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Immunology and Infection

फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में स्यूडोमोनास संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए कैसे सिगरेट धुआं निकालने फेफड़ों एपिथेलियल कोशिकाओं में जीवाणु उपनिवेशीकरण को प्रभावित करता है ।

Abstract

सिगरेट धूम्रपान फेफड़ों के एम्फिसिमा और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) के लिए प्रमुख एटियोलॉजिकल कारण है। सिगरेट पीने से श्वसन प्रणाली में बैक्टीरियल संक्रमण की संवेदनशीलता को भी बढ़ावा देता है। हालांकि, मानव फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल संक्रमण पर सिगरेट पीने के प्रभाव का अभी तक अच्छी तरह से अध्ययन किया जाना है । यहां वर्णित सिगरेट धूम्रपान अर्क (सीएसई), सीएसई के साथ मानव फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं के उपचार, और बैक्टीरियल संक्रमण और संक्रमण निर्धारण की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। सीएसई को पारंपरिक विधि से तैयार किया गया था। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को 3 घंटे सीएसई-उपचारित कोशिकाओं के लिए 4% सीएसई के साथ इलाज किया गया था, फिर, 10 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर स्यूडोमोनास से संक्रमित थे। कोशिकाओं का बैक्टीरियल भार तीन अलग-अलग तरीकों से निर्धारित किया गया था। परिणामों से पता चला है कि सीएसई फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में स्यूडोमोनास लोड में वृद्धि हुई । इसलिए, यह प्रोटोकॉल फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सरल और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

सिगरेट पीने से दुनिया भर में लाखों लोगों के सार्वजनिक स्वास्थ्य पर असर पड़ता है । फेफड़ों के कैंसर और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) सहित कई हानिकारक बीमारियों को सिगरेट पीने से संबंधित बताया गया है1,,2। सिगरेट पीने से श्वसन तंत्र में तीव्र माइक्रोबियल संक्रमण की संवेदनशीलता बढ़ जाती है3,4,5.5 इसके अलावा , बढ़ते साक्ष्य यह साबित करते हैं कि सिगरेट पीने से कई पुराने विकारों की रोगजनन क्षमता बढ़ती है6,7,8. उदाहरण के लिए, सिगरेट पीने से वायरल या बैक्टीरियल संक्रमण बढ़ सकता है जो सीओपीडी उत्तेजना9का कारण बनता है। जीवाणु रोगजनकों में से जो सीओपीडी के तीव्र उत्तेजना में योगदान देते हैं, एक अवसरवादी ग्राम-नकारात्मक बैसिलस रोगजनक, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,उन संक्रमणों का कारण बनता है जो खराब शकुन और उच्च मृत्यु दर10, 11,11से सहसंबद्ध हैं। सीओपीडी उत्तेजना रोग प्रगति को तेज करके बीमारी को खराब कर देती है। एंटीसिम्प्टोमैटिक मैनेजमेंट12को छोड़कर सीओपीडी के खिलाफ कोई प्रभावी उपचार नहीं हैं । सीओपीडी उत्तेजना रोगी मृत्यु दर को बढ़ावा देती है, जीवन की गुणवत्ता को कम करती है, और समाज पर आर्थिक बोझ बढ़ाती है13।

श्वसन वायुमार्ग एक खुली प्रणाली है, जो लगातार बाहरी रूप से मौजूद विभिन्न माइक्रोबियल रोगजनकों के अधीन है। अवसरवादी जीवाणु रोगजनकों का पता आमतौर पर ऊपरी वायुमार्ग में लगाया जाता है लेकिन कभी - कभी निचले वायुमार्ग14,15में देखा जाता है . पशु मॉडलों में पी एरुगिनोसा को संक्रमण के 16 के बाद 1 घंटे के रूप में अल्वेलर सैक्स में पाया जा सकता है।16 एक प्रमुख रक्षा तंत्र के रूप में, मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं वायुमार्ग में बैक्टीरिया को खत्म कर देती हैं। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाएं, पहली शारीरिक बाधा के रूप में, माइक्रोबियल संक्रमण के खिलाफ मेजबान रक्षा में एक अनूठी भूमिका निभाती हैं। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाएं17प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्वतंत्र माइक्रोबियल आक्रमण, उपनिवेशीकरण या प्रतिकृति को विनियमित कर सकती हैं। पीपीएआरजी सहित एपिथेलियल कोशिकाओं में पाए जाने वाले कुछ अणु जीवाणुरोधी कार्य करते हैं, जिससे फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण और प्रतिकृति को विनियमित किया जाता है18। सिगरेट पीने से अणुओं में परिवर्तन हो सकता है और फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में सामान्य रक्षा कार्य ख़राब हो सकता है19,20 हाल के अध्ययनों में रोबोट धूम्रपान उपकरण का उपयोग करके फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को सिगरेट के धुएं के सीधे संपर्कमें आनेकी सूचना दीगईहै। धुएं के संपर्क में अन्य तरीकों से प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि, सीएसई के आवेदन सहित। सीएसई की तैयारी अन्य सेल प्रकारों में संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक प्रजनन योग्य दृष्टिकोण है, जिसमें वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं जो अप्रत्यक्ष रूप से सिगरेट के धुएं के संपर्क में हैं।

यह रिपोर्ट फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड को बदलने के लिए सिगरेट के धुएं के अर्क को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है । सीएसई पी एरुगिनोसाके बैक्टीरियल लोड को बढ़ाता है, और यह आमतौर पर सीओपीडी उत्तेजना में देखे जाने वाले बैक्टीरियल संक्रमणों की पुनरावृत्ति में योगदान दे सकता है। सीएसई की तैयारी के लिए एक पारंपरिक विधि का उपयोग किया जाता है। फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं, उनके घातीय विकास चरण में, 3 घंटे के लिए 4% सीएसई के साथ इलाज कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, मोनोलेयर-सुसंस्कृत फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को सीधे एयर-लिक्विड इंटरफेस में सिगरेट के धुएं से अवगत कराया जा सकता है। सीएसई-उपचारित कोशिकाओं को तब 10 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर स्यूडोमोनास के साथ चुनौती दी जाती है। बैक्टीरिया को एक विशेष मिलाते हुए गति से प्रचारित किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उनकी पूर्ण आक्रामक क्षमता को बनाए रखने के लिए उनके फ्लैगेला की आकृति विज्ञान बरकरार रहे। Gentamycin संस्कृति माध्यम में छोड़ दिया बैक्टीरिया को मारने के लिए नियोजित है, जिससे जीवाणु भार के बाद के निर्धारण के दौरान संभावित संदूषण को कम करने । प्रोटोकॉल भी GFP लेबल स्यूडोमोनासका उपयोग करता है, जो विभिन्न मॉडलों में स्यूडोमोनास संक्रमण का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। एक प्रतिनिधि तनाव पी फ्लोरोसेनएस मिगुला23है । सीएसई उपचार के बाद संक्रमण या बैक्टीरियल लोड की डिग्री तीन तरीकों से निर्धारित की जाती है: कॉलोनी गिनती के साथ ड्रॉप प्लेट विधि, स्यूडोमोनास 16S आरएनए-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके मात्रात्मक पीसीआर, या फ्लोरोसेंट स्यूडोमोनाससे संक्रमित कोशिकाओं में साइटोमेट्री प्रवाह। यह प्रोटोकॉल फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सरल और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण है।

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Protocol

1. 100% सीएसई तैयारी

  1. सीरम मुक्त सेल कल्चर मीडिया के 10 एमएल (BEAS-2B कोशिकाओं के लिए DMEM/F12; HSAEC कोशिकाओं के लिए एयरवे एपिथेलियल सेल बेसल माध्यम) को ६० एमएल सिरिंज में ड्रा करें ।
  2. रिवर्स सिगरेट (3R4F) को पकड़ने के लिए एक एडाप्टर के रूप में सिरिंज के नोजल के लिए एक उचित छंटनी की गई 1 मिलीएल पिपेट टिप देते हैं।
  3. सिगरेट का फिल्टर निकालें। टिप एडाप्टर के लिए एक सिगरेट देते हैं और सिगरेट दहन।
  4. सीरम मुक्त मीडिया के 10 एमएल में धुएं युक्त हवा के 40 एमएल ड्रा करें। तेजी से मिलाते हुए माध्यम के साथ धुआं मिलाएं (30 एस प्रति ड्रा)।
  5. दोहराएं चरण 1.4 ~ 7 मिनट में 11x के बारे में जब तक सिगरेट पूरी तरह से जला दिया जाता है।
  6. किसी भी सूक्ष्मजीव और अघुलनशील कणों को बाहर करने के लिए 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर के साथ स्मोक्ड मीडिया के 10 एमएल को फ़िल्टर करें। एक बंद बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद की परख से पहले 100% सीएसई को 30 मिनट से अधिक नहीं तैयार करें।

2. स्यूडोमोनास संस्कृति

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति के लिए एक ट्रिप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) आगर प्लेट में जमे हुए पी एरुगिनोसा (तनाव PAO1) या पी फ्लोरोसेंस मिगुला (तनाव PAO143) में टीका लगाएं।
    नोट: खेती के लिए पर्याप्त बैक्टीरिया प्राप्त करने के लिए, संभव के रूप में TSB आगर प्लेट पर ज्यादा बैक्टीरिया के रूप में फैल गया ।
  2. कार्बन स्रोत के रूप में ग्लाइस्रोल के 5% के साथ टीएसबी के 20 एमएल में एक बैक्टीरियल स्मिर और इनक्यूबेट ले लीजिए।
  3. ऑड600 वैल्यू = 0.6 तक 1 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बैक्टीरियल सस्पेंशन को हिलाएं।
    सावधानी: झटकों की गति 200 आरपीएम से अधिक न होने दें। उच्च झटकों की गति बैक्टीरियल फ्लैगेला की आकृति विज्ञान को नुकसान पहुंचा सकती है और फेफड़ों के एपिथेलिया में बैक्टीरियल आक्रमण को प्रभावित कर सकती है। इसी तरह, अत्यधिक आक्रामक बैक्टीरिया प्राप्त करने के लिए हिलते समय को 1 घंटे तक सीमित करें। बैक्टीरिया की संख्या का अनुमान लगाने के लिए ओडी600 मूल्य को मापें। एक ओडी600 = 1 ~ 109 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) /

3. मानव फेफड़ों एपिथेलियल सेल संस्कृति और सीएसई उपचार

  1. संस्कृति मानव BEAS-2B कोशिकाओं में HITES माध्यम (DMEM के ५०० मिलीएल/F12, २.५ मिलीग्राम इंसुलिन, 2.5 मिलीग्राम ट्रांसफरिन, 2.5 मिलीग्राम सोडियम सेलेनिट, 2.5 मिलीग्राम ट्रांसफरिन, 10 माइक्रोन हाइड्रोकॉर्टिसोन, 10 माइक्रोन β-एस्ट्राडिओल, 10 एमएम एचईपीईएस और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन) 10% भ्रूण बोविन सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक पहलेवर्णितहै।
  2. संस्कृति मानव प्राथमिक छोटे वायुमार्ग एपिथेलियल कोशिकाओं (एचएसएईसी) में वायुमार्ग एपिथेलियल सेल कल्चर मीडियम (एयरवे सेल बेसल मीडियम के 500 एमएल, 500 माइक्रोग्राम/एमएल एचएसए, 0.6 माइक्रोन लिनोलिक एसिड, 0.6 μg/mL lecithin, 6 m L-ग्लूटामाइन, 0.4% निकालने पी, 1.0 μM epinephrine, 5 μg/mL ट्रांसफरिन, 10 एनएम T3, 1 μg/mL हाइड्रोकॉर्टिसोन, आरएच ईजीएफ 5 एनजी/एमएल आरएच इंसुलिन) । 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 0.25% ट्राइप्सिन के 1 मिलील के साथ अलग करें जब तक कि कोशिकाएं प्लेट के नीचे से पूरी तरह अलग न हो जाएं।
  4. ट्रिप्सिन को बेअसर करने और कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए पूर्ण हिट्स माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज।
    सावधानी: माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्राइप्सिन पाचन के समय की सावधानीपूर्वक निगरानी करें, क्योंकि अतिचिकित्सा सेल मृत्यु का कारण बन सकता है।
  5. सुपरनेट को त्यागें और 10% एफबीएस के साथ 2 मिलीएल की 2 मिलीलनीय में कोशिकाओं को फिर से रीसस्ट करें।
  6. प्लेट पर उपरोक्त सेल निलंबन के पिपेट 10 माइक्रोन और कोशिकाओं/एमएल में एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इसे एक स्वचालित सेल काउंटर में डालें ।
  7. प्लेट BEAS-2B कोशिकाओं की एकाग्रता पर 3 × 105 कोशिकाओं/एमएल की एक एकाग्रता में 6 अच्छी तरह से प्लेटों में HITES मध्यम में 2 मिलीएल की कुल मात्रा में रातोंरात संस्कृति के लिए FBS के 10% के साथ पूरक ।
  8. कोशिकाओं को लगभग 80% स्थूलता, या 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल पर इलाज करें, 3 घंटे के लिए 4% सीएसई के साथ। सीएसई उपचार से पहले, एफबीएस के 1% के साथ हिट्स माध्यम के साथ माध्यम बदलें।

4. बैक्टीरियल इंफेक्शन

  1. सीएसई-उपचारित कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में पी एरुगिनोसा या पी फ्लोरोसेंस मिगुला (~ 1 ×10 7 सीएलयू/एमएल) जोड़ें और 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और 4% सीएसई और 100 μg/एमएल जेंटामिसिन के साथ इलाज करने के लिए ताजा हिट्स माध्यम के 2 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें।
    नोट: जेंटामिसिन का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि यह मानव फेफड़ों के एपिथेलियल सेलुलर झिल्ली में प्रवेश करने में असमर्थ है। इस प्रकार, यह माध्यम में सभी बैक्टीरिया को मार सकता है लेकिन उन लोगों को नहीं जो फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं पर हमला करते हैं।
  3. सीएसई/जेंटामिसिन उपचार के 1 घंटे के बाद 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर, सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और बाद के बैक्टीरियल एकाग्रता निर्धारण के लिए कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 3x धोएं।
    नोट: आंतरिक बैक्टीरिया की पुष्टि करने के लिए, जीएफपी-लेबल पी फ्लोरोस्केंस मिगुला से संक्रमित कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत देखा गया।

5. ड्रॉप प्लेट विधि का उपयोग कर जीवाणु एकाग्रता का निर्धारण

  1. ड्रॉप प्लेट विधि के साथ संक्रमित कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए, ठंडे पीबीएस के 2 मिलील के साथ 2x gentamycin-इलाज कोशिकाओं को धोएं।
  2. प्रत्येक कुएं में सेल लाइसिस बफर (पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स-100) का 1 मिलियन एमएलए जोड़ें।
  3. टीएसबी आगर प्लेट के लिए निम्नलिखित टीका के लिए एक ढाल (1:10, 1:100, 1:1,000, और 1:10,000) में आंतरिक बैक्टीरिया युक्त कोशिका lysates पतला ।
  4. इनक्यूबेशन के 16 एच के बाद, बैक्टीरियल कॉलोनियों की गिनती करके सीएलयू के परिणाम प्राप्त करें।

6. बैक्टीरियल 16S आरएनए का आरटी-क्यूपीसीआर डिटेक्शन

  1. ऊपर वर्णित जेनटामाइसिन के साथ स्यूडोमोनास-संक्रमितफेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं (~ 1 x10 6 कोशिकाओं/एमएल) का इलाज करें। माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 2x ठंडे पीबीएस के 2 मिलील के साथ धोएं।
  2. 6 अच्छी प्लेट के प्रति कुएं में ग्वानिडियम थिओसायनेट लाइसिस बफर का 0.35 एमएल जोड़ें। एक सेल स्क्रैपर के साथ कोशिकाओं को ले लीजिए। एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में लिसेट करें और पिपेट के साथ धीरे-धीरे मिलाएं।
  3. एक ही मात्रा (0.35 मिलीएल) ताजा तैयार 70% इथेनॉल को lysate में जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। सभी नमूनों को 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखे स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें। 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 10,000 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज। इसके बाद बफर को कलेक्शन ट्यूब में छोड़ दें।
  4. वॉश बफर 1 के 0.7 एमएल के साथ कॉलम धो लें। 30 एस के लिए 10,000 x g पर कॉलम अपकेंद्रित्र। झिल्ली से बंधे आरएनए को धोने के लिए बफर के 0.5 एमएल के साथ कॉलम 2x धोएं। 2 मिनट के लिए 10,000 x g पर अपकेंद्रित्र दोहराएं।
  5. कॉलम को एक नए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में रखें। 30-50 माइक्रोन आरएनएसई-मुक्त पानी जोड़ें। 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और आरएनए एकाग्रता को मापने।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया करें। 10 एमएल रिएक्शन बफर, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 1 माइक्रोन और 20 माइक्रोन रिएक्शन के लिए आरएनए-फ्री पानी के साथ कुल आरएनए का 1 माइक्रोन मिलाएं। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस आचरण करें।
  7. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, सीडीएनए टेम्पलेट्स (ऊपर प्रत्येक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया का 1 माइक्रोन), मास्टर मिक्स के 5 माइक्रोन जिसमें एसआईबीआर डाई, प्रत्येक 200 एनएम विशिष्ट प्राइमर का 1 माइक्रोन और निम्नलिखित पीसीआर विश्लेषण के लिए 20 माइक्रोन मिश्रण में पानी मिलाएं।
    नोट: निम्नलिखित प्राइमर पी एरुगिनोसाके 16S आरएनए को लक्षित कर रहे हैं: फॉरवर्ड 5'-CAAAACTGAGCTAGTATACG-3'; रिवर्स 5'-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3'। गैपध का उपयोग निम्नलिखित प्राइमर के साथ लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था: फॉरवर्ड: 5'-GGCATGGCATGGCATCATGA-3'; रिवर्स: 5'-TTCACCATGGAGAAGAGGC-3'.
  8. अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए तुलनात्मक सीटी विधि का उपयोग करें।

7. प्रवाह साइटोमेट्री के साथ फ्लोरोसेंट स्यूडोमोनास का पता लगाना

  1. ऊपर फ्लोरोसेंट स्यूडोमोनास-संक्रमितफेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं (~ 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल) को पहले वर्णित जेंटामाइसिन के साथ इलाज करें । माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 2x ठंडे पीबीएस के 2 मिलील के साथ धोएं।
  2. जीएफपी का पता लगाने के लिए 509 एनएम की तरंगदैर्ध्य में एक प्रवाह साइटोमीटर के साथ नमूनों का विश्लेषण करें। प्रत्येक को 100,000 मामलों में पढ़ा समाप्त करें। संबंधित सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहीत डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

चित्र 1में प्रोटोकॉल को स्पष्ट करने के लिए एक आरेख का उपयोग किया जाता है। फेफड़ों के एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाओं का सीएसई के साथ इलाज किया गया और स्यूडोमोनासके साथ चुनौती दी गई । संस्कृति माध्यम में स्यूडोमोनास को जोड़ा गया जेनटामाइसिन द्वारा मार डाला गया था और कोशिकाओं को ड्रॉप प्लेट परख, स्यूडोमोनास राइबोसोम 16S आरएनए का आरटी-क्यूपीसीआर डिटेक्शन और फ्लो साइटोमेट्री के अधीन किया गया था। नियंत्रण के साथ तुलना में, सीएसई उपचार ड्रॉप प्लेट विधियों(चित्रा 2)में बैक्टीरियल संक्रमण में काफी वृद्धि हुई। तदनुसार, सीएसई ने एचएसएईसी(चित्रा 3)में बैक्टीरियल लोड को प्रभावित किया। 4% सीएसई उपचार के 3 एच के बाद सेल व्यवहार्यता में काफी परिवर्तन नहीं हुआ, स्यूडोमोनास संक्रमण के 1 घंटे में, या 1 घंटे में जेनटामाइसिन उपचार(चित्रा 4 चित्रा 5 चित्रा 6)। 16S rRNA-लक्ष्य आरटी-qPCR विधि(चित्रा 7)और प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 8)ने इसी तरह के परिणामों का प्रदर्शन किया। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के परिणामों से पता चला है कि जीएफपी-लेबल बैक्टीरिया एक पी फ्लोरोस्केंस मिगुला संक्रमण प्रयोग(चित्रा 9)में BEAS-2B कोशिकाओं के साथ कोलोकैलाइज्ड । इन परिणामों से पता चलता है कि सिगरेट पीने से ब्यास-2 बी कोशिकाओं में स्यूडोमोनास लोड बढ़ा ।

Figure 1
चित्रा 1: फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में स्यूडोमोनास संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध प्रस्तुति। कोशिका संस्कृति आवेषण या पारंपरिक संस्कृति प्लेटों या फेफड़ों के ऑर्गेनॉइड में उगाई जाने वाली फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं को धूम्रपान रोबोट के माध्यम से 16 मिनट के लिए सिगरेट के धुएं से अवगत कराया गया था या 3 घंटे के लिए तैयार 4% सीएसई के साथ इलाज किया गया था। इन कोशिकाओं को तो 1 घंटे के लिए पी aeruginosa से संक्रमित थे (MOI = 10) । गेंटामाइसिन का उपयोग संस्कृति माध्यम में लाइव स्यूडोमोनास को खत्म करने के लिए किया गया था। उपरोक्त कोशिकाएं बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए ड्रॉप प्लेट विधि, क्यूआरटी-पीसीआर, या प्रवाह साइटोमेट्री दृष्टिकोण के अधीन थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फेफड़ों के एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए ड्रॉप प्लेट विधि। ब्यास-2बी कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए 4% सीएसई के साथ इलाज किया गया । कोशिकाओं को तब 1 घंटे के लिए पी एरुगिनोसा (तनाव PAO1) संक्रमण के अधीन किया गया था और इसके बाद एक और 1 घंटे के लिए जेनटामाइसिन उपचार किया गया था। कोशिकाओं को lysed किया गया और कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए टीएसबी प्लेटों को टीका लगाने के लिए पतला किया गया था । कॉलोनियों की गिनती की गई; सीएलयू नंबर साजिश में सचित्र हैं। ग्राफ शो का मतलब ± एसडी, और "*" पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 को दर्शाता है। परिणाम एन = 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। दो तरह से अकरोपित छात्र टी-परीक्षणका उपयोग धुएं से इलाज और अनुपचारित समूहों के लिए किया गया था । पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: HSAEC कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए ड्रॉप प्लेट विधि। मानव प्राथमिक छोटे वायुमार्ग एपिथेलियल कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए 4% सीएसई के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को तब 1 घंटे के लिए पी एरुगिनोसा (तनाव PAO1) संक्रमण के अधीन किया गया था और इसके बाद एक और 1 घंटे के लिए जेनटामाइसिन उपचार किया गया था। कोशिकाओं को lysed किया गया और कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए टीएसबी प्लेटों पर टीका लगाने के लिए पतला किया गया था । कॉलोनियों की गिनती की गई; सीएलयू नंबर साजिश में सचित्र हैं। ग्राफ शो का मतलब ± एसडी, और "*" पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 को दर्शाता है। परिणाम एन = 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। दो तरह से अकरोपित छात्र टी-परीक्षणका उपयोग धुएं से इलाज और अनुपचारित समूहों के लिए किया गया था । पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: सीएसई-इलाज फेफड़ों एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाओं में कोशिका व्यवहार्यता का निर्धारण। फेफड़ों के एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए 4% सीएसई के साथ इलाज किया गया । कोशिकाओं को ट्राइपैन ब्लू से दाग दिया गया था और सेल व्यवहार्यता को सेल काउंटर के साथ मापा गया था। ग्राफ शो का मतलब है ± एसडी. परिणाम एन = 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: स्यूडोमोनासमें कोशिका व्यवहार्यता का निर्धारण-संक्रमित फेफड़ों एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाओं। फेफड़ों के एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाएं 1 घंटे के लिए पी एरुगिनोसा (एमओआई = 10) से संक्रमित थीं । कोशिकाओं को ट्राइपैन नीले रंग से दाग दिया गया था और सेल व्यवहार्यता को सेल काउंटर के साथ मापा गया था। ग्राफ शो का मतलब है ± एसडी. परिणाम एन = 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: जेनटामाइसिन-उपचारित फेफड़ों एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाओं में कोशिका व्यवहार्यता का निर्धारण। फेफड़ों के एपिथेलियल ब्यास-2 बी कोशिकाओं का इलाज 1 घंटे के लिए १०० μg/mL gentamycin के साथ किया गया । कोशिकाओं को ट्राइपैन नीले रंग से दाग दिया गया था और सेल व्यवहार्यता को सेल काउंटर के साथ मापा गया था। ग्राफ शो का मतलब है ± एसडी. परिणाम एन = 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए क्यूआरटी-पीसीआर। चित्रा 2 में इलाज कोशिकाओं को कुल आरएनए निष्कर्षण के अधीन थे । प्रत्येक नमूने से आरएनए की एक समकक्ष राशि सीडीएनए में लिखित रिवर्स थी, और पी एरुगिनोसा के 16S आरएनए की राशि विशिष्ट प्राइमर जोड़े का उपयोग करके मात्रात्मक पीसीआर के साथ निर्धारित की गई थी। क्यूपीसीआर से परिणाम ग्राफ में प्लॉट किए जाते हैं। ग्राफ शो का मतलब ± एसडी, और "*" पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 को दर्शाता है। परिणाम एन = 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। दो तरह से अकरोपित छात्र टी-परीक्षणका उपयोग धुएं से इलाज और अनुपचारित समूहों के लिए किया गया था । पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8: फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री। BEAS-2B कोशिकाओं सीएसई के साथ इलाज किया गया और पी फ्लोरोस्केंस मिगुला (तनाव PAO143) से संक्रमित । संक्रमित कोशिकाओं को जेनटामाइसिन के साथ इलाज किया गया और कोशिका निलंबन करने के लिए ट्राइप्सिन के साथ पचाया गया। सेल निलंबन प्रवाह साइटोमीटर और फ्लोरोसेंट स्यूडोमोनासके माध्यम से पारित किए गए थे - सकारात्मक कोशिकाओं को 509 एनएम की तरंग दैर्ध्य में निर्धारित किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्री से परिणाम ग्राफ में प्लॉट किए जाते हैं। ग्राफ शो का मतलब ± एसडी, और "*" पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 को दर्शाता है। परिणाम एन = 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। दो तरह से अकरोपित छात्र टीपरीक्षण धुआं इलाज और अनुपचारित समूहों के लिए इस्तेमाल किया गया था । पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ बैक्टीरियल संक्रमण का अवलोकन। BEAS-2B कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए पी फ्लोरोसेंस मिगुला (तनाव PAO143) से संक्रमित थे । कोशिकाओं को एक और 1 घंटे के लिए gentamycin के साथ इलाज किया गया और ठंडे PBS के साथ 2x धोया । जीएफपी-लेबल वाले बैक्टीरिया को 480 एनएम की तरंगदैर्ध्य में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया और बीएएस-2 बी कोशिकाओं को चरण की छवि के साथ कल्पना की गई। छवियों को विलय कर दिया गया था, और प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है। स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में जीवाणु आक्रमण जीवाणु संक्रमण के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कदम है। कोशिकाओं में जीवाणु आक्रमण की प्रक्रिया को निम्नलिखित तीन चरणों में तोड़ा जा सकता है: सबसे पहले, बैक्टीरिया संपर्क करते हैं और अपने फ्लैगेला का उपयोग करके एपिथेलियल सेल की सतह का पालन करते हैं। दूसरा, बैक्टीरिया या तो आंतरिककरण से गुजरते हैं या सेलुलर झिल्ली में प्रवेश करते हैं। अंत में , बैक्टीरिया कोशिकाओं को दोहराते हैं और उपनिवेश करते हैं यदि वे सफलतापूर्वक सेलुलर रक्षा तंत्र से बच जाते हैं25,,26. फेफड़ों के माइक्रोफेज में जीवाणु संक्रमण के अवलोकन के दृष्टिकोण लंबे समय से विकसित किए गए हैं, लेकिन फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं के सीमित ज्ञान के साथ27,28। इस अध्ययन ने तीन दृष्टिकोणों के माध्यम से फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड निर्धारित किया: एक ड्रॉप प्लेट परख, स्यूडोमोनास राइबोसोम 16S आरएनए के लिए आरटी-क्यूपीसीआर, और प्रवाह साइटोमेट्री। सभी तीन दृष्टिकोण समान संवेदनशीलता के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं । फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए दृष्टिकोण चुनना उपकरण और समय की उपलब्धता पर निर्भर करता है। इन प्रयोगों में, बैक्टीरियल फ्लैगेला को अक्षतिग्रस्त और बरकरार रखना सफल फेफड़ों के एपिथेलियल सेल संक्रमण29के लिए महत्वपूर्ण है। सीमित गति के साथ एक छोटा सा समय बैक्टीरियल हमलावर क्षमता को और बढ़ावा देने में मदद कर सकता है30.

फेफड़ों की एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल एकाग्रता के निर्धारण में एक बड़ी बाधा संस्कृति माध्यम से जीवाणु संदूषण है। सेल संक्रमण प्रयोगों में, बैक्टीरिया को एक विशिष्ट समय अवधि (यानी, 1 घंटे) के लिए संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है। उस समय के भीतर, उस जीवाणु भार का एक हिस्सा सफलतापूर्वक साइटोप्लाज्मिक डिब्बे पर हमला करता है, लेकिन अवशेष कोशिकाओं की बाहरी झिल्ली से जुड़ सकते हैं। एक एंटीबायोटिक, जेनटामाइसिन, संस्कृति माध्यम में बैक्टीरिया को मारने के लिए और31कोशिकाओं की बाहरी झिल्ली से जुड़े अवशेषों का उपयोग किया जाता है। Gentamycin सेलुलर झिल्ली के लिए पारम नहीं माना जाता है और इस तरह कोशिकाओं के भीतर पहले से ही बैक्टीरिया को प्रभावित नहीं करेगा । जेनटामाइसिन के साथ उपचार इस प्रणाली के लिए संक्रमित फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं के बाहर से संभावित संदूषण को बाहर करने के लिए आदर्श बनाता है।

फेफड़ों के एपिथेलियल कोशिकाओं में बैक्टीरियल संक्रमण पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, फेफड़ों की कोशिकाओं को सेलुलर मॉडल में बैक्टीरियल संक्रमण से पहले सिगरेट के धुएं से अवगत कराया जाना चाहिए। एक पारंपरिक दृष्टिकोण कोशिकाओं के इलाज के लिए ताजा सीएसई तैयार कर रहा है । सीएसई का उत्पादन अध्ययन के लिए एक लागत प्रभावी तरीका है। सीएसई को संभालना आसान है, सीएसई बनाने की प्रक्रिया सरल है, और सीएसई इंट्राचेल इंजेक्शन कम समय अवधि32में पशु मॉडल में एम्फिसिमा की पीढ़ी में प्रभावी है। इन विट्रो सेलुलर मॉडल और वीवो कृंतक मॉडल दोनों के लिए प्रत्यक्ष सिगरेट एक्सपोजर के दृष्टिकोण भी विकसित किए गए हैं। चूहों के लिए छह महीने के दैनिक सिगरेट के धुएं के संपर्क में व्यापक रूप से एम्फिसिमा33उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रत्यक्ष सिगरेट धुआं जोखिम जटिल उपकरण है कि सिगरेट दहन और सेल संस्कृति प्रणाली को जोड़ती है की आवश्यकता है । सिगरेट दहन सिगरेट का धुआं पैदा करता है, लेकिन यह भी गर्मी की एक राशि है कि संस्कृति चैंबर के तापमान और आर्द्रता को प्रभावित कर सकते है उत्पन्न करता है । सौभाग्य से, हाल की तकनीकें प्रत्यक्ष सिगरेट के धुएं के संपर्क को21आसान बनाती हैं। प्रत्यक्ष सिगरेट के धुएं के संपर्क प्रयोगों के लिए एक अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन (आईएसओ) प्रोटोकॉल लागू किया गया है22. सिगरेट के धुएं के संपर्क में एक बार या कई बार किया जा सकता है। इसके अलावा, सेल संस्कृति तकनीकों की प्रगति के साथ, फेफड़ों की प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाओं को पारदर्शी सम्मिलित कोशिकाओं पर भी उगाया जा सकता है ताकि एक शांत फेफड़े एपिथेलियल सेल मोनोलेयर34प्राप्त किया जा सके। फेफड़ों के एपिथेलियल सेल मोनोलेयर संरचनात्मक रूप से फेफड़ों के ऊतकों में शारीरिक स्थितियों की नकल करते हैं। कोशिकाओं को तब हवा-तरल इंटरफेस35पर एपिकल गैसीय धुएं या हवा के संपर्क में किया जा सकता है। इसके अलावा , फेफड़ों के ऑर्गेनॉइड की संस्कृति वर्तमान फेफड़ों के अध्ययन36,37में उभरी है . यह जानना दिलचस्प होगा कि सिगरेट का धुआं फेफड़ों के ऑर्गेनॉइड में बैक्टीरियल इंफेक्शन को कैसे प्रभावित करता है। वर्णित दृष्टिकोण सुसंस्कृत कोशिकाओं के बजाय ऊतकों में मानव संक्रमण की नकल कर सकता है और कम श्वसन जीवाणु संक्रमण में और अधिक अंतर्दृष्टि बना सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में स्वास्थ्य R01 अनुदान HL125435 और HL142997 (CZ के लिए) के एक राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

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References

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

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Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

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