳斯 感染的有力工具。一个代表菌株 是P.氟森s 米古拉23。CSE治疗后感染程度或细菌负荷通过三种方式确定：带菌落计数的滴板方法，使用伪 多多 纳斯16S rRNA特异性底法的定量PCR，或感染荧光伪多多纳斯细胞的流细胞 仪。该协议是研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响的简单且可重复的方法。
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Protocol
1. 100% CSE 制备
- 将 10 mL 的无血清细胞培养基（BEAS-2B 细胞的 DMEM/F12;HSAEC 细胞的气道上皮细胞基质）绘制到 60 mL 注射器中。
- 反向将适当修剪的 1 mL 移液器尖端连接到注射器的喷嘴中，作为用于容纳香烟 （3R4F） 的适配器。
- 取出香烟的过滤器。将香烟连接到尖端适配器上，然后点燃香烟。
- 将 40 mL 含烟空气吸入 10 mL 的无血清介质中。通过剧烈摇晃（每次绘制 30 s）将烟雾与介质混合。
- 在 +7 分钟内重复步骤 1.4 约 11 倍，直到香烟完全烧灭。
- 使用 0.22 μm 过滤器过滤 10 mL 的烟熏介质，以排除任何微生物和不溶性颗粒。转移到封闭的无菌管。在后续检测前 30 分钟准备 100% CSE。
2. 伪多莫纳 文化
- 将冷冻 P.aeruginosa（ 应变PAO1）或P.荧光米古拉（ 应变PAO143） 接种到37°C的试吃大豆（TSB）的加糖板中。
注意：为了获得足够的细菌进行培养，将尽可能多的细菌传播到TSB果糖板上。 - 收集细菌涂片，在TSB的20 mL中孵育，以5%的甘油作为碳源。
- 在 200 rpm 的 37 °C 培养箱中摇动细菌悬浮液 1 小时，直到 OD600 值 = 0.6。
注意：不要让抖动速度超过 200 rpm。较高的摇动速度可能会损害细菌旗菌的形态，并影响细菌进入肺上皮。同样，将摇动时间限制在1小时，以获得高侵入性细菌。测量 OD600 值以估计细菌数量。OD600 = 1 对应于 ±109菌落形成单位 （CFU）/mL。
3. 人肺上皮细胞培养与 CSE 治疗
- 在 HITES 介质培养人类 BEAS-2B 细胞（500 mL 的 DMEM/F12， 2.5毫克胰岛素，2.5毫克转移素，2.5毫克血清钠，2.5毫克转移素，10μM氢皮质松，10μM β-雌二醇，10 mM HEPES和2 mM L-谷氨酰胺），辅以10%胎儿牛血清（FBS），如前面所述24。
- 培养人类原发性小气道上皮细胞（HSAEC）在气道上皮细胞培养基（500 mL的气道细胞基础介质，500μg/mL HSA，0.6μM亚油酸， 0.6 μg/mL 卵磷脂，6 mM L-谷氨酰胺，0.4%提取物P，1.0μM肾上腺素，5微克/mL转移素，10nM T3，1 μg/mL氢皮质松，rh EGF 5 ng/mL，和5μg/mL rh胰岛素）。在5%CO 2中孵育37°C的细胞。
- 用 1 mL 的 0.25% trypsin 分离细胞 5 分钟，直到细胞完全脱离板的底部。
- 加入10 mL的完整 HITES 介质，中和尝试，并在 15 mL 管中收集细胞。在 4 °C 下以 300 x g 离 心 5 分钟。
注意：通过显微镜仔细监测三辛消化的时间，因为过度消化可能导致细胞死亡。 - 丢弃上一液，用10%的FBS在2mL的S热介质中重新暂停细胞。
- 上述细胞悬浮液的移液器10μL插入板，并将其插入自动细胞计数器，以获得细胞/mL中的浓度。
- 在 HITES 介质中，浓度为 3 ×5 细胞/mL 的板 BEAS-2B 细胞以 2 mL 的总体积为 2 mL，辅以 10% 的 FBS 过夜培养。
- 以约80%的汇合处理细胞，或5 x 105 5 细胞/mL，用4%的CSE3小时。在 CSE 治疗之前，使用 1% 的 FBS 使用 HITS 介质更换介质。
4. 细菌感染
- 将P.aeruginosa或P.荧光米古拉（+1× 107 CFU/mL）加入到经过CSE处理的细胞的每个井中，并在5%CO2的37°C下孵育1小时。
- 吸制超自然剂，代之以2 mL的新鲜 HITES 介质，用 4% 的 CSE 和 100 μg/mL 的根他素进行治疗。
注：使用根霉素是因为无法穿透人肺上皮细胞膜。因此，它可以杀死所有细菌在中等，但不是那些入侵肺上皮细胞。 - 在 5% CO 2 中 37 °C 下进行 1 小时 CSE/根霉素治疗后，吸出中继剂，用 PBS 洗涤细胞 3 倍，以便随后确定细菌浓度。
注：为了确认内化细菌，在荧光显微镜下观察到感染了GP标签的 P.荧光米古拉的细胞。
5. 使用滴板法测定细菌浓度
- 要使用滴盘法确定受感染细胞中的细菌负荷，用2 mL的冷PBS将根霉素处理的细胞洗涤2倍。
- 向每井添加 1 mL 的细胞解液缓冲液（PBS 中为 0.5% 三吨 X-100）。
- 在梯度（1：10、1：100、1：100、1：1，000 和 1：10，000）中稀释含有内化细菌的细胞利化物，以接种以下 TSB 汞板。
- 经过16小时孵育，通过计数细菌菌落获得CFU的结果。
6. 细菌16S rRNA的RT-qPCR检测
- 如 上文所述，用根霉素治疗伪多多马斯感染的肺上皮细胞（+1 x10 6 细胞/mL）。吸气介质，用2 mL的冷PBS清洗细胞2倍。
- 在6井板的井中加入0.35 mL的硫氰酸钠解液缓冲液。使用单元格刮刀收集单元格。将利沙酸盐移液到微离心管中，并轻轻地与移液器混合。
- 将新鲜准备好的70%乙醇加入相同体积（0.35 mL）的糖酸盐中，并混合好。将所有样品转移到放置在 2 mL 收集管中的旋转柱。在20~25°C下以10，000 x g 的30 s左右的离心。 然后，丢弃收集管中的缓冲区。
- 用 0.7 mL 的洗涤缓冲液 1 清洗柱。将柱子以 10，000 x g 离心 ，为 30 s。用0.5 mL缓冲液清洗柱2x，清洗膜结合的RNA。在 10，000 x g 下重复离心 2 分钟。
- 将柱子放入新的 1.5 mL 收集管中。加入30~50μL无RSSe水。以 10，000 x g 的离心机 ，1 分钟。收集流经并测量RNA浓度。
- 根据制造商的协议执行逆转录反应。将总RNA与10 mL反应缓冲液、1 μL逆转录酶和无RNase水混合，进行20μL反应。在37°C下进行逆转录反应1小时，然后95°C进行5分钟。
- 根据制造商的建议，将 cDNA 模板（以上每个逆转录反应的 1 μL）、含有 SYBR 染料的主混合物的 5 μL、每个 200 nM 特定底向剂的 1 μL 和水混合在一起，用于以下 PCR 分析。
注：以下是针对 P.aeruginosa的16S rRNA的底注：正向5°-CACACTGAGCTAGAGAGG-3+;反向 5]-塔加特克卡格加特帕CGG-3]。 GAPDH 用作具有以下底像的装载控制：前进：5°-GGCATGGACTTCATGA-3°;反向： 5'-TTCACCATGGAGG-3+。 - 使用比较 CT 方法确定表达式。
7. 用流动 细胞学检测 荧光伪多体
- 如先前所述 ，用根霉素治疗上述荧光伪多多多感染的肺上皮细胞（+1 x10 6 细胞/mL）。吸气介质，用2 mL的冷PBS清洗细胞2倍。
- 使用波长为 509 nm 的流动环流仪分析样品，以检测 GFP。以 100，000 计数终止每个读取。使用相关软件分析获取的数据。
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Representative Results
图用于说明图1 中的协议。肺上皮 BEAS-2B细胞用CSE治疗，并挑战伪多莫纳斯。培养基中的伪多多纳斯被添加的根霉素杀死，细胞接受滴板测定、伪多多体16SRNA的RT-qPCR检测和流动细胞切除术。与控制相比，CSE治疗在滴板方法中大大增加了细菌感染（图2）。相应地，CSE在HSAEC中受影响的细菌负荷（图3）。细胞生存能力没有显著变化后，3小时4%的CSE治疗，在1小时伪单体感染，或在1小时根霉素治疗（图4图5图6）。16S rRNA靶RT-qPCR方法（图7）和流细胞学（图8）也显示了类似的结果。荧光显微镜的结果表明，在P.荧光米古拉感染实验中，与BAS-2B细胞一起繁殖的GGFP标记细菌（图9）。这些结果表明，吸烟增加了BEAS-2B细胞中的伪多多纳斯负荷。
图1：研究香烟烟雾对肺上皮细胞伪 多多多 例感染的影响的原理图的示意图。 在细胞培养物插入物或传统培养板或肺器官中生长的肺上皮细胞通过吸烟机器人暴露在香烟烟雾中16分钟，或用准备好的4%CSE治疗3小时。这些细胞随后感染了 P.aeruginosa1 小时（MOI = 10）。根塔霉素用于消除文化 媒介中的活 伪多莫纳斯。上述细胞受制于滴板方法、qRT-PCR或流式细胞学方法来确定细菌负荷。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：滴板法，确定肺上皮 BEAS-2B细胞中的细菌负荷。 BEAS-2B细胞用4%的CSE治疗3小时。然后，细胞受到 P.aeruginosa（ 应变PAO1）感染1小时，然后再治疗根霉素1小时。细胞被稀释，细胞酸盐被稀释，以接种TSB板16小时。殖民地被计算在内;CFU 数字在图中说明。图显示 SD ±，"*"表示 P < 0.05。结果代表n= 3实验。双向无配对学生 t- 测试用于烟雾处理和未经治疗的组。P < 0.05 表示统计显著性。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：滴板法，用于确定HSAEC细胞中的细菌负荷。 人类原发性小气道上皮细胞用4%的CSE治疗3小时。然后，细胞受到 P.aeruginosa（ 应变PAO1）感染1小时，然后再治疗根霉素1小时。细胞被磨化，细胞酸盐被稀释，在TSB板上接种16小时。殖民地被计算在内;CFU 数字在图中说明。图显示 SD ±，"*"表示 P < 0.05。结果代表n= 3实验。双向无配对学生 t- 测试用于烟雾处理和未经治疗的组。P < 0.05 表示统计显著性。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：在经过CSE治疗的肺上皮 BEAS-2B细胞中确定细胞生存能力。 肺上皮 BEAS-2B 细胞用 4% CSE 治疗 3 小时。细胞被染成锥蓝色，细胞生存能力用细胞计数器测量。图显示了 SD ±均值。结果代表 n = 3 实验。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：确定伪多多体 -感染肺上皮 BEAS-2B 细胞的细胞生存能力。 肺上皮 BEAS-2B 细胞感染 P. aeruginosa （MOI = 10） 1 小时。细胞被染成蓝锥，细胞活力用细胞计数器测量。图显示了 SD ±均值。结果代表 n = 3 实验。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：测定基因霉素治疗的肺上皮 BEAS-2B 细胞的细胞生存能力。 肺上皮 BEAS-2B 细胞用 100 μg/mL 根塔霉素治疗 1 小时。细胞被染成蓝锥，细胞活力用细胞计数器测量。图显示了 SD ±均值。结果代表 n = 3 实验。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：qRT-PCR确定肺上皮细胞中的细菌负荷。图2中经过的细胞受到RNA总提取。每个样品中的等量RNA被反向转录到cDNA中，使用特定的质转对用定量PCR确定16S P. aeruginosa RNA的量。qPCR 的结果在图表中绘制。图显示 SD ±，"*"表示 P < 0.05。结果代表n= 3实验。双向无配对学生t- 测试用于烟雾处理和未经治疗的组。P < 0.05 表示统计显著性。请单击此处查看此图的较大版本。
图8：流细胞测量，以确定肺上皮细胞中的细菌负荷。 BEAS-2B细胞用CSE治疗，并感染了 P.荧光米古拉（ 应变PAO143）。受感染的细胞用基因霉素治疗，并消化与三普辛，使细胞悬浮。细胞悬浮液通过流式细胞计和荧 光伪多多细胞确定波长为509nm。流式细胞学的结果在图形中绘制。图显示 SD ±，"*"表示 P < 0.05。结果代表n= 3实验。双向无配对学生 t- 测试用于烟雾处理和未经治疗的组。P < 0.05 表示统计显著性。 请单击此处查看此图的较大版本。
图9：用荧光显微镜观察细菌感染。 BEAS-2B细胞感染了 P.荧光米古拉 （应变PAO143）1小时。细胞用根霉素再治疗1小时，用冷PBS洗2次。在波长为480nm的荧光显微镜下观察到了GGFP标记的细菌，BEAS-2B细胞用相位图像进行可视化。图像被合并，并显示了代表性的结果。比例线 = 10 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
细菌进入肺上皮细胞是细菌感染发病机制的关键一步。细菌进入细胞的过程可以分为以下三个步骤：第一，细菌接触并附着在上皮细胞表面使用其旗菌。其次，细菌要么进行内化，要么穿透细胞膜。最后，如果细菌成功逃脱细胞防御机制25，26，细菌复制和殖民细胞。观察肺微噬细胞细菌感染的方法早已发展起来，但对肺上皮细胞的了解有限，为27，28。,28这项研究通过三种方法确定肺上皮细胞中的细菌负荷：滴板测定、伪多多体核糖16SRNA的RT-qPCR和流动细胞学。 Pseudomonas这三种方法都具有类似的敏感性。选择确定肺上皮细胞中细菌负荷的方法取决于设备和时间的供应情况。在这些实验中，保持细菌旗杆完好无损是成功成功肺部上皮细胞感染的关键。以有限的速度缩短震动时间可能有助于进一步提升细菌入侵能力30。
确定肺上皮细胞中细菌浓度的一个主要障碍是培养培养的细菌污染。在细胞感染实验中，细菌在特定时间段（即1小时）被添加到培养培养中。在这段时间里，部分细菌负荷成功地侵入了细胞质隔间，但残留物可能附着在细胞的外膜上。一种抗生素，根霉素，用于杀死培养基中的细菌和附着在细胞外膜上的残留物。根霉素被认为不能渗透到细胞膜上，因此不会影响细胞内的细菌。使用根霉素治疗是该系统排除受感染肺上皮细胞外潜在污染的的理想之选。
为了研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响，肺细胞必须在细胞模型的细菌感染之前暴露在香烟烟雾中。一种传统方法是准备新的CSE来治疗细胞。生成 CSE 是一种经济高效的研究方法。CSE易于处理，制作CSE的过程简单，CSE内胃注射在短时间内对动物模型的肺气肿生成有效。也为体外细胞模型和体内啮齿动物模型开发了直接接触香烟的方法。每天6个月的香烟烟雾暴露在老鼠被广泛用于产生肺气肿33。直接接触香烟烟雾需要复杂的设备，将卷烟燃烧和细胞培养系统相结合。香烟燃烧会产生香烟烟雾，但也会产生大量热量，可能会影响培养室的温度和湿度。幸运的是，最近的技术使直接吸烟暴露更容易21。国际标准化组织（ISO）已实施一项直接吸烟暴露实验的协议22。接触香烟烟雾可以进行一次或多次。此外，随着细胞培养技术的进步，肺原上皮细胞也可以生长在透明插入物上，以获得汇合肺上皮细胞单层34。肺上皮细胞单层结构模仿肺组织的生理条件。然后，细胞可以在空气-液体界面35暴露在气态气体烟雾或空气中。此外，肺器官的培养已经出现在目前的肺研究36，37。36,这将是有趣的，知道香烟烟雾如何影响细菌感染的肺器官。所述方法可能模仿组织中的人感染，而不是培养细胞，并可能有助于进一步深入了解下呼吸道细菌感染。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了国家卫生研究院R01赠款HL125435和HL142997（对CZ）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
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