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Immunology and Infection

Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Décrit ici est un protocole pour étudier comment l’extrait de fumée de cigarette affecte la colonisation bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires.

Abstract

Le tabagisme est la principale cause étiologique de l’emphysème pulmonaire et de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Le tabagisme favorise également la susceptibilité aux infections bactériennes dans le système respiratoire. Cependant, les effets du tabagisme sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines n’ont pas encore été étudiés en profondeur. Décrit ici est un protocole détaillé pour la préparation des extraits de tabagisme (CSE), le traitement des cellules épithéliales pulmonaires humaines avec CSE, et l’infection bactérienne et la détermination de l’infection. Le CST a été préparé selon une méthode conventionnelle. Les cellules épithéliales pulmonaires ont été traitées avec 4% de CSE pour 3 h. Les cellules traitées au CSE ont alors été infectées par Pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les charges bactériennes des cellules ont été déterminées par trois méthodes différentes. Les résultats ont montré que le CSE a augmenté la charge de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Ce protocole fournit donc une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.

Introduction

Le tabagisme affecte la santé publique de millions de personnes dans le monde. De nombreuses maladies nocives, y compris le cancer du poumon et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), seraient liées au tabagisme1,2. Le tabagisme augmente la susceptibilité aux infections microbiennes aiguës dans le système respiratoire3,4,5. En outre, les preuves de montage prouvent que le tabagisme améliore la pathogénie de nombreux troubles chroniques6,7,8. Par exemple, le tabagisme peut augmenter les infections virales ou bactériennes qui causent l’exacerbation de la MPOC9. Parmi les pathogènes bactériens qui contribuent étiologiquement à l’exacerbation aiguë de la MPOC, un pathogène gramme-négatif opportuniste bacillus, Pseudomonas aeruginosa, provoque des infections qui se corrélent avec de faibles pronostics et des mortalités plus élevées10,11. L’exacerbation de la MPOC aggrave la maladie en accélérant la progression pathologique. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre l’exacerbation de la MPOC, à l’exception de la prise en charge antisymptomatique12. L’exacerbation de la MPOC favorise la mortalité des patients, diminue la qualité de vie et augmente le fardeau économique pour la société13.

Les voies respiratoires sont un système ouvert, continuellement soumis à divers agents pathogènes microbiens présents à l’extérieur. Des agents pathogènes bactériens opportunistes sont habituellement détectés dans les voies respiratoires supérieures, mais sont parfois observés dans les voies respiratoires inférieures14,15. Dans les modèles animaux P. aeruginosa peut être détecté dans les sacs alvéolaires dès 1 h après l’infection16. En tant que mécanisme de défense majeur, les cellules immunitaires telles que les macrophages ou les neutrophiles éliminent les bactéries dans les voies respiratoires. Les cellules épithéliales pulmonaires, en tant que première barrière physiologique, jouent un rôle unique dans la défense de l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules épithéliales pulmonaires peuvent réguler l’invasion microbienne, la colonisation ou la réplication indépendamment des cellules immunitaires17. Certaines molécules présentes dans les cellules épithéliales, y compris PPARg, exercent des fonctions antibactériennes, régulant ainsi la colonisation bactérienne et la réplication dans les cellules épithéliales pulmonaires18. Le tabagisme peut altérer les molécules et altérer la fonction de défense normale dans les cellules épithéliales pulmonaires19,20. Des études récentes ont rapporté l’exposition directe de la fumée de cigarette aux cellules épithéliales de poumon utilisant l’appareil de tabagisme de robot21,22. Toutefois, l’exposition à la fumée peut être effectuée d’autres façons, y compris l’application du CST. La préparation du CST est une approche reproductible avec des applications potentielles dans d’autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales vasculaires qui sont indirectement exposées à la fumée de cigarette.

Ce rapport décrit un protocole pour générer l’extrait de fumée de cigarette pour modifier la charge bactérienne dans les cellules épithéliales de poumon. CST augmente la charge bactérienne de P. aeruginosa, et il peut contribuer à la récurrence des infections bactériennes habituellement observées dans l’exacerbation de la MPOC. Une méthode conventionnelle est utilisée pour la préparation du CST. Les cellules épithéliales pulmonaires, à leur stade de croissance exponentielle, sont traitées avec 4% de CST pendant 3 h. Alternativement, les cellules épithéliales pulmonaires de culture monocouche peuvent être directement exposées à la fumée de cigarette dans une interface air-liquide. Les cellules traitées au CSE sont ensuite défiées avec pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les bactéries sont propagées à une vitesse de secousse particulière pour s’assurer que la morphologie de leur flagelle reste intacte pour conserver leur pleine capacité invasive. La gentamycine est utilisée pour tuer les bactéries laissées dans le milieu de culture, réduisant ainsi la contamination potentielle pendant la détermination ultérieure de la charge bactérienne. Le protocole utilise également pseudomonasétiqueté GFP , qui a été utilisé comme un outil puissant dans l’étude de l’infection Pseudomonas dans différents modèles. Une souche représentative est P. fluorescens Migula23. Le degré d’infection ou de charge bactérienne après le traitement du CST est déterminé de trois façons : la méthode de la plaque de chute avec le comptage des colonies, le PCR quantitatif à l’aide d’amorces spécifiques à pseudomonas 16S, ou la cytométrie de flux dans les cellules infectées par des pseudomonas fluorescents. Ce protocole est une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.

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Protocol

1. Préparation du CST à 100 %

  1. Dessiner 10 mL de milieux de culture cellulaire sans sérum (DMEM/F12 pour les cellules BEAS-2B; milieu basal épithélial des voies respiratoires pour les cellules HSAEC) dans une seringue de 60 mL.
  2. Attachez à l’envers une pointe de pipette de 1 mL bien garnie à la buse de la seringue comme adaptateur pour tenir la cigarette (3R4F).
  3. Retirer le filtre de la cigarette. Attachez une cigarette à l’adaptateur de pointe et allumez la cigarette.
  4. Dessinez 40 mL d’air contenant de la fumée dans 10 mL de milieu sans sérum. Mélanger la fumée avec le milieu en secouant vigoureusement (30 s par tirage).
  5. Répétez l’étape 1.4 environ 11x en ~7 min jusqu’à ce que la cigarette soit complètement brûlée.
  6. Filtrer les 10 mL de milieux fumés à l’aide d’un filtre de 0,22 μm pour exclure les micro-organismes et les particules insolubles. Transférer dans un tube stérile fermé. Préparez le CST à 100 % pas plus de 30 min avant l’essai subséquent.

2. Pseudomonas culture

  1. Inoculer le P. aeruginosa congelé (souche PAO1) ou P. fluorescens Migula (souche PAO143) dans une plaque d’agar tryptique de soja (TSB) pour la culture du jour au lendemain à 37 °C.
    REMARQUE : Pour obtenir suffisamment de bactéries pour la culture, répandez autant de bactéries que possible sur la plaque d’agar du BST.
  2. Recueillir un frottis bactérien et incuber dans 20 mL du BST avec 5% de glycérol comme source de carbone.
  3. Agiter la suspension bactérienne dans un incubateur de 37 °C à 200 tr/min pendant 1 h jusqu’à la valeur OD600 = 0,6.
    ATTENTION : Ne laissez pas la vitesse de secousse dépasser 200 tr/min. Des vitesses de secousse plus élevées peuvent endommager la morphologie de la flagelle bactérienne et avoir un impact sur l’invasion bactérienne dans l’épithélie pulmonaire. De même, limiter le temps de secousse à 1 h pour obtenir des bactéries très invasives. Mesurer la valeur od600 pour estimer le nombre de bactéries. Une OD600 = 1 correspond à ~109 unités de formation de colonies (CFU)/mL.

3. Culture épithéliale pulmonaire humaine et traitement du CST

  1. Culture cellules humaines BEAS-2B dans le milieu HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg d’insuline, 2,5 mg de transférrine, 2,5 mg de sélénite de sodium, 2,5 mg de transferrine, 10 μM d’hydrocortisone, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES et 2 mM L-glutamine) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) tel que décrit précédemment24.
  2. Culture humaine de petites cellules épithéliales des voies respiratoires (HSAEC) dans le milieu de culture épithéliale des voies respiratoires (500 mL de milieu basal à cellules des voies respiratoires, 500 μg/mL HSA, 0,6 μM d’acide linoléique, 0,6 μg/mL de lécithine, 6 mM L-glutamine, 0,4% d’extrait P, 1,0 μM d’épinéphrine, 5 μg/mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL hydrocortisone, rh EGF 5 ng/mL, et 5 μg/mL insuline rh). Incuber les cellules à 37 °C en CO2 à5 %.
  3. Dissocier les cellules avec 1 mL de trypsin de 0,25% pendant 5 min jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement du bas de la plaque.
  4. Ajouter 10 ml de support HITES complet pour neutraliser la trypsine et recueillir les cellules dans un tube de 15 mL. Centrifugeuse à 4 °C à 300 x g pendant 5 min.
    ATTENTION : Surveillez attentivement l’heure de la digestion de la trypsine par microscopie, car la surdiggestion peut causer la mort cellulaire.
  5. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 2 mL de hites moyen avec 10% FBS.
  6. Pipette 10 μL de la suspension cellulaire ci-dessus sur la plaque et l’insérer dans un compteur cellulaire automatisé pour obtenir la concentration dans les cellules/mL.
  7. Plaquez les cellules BEAS-2B à une concentration de 3 × 105 cellules/mL en 6 plaques de puits dans un volume total de 2 mL dans le milieu HITES complété par 10% de FBS pour la culture du jour au lendemain.
  8. Traiter les cellules à environ 80% de confluence, ou 5 x 105 cellules/mL, avec 4% de CST pendant 3 h. Avant le traitement du CSE, modifiez le milieu avec le milieu HITES avec 1 % de FBS.

4. Infection bactérienne

  1. Ajouter P. aeruginosa ou P. fluorescens Migula (~1 × 107 CFU/mL) à chaque puits des cellules traitées au CSE et incuber pendant 1 h à 37 °C dans 5 % de CO2.
  2. Remplacer les supernatants et remplacer par 2 mL de touches fraîches à traiter par 4% de CSE et 100 μg/mL de gentamicine.
    REMARQUE : La gentamicine est utilisée parce qu’elle est incapable de pénétrer les membranes cellulaires épithéliales du poumon humain. Ainsi, il peut tuer toutes les bactéries dans le milieu, mais pas ceux qui ont envahi les cellules épithéliales pulmonaires.
  3. Après 1 h de traitement CSE/gentamicine à 37 °C dans 5% CO2, remplacer les supernatants et laver les cellules 3x avec PBS pour la détermination ultérieure de la concentration bactérienne.
    REMARQUE : Pour confirmer les bactéries intériorisées, des cellules infectées par P. fluorescens Migula, étiquetée GFP, ont été observées sous microscopie fluorescente.

5. Détermination de la concentration bactérienne à l’aide de la méthode de la plaque de dépôt

  1. Pour déterminer la charge bactérienne dans les cellules infectées avec la méthode de la plaque de chute, laver les cellules traitées à la gentamycine 2x avec 2 mL de PBS froid.
  2. Ajouter 1 mL de tampon de lyse cellulaire (0,5% triton X-100 dans PBS) à chaque puits.
  3. Diluer les lysates cellulaires contenant les bactéries intériorisées dans un gradient (1:10, 1:100, 1:1,000 et 1:10,000) pour l’inoculation suivante à la plaque d’agar du BST.
  4. Après 16 h d’incubation, obtenez les résultats de cfu en comptant les colonies bactériennes.

6. Détection RT-qPCR de l’ARN 16S bactérien

  1. Traiter les cellules épithéliales pulmonaires infectées par Pseudomonas(~1 x 106 cellules/mL) avec la gentamycine comme décrit ci-dessus. Apirate le milieu et laver les cellules 2x avec 2 mL de PBS froid.
  2. Ajouter 0,35 mL du tampon de lyse de thiocyanate de guanidium par puits d’une plaque de 6 puits. Recueillir les cellules avec un grattoir cellulaire. Pipette le lysate dans un tube de microcentrifuge et mélanger doucement avec la pipette.
  3. Ajouter le même volume (0,35 mL) d’éthanol fraîchement préparé à 70 % dans le lysate et bien mélanger. Transférer tous les échantillons dans une colonne de rotation placée dans un tube de collecte de 2 mL. Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s à 20–25 °C. Ensuite, jetez la mémoire tampon dans le tube de collecte.
  4. Laver la colonne avec 0,7 mL de tampon de lavage 1. Centrifuge la colonne à 10 000 x g pour 30 s. Lavez la colonne 2x avec 0,5 mL de tampon pour laver l’ARN lié à la membrane. Répéter la centrifuge à 10 000 x g pendant 2 min.
  5. Placez la colonne dans un nouveau tube de collection de 1,5 mL. Ajouter de 30 à 50 μL d’eau sans RNase. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min. Recueillir le débit et mesurer la concentration de l’ARN.
  6. Effectuer une réaction de transcription inversée selon le protocole du fabricant. Mélanger 1 μg d’ARN total avec 10 mL de tampon de réaction, 1 μL de transcriptase inverse et de l’eau sans RNase pour une réaction de 20 μL. Effectuer la réaction de transcription inverse à 37 °C pendant 1 h, puis 95 °C pendant 5 min.
  7. Mélanger les modèles d’ADN (1 μL de chaque réaction de transcription inverse ci-dessus), 5 μL du Mélange principal contenant du colorant SYBR, 1 μL de chaque amorce spécifique de 200 nM et de l’eau dans un mélange de 20 μL pour l’analyse PCR suivante, selon les recommandations du fabricant.
    NOTE: Les amorces suivantes sont les amorces ciblant l’ARN 16S de P. aeruginosa: avant 5′-CAAAACTGAGCTAGAGTAGCG-3′; inverse 5′-TAAGATCTCCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH a été utilisé comme un contrôle de chargement avec les amorces suivantes: avant: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; inverse: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
  8. Utilisez la méthode CT comparative pour déterminer l’expression.

7. Détection de Pseudomonas fluorescents avec cytométrie de flux

  1. Traitez les cellules épithéliales pulmonaires fluorescentes de Pseudomonasci-dessus (~1 x 106 cellules/mL) avec la gentamycine comme décrit précédemment. Apirate le milieu et laver les cellules 2x avec 2 mL de PBS froid.
  2. Analyser les échantillons à l’aide d’un cytomètre de débit à une longueur d’onde de 509 nm pour la détection de GFP. Terminez chaque lecture à 100 000 chefs d’accusation. Analyser les données acquises avec un logiciel connexe.

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Representative Results

Un diagramme est utilisé pour illustrer le protocole de la figure 1. Les cellules épithéliales du poumon BEAS-2B ont été traitées avec le CST et défiées par Pseudomonas. Pseudomonas dans le milieu de culture ont été tués par la gentamycine ajoutée et les cellules ont été soumises à l’essai de plaque de chute, la détection de RT-qPCR de Pseudomonas ribosome 16S ARN, et la cytométrie de flux. Par rapport au contrôle, le traitement du CST a considérablement augmenté l’infection bactérienne dans les méthodes de plaque de chute (figure 2). En conséquence, le CST a affecté la charge bactérienne dans HSAEC (Figure 3). La viabilité cellulaire n’a pas changé considérablement après 3 h de traitement du CST à 4 h, dans 1 h d’infection à Pseudomonas ou dans 1 h de traitement à la gentamycine(figure 4 figure 5 figure 6). La méthode RT-qPCR cible rRNA 16S (figure 7) et la cytométrie du débit (figure 8) ont démontré des résultats similaires. Les résultats de la microscopie fluorescente ont montré que les bactéries étiquetées GFP colocalisées avec des cellules BEAS-2B dans une expérience d’infection à P. fluorescens Migula (Figure 9). Ces résultats suggèrent que le tabagisme a augmenté la charge de Pseudomonas dans les cellules DEAS-2B.

Figure 1
Figure 1 : Présentation schématique du protocole pour étudier les effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Les cellules épithéliales pulmonaires cultivées dans des inserts de culture cellulaire ou des plaques de culture conventionnelle ou des organoïdes pulmonaires ont été exposées à la fumée de cigarette pendant 16 min par l’intermédiaire d’un robot fumeur ou traitées avec 4 % de CST préparé pendant 3 h. Ces cellules ont ensuite été infectées par P. aeruginosa pendant 1 h (MOI = 10). La gentamycine a été utilisée pour éliminer les Pseudomonas vivants dans le milieu de culture. Les cellules ci-dessus étaient soumises à la méthode de la plaque de chute, qRT-PCR, ou approches de cytométrie de flux pour déterminer la charge bactérienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Méthode de plaque de chute pour déterminer la charge bactérienne dans les cellules épithéliales du poumon BEAS-2B. Les cellules BEAS-2B ont été traitées avec 4% de CSE pendant 3 h. Les cellules ont ensuite été soumises à l’infection de P. aeruginosa (souche PAO1) pendant 1 h suivie du traitement de la gentamycine pour un autre 1 h. Les cellules ont été lysées et les lysates cellulaires ont été dilués pour inoculer les plaques du BST pendant 16 h. Les colonies ont été comptées; les chiffres de l’EC sont illustrés dans l’intrigue. Le graphique montre la moyenne ± SD et « » désigne P < 0,05. Les résultats sont représentatifs de n = 3 expériences. Le test td’étudiant non apparié bidirectionné a été utilisé pour les groupes traités par la fumée et non traités. P < 0,05 indique une signification statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Méthode de plaque de chute pour déterminer la charge bactérienne dans les cellules HSAEC. Les petites cellules épithéliales primaires de voie aérienne humaines ont été traitées avec 4% de CST pendant 3 h. Les cellules ont ensuite été soumises à l’infection de P. aeruginosa (souche PAO1) pendant 1 h suivie du traitement de la gentamycine pour un autre 1 h. Les cellules ont été lysées et les lysates cellulaires ont été dilués pour s’inoculer sur les plaques du BST pendant 16 h. Les colonies ont été comptées; les chiffres de l’EC sont illustrés dans l’intrigue. Le graphique montre la moyenne ± SD et « » désigne P < 0,05. Les résultats sont représentatifs de n = 3 expériences. Le test td’étudiant non apparié bidirectionné a été utilisé pour les groupes traités par la fumée et non traités. P < 0,05 indique une signification statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Détermination de la viabilité cellulaire dans les cellules épithéliales du poumon traitées par le CSE BEAS-2B. Les cellules épithéliales de BEAS-2B de poumon ont été traitées avec le CST de 4% pendant 3 h. Les cellules ont été tachées avec le bleu de trypan et la viabilité de cellules a été mesurée avec le compteur de cellules. Le graphique montre la moyenne ± SD. Les résultats sont représentatifs de n = 3 expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Détermination de la viabilité cellulaire dans les cellules épithéliales du poumon infectées par Pseudomonas. Les cellules épithéliales du poumon BEAS-2B ont été infectées par P. aeruginosa (MOI = 10) pendant 1 h. Les cellules ont été tachées avec le bleu de trypan et la viabilité de cellules a été mesurée avec un compteur de cellule. Le graphique montre la moyenne ± SD. Les résultats sont représentatifs de n = 3 expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Détermination de la viabilité cellulaire dans les cellules épithéliales du poumon traitées par la gentamycine BEAS-2B. Les cellules épithéliales pulmonaires BEAS-2B ont été traitées avec 100 μg/mL de gentamycine pendant 1 h. Les cellules ont été tachées avec le bleu de trypan et la viabilité de cellules a été mesurée avec un compteur de cellule. Le graphique montre la moyenne ± SD. Les résultats sont représentatifs de n = 3 expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : qRT-PCR pour déterminer la charge bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires. Les cellules traitées de la figure 2 ont été soumises à l’extraction totale de l’ARN. Une quantité équivalente d’ARN de chaque échantillon a été transcrite à l’inverse en ADNC, et la quantité d’ARN 16S de P. aeruginosa a été déterminée avec pcr quantitatif à l’aide de paires d’amorces spécifiques. Les résultats de qPCR sont tracés dans le graphique. Le graphique montre la moyenne ± SD et « » désigne P < 0,05. Les résultats sont représentatifs de n = 3 expériences. Le test td’étudiant non apparié bidirectionné a été utilisé pour les groupes traités par la fumée et non traités. P < 0,05 indique une signification statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Cytométrie de flux pour déterminer la charge bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires. Les cellules BEAS-2B ont été traitées avec le CST et infectées par P. fluorescens Migula (souche PAO143). Les cellules infectées ont été traitées avec la gentamycine et digérées avec la trypsie pour faire une suspension de cellule. Les suspensions cellulaires ont été passées par le cytomètre de flux et les cellules fluorescentes pseudomonas-positivesont été déterminées à une longueur d’onde de 509 nm. Les résultats de la cytométrie de flux sont tracés dans le graphique. Le graphique montre la moyenne ± SD et « » désigne P < 0,05. Les résultats sont représentatifs de n = 3 expériences. Le test td’étudiant non apparié bidirectionné a été utilisé pour les groupes traités par la fumée et non traités. P < 0,05 indique une signification statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Observation de l’infection bactérienne par microscopie fluorescente. Les cellules BEAS-2B ont été infectées par P. fluorescens Migula (souche PAO143) pendant 1 h. Les cellules ont été traitées avec la gentamycine pendant un autre 1 h et lavées 2x avec pbs froid. Les bactéries étiquetées GFP ont été observées sous un microscope fluorescent à une longueur d’onde de 480 nm et les cellules BEAS-2B ont été visualisées avec une image de phase. Les images ont été fusionnées et le résultat représentatif est affiché. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L’invasion bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires est une étape cruciale dans la pathogénie des infections bactériennes. Le processus d’invasion bactérienne dans les cellules peut être divisé en trois étapes suivantes: Premièrement, les bactéries entrent en contact et adhèrent à la surface de la cellule épithéliale à l’aide de leur flagelle. Deuxièmement, les bactéries subissent une internalisation ou pénètrent dans la membrane cellulaire. Enfin, les bactéries reproduisent et colonisent les cellules si elles réussissent à échapper aux mécanismes de défense cellulaire25,26. Des approches pour l’observation des infections bactériennes dans les microphages pulmonaires ont longtemps été développées mais avec une connaissance limitée des cellules épithéliales pulmonaires27,28. Cette étude a déterminé la charge bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires par trois approches : un essai de plaque de chute, RT-qPCR pour l’ARN 16S de Pseudomonas ribosome, et la cytométrie de flux. Les trois approches fonctionnent bien avec des sensibilités similaires. Choisir les approches pour déterminer la charge bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires dépend de la disponibilité de l’équipement et du temps. Dans ces expériences, le maintien de la flagelle bactérienne intacte et intacte est crucial pour l’infection réussie de cellules épithéliales pulmonaires29. Un temps de secousse plus court avec une vitesse limitée peut aider à promouvoir davantage la capacité d’invasion bactérienne30.

Un obstacle majeur dans la détermination de la concentration bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires est la contamination bactérienne du milieu de culture. Dans les expériences d’infection cellulaire, les bactéries sont ajoutées dans le milieu de culture pour une période de temps spécifique (c.-à-d. 1 h). Dans ce temps, une partie de cette charge bactérienne envahit avec succès le compartiment cytoplasmique, mais les résidus peuvent se fixer à la membrane externe des cellules. Un antibiotique, la gentamycine, est utilisé pour tuer les bactéries dans le milieu de culture et les résidus qui s’attachent à la membrane externe des cellules31. La gentamycine est considérée comme non perméable à la membrane cellulaire et n’affectera donc pas les bactéries déjà dans les cellules. Le traitement par la gentamycine fait qu’il est idéal pour ce système d’exclure la contamination potentielle de l’extérieur des cellules épithéliales du poumon infectés.

Pour étudier les effets de la fumée de cigarette sur l’infection bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires, les cellules pulmonaires doivent être exposées à la fumée de cigarette avant l’infection bactérienne dans les modèles cellulaires. Une approche conventionnelle consiste à préparer le CST frais pour traiter les cellules. La production de CST est une méthode rentable pour les études. Le CST est facile à gérer, le processus de fabrication du CST est simple, et l’injection intratrachéale du CSE est efficace dans la génération d’emphysème chez les modèles animaux dans une courte période de temps32. Des approches d’exposition directe aux cigarettes ont également été développées pour les modèles cellulaires in vitro et les modèles in vivo des rongeurs. Six mois d’exposition quotidienne de fumée de cigarette aux souris est largement utilisé pour générer l’emphysème33. L’exposition directe à la fumée de cigarette nécessite un équipement compliqué qui combine les systèmes de combustion des cigarettes et de culture cellulaire. La combustion des cigarettes produit de la fumée de cigarette, mais génère également une quantité de chaleur qui peut affecter la température et l’humidité de la chambre de culture. Heureusement, des techniques récentes facilitent l’exposition directe à la fumée de cigarette21. Un protocole de l’Organisation internationale pour la normalisation (ISO) a été mis en œuvre pour les expériences directes d’exposition à la fumée de cigarette22. L’exposition à la fumée de cigarette peut être effectuée une ou plusieurs fois. En outre, avec le progrès des techniques de culture cellulaire, les cellules épithéliales primaires pulmonaires pourraient également être cultivées sur des inserts transparents pour obtenir un monocouche de cellules épithéliales pulmonaires confluentes34. Les monocouches épithéliales pulmonaires imitent structurellement les conditions physiologiques dans les tissus pulmonaires. Les cellules peuvent alors être exposées à la fumée gazeuse apicale ou à l’air à l’interface air-liquide35. En outre, la culture des organoïdes pulmonaires a émergé dans les études pulmonaires actuelles36,37. Il sera intéressant de savoir comment la fumée de cigarette affecte l’infection bactérienne dans les organoïdes pulmonaires. L’approche décrite peut imiter l’infection humaine dans les tissus au lieu des cellules cultivées et peut rendre possible d’autres connaissances dans l’infection bactérienne des voies respiratoires inférieures.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par un National Institutes of Health R01 subventions HL125435 et HL142997 (à CZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ce mois-ci dans JoVE Numéro 159 exposition à la fumée de cigarette extrait de fumée de cigarette Pseudomonas infection charge bactérienne cellule épithéliale pulmonaire lésion pulmonaire
Étude des effets de la fumée de cigarette sur <em>l’infection de Pseudomonas</em> dans les cellules épithéliales pulmonaires
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Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

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