Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

دراسة آثار دخان السجائر على عدوى Pseudomonas في الخلايا الظهارية الرئة

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

وصف هنا هو بروتوكول لدراسة كيفية استخراج دخان السجائر يؤثر على الاستعمار البكتيري في خلايا الظهارية الرئة.

Abstract

تدخين السجائر هو السبب الرئيسي المسببة لنفاخ الرئة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). كما أن تدخين السجائر يعزز قابلية الإصابة بعدوى بكتيرية في الجهاز التنفسي. ومع ذلك، فإن آثار تدخين السجائر على العدوى البكتيرية في الخلايا الظهارية الرئة البشرية لم تدرس بعد بدقة. ويرد هنا هو بروتوكول مفصل لإعداد مقتطفات تدخين السجائر (CSE)، وعلاج الخلايا الظهارية الرئة البشرية مع CSE، والعدوى البكتيرية وتحديد العدوى. تم إعداد CSE مع طريقة تقليدية. تم علاج الخلايا الظهارية الرئة مع 4٪ CSE ل 3 ح الخلايا المعالجة CSE كانت، ثم، مصابة Pseudomonas في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. تم تحديد الأحمال البكتيرية من الخلايا من خلال ثلاث طرق مختلفة. وأظهرت النتائج أن CSE زيادة تحميل Pseudomonas في خلايا الرئة الظهارية. لذلك، يوفر هذا البروتوكول منهجًا بسيطًا ويمكن إعادة إنتاجه لدراسة تأثير دخان السجائر على العدوى البكتيرية في خلايا الرئة الظهارية.

Introduction

يؤثر تدخين السجائر على الصحة العامة لملايين الناس في جميع أنحاء العالم. العديد من الأمراض الضارة, بما في ذلك سرطان الرئة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD), ويقال أن تكون ذات صلة لتدخين السجائر1,2. التدخين السجائر يزيد من التعرض للعدوى الميكروبية الحادة في الجهاز التنفسي3,4,5. وعلاوة على ذلك، تثبت الأدلة المتزايدة أن تدخين السجائر يعزز التسبب في العديد من الاضطرابات المزمنة6،7،8. على سبيل المثال، قد يزيد تدخين السجائر من العدوى الفيروسية أو البكتيرية التي تسبب تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد9. من بين مسببات الأمراض البكتيرية التي تساهم في تفاقم حاد مرض الانسداد الرئوي الحاد ، وهو عامل أمراض عصيات سلبية الغرام ، Pseudomonas aeruginosa، يسبب العدوى التي ترتبط مع سوء التكهن وارتفاع الوفيات10،11. تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد يزيد من تفاقم المرض عن طريق تسريع التقدم المرضي. لا توجد علاجات فعالة ضد تفاقم الانسداد الرئوي الحاد باستثناء إدارة12مضاداً للأعراض . إن تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد (COPD) يعزز وفيات المرضى، ويقلل من نوعية الحياة، ويزيد من العبء الاقتصادي على المجتمع13.

مجرى الهواء التنفسي هو نظام مفتوح ، يخضع باستمرار لمختلف مسببات الأمراض الميكروبية الموجودة خارجيا. وعادة ما يتم الكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الانتهازية في الشعب الهوائية العليا ولكن في بعض الأحيان لوحظ في الشعب الهوائية السفلية14,15. في نماذج الحيوان P. aeruginosa يمكن الكشف عنها في الحويصلات السنخية في أقرب وقت 1 ح بعد العدوى16. كآلية دفاعية رئيسية، الخلايا المناعية مثل الضامة أو العدلات القضاء على البكتيريا في الشعب الهوائية. الخلايا الظهارية في الرئة، باعتبارها الحاجز الفسيولوجي الأول، تؤدي دورا فريدا في الدفاع المضيف ضد الالتهابات الميكروبية. قد تنظم الخلايا الظهارية للرئة الغزو الميكروبي، أو الاستعمار، أو النسخ المتماثل المستقل للخلايا المناعية17. بعض الجزيئات الموجودة في الخلايا الظهارية، بما في ذلك PPARg، ممارسة وظائف مضادة للبكتيريا، وبالتالي تنظيم الاستعمار البكتيري وتكرار في خلايا الظهارية الرئة18. قد تدخين السجائر تغيير الجزيئات وضعف وظيفة الدفاع الطبيعي في خلايا الظهارية الرئة19,20. وأفادت الدراسات الحديثة التعرض المباشر لدخان السجائر لخلايا الرئة الظهارية باستخدام جهاز التدخين الروبوت21,22. ويمكن إجراء التعرض للدخان بطرق أخرى، ومع ذلك، بما في ذلك تطبيق CSE. يعد إعداد CSE نهجًا قابلًا للتكرار مع التطبيقات المحتملة في أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية الوعائية التي تتعرض بشكل غير مباشر لدخان السجائر.

يصف هذا التقرير بروتوكولًا لتوليد مستخلص دخان السجائر لتغيير الحمل البكتيري في الخلايا الظهارية في الرئة. CSE يزيد من الحمل البكتيري P. aeruginosa، وأنه قد يسهم في تكرار الالتهابات البكتيرية عادة ما ينظر في تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد. يتم استخدام طريقة تقليدية لإعداد CSE. خلايا ظهارية الرئة، في مرحلة النمو الأسي، يتم التعامل مع 4٪ CSE لمدة 3 ساعة. بدلا من ذلك، يمكن أن تتعرض الخلايا الظهارية لمعالجة الرئة أحادية الطبقات مباشرة لدخان السجائر في واجهة الهواء السائل. ثم يتم تحدي الخلايا المعالجة CSE مع Pseudomonas في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. يتم نشر البكتيريا بسرعة اهتزاز خاصة لضمان مورفولوجيا فلايديلا الخاصة بهم لا تزال سليمة للحفاظ على قدرتها الغازية الكاملة. يتم استخدام جينتاميسين لقتل البكتيريا التي تركت في الوسط الثقافة، وبالتالي الحد من التلوث المحتمل خلال تحديد لاحق من الحمل البكتيري. كما يستخدم البروتوكول Pseudomonasالمسمى GFP ، والتي تم استخدامها كأداة قوية في دراسة العدوى Pseudomonas في نماذج مختلفة. سلالة ممثل هو P. الفلوريسينS Migula23. يتم تحديد درجة العدوى أو الحمل البكتيري بعد العلاج CSE في ثلاث طرق: طريقة لوحة قطرة مع عد مستعمرة، PCR الكمية باستخدام Pseudomonas 16S RRNA التمهيدي محددة، أو تدفق الخلايا في الخلايا المصابة ب Pseudomonasالفلورسنت . هذا البروتوكول هو نهج بسيط ويمكن استنساخه لدراسة تأثير دخان السجائر على العدوى البكتيرية في خلايا الرئة الظهارية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 100% إعداد CSE

  1. رسم 10 مل من وسائل الإعلام خالية من الدم خلية خالية من المصل (DMEM / F12 لخلايا BEAS-2B؛ مجرى الهواء المتوسطة خلية الظهارية القاعدية لخلايا HSAEC) في حقنة 60 مل.
  2. عكس ذلك إرفاق 1 مل قلصت بشكل مناسب تلميح ماصة إلى فوهة الحقنة كمحول لعقد السجائر (3R4F).
  3. إزالة مرشح من السجائر. إرفاق سيجارة إلى محول تلميح ونافور السيجارة.
  4. رسم 40 مل من الهواء المحتوي على الدخان في 10 مل من وسائل الإعلام خالية من المصل. اخلط الدخان مع الوسيلة عن طريق الهز بقوة (30 s لكل سحب).
  5. كرر الخطوة 1.4 حوالي 11x في ~ 7 دقيقة حتى يتم حرق السجائر تماما.
  6. تصفية 10 مل من وسائل الإعلام المدخنة مع مرشح 0.22 μm لاستبعاد أي الكائنات الدقيقة والجسيمات غير القابلة للذوبان. نقل إلى أنبوب معقمة مغلقة. إعداد 100٪ CSE لا يزيد عن 30 دقيقة قبل الفحص اللاحقة.

2. ثقافة السودوموناس

  1. تلقيح المجمدة P. aeruginosa (سلالة PAO1) أو P. الفلوريسين Migula (سلالة PAO143) في مرق الصويا Tryptic (TSB) أجار لثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على ما يكفي من البكتيريا للاستزراع، انتشار قدر من البكتيريا على لوحة Agar TSB ممكن.
  2. جمع تشويه البكتيرية واحتضان في 20 مل من TSB مع 5٪ من الجلسرين كمصدر للكربون.
  3. تخلص من التعليق البكتيري في حاضنة 37 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة حتى تصبح قيمة OD600 = 0.6.
    تنبيه: لا تدع سرعة الاهتزاز تتجاوز 200 دورة في الدقيقة. قد تؤدي سرعات الهز العالية إلى تلف مورفولوجيا البايلاليلا البكتيرية وتؤثر على الغزو البكتيري في ظهارة الرئة. وبالمثل، الحد من الوقت اهتزاز إلى 1 ح للحصول على البكتيريا الغازية للغاية. قياس قيمة OD600 لتقدير عدد البكتيريا. وDD600 = 1 يتوافق مع ~ 109 مستعمرة تشكيل وحدات (CFU)/مل.

3. الإنسان ثقافة الخلايا الظهارية الرئة والعلاج CSE

  1. ثقافة الإنسان بياس - 2B الخلايا في HITES المتوسطة (500 مل من DMEM / F12 ، 2.5 ملغ الأنسولين، 2.5 ملغ transferrin، 2.5 ملغ سيلينيت الصوديوم، 2.5 ملغ transferrin، 10 ميكرومتر هيدروكورتيزون، 10 ميكرومتر β-استراديول، 10 mM HEPES، و 2 MM L-الجلوتامين) تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) كما وصفت سابقا24.
  2. ثقافة الإنسان الأولية الخلايا الظهارية مجرى الهواء الصغيرة (HSAEC) في مجرى الهواء خلية الظهارية المتوسطة ثقافة (500 مل من الخطوط الجوية خلية القاع المتوسط، 500 ميكروغرام / مل HSA، 0.6 μM حمض اللينوليك، 0.6 ميكروغرام/مل ليسيثين، 6 م م L-الجلوتامين، 0.4٪ استخراج P، 1.0 ميكرومتر إبينيفرين، 5 ميكروغرام / مل transferrin، 10 NM T3، 1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون، RHGF 5 نانوغرام / مل، و5 ميكروغرام / مل الأنسولين rh. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
  3. افصل الخلايا مع 1 مل من 0.25٪ التربسين لمدة 5 دقائق حتى الخلايا فصل تماما من الجزء السفلي من لوحة.
  4. إضافة 10 مل من كامل HITES المتوسطة لتحييد التربسين وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل. جهاز طرد مركزي عند درجة حرارة 4 درجة مئوية عند 300 x غم لمدة 5 دقائق.
    تنبيه: مراقبة بعناية الوقت لعملية الهضم التربسين عن طريق المجهر، لأن عسر الهضم المفرط قد يسبب موت الخلايا.
  5. تجاهل فائقة و resuspend الخلايا في 2 مل من HITES المتوسطة مع 10٪ FBS.
  6. Pipette 10 μL من تعليق الخلية أعلاه على لوحة وأدخلها في عداد الخلايا الآلي للحصول على التركيز في الخلايا / مل.
  7. الخلايا لوحة BEAS-2B بتركيز 3 × 105 الخلايا / مل في 6 لوحات جيدا في حجم إجمالي 2 مل في متوسطة HITES تكملها 10٪ من FBS للثقافة بين عشية وضحاها.
  8. علاج الخلايا في التقاء حوالي 80٪ ، أو 5 × 55 خلايا / مل ، مع 4 ٪ CSE لمدة 3 ساعة. قبل العلاج CSE، تغيير المتوسطة مع HITES المتوسطة مع 1٪ من FBS.

4. العدوى البكتيرية

  1. إضافة P. aeruginosa أو P. الفلوريسين Migula (~ 1 ×10 7 CFU / مل) إلى كل بئر من الخلايا المعالجة CSE واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
  2. استلهموا من النمل الخارق واستبدله بـ 2 مل من طازج من HITES المتوسطة لعلاجه بنسبة 4% CSE و 100 ميكروغرام/مل جينتاميسين.
    ملاحظة: يتم استخدام جنتاميسين لأنه غير قادر على اختراق الأغشية الخلوية الظهارية الرئة الإنسان. وهكذا، فإنه يمكن أن تقتل جميع البكتيريا في المتوسط ولكن ليس تلك التي غزت خلايا الرئة الظهارية.
  3. بعد 1 ح من CSE / gentamicin العلاج في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2، pirate 3x الخلايا مع برنامج تلفزيوني لتحديد تركيز البكتيريا اللاحقة.
    ملاحظة: لتأكيد البكتيريا الداخلية، لوحظت الخلايا المصابة بـ P. fluorescens Migula تحت المجهر الفلوري.

5. تحديد تركيز البكتيريا باستخدام طريقة لوحة قطرة

  1. لتحديد الحمل البكتيري في الخلايا المصابة مع طريقة لوحة قطرة، وغسل الخلايا المعالجة gentamycin 2x مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
  2. إضافة 1 مل من العازلة تحلل الخلية (0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) إلى كل بئر.
  3. تخفيف الخلية التي تحتوي على البكتيريا الداخلية في التدرج (1:10، 1:100، 1:1،000، و 1:10،000) للحصول على التطعيم التالي إلى لوحة أجار TSB.
  4. بعد 16 ساعة من الحضانة، والحصول على نتائج CFU عن طريق عد المستعمرات البكتيرية.

6. RT-qPCR الكشف عن البكتيريا 16S rRNA

  1. علاج الخلايا الظهارية الرئوية المصابة Pseudomonas(~ 1 × 106 خلايا / مل) مع النبلاء كما هو موضح أعلاه. pirate المتوسطة وغسل الخلايا 2x مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
  2. إضافة 0.35 مل من تحلل ثيوسيانات guanidium العازلة لكل بئر من 6 لوحة جيدا. جمع الخلايا مع مكشطة الخلية. الماصات في lysate في أنبوب microcentrifuge وخلط بلطف مع ماصة.
  3. إضافة نفس حجم (0.35 مل) من الإيثانول الطازجة 70% أعد في lysate ومزيج جيد. نقل جميع العينات إلى عمود تدور وضعت في أنبوب جمع 2 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 10,000 x غ مقابل 30 s عند 20-25 درجة مئوية. ثم، تجاهل المخزن المؤقت في أنبوب التجميع.
  4. غسل العمود مع 0.7 مل من غسل العازلة 1. جهاز طرد مركزي العمود في 10،000 س ز لمدة 30 s. غسل العمود 2x مع 0.5 مل من العازلة لغسل غشاء الرنا. كرر الطرد المركزي عند 10000 × ز لمدة 2 دقيقة.
  5. ضع العمود في أنبوب جمع جديد 1.5 مل. إضافة 30-50 ميكرولتر RNase خالية من المياه. جهاز طرد مركزي في 10،000 س ز لمدة 1 دقيقة. جمع تدفق من خلال وقياس تركيز الجيش الملكي النيبالي.
  6. تنفيذ رد فعل النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. مزيج 1 ميكروغرام من مجموع RNA مع 10 مل من العازلة رد فعل، 1 ميكرولتر من النسخ العكسي، و RNase خالية من المياه ل20 μL التفاعل. إجراء رد فعل النسخ العكسي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. مزيج معا قوالب cDNA (1 ميكرولتر من كل رد فعل النسخ العكسي أعلاه)، 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي التي تحتوي على صبغة SYBR، 1 ميكرولتر من كل 200 nM التمهيدية محددة، والماء في خليط 20 ميكرولتر لتحليل PCR التالية، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: وفيما يلي التمهيديين التي تستهدف 16S rRNA P. aeruginosa: إلى الأمام 5′-CAAAACTACTGAGCTAGTAGTACG-3'; عكس 5′-TAAGATCTCAAG جاتكاكاكجيج-3'. تم استخدام GAPDH كتحكم التحميل مع التمهيديات التالية: إلى الأمام: 5′-GGCATGGACTGGACTGGTCATGA-3'؛ عكس: 5'-TTCACCATGGGGAGAAGGC-3'.
  8. استخدم أسلوب CT المقارن لتحديد التعبير.

7. الكشف عن Pseudomonas الفلورسنت مع تدفق cytometry

  1. علاج الفلورسنت Pseudomonasأعلاه -المصابة خلايا الرئة الظهارية (~ 1 × 106 خلايا / مل) مع النبلاء كما سبق وصفه. pirate المتوسطة وغسل الخلايا 2x مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
  2. تحليل العينات مع جهاز قياس تدفق في طول موجة من 509 نانومتر للكشف عن GFP. إنهاء كل قراءة في 100،000 التهم. تحليل البيانات المكتسبة مع البرامج ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم استخدام رسم تخطيطي لتوضيح البروتوكول في الشكل 1. تم التعامل مع خلايا الظهارية في الرئة BEAS-2B مع CSE وتحدى مع Pseudomonas. قتل Pseudomonas في الوسط ثقافة من قبل gentamycin المضافة والخلايا تعرضت لمقايسة لوحة قطرة, كشف RT-qPCR من الريبوسوم 16S الزائفة, وتدفق cytometry. مقارنة مع السيطرة، CSE العلاج زيادة كبيرة العدوى البكتيرية في طرق قطرة لوحة (الشكل 2). وفي المقابل، أثرت CSE الحمل البكتيري في HSAEC (الشكل 3). لم تتغير صلاحية الخلية بشكل كبير بعد 3 ح من 4٪ CSE العلاج، في 1 ح من العدوى Pseudomonas، أو في 1 ح من العلاج gentamycin(الشكل 4 الشكل 5 الشكل 6). 16S rrna الهدف RT-qPCR الأسلوب(الشكل 7)والتدفق cytometry(الشكل 8)أظهرت نتائج مماثلة. وأظهرت النتائج من المجهر الفلورسنت أن البكتيريا التي تحمل اسم GFP كولوستان مع خلايا BEAS-2B في تجربة العدوى Migula الفلوريسينس (الشكل 9). هذه النتائج تشير إلى أن تدخين السجائر زيادة تحميل Pseudomonas في خلايا BEAS-2B.

Figure 1
الشكل 1: العرض التخطيطي للبروتوكول لدراسة آثار دخان السجائر على عدوى Pseudomonas في خلايا الظهارية في الرئة. الخلايا الظهارية الرئة التي تزرع في إدراج ثقافة الخلية أو لوحات الثقافة التقليدية أو ألواح العضانية الرئة تعرضت لدخان السجائر لمدة 16 دقيقة عن طريق الروبوت التدخين أو تعامل مع استعداد 4٪ CSE لمدة 3 ساعة. ثم أصيبت هذه الخلايا بـ P. aeruginosa لمدة 1 ساعة (MOI = 10). تم استخدام Gentamycin للقضاء على Pseudomonas الحية في الوسط الثقافة. كانت الخلايا المذكورة أعلاه تخضع لطريقة لوحة الإسقاط، qRT-PCR، أو طرق تدفق الخلايا لتحديد الحمل البكتيري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إسقاط طريقة لوحة لتحديد الحمل البكتيري في خلايا الرئة الظهارية BEAS-2B. تم علاج خلايا BEAS-2B بـ 4% CSE لمدة 3 ساعات. ثم تعرضت الخلايا لP. aeruginosa (سلالة PAO1) العدوى لمدة 1 ساعة تليها العلاج gentamycin ل 1 ساعة أخرى. كانت الخلايا lysed وتم تخفيف الخلايا للوحات TSB تلقيح لمدة 16 ساعة. تم عد المستعمرات، و 10000000000000 ويتضح أرقام CFU في المؤامرة. يعرض الرسم البياني يعني ± SD، و "*" يدل على P < 0.05. النتائج هي ممثلة لـ n = 3 تجارب. تم استخدام اختبار T-Student غير المدفوع في الاتجاهين للمجموعات المعالجة بالدخان وغير المعالجة. P < 0.05 يشير إلى الأهمية الإحصائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إسقاط طريقة لوحة لتحديد الحمل البكتيري في خلايا HSAEC. تم التعامل مع الخلايا الظهارية الهوائية الصغيرة الأساسية البشرية بنسبة 4٪ CSE لمدة 3 ساعات. ثم تعرضت الخلايا لP. aeruginosa (سلالة PAO1) العدوى لمدة 1 ساعة تليها العلاج gentamycin ل 1 ساعة أخرى. كانت الخلايا lysed وتم تخفيف الخلايا lysates لتلقح على لوحات TSB لمدة 16 ساعة. تم عد المستعمرات، و 10000000000000 ويتضح أرقام CFU في المؤامرة. يعرض الرسم البياني يعني ± SD، و "*" يدل على P < 0.05. النتائج هي ممثلة لـ n = 3 تجارب. تم استخدام اختبار T-Student غير المدفوع في الاتجاهين للمجموعات المعالجة بالدخان وغير المعالجة. P < 0.05 يشير إلى الأهمية الإحصائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد صلاحية الخلية في خلايا BEAS-2B للرئتين المعالجة من قبل الظهارية CSE. تم علاج خلايا BEAS-2B الظهارية للرئة بـ 4% CSE لمدة 3 ساعات. كانت الخلايا ملطخة باللون الأزرق trypan وتم قياس قابلية الخلية مع عداد الخلية. الرسم البياني يبين يعني ± SD. النتائج هي ممثلة ن = 3 التجارب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحديد صلاحية الخلية في Pseudomonas-المصابة الرئة الظهارية BEAS-2B الخلايا. أصيبت خلايا BEAS-2B الظهارية للرئة بـ P. aeruginosa (MOI = 10) لمدة ساعة. كانت الخلايا ملطخة باللون الأزرق trypan وتم قياس صلاحية الخلية مع عداد الخلية. الرسم البياني يبين يعني ± SD. النتائج هي ممثلة ن = 3 التجارب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تحديد صلاحية الخلية في خلايا BEAS-2B الرئوية المعالجة بالظهارية في ظهارية الرئة. تم علاج خلايا BEAS-2B الظهارية للرئة بـ 100 ميكروغرام/مل جنتاميسين لمدة ساعة. كانت الخلايا ملطخة باللون الأزرق trypan وتم قياس صلاحية الخلية مع عداد الخلية. الرسم البياني يبين يعني ± SD. النتائج هي ممثلة ن = 3 التجارب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: qRT-PCR لتحديد الحمل البكتيري في خلايا الرئة الظهارية. وقد خضعت الخلايا المعالجة في الشكل 2 لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي. وكان هناك قدر مماثل من الحمض النووي الريبي من كل عينة تم نسخها في cDNA، وتم تحديد كمية 16S RNA من P. aeruginosa مع PCR الكمية باستخدام أزواج التمهيدي محددة. يتم رسم النتائج من qPCR في الرسم البياني. يعرض الرسم البياني يعني ± SD، و "*" يدل على P < 0.05. النتائج هي ممثلة لـ n = 3 تجارب. تم استخدام اختبار T-Student غير المدفوع في الاتجاهين للمجموعات المعالجة بالدخان وغير المعالجة. P < 0.05 يشير إلى الأهمية الإحصائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تدفق استئصال الخلايا لتحديد الحمل البكتيري في الخلايا الظهارية الرئة. تم علاج خلايا BEAS-2B بـ CSE والمصابة بـ P. fluorescens Migula (سلالة PAO143). تم علاج الخلايا المصابة مع النبلاء وهضمها مع التربسين لجعل تعليق الخلية. تم تمرير تعليق الخلايا من خلال جهاز قياس التدفق وSededsmonasالفلورسنت - تم تحديد الخلايا الإيجابية في الطول الموجي من 509 نانومتر. يتم رسم النتائج من عملية استئصال الانسياب في الرسم البياني. يعرض الرسم البياني يعني ± SD، و "*" يدل على P < 0.05. النتائج هي ممثلة لـ n = 3 تجارب. تم استخدام اختبار t-Student غير المدفوع في الاتجاهين لمجموعات الدخان المعالجة وغير المعالجة. P < 0.05 يشير إلى الأهمية الإحصائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: ملاحظة العدوى البكتيرية مع المجهر الفلورسنت. وكانت خلايا BEAS-2B مصابة بـ P. fluorescens Migula (سلالة PAO143) لمدة ساعة. تم علاج الخلايا مع gentamycin ل1 ساعة أخرى وغسلها 2x مع برنامج تلفزيوني الباردة. وقد لوحظت البكتيريا التي تحمل علامة GFP تحت مجهر فلوري في طول موجي من 480 نانومتر والخلايا BEAS-2B تم تصورها مع صورة المرحلة. تم دمج الصور، وتظهر النتيجة التمثيلية. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

غزو البكتيريا في خلايا الظهارية الرئة هو خطوة حاسمة في التسبب في الالتهابات البكتيرية. يمكن تقسيم عملية الغزو البكتيري إلى الخلايا إلى الخطوات الثلاث التالية: أولاً ، تتصل البكتيريا وتلتزم بسطح الخلية الظهارية باستخدام flagella الخاصة بهم. ثانياً، تخضع البكتيريا إما إلى الداخل أو تخترق الغشاء الخلوي. وأخيرا، فإن البكتيريا تكرار واستعمار الخلايا إذا كانت الهروب بنجاح آليات الدفاع الخلوي25،26. وقد وضعت منذ فترة طويلة نهج لمراقبة الالتهابات البكتيرية في microphages الرئة ولكن مع معرفة محدودة من خلايا الرئةالظهارية 27,28. حددت هذه الدراسة الحمل البكتيري في الخلايا الظهارية الرئة عن طريق ثلاثة نهج: مقايسة لوحة قطرة، RT-qPCR لS pseudomonas ريبوسوم 16S RNA، وتدفق استئصال الخلايا. وتعمل جميع الأساليب الثلاثة بشكل جيد مع حساسيات مماثلة. اختيار النهج لتحديد الحمل البكتيري في خلايا الرئة الظهارية يعتمد على توافر المعدات والوقت. في هذه التجارب، والحفاظ على flagella البكتيرية غير التالفة وسليمة أمر بالغ الأهمية لنجاح عدوى الخلايا الظهارية الرئة29. قد أقصر وقت اهتزاز مع سرعة محدودة تساعد على تعزيز قدرة غزو البكتيريا30.

عقبة رئيسية في تحديد تركيز البكتيريا في خلايا الظهارية الرئة هو التلوث البكتيري من وسط الثقافة. في تجارب العدوى الخلوية، تضاف البكتيريا إلى الوسط الثقافي لفترة زمنية محددة (أي 1 ساعة). خلال ذلك الوقت، جزء من هذا الحمل البكتيري يغزو بنجاح المقصورة السيتوبلازمية، ولكن قد ترفق المخلفات إلى الغشاء الخارجي للخلايا. مضاد حيوي، جينتاميسين، يستخدم لقتل البكتيريا في الوسط ثقافة والمخلفات التي تعلق على الغشاء الخارجي للخلايا31. ويعتبر Gentamycin غير قابل للنفاذ إلى الغشاء الخلوي، وبالتالي لن تؤثر على البكتيريا بالفعل داخل الخلايا. العلاج مع gentamycin يجعل من المثالي لهذا النظام لاستبعاد التلوث المحتمل من خارج خلايا الرئة الظهارية المصابة.

لدراسة آثار دخان السجائر على العدوى البكتيرية في خلايا الظهارية في الرئة، يجب أن تتعرض خلايا الرئة لدخان السجائر قبل العدوى البكتيرية في النماذج الخلوية. نهج تقليدي هو إعداد CSE جديدة لعلاج الخلايا. إن توليد CSE هو طريقة فعالة من حيث التكلفة للدراسات. CSE من السهل التعامل معها، وعملية صنع CSE بسيطة، وCSE الحقن داخل الرحم فعالة في توليد انتفاخ الرئة في النماذج الحيوانية في فترة زمنية قصيرة32. كما تم تطوير نهج التعرض المباشر للسجائر لكل من النماذج الخلوية في المختبر وفي نماذج القوارض الحية. ستة أشهر من التعرض اليومي لدخان السجائر للفئران يستخدم على نطاق واسع لتوليد انتفاخ الرئة33. يتطلب التعرض المباشر لدخان السجائر معدات معقدة تجمع بين أنظمة احتراق السجائر وأنظمة زراعة الخلايا. ينتج احتراق السجائر دخان السجائر، ولكنه يولد أيضًا كمية من الحرارة قد تؤثر على درجة حرارة غرفة الثقافة والرطوبة. لحسن الحظ، التقنيات الحديثة تجعل التعرض المباشر لدخان السجائر أسهل21. وقد تم تنفيذ بروتوكول المنظمة الدولية للتوحيد القياسي (ISO) لتجارب التعرض المباشر لدخان السجائر22. يمكن إجراء التعرض لدخان السجائر مرة واحدة أو عدة مرات. وبالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع التقدم في تقنيات زراعة الخلايا، يمكن أيضا أن تزرع خلايا الظهارية الأساسية الرئة على إدراج شفافة للحصول على خلية أحادية أحادية تينولية الرئة1. أحادية الطبقات الخلية الظهارية الرئة تحاكي هيكليا الظروف الفسيولوجية في أنسجة الرئة. يمكن أن تتعرض الخلايا بعد ذلك للدخان الغازي أو الهواء في واجهة الهواء السائل35. وعلاوة على ذلك، ظهرت ثقافة الجهاز الرئة في الدراسات الحالية الرئة36،37. سيكون من المثير للاهتمام أن نعرف كيف يؤثر دخان السجائر على العدوى البكتيرية في الأعضاء الرئوية. النهج الموصوف قد يحاكي العدوى البشرية في الأنسجة بدلا من الخلايا المستزرعة وقد يجعل من الممكن المزيد من الرؤى في عدوى البكتيريا في الجهاز التنفسي السفلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 منح HL125435 و HL142997 (إلى CZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

Tags

هذا الشهر في JoVE، العدد 159، التعرض دخان السجائر، سيجارة مستخلص الدخان، Pseudomonas،عدوى، الحمل البكتيري، خلية ظهارية الرئة، إصابة الرئة
دراسة آثار دخان السجائر على عدوى <em>Pseudomonas</em> في الخلايا الظهارية الرئة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter