Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

מתואר כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד כיצד תמצית עשן סיגריות משפיעה על קולוניזציה חיידקים בתאי אפיתל ריאות.

Abstract

עישון סיגריות הוא הגורם האטיולוגי העיקרי לנפחת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). עישון סיגריות גם מקדם רגישות לזיהומים חיידקיים במערכת הנשימה. עם זאת, ההשפעות של עישון סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות אנושיים עדיין לא נחקרו ביסודיות. מתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט להכנת תמציות עישון סיגריות (CSE), טיפול בתאי אפיתל ריאות אנושיים עם CSE, זיהום חיידקי וקביעת זיהום. CSE הוכן בשיטה קונבנציונלית. תאי אפיתל ריאות טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים שטופלו CSE היו, אז, נגועים פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. עומסים חיידקיים של התאים נקבעו על ידי שלוש שיטות שונות. התוצאות הראו כי CSE גדל עומס פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות. פרוטוקול זה, לכן, מספק גישה פשוטה ושחזור כדי ללמוד את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

Introduction

עישון סיגריות משפיע על בריאות הציבור של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלות מזיקות רבות, כולל סרטן ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מדווחים להיות קשורים עישון סיגריות1,,2. עישון סיגריות מגביר את הרגישות לזיהומים מיקרוביאליים חריפים במערכתהנשימה 3,4,5. יתר על כן, הצטברות ראיות מוכיחה כי עישון סיגריות משפר את הפתוגנזה של הפרעותכרוניות רבות 6,7,8. לדוגמה, עישון סיגריות עלול להגביר זיהומים ויראליים או חיידקיים הגורמים להחרפה COPD9. בין הפתוגנים החיידקיים התורמים באופן אטיאולוגי להחמרה חריפה של COPD, פתוגן באקלוס אופורטוניסטי-שלילי, פסאודומונס ארוגינוזה, גורם לזיהומים המתאם עם פרוגנוזה עניים ותמותהגבוהה יותר 10,11. החמרת COPD מחמירה את המחלה על ידי האצת ההתקדמות הפתולוגית. אין טיפולים יעילים נגד החמרה COPD למעט ניהול אנטי-סמפטומטי12. החמרת COPD מקדמת תמותת חולים, מפחיתה את איכות החיים ומגבירה את הנטל הכלכלי עלהחברה 13.

דרכי הנשימה היא מערכת פתוחה, נתון ברציפות פתוגנים מיקרוביאליים שונים נוכחים מבחוץ. פתוגנים חיידקיים אופורטוניסטיים מזוהים בדרך כלל בדרכי הנשימה העליונות, אך לעתים נצפו בדרכי הנשימההתחתיות 14,15. במודלים של בעלי חיים P. aeruginosa ניתן לזהות בבקבי alveolar ברגע 1 שעה לאחר זיהום16. כמנגנון הגנה מרכזי, תאים חיסוניים כגון מקרופאגים או נויטרופילים לחסל את החיידקים בדרכי הנשימה. תאי אפיתל ריאות, כמו המחסום הפיזיולוגי הראשון, לבצע תפקיד ייחודי בהגנה המארח מפני זיהומים מיקרוביאליים. תאי אפיתל ריאות עשויים לווסת פלישה מיקרוביאלית, קולוניזציה, או שכפול ללא תלות בתאים חיסוניים17. מולקולות מסוימות שנמצאו בתאי אפיתל, כולל PPARg, להפעיל פונקציות אנטיבקטריאליות, ובכך ויסות קולוניזציה חיידקים שכפול בתאי אפיתלריאות 18. עישון סיגריות עשוי לשנות את המולקולות ולפגוע בתפקוד ההגנה הנורמלי בתאיאפיתל ריאות 19,20. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על חשיפה ישירה של עשן סיגריות לתאי אפיתלריאות באמצעות 21,22. חשיפה לעשן יכולה להתבצע בדרכים אחרות, עם זאת, כולל יישום של CSE. הכנת CSE היא גישה לשחזור עם יישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים, כולל תאי אנדותל כלי דם החשופים בעקיפין לעשן סיגריות.

דו"ח זה מתאר פרוטוקול כדי ליצור תמצית עשן סיגריה כדי לשנות את העומס חיידקים בתאי אפיתל ריאות. CSE מגביר העומס החיידקי של P. aeruginosa, וזה עשוי לתרום הישנות של זיהומים חיידקיים בדרך כלל לראות בהחמרה COPD. שיטה קונבנציונלית משמשת להכנת CSE. תאי אפיתל ריאות, בשלב הצמיחה המעריכי שלהם, מטופלים עם 4% CSE עבור 3 שעות. לחלופין, תאי אפיתל ריאות חד שכבתיים יכולים להיחשף ישירות לעשן סיגריות בממשק נוזלי אוויר. תאים שטופלו CSE לאחר מכן מאותגרים עם פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. החיידקים מופצים במהירות רועדת מסוימת כדי להבטיח את המורפולוגיה של הטלגלה שלהם נשאר שלם כדי לשמור על הקיבולת הפולשנית המלאה שלהם. Gentamycin מועסק להרוג את החיידקים שנותרו במדיום התרבות, ובכך להפחית את הזיהום הפוטנציאלי במהלך הקביעה הבאה של העומס החיידקי. הפרוטוקול משתמש גם בפסאודומונס עם תוויתGFP , אשר נוצל ככלי רב עוצמה בחקר זיהום פסאודומונס במודלים שונים. זן מייצג הוא P. פלואורסן של מיגולה23. מידת הזיהום או העומס החיידקי לאחר טיפול CSE נקבעת בשלוש דרכים: שיטת צלחת הטיפה עם ספירת מושבה, PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים Pseudomonas 16S rRNA, או ציתומיה זרימה בתאים נגועים פסאודומונס פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גישה פשוטה לשחזור כדי לחקור את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת CSE 100%

  1. צייר 10 מ"ל של מדיה של תרבות תאים ללא סרום (DMEM/F12 עבור תאי BEAS-2B; אוויר אפיתל תא בסיס בינוני עבור תאי HSAEC) לתוך מזרק 60 מ"ל.
  2. חבר הפוך קצה פיפטה 1 מ"ל גזוז כראוי לתרסיס המזרק כמתאם להחזיק את הסיגריה (3R4F).
  3. הסר את המסנן של הסיגריה. חבר סיגריה לפטיפטי מתאם ובעצר את הסיגריה.
  4. משוך 40 מ"ל של אוויר המכיל עשן לתוך 10 מ"ל של מדיה ללא סרום. מערבבים את העשן עם המדיום על ידי רעד נמרצות (30 שניות לכל תיקו).
  5. חזור על שלב 1.4 על 11x ב ~ 7 דקות עד הסיגריה נשרף לחלוטין.
  6. לסנן את 10 מ"ל של מדיה מעושנת עם מסנן 0.22 μm כדי לא לכלול כל מיקרואורגניזמים וחלקיקים מסיסים. העברה לצינור סטרילי סגור. הכן את 100% CSE לא יותר מ- 30 דקות לפני ההסכם הבא.

2. תרבות פסאודומונס

  1. לחסן קפוא P. aeruginosa (זן PAO1) או P. פלואורסצן מיגולה (זן PAO143) לתוך מרק סטיטי (TSB) צלחת אגר לתרבות לילה ב 37 °C.
    הערה: כדי להשיג מספיק חיידקים לקולטה, להפיץ חיידקים רבים ככל האפשר על צלחת אגר TSB ככל האפשר.
  2. לאסוף מריחה חיידקית דגירה ב 20 מ"ל של TSB עם 5% של גליצטרול כמקור הפחמן.
  3. לנער את המתלים חיידקים ב אינקובטור 37 °C ב 200 סל"ד עבור 1 שעה עד OD600 ערך = 0.6.
    התראה: אין לתת למהירות הרעידות לעלות על 200 סל"ד. מהירויות רועדות גבוהות יותר עלולות לפגוע מורפולוגיה של פלאגלה חיידקים ולהשפיע על הפלישה חיידקים לתוך אפיטליה ריאות. כמו כן, להגביל את זמן הרעידות 1 שעות כדי להשיג חיידקים פולשניים מאוד. למדוד את ערך OD600 כדי להעריך את מספר החיידקים. OD600 = 1 מתאים ~ 109 מושבה יצירת יחידות (CFU)/mL.

3. תרבות תאי אפיתל ריאות אנושיים וטיפול CSE

  1. תרבות תאי BEAS-2B אנושיים במדיום HITES (500 מ"ל של DMEM/F12, 2.5 אינסולין מ"ג, 2.5 מ"ג transferrin, 2.5 מ"ג נתרן סלניט, 2.5 מ"ג transferrin, 10 μM הידרוקורטיזון, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES, ו 2 mM L-גלוטמין) בתוספת עם 10% סרום מבקרים עובריים (FBS) כפי שתוארקודם לכן 24.
  2. תרבות תאי אפיתל דרכי הנשימה העיקריים של דרכי הנשימה (HSAEC) במדיום תרבות תאי האפיתל בדרכי הנשימה (500 מ"ל של תאי אוויר בינוני בסיס, 500 μg/mL HSA, 0.6 μM חומצה לינולאית, 0.6 μg/mL לציטין, 6 mM L-גלוטמין, 0.4% לחלץ P, 1.0 μM אפינפרין, 5 μg /mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL הידרוקורטיזון, rh EGF 5 ng/mL, ו 5 μg/mL rh אינסולין). דגירה התאים ב 37 °C ב 5% CO2.
  3. ניתוק התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 5 דקות עד התאים להתנתק לחלוטין מתחתית הצלחת.
  4. להוסיף 10 מ"ל של HITES שלם מדיום כדי לנטרל טריפסין ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
    התראה: בזהירות לפקח על הזמן לעיכול נסהפסין על ידי מיקרוסקופיה, כי עיכול יתר עלול לגרום למוות של תאים.
  5. בטל את supernatant וssuspend התאים ב 2 מ"ל של HITES בינוני עם 10% FBS.
  6. Pipette 10 μL של מתלה התא לעיל על הלוח ולהכניס אותו לתוך מונה תא אוטומטי כדי להשיג את הריכוז בתאים / מ"ל.
  7. צלחת BEAS-2B תאים בריכוז של 3 × 105 תאים / מ"ל לתוך 6 צלחות גם בנפח כולל של 2 מ"ל ב HITES בינוני בתוספת עם 10% של FBS לתרבות לילה.
  8. לטפל בתאים בכ 80% confluency, או 5 x 105 תאים / מ"ל, עם 4% CSE עבור 3 שעות. לפני טיפול CSE, לשנות את המדיום עם HITES בינוני עם 1% של FBS.

4. זיהום חיידקי

  1. הוסף P. aeruginosa או P. פלואורסצנים מיגולה (~ 1 ×10 7 CFU / מ"ל) לכל באר של תאים שטופלו CSE דגירה עבור 1 שעה ב 37 ° C ב 5% CO2.
  2. שאף את supernatants ולהחליף עם 2 מ"ל של HITES טרי בינוני לטיפול עם 4% CSE ו 100 μg / מ"ל gentamicin.
    הערה: Gentamicin משמש כי הוא אינו מסוגל לחדור קרום תאי אפיתל ריאות אנושיות. לכן, זה יכול להרוג את כל החיידקים במדיום אבל לא את אלה שפלשו לתאי אפיתל הריאה.
  3. לאחר 1 שעה של CSE / gentamicin טיפול ב 37 °C ב 5% CO2, לשאוף את supernatants ולשטוף את התאים 3x עם PBS לקביעת ריכוז חיידקים הבאים.
    הערה: כדי לאשר את החיידקים הפנימיים, תאים נגועים GFP תווית P. פלואורסצנים מיגולה נצפו תחת מיקרוסקופ פלורסנט.

5. קביעת ריכוז חיידקים בשיטת צלחת הטיפה

  1. כדי לקבוע עומס חיידקים בתאים נגועים בשיטת צלחת טיפה, לשטוף את התאים שטופלו gentamycin 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
  2. הוסף 1 מ"ל של מאגר סיס תא (0.5% triton X-100 ב PBS) לכל באר.
  3. לדלל את התא המכיל את החיידקים הפנימיים בהדרגתי (1:10, 1:100, 1:1,000 ו- 1:10,000) עבור החיסונים הבאים לצלחת אגר TSB.
  4. לאחר 16 שעות של דגירה, להשיג את התוצאות של CFU על ידי ספירת המושבות חיידקים.

6. RT-qPCR זיהוי של חיידקים 16S rRNA

  1. לטפל בתאי אפיתל ריאות נגועיםפסאודומונס (~ 1 x 106 תאים / מ"ל) עם gentamycin כמתואר לעיל. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
  2. מוסיפים 0.35 מ"ל של מאגר הליזה של גאנידיום תיוציאניאט לבאר של צלחת באר 6. לאסוף את התאים עם מגרד תא. פיפט lysate לתוך צינור microcentrifuge ולערבב בעדינות עם פיפטה.
  3. מוסיפים את אותו נפח (0.35 מ"ל) של אתנול טרי 70% לתוך lysate ומערבבים היטב. העבר את כל הדגימות לעמודת ספין הממוקמת בצינור אוסף של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב- 10,000 x g עבור 30 s ב 20-25 ° C. לאחר מכן, מחק את המאגר בצינור האוסף.
  4. שטוף את העמודה עם 0.7 מ"ל של מאגר כביסה 1. צנטריפוגה בעמודה ב- 10,000 x g עבור 30 s. יש לשטוף את העמודה 2x עם 0.5 מ"ל של חוצץ כדי לשטוף את RNA מאוגד קרום. חזור על הצנטריפוגה ב- 10,000 x g למשך 2 דקות.
  5. מקם את העמודה בצינור קולקציה חדש של 1.5 מ"ל. מוסיפים 30-50 μL מים ללא תסה. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת. לאסוף את הזרימה דרך למדוד את ריכוז RNA.
  6. בצע תגובת שעתוק הפוכה בהתאם לפרוטוקול היצרן. לערבב 1 μg של RNA הכולל עם 10 מ"ל של מאגר תגובה, 1 μL של תעתיק הפוך, ומים ללא RNase לתגובה 20 μL. לבצע את תגובת שעתוק הפוכה ב 37 ° C עבור 1 שעות ולאחר מכן 95 ° C במשך 5 דקות.
  7. לערבב יחד את תבניות cDNA (1 μL של כל תגובה שעתוק הפוך לעיל), 5 μL של תערובת מאסטר המכיל צבע SYBR, μL 1 של כל פריימרים ספציפיים 200 nM, ומים בתערובת 20 μL לניתוח PCR הבא, על פי המלצות היצרן.
    הערה: להלן פריימרים מיקוד 16S rRNA של P. aeruginosa: קדימה 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGAGAGCG-3′; הפוך 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH שימש כפקד טעינה עם פריימרים הבאים: קדימה: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; הפוך: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
  8. השתמש בשיטת CT השוואתית כדי לקבוע את הביטוי.

7. זיהוי פסאודומונס פלורסנט עם ציתום זרימה

  1. לטפל פלואורסצנט פסאודומונס -נגוע תאיאפיתל ריאות (~ 1 x 106 תאים / מ"ל) עם gentamycin כפי שתואר קודם לכן. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
  2. נתח את הדגימות עם ציטומטר זרימה באורך גל של 509 ננומטר לזיהוי GFP. סיים כל קריאה ב-100,000 אישומים. נתח את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנה קשורה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דיאגרמה משמשת להמחשת הפרוטוקול באות 1. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות טופלו CSE ואתגרו עם פסאודומונס. פסאודומונס במדיום התרבות נהרגו על ידי gentamycin הוסיף ואת התאים היו נתונים לצלחת טיפה, RT-qPCR זיהוי של פסאודומונס ריבוזום 16S RNA, וציטומטריית זרימה. בהשוואה לבקרה, טיפול CSE גדל באופן משמעותי זיהום חיידקי בשיטות צלחת טיפה(איור 2). בהתאמה, CSE מושפע עומס חיידקי ב HSAEC (איור 3). הכדאיות בתא לא השתנה באופן משמעותי לאחר 3 שעות של 4% טיפול CSE, ב 1 שעה של זיהום פסאודומונס, או ב 1 שעה של טיפול gentamycin(איור 4 איור 5 איור 6). שיטת RT-qPCR RT-qPCR של יעד RRNA 16S (איור 7) וציתום זרימה (איור 8) הדגימו תוצאות דומות. תוצאות מיקרוסקופ פלורסנט הראו כי חיידקים עם תווית GFP colocalized עם תאי BEAS-2B בניסוי זיהום Migula P. פלואורסצנט (איור 9). תוצאות אלה מצביעות על כך עישון סיגריות גדל עומס פסאודומונס בתאי BEAS-2B.

Figure 1
איור 1: מצגת סכמטית של הפרוטוקול כדי ללמוד את השפעות עשן הסיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות. תאי אפיתל ריאות גדל בתרבית התא מוסיף או צלחות תרבות קונבנציונלית או אורגנואידים ריאות נחשפו עשן סיגריות במשך 16 דקות באמצעות רובוט עישון או טופלו מוכן 4% CSE עבור 3 שעות. תאים אלה היו נגועים אז P. aeruginosa במשך 1 h (MOI = 10). ג'נמיצין שימש לחסל פסאודומונס חיים במדיום התרבות. התאים לעיל היו כפופים לשיטת לוח הטיפה, qRT-PCR, או גישות ציתומיה זרימה כדי לקבוע את העומס החיידקי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: שיטת צלחת טיפה כדי לקבוע עומס חיידקי בתאי BEAS-2B אפיתל ריאות. תאי BEAS-2B טופלו עם 4% CSE במשך 3 שעות. תאים היו נתונים לאחר מכן P. aeruginosa (זן PAO1) זיהום עבור 1 h ואחריו טיפול gentamycin לעוד 1 שעות. התאים היו lysed ואת התא lysates היה מדולל לחסן צלחות TSB במשך 16 שעות. המושבות נספרו; מספרי CFU מאוירים בעלילה. גרף מציג ממוצע ± SD, ו- "*" מציין P < 0.05. התוצאות מייצגות n = 3 ניסויים. מבחן T סטודנט ללא תשלוםדו-סטרי שימש לקבוצות שטופלו בעשן ולא טופלו. P < 0.05 מציין משמעות סטטיסטית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: שיטת צלחת שחרור כדי לקבוע עומס חיידקי בתאי HSAEC. תאי אפיתל דרכי הנשימה הקטנות של דרכי הנשימה העיקריות של האדם טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים היו נתונים לאחר מכן P. aeruginosa (זן PAO1) זיהום עבור 1 h ואחריו טיפול gentamycin לעוד 1 שעות. התאים היו lysed ואת התא lysates היה מדולל לחסן על לוחות TSB במשך 16 שעות. המושבות נספרו; מספרי CFU מאוירים בעלילה. גרף מציג ממוצע ± SD, ו- "*" מציין P < 0.05. התוצאות מייצגות n = 3 ניסויים. מבחן T סטודנט ללא תשלוםדו-סטרי שימש לקבוצות שטופלו בעשן ולא טופלו. P < 0.05 מציין משמעות סטטיסטית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: קביעת יכולת הכדאיות של תאים בתאי BEAS-2B אפיתל אפיתל שטופלו ב-CSE. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים היו מוכתמים בכחול טריפאן וכדאיות התא נמדדה עם מונה תא. גרף מראה ± SD. תוצאות מייצגות של n = 3 ניסויים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: קביעת יכולת הכדאיות של תאים בתאי Pseudomonas-נגועים בריאה אפיתל BEAS-2B. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות נדבקו P. aeruginosa (MOI = 10) עבור 1 h. תאים היו מוכתמים בכחול טריפאן וכדאיות התא נמדדה עם מונה תא. גרף מראה ± SD. תוצאות מייצגות של n = 3 ניסויים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: קביעת יכולת הכדאיות של התא בתאי BEAS-2B אפיתל ריאות שטופלו בג'נטמיצין. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות טופלו עם 100 μg / מ"ל gentamycin במשך 1 שעה. תאים היו מוכתמים בכחול טריפאן וכדאיות התא נמדדה עם מונה תא. גרף מראה ± SD. תוצאות מייצגות של n = 3 ניסויים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: qRT-PCR כדי לקבוע עומס חיידקי בתאי אפיתל ריאות. תאים שטופלו באיון 2 היו נתונים לחילוץ RNA הכולל. כמות שווה ערך של RNA מכל מדגם תמללה הפוך ל- cDNA, וכמות 16S RNA של P. aeruginosa נקבעה עם PCR כמותי באמצעות זוגות פריימר ספציפיים. תוצאות qPCR מתווים בגרף. גרף מציג ממוצע ± SD, ו- "*" מציין P < 0.05. התוצאות מייצגות n = 3 ניסויים. מבחן T סטודנט ללא תשלוםדו-סטרי שימש לקבוצות שטופלו בעשן ולא טופלו. P < 0.05 מציין משמעות סטטיסטית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: ציתום זרימה כדי לקבוע עומס חיידקי בתאי אפיתל ריאות. תאי BEAS-2B טופלו ב-CSE ונדבקו ב-P. fluorescens Migula (זן PAO143). תאים נגועים טופלו עם gentamycin ועיכל עם trypsin כדי להפוך את מתלה התא. מתלי תאים הועברו דרך ציטומטר זרימה פלואורסצנט פסאודומונס-תאים חיוביים נקבעו באורך גל של 509 ננומטר. תוצאות ציתומיית זרימה מתווים בגרף. גרף מציג ממוצע ± SD, ו- "*" מציין P < 0.05. התוצאות מייצגות n = 3 ניסויים. מבחן T סטודנט ללא תשלוםדו-סטרי שימש לעישון שטופל וקבוצות לא מטופלות. P < 0.05 מציין משמעות סטטיסטית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: התבוננות בזיהום חיידקי עם מיקרוסקופ פלורסנט. תאי BEAS-2B נדבקו P. פלואורסצנים מיגולה (זן PAO143) עבור 1 שעה. התאים טופלו עם gentamycin במשך 1 שעות נוספות ושטפו 2x עם PBS קר. החיידקים עם תווית GFP נצפו תחת מיקרוסקופ פלורסנט באורך גל של 480 טנ"מ ותאי BEAS-2B היו חזותיים עם תמונת שלב. התמונות מוזגו והתוצאה המייצגת מוצגת. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פלישה חיידקית לתאי אפיתל ריאות היא צעד מכריע בפתוגנזה של זיהומים חיידקיים. התהליך של פלישה חיידקית לתאים יכול להיות מחולק לתוך שלושת השלבים הבאים: הראשון, מגע החיידקים ולדבוק על פני השטח של תא האפיתל באמצעות flagella שלהם. שנית, החיידקים עוברים הפניה או חודרים את קרום התא. לבסוף, החיידקים לשכפל ליישב את התאים אם הם בהצלחה לברוח מנגנוניהגנה סלולרית 25,26. גישות לתצפית על זיהומים חיידקיים במיקרופגים ריאות פותחו זמן רב אבל עם ידע מוגבל של תאי אפיתלריאות 27,28. מחקר זה קבע עומס חיידקי בתאי אפיתל ריאות באמצעות שלוש גישות: צלחת טיפה esay, RT-qPCR עבור פסאודומונס ריבוזום 16S RNA, וציטומטריה זרימה. כל שלוש הגישות עובדות היטב עם רגישויות דומות. בחירת הגישות לקביעת עומס חיידקי בתאי אפיתל ריאות תלויה בזמינות של ציוד וזמן. בניסויים אלה, שמירה על פלאגלה חיידקית ללא פגע ושלמה היא חיונית לזיהום מוצלח של תאי אפיתלריאות 29. זמן רעידה קצר יותר עם מהירות מוגבלת עשוי לעזור לקדם עוד יותר את קיבולת הפלישה חיידקים30.

מכשול מרכזי בקביעת הריכוז החיידקי בתאי אפיתל ריאות הוא זיהום חיידקי ממדיום התרבות. בניסויי זיהום תאים, החיידקים מתווספים למדיום התרבות לפרק זמן מסוים (כלומר, 1 h). בתוך זמן זה, חלק מהעומס החיידקי הזה פולש בהצלחה לתא הציטופלסמי, אבל שאריות עשויות להיקשר לקרום החלקי של התאים. אנטיביוטיקה, gentamycin, משמש כדי להרוג את החיידקים במדיום התרבות ואת השאריות המחוברות קרום החלקה של התאים31. Gentamycin נחשב לא חדיר קרום התא ולכן לא ישפיע על החיידקים כבר בתוך התאים. טיפול עם gentamycin עושה את זה אידיאלי עבור מערכת זו כדי להוציא את הזיהום הפוטנציאלי מחוץ לתאי אפיתל ריאות נגועים.

כדי לחקור את ההשפעות של עשן סיגריות על זיהום חיידקי בתאי אפיתל ריאות, תאי ריאות חייבים להיחשף לעשן סיגריות לפני זיהום חיידקי במודלים תאיים. גישה קונבנציונלית היא הכנת CSE טרי לטיפול בתאים. דור CSE היא שיטה חסכונית ללימודים. CSE הוא קל להתמודד, התהליך של ביצוע CSE הוא פשוט, הזרקת CSE תוך-תוך-תוך-תכלית יעילה בדור הנפחת במודלים של בעלי חיים בפרק זמן קצר32. גישות של חשיפה ישירה לסיגריות פותחו גם הן בדגמים סלולריים חוץ-סרטיים והן בדגמי מכרסמים ויוו. שישה חודשים של חשיפה יומית לעשן סיגריות לעכברים משמש נרחב כדי ליצור נפחת33. חשיפה ישירה לעישון סיגריות דורשת ציוד מורכב המשלב מערכות בעירת סיגריות ותרבות תאים. בעירת סיגריות מייצרת עשן סיגריות, אך גם מייצרת כמות חום מסוימת שעשויה להשפיע על הטמפרטורה והלחות של תא התרבות. למרבה המזל, הטכניקות האחרונות להפוך חשיפה ישירה עשן סיגריהקל יותר 21. פרוטוקול ארגון בינלאומי לתענונה (ISO) יושם לניסויים ישירים בחשיפה לעשן סיגריות22. חשיפה לעשן הסיגריות יכולה להתבצע פעם או מספר פעמים. בנוסף, יחד עם ההתקדמות של טכניקות תרבות התא, תאי אפיתל ראשי ריאות יכול גם לגדול על תוספות שקופות כדי להשיג confluent תא אפיתלאפיתל מונו-שכבתית 34. מונושכבות תא אפיתל ריאות מבחינה מבנית לחקות את התנאים הפיזיולוגיים ברקמות ריאה. לאחר מכן ניתן להיחשף לתאים לעשן גזים אפיים או לאוויר בממשק האוויר-נוזלי35. יתר על כן, תרבות של אורגנואידים ריאות הגיח במחקרי ריאותהנוכחיים 36,37. זה יהיה מעניין לדעת איך עשן סיגריות משפיע על זיהום חיידקי באורגן ריאות. הגישה המתוארת עשויה לחקות זיהום אנושי ברקמות במקום תאים תרבותיים, עשויה לאפשר תובנות נוספות בזיהום חיידקי בדרכי הנשימה נמוכות יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 מענקים HL125435 ו HL142997 (ל CZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

Tags

החודש ב JoVE גיליון 159 חשיפה לעשן סיגריות תמצית עשן סיגריות פסאודומונס זיהום עומס חיידקי תא אפיתל ריאות פגיעה בריאה
מחקר השפעות של עשן סיגריות <em>על זיהום פסאודומונס</em> בתאי אפיתל ריאות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter