Summary
Beschrieben hier ist ein Protokoll zu untersuchen, wie Zigarettenrauch-Extrakt bakterielle Besiedlung in Lungenepithelzellen beeinflusst.
Abstract
Zigarettenrauchen ist die Hauptursache für Lungenemphysem und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Zigarettenrauchen fördert auch die Anfälligkeit für bakterielle Infektionen in den Atemwegen. Die Auswirkungen des Zigarettenrauchens auf bakterielle Infektionen in menschlichen Lungenepithelzellen müssen jedoch noch gründlich untersucht werden. Beschrieben ist ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Zigarettenrauchextrakten (CSE), die Behandlung von menschlichen Lungenepithelzellen mit CSE, und bakterielle Infektion und Infektionsbestimmung. CSE wurde nach einem konventionellen Verfahren hergestellt. Lungenepithelzellen wurden mit 4% CSE für 3 h behandelt. CSE-behandelte Zellen wurden dann mit Pseudomonas bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 infiziert. Die bakteriellen Belastungen der Zellen wurden durch drei verschiedene Methoden bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass CSE die Epithelbelastung in Lungenepithelzellen erhöhte. Dieses Protokoll bietet daher einen einfachen und reproduzierbaren Ansatz, um die Wirkung von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen.
Introduction
Das Rauchen von Zigaretten beeinträchtigt die öffentliche Gesundheit von Millionen von Menschen weltweit. Viele schädliche Krankheiten, einschließlich Lungenkrebs und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), werden berichtet, dass im Zusammenhang mit Zigarettenrauchen1,2. Zigarettenrauchen erhöht die Anfälligkeit für akute mikrobielle Infektionen in den Atemwegen3,4,5. Darüber hinaus belegen immer mehr Beweise, dass Zigarettenrauchen die Pathogenese vieler chronischer Erkrankungen verstärkt6,7,8. Zum Beispiel kann Zigarettenrauchen virale oder bakterielle Infektionen erhöhen, die COPD-Exazerbation verursachen9. Unter den bakteriellen Krankheitserregern, die ätiologisch zur akuten Exazerbation von COPD beitragen, verursacht ein opportunistischer gramnegativer Bacillus-Erreger, Pseudomonas aeruginosa,Infektionen, die mit schlechten Prognosen und höheren Sterblichkeiten korrelieren10,11. CopD-Exazerbation verschlimmert die Krankheit durch Beschleunigung der pathologischen Progression. Es gibt keine wirksamen Therapien gegen COPD-Exazerbation außer dem antisymptomatischen Management12. COPD-Exazerbation fördert die Sterblichkeit der Patienten, verringert die Lebensqualität und erhöht die wirtschaftliche Belastung der Gesellschaft13.
Die Atemwege sind ein offenes System, das kontinuierlich verschiedenen mikrobiellen Krankheitserregern ausgesetzt ist, die extern vorkommen. Opportunistische bakterielle Krankheitserreger werden in der Regel in den oberen Atemwegen nachgewiesen, aber manchmal in den unteren Atemwegenbeobachtet 14,15. In Tiermodellen kann P. aeruginosa in alveolaren Säcken schon nach 1 h nach der Infektion16nachgewiesen werden. Als wichtiger Abwehrmechanismus eliminieren Immunzellen wie Makrophagen oder Neutrophilen die Bakterien in den Atemwegen. Lungenepithelzellen, als erste physiologische Barriere, spielen eine einzigartige Rolle in der Wirtsabwehr gegen mikrobielle Infektionen. Lungenepithelzellen können mikrobielle Invasion, Kolonisation oder Replikation unabhängig von Immunzellen regulieren17. Einige Moleküle, die in Epithelzellen gefunden werden, einschließlich PPARg, üben antibakterielle Funktionen aus und regulieren dadurch die bakterielle Besiedlung und Replikation in Lungenepithelzellen18. Zigarettenrauchen kann die Moleküle verändern und die normale Abwehrfunktion in den Lungenepithelzellen19,20beeinträchtigen. Jüngste Studien berichteten über die direkte Exposition von Zigarettenrauch gegenüber Lungenepithelzellen mit Roboter-Raucherapparat21,22. Die Exposition gegenüber Rauch kann jedoch auf andere Weise durchgeführt werden, einschließlich der Anwendung von CSE. Die Herstellung von CSE ist ein reproduzierbarer Ansatz mit möglichen Anwendungen in anderen Zelltypen, einschließlich vaskulärer Endothelzellen, die indirekt Zigarettenrauch ausgesetzt sind.
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von Zigarettenrauchextrakt, um die bakterielle Belastung in Lungenepithelzellen zu verändern. CSE erhöht die bakterielle Belastung von P. aeruginosa, und es kann zum Wiederauftreten von bakteriellen Infektionen in der Regel bei COPD Exazerbation gesehen beitragen. Zur Herstellung von CSE wird eine konventionelle Methode verwendet. Lungenepithelzellen werden in ihrem exponentiellen Wachstumsstadium mit 4% CSE für 3 h behandelt. Alternativ können monolayer-kultivierte Lungenepithelzellen in einer luft-flüssigen Schnittstelle direkt Zigarettenrauch ausgesetzt werden. CSE-behandelte Zellen werden dann mit Pseudomonas bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 herausgefordert. Die Bakterien werden mit einer bestimmten Schüttelgeschwindigkeit vermehrt, um sicherzustellen, dass die Morphologie ihrer Flagella intakt bleibt, um ihre volle invasive Kapazität zu behalten. Gentamycin wird eingesetzt, um die im Kulturmedium zurückgelassenen Bakterien abzutöten und so die potenzielle Kontamination bei der anschließenden Bestimmung der Bakterienbelastung zu reduzieren. Das Protokoll verwendet auch GFP-markierte Pseudomonas, die als ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung Pseudomonas Infektion in verschiedenen Modellen verwendet wurde. Ein repräsentativer Stamm ist P. fluorescens Migula23. Der Grad der Infektion oder bakterielle Belastung nach der CSE-Behandlung wird auf drei Arten bestimmt: die Fallplattenmethode mit Koloniezählung, quantitative PCR mit Pseudomonas 16S rRNA-spezifischen Primern oder die Durchflusszytometrie in Zellen, die mit fluoreszierenden Pseudomonasinfiziert sind. Dieses Protokoll ist ein einfacher und reproduzierbarer Ansatz, um die Wirkung von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 100% CSE Vorbereitung
- Zeichnen Sie 10 ml serumfreie Zellkulturmedien (DMEM/F12 für BEAS-2B-Zellen; Atemwegsepithelzellbasalmedium für HSAEC-Zellen) in eine 60 ml Spritze.
- Legen Sie eine entsprechend getrimmte 1 ml Pipettespitze als Adapter zur Haltung der Zigarette (3R4F) an der Düse der Spritze an.
- Entfernen Sie den Filter der Zigarette. Befestigen Sie eine Zigarette am Tip-Adapter und verbrennen Sie die Zigarette.
- Zeichnen Sie 40 ml rauchhaltige Luft in 10 ml serumfreie Medien. Mischen Sie den Rauch mit dem Medium durch kräftiges Schütteln (30 s pro Unentschieden).
- Wiederholen Sie Schritt 1.4 ca. 11x in 7 min, bis die Zigarette vollständig ausgebrannt ist.
- Filtern Sie die 10 ml geräucherten Medien mit einem 0,22 m-Filter, um Mikroorganismen und unlösliche Partikel auszuschließen. Transfer in ein geschlossenes steriles Rohr. Bereiten Sie die 100% CSE nicht mehr als 30 min vor dem nachfolgenden Test vor.
2. Pseudomonas-Kultur
- Gefrorene P. aeruginosa (Stamm PAO1) oder P. fluoreszens Migula (Stamm PAO143) in eine Tryptic Soy Broth (TSB) Agarplatte für die Nachtkultur bei 37 °C impfen lassen.
HINWEIS: Um genügend Bakterien für die Kultivierung zu erhalten, verbreiten Sie so viele Bakterien wie möglich auf die TSB-Agarplatte. - Sammeln Sie einen bakteriellen Abstrich und inkubieren in 20 ml TSB mit 5% Glycerin als Kohlenstoffquelle.
- Schütteln Sie die bakterielle Suspension in einem 37 °C Inkubator bei 200 Rpm für 1 h, bis der OD600-Wert = 0,6.
VORSICHT: Lassen Sie die Schüttelgeschwindigkeit nicht mehr als 200 Umdrehungen an pm. Höhere Schüttelgeschwindigkeiten können die Morphologie der bakteriellen Flagella schädigen und die bakterielle Invasion in Lungenepithelien beeinträchtigen. Ebenso begrenzen Sie die Schüttelzeit auf 1 h, um hochinvasive Bakterien zu erhalten. Messen Sie den OD600-Wert, um die Anzahl der Bakterien zu schätzen. Eine OD600 = 1 entspricht 109 Koloniebildenden Einheiten (CFU)/ml.
3. Menschliche Lungenepithelzellkultur und CSE-Behandlung
- Kultur menschliche BEAS-2B-Zellen in HITES-Medium (500 ml DMEM/F12, 2,5 mg Insulin, 2,5 mg Transferrin, 2,5 mg Natriumselenit, 2,5 mg Transferrin, 10 M Hydrocortison, 10 M β-Estradiol, 10 mM HEPES und 2 mM L-Glutamin) ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) wie zuvor beschrieben24.
- Kultur menschliche primäre kleine Atemwegsepithelzellen (HSAEC) im Atemwegsepithelzellkulturmedium (500 ml Airway Cell Basal Medium, 500 g/ml HSA, 0,6 m Linolsäure, 0,6 g/ml Lecithin, 6 mM L-Glutamin, 0,4 % Extrakt P, 1,0 M Epinephrin, 5 g/ml Transferrin, 10 nM T3, 1 g/ml Hydrocortison, rh EGF 5 ng/mL und 5 g/ml Rh Insulin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2.
- Dissoziieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin für 5 min, bis sich die Zellen vollständig von der Unterseite der Platte lösen.
- Fügen Sie 10 ml komplettes HITES-Medium hinzu, um Trypsin zu neutralisieren und die Zellen in einem 15 ml-Rohr zu sammeln. Zentrifuge bei 4 °C bei 300 x g für 5 min.
VORSICHT: Überwachen Sie sorgfältig die Zeit für die Trypsin-Verdauung durch Mikroskopie, da Überverdauung zum Zelltod führen kann. - Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 2 ml HITES-Medium mit 10% FBS wieder aus.
- Pipette 10 l der oben genannten Zellsuspension auf die Platte und legen Sie sie in einen automatisierten Zellzähler, um die Konzentration in Zellen/ml zu erhalten.
- Platte BEAS-2B Zellen in einer Konzentration von 3 × 105 Zellen/ml in 6 Brunnenplatten in einem Gesamtvolumen von 2 ml in HITES Medium ergänzt mit 10% FBS für Die Nachtkultur.
- Behandeln Sie die Zellen mit ca. 80% Konfluenz oder 5 x 105 Zellen/ml, mit 4% CSE für 3 h. Ändern Sie vor der CSE-Behandlung das Medium mit HITES-Medium mit 1% FBS.
4. Bakterielle Infektion
- P. aeruginosa oder P. fluorescens Migula (1 × 107 KBE/ml) zu jedem Brunnen der MIT CSE behandelten Zellen hinzufügen und 1 h bei 37 °C bei 5%CO2brüten.
- Aspirieren Sie die Überräube und ersetzen Sie mit 2 ml frischem HITES Medium, um mit 4% CSE und 100 g/ml Gentamicin zu behandeln.
HINWEIS: Gentamicin wird verwendet, weil es nicht in der Lage ist, menschliche Lungenepithelzellmembranen zu durchdringen. So kann es alle Bakterien im Medium abtöten, aber nicht diejenigen, die in die Lungenepithelzellen eingedrungen sind. - Nach 1 h CSE/Gentamicin-Behandlung bei 37 °C in 5%CO2die Überwälten ansaugen und die Zellen 3x mit PBS für die anschließende bakterielle Konzentrationsbestimmung waschen.
HINWEIS: Zur Bestätigung der verinnerlichten Bakterien wurden Zellen, die mit gfP-markierten P. fluoreszens Migula infiziert waren, unter fluoreszierender Mikroskopie beobachtet.
5. Bestimmung der bakterienkonzentration nach der Tropfplattenmethode
- Um die bakterielle Belastung in infizierten Zellen mit der Tropfplattenmethode zu bestimmen, waschen Sie die mit Gentamycin behandelten Zellen 2x mit 2 ml kaltem PBS.
- Fügen Sie 1 ml Zelllysepuffer (0,5% Triton X-100 in PBS) zu jedem Brunnen hinzu.
- Verdünnen Sie die Zelllysate, die die verinnerlichten Bakterien in einem Gradienten (1:10, 1:100, und 1:10.000) enthalten, für die folgende Impfung auf die TSB-Agarplatte.
- Nach 16 h Inkubation, erhalten Sie die Ergebnisse der KBE durch Zählen der Bakterienkolonien.
6. RT-qPCR Nachweis von bakteriellen 16S rRNA
- Behandeln Sie die Pseudomonas-infiziertenLungenepithelzellen (ca. 1 x 106 Zellen/ml) mit Gentamycin, wie oben beschrieben. Das Medium ansaugen und die Zellen 2x mit 2 ml kaltem PBS waschen.
- 0,35 ml des Guanidium-Thiocyanat-Lysepuffers pro Brunnen einer 6-Well-Platte hinzufügen. Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Das Lysat in ein Mikrozentrifugenrohr geben und sanft mit der Pipette mischen.
- Das gleiche Volumen (0,35 ml) frisch zubereitetes 70% Ethanol in das Lysat geben und gut vermischen. Übertragen Sie alle Proben in eine Spin-Spalte, die in einem 2 ml-Sammelrohr platziert ist. Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s bei 20–25 °C. Verwerfen Sie dann den Puffer im Auflistungsrohr.
- Waschen Sie die Säule mit 0,7 ml Waschpuffer 1. Zentrifugieren Sie die Säule bei 10.000 x g für 30 s. Waschen Sie die Säule 2x mit 0,5 ml Puffer, um die membrangebundene RNA zu waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 10.000 x g für 2 min.
- Platzieren Sie die Säule in einem neuen 1,5 ml Sammelrohr. Fügen Sie 30–50 L RNase-freies Wasser hinzu. Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min. Sammeln Sie den Durchfluss und messen Sie die RNA-Konzentration.
- Führen Sie eine umgekehrte Transkriptionsreaktion gemäß dem Herstellerprotokoll durch. Mischen Sie 1 g Gesamt-RNA mit 10 ml Reaktionspuffer, 1 l Reverse-Transkriptase und RNase-freiem Wasser für eine 20-L-Reaktion. Führen Sie die Umgekehrte Transkriptionsreaktion bei 37 °C für 1 h und dann 95 °C für 5 min.
- Mischen Sie die cDNA-Vorlagen (1 l jeder Reverse-Transkriptionsreaktion oben), 5 l des Master-Mix, der SYBR-Farbstoff enthält, 1 l von je 200 nM-spezifischen Primern und Wasser in einem 20-L-Gemisch für die folgende PCR-Analyse gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
ANMERKUNG: Im Folgenden sind die Primer für die 16S rRNA von P. aeruginosa: vorwärts 5-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3"; reverse 5-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3. GAPDH wurde als Ladesteuerung mit folgenden Primern verwendet: vorwärts: 5-GGCATGGACTGGTCATGA-3; Rückseite: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3.. - Verwenden Sie die vergleichende CT-Methode, um den Ausdruck zu bestimmen.
7. Nachweis von fluoreszierenden Pseudomonas mit Durchflusszytometrie
- Behandeln Sie die oben fluoreszierenden Pseudomonas-infiziertenLungenepithelzellen (ca. 1 x 106 Zellen/ml) mit Gentamycin, wie zuvor beschrieben. Das Medium ansaugen und die Zellen 2x mit 2 ml kaltem PBS waschen.
- Analysieren Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer bei einer Wellenlänge von 509 nm für die Detektion von GFP. Beenden Sie jeden Lesewert mit 100.000 Zählungen. Analysieren Sie die erfassten Daten mit zugehöriger Software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Diagramm wird verwendet, um das Protokoll in Abbildung 1zu veranschaulichen. Lungenepithel-BEAS-2B-Zellen wurden mit CSE behandelt und mit Pseudomonasherausgefordert. Pseudomonas im Kulturmedium wurden durch das zugesetzte Gentamycin getötet und die Zellen wurden dem Fallplattentest, dem RT-qPCR-Nachweis von Pseudomonas Ribosom 16S-RNA und der Durchflusszytometrie unterzogen. Im Vergleich zur Kontrolle erhöhte die CSE-Behandlung die bakterielle Infektion bei Fallplattenmethoden erheblich (Abbildung 2). Entsprechend wirkte sich CSE auf die bakterielle Belastung in HSAEC aus (Abbildung 3). Die Zelllebensfähigkeit änderte sich nicht wesentlich nach 3 h 4% CSE-Behandlung, bei 1 h Pseudomonas-Infektion oder bei 1 h Gentamycin-Behandlung(Abbildung 4 Abbildung 5 Abbildung 6). Die 16S rRNA-target RT-qPCR-Methode (Abbildung 7) und die Durchflusszytometrie (Abbildung 8) zeigten ähnliche Ergebnisse. Die Ergebnisse der fluoreszierenden Mikroskopie zeigten, dass GFP-markierte Bakterien in einem P. fluorescens Migula-Infektionsexperiment mit BEAS-2B-Zellen kolokalisiert wurden (Abbildung 9). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zigarettenrauchen die Pseudomonas-Belastung in BEAS-2B-Zellen erhöht hat.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls zur Untersuchung der Auswirkungen von Zigarettenrauch auf die Pseudomonas-Infektion in Lungenepithelzellen. Lungenepithelzellen, die in Zellkultureinsätzen oder konventionellen Kulturplatten oder Lungenorganoiden angebaut wurden, wurden 16 min lang über einen Rauchroboter Zigarettenrauch ausgesetzt oder mit präparierten 4% CSE für 3 h behandelt. Diese Zellen wurden dann 1 h lang mit P. aeruginosa infiziert (MOI = 10). Gentamycin wurde verwendet, um lebende Pseudomonas im Kulturmedium zu beseitigen. Die oben genannten Zellen wurden der Fallplattenmethode, qRT-PCR oder Strömungszytometrie-Ansätzen zur Bestimmung der bakteriellen Belastung unterzogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fallplattenmethode zur Bestimmung der bakteriellen Belastung in den BeAS-2B-Zellen der Lunge. BEAS-2B-Zellen wurden mit 4% CSE für 3 h behandelt. Die Zellen wurden dann P. aeruginosa (Stamm PAO1) Infektion für 1 h gefolgt von Gentamycin-Behandlung für weitere 1 h unterzogen. Die Zellen wurden lysiert und die Zelllysate wurden verdünnt, um TSB-Platten für 16 h zu impfen. Kolonien wurden gezählt; die CFU-Nummern werden im Diagramm dargestellt. Diagramm zeigt den Mittelwert ± SD und "*" bedeutet P < 0,05. Die Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 Experimente. Zwei-Wege-ungepaarter Student t-Testwurde für rauchbehandelte und unbehandelte Gruppen verwendet. P < 0,05 gibt die statistische Signifikanz an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fallplattenmethode zur Bestimmung der bakteriellen Belastung in HSAEC-Zellen. Menschliche primäre kleine Atemwegsepithelzellen wurden mit 4% CSE für 3 h behandelt. Die Zellen wurden dann P. aeruginosa (Stamm PAO1) Infektion für 1 h gefolgt von Gentamycin-Behandlung für weitere 1 h unterzogen. Die Zellen wurden lysiert und die Zelllysate wurden verdünnt, um auf TSB-Platten für 16 h zu impfen. Kolonien wurden gezählt; die CFU-Nummern werden im Diagramm dargestellt. Diagramm zeigt den Mittelwert ± SD und "*" bedeutet P < 0,05. Die Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 Experimente. Zwei-Wege-ungepaarter Student t-Testwurde für rauchbehandelte und unbehandelte Gruppen verwendet. P < 0,05 gibt die statistische Signifikanz an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bestimmung der Zelllebensfähigkeit in CSE-behandelten Lungenepithelzellen BEAS-2B. Lungenepithel-BEAS-2B-Zellen wurden 3 h lang mit 4% CSE behandelt. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und die Zelllebensfähigkeit wurde mit Zellzähler niert. Graph zeigt mittels ± SD. Die Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bestimmung der Zelllebensfähigkeit in Pseudomonas-infiziertenLungenepithel-BEAS-2B-Zellen. Lungenepithel-BEAS-2B-Zellen wurden 1 h lang mit P. aeruginosa (MOI = 10) infiziert. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem Zellzähler gemessen. Graph zeigt mittels ± SD. Die Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Bestimmung der Zelllebensfähigkeit in gentamycinbehandelten Lungenepithelzellen BEAS-2B. Lungenepithel-BEAS-2B-Zellen wurden 1 h lang mit 100 g/ml Gentamycin behandelt. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem Zellzähler gemessen. Graph zeigt mittels ± SD. Die Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: qRT-PCR zur Bestimmung der bakteriellen Belastung in Lungenepithelzellen. Behandelte Zellen in Abbildung 2 wurden einer vollständigen RNA-Extraktion unterzogen. Eine entsprechende Menge an RNA aus jeder Probe wurde in cDNA umgeschrieben, und die Menge an 16S-RNA von P. aeruginosa wurde mit quantitativer PCR mit spezifischen Primer-Paaren bestimmt. Die Ergebnisse von qPCR werden im Diagramm dargestellt. Diagramm zeigt den Mittelwert ± SD und "*" bedeutet P < 0,05. Die Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 Experimente. Zwei-Wege-ungepaarter Student t-Testwurde für rauchbehandelte und unbehandelte Gruppen verwendet. P < 0,05 gibt die statistische Signifikanz an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Durchflusszytometrie zur Bestimmung der bakteriellen Belastung in Lungenepithelzellen. BEAS-2B-Zellen wurden mit CSE behandelt und mit P. fluorescens Migula (Stamm PAO143) infiziert. Infizierte Zellen wurden mit Gentamycin behandelt und mit Trypsin verdaut, um eine Zellsuspension zu machen. Zellsuspensionen wurden durch Durchflusszytometer und fluoreszierende Pseudomonas-positiveZellen mit einer Wellenlänge von 509 nm bestimmt. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie werden im Diagramm dargestellt. Diagramm zeigt den Mittelwert ± SD und "*" bedeutet P < 0,05. Die Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 Experimente. Zwei-Wege-ungepaarter Student t-Testwurde für rauchbehandelte und unbehandelte Gruppen verwendet. P < 0,05 gibt die statistische Signifikanz an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Beobachtung einer bakteriellen Infektion mit fluoreszierender Mikroskopie. BEAS-2B-Zellen wurden 1 h lang mit P. fluorescens Migula (Stamm PAO143) infiziert. Die Zellen wurden weitere 1 H mit Gentamycin behandelt und 2x mit kaltem PBS gewaschen. Die GFP-markierten Bakterien wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Wellenlänge von 480 nm beobachtet und BEAS-2B-Zellen mit einem Phasenbild visualisiert. Die Bilder wurden zusammengeführt, und das repräsentative Ergebnis wird angezeigt. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die bakterielle Invasion in Lungenepithelzellen ist ein entscheidender Schritt bei der Pathogenese bakterieller Infektionen. Der Prozess der bakteriellen Invasion in die Zellen kann in die folgenden drei Schritte unterteilt werden: Erstens, die Bakterien kontaktieren und haften an der Oberfläche der Epithelzelle mit ihren Flagella. Zweitens werden die Bakterien entweder verinnerlicht oder in die Zellmembran eindringen. Schließlich replizieren und besiedeln die Bakterien die Zellen, wenn sie erfolgreich zellulären Abwehrmechanismen entkommen25,26. Ansätze zur Beobachtung bakterieller Infektionen in Lungenmikrophagen wurden seit langem entwickelt, aber mit begrenztem Wissen über Lungenepithelzellen27,28. Diese Studie ermittelte die bakterielle Belastung in den Lungenepithelzellen über drei Ansätze: einen Fallplattentest, RT-qPCR für Pseudomonas Ribosom 16S RNA und Durchflusszytometrie. Alle drei Ansätze funktionieren gut mit ähnlichen Empfindlichkeiten. Die Wahl der Ansätze zur Bestimmung der bakteriellen Belastung in Lungenepithelzellen hängt von der Verfügbarkeit der Ausrüstung und der Zeit ab. In diesen Experimenten ist es entscheidend für eine erfolgreiche Lungenepithelzellinfektion29. Eine kürzere Schüttelzeit mit begrenzter Geschwindigkeit kann dazu beitragen, die bakterielle Eindringfähigkeit weiter zu fördern30.
Ein großes Hindernis bei der Bestimmung der bakteriellen Konzentration in Lungenepithelzellen ist die bakterielle Kontamination aus dem Kulturmedium. In Zellinfektionsexperimenten werden die Bakterien für einen bestimmten Zeitraum (d.h. 1 h) in das Kulturmedium aufgenommen. Innerhalb dieser Zeit dringt ein Teil dieser bakteriellen Belastung erfolgreich in das zytoplasmatische Fach ein, aber Rückstände können sich an die äußere Membran der Zellen anheften. Ein Antibiotikum, Gentamycin, wird verwendet, um die Bakterien im Kulturmedium und die Rückstände, die an der äußeren Membran der Zellenbefestigt sind 31abtöten. Gentamycin gilt als nicht durchlässig für die Zellmembran und wirkt sich daher nicht auf die Bakterien aus, die sich bereits in den Zellen befinden. Die Behandlung mit Gentamycin macht es ideal für dieses System, die potenzielle Kontamination von außerhalb der infizierten Lungenepithelzellen auszuschließen.
Um die Auswirkungen von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen, müssen Lungenzellen vor einer bakteriellen Infektion in Zellmodellen Zigarettenrauch ausgesetzt sein. Ein konventioneller Ansatz ist die Vorbereitung frischer CSE zur Behandlung von Zellen. Die Generierung von CSE ist eine kostengünstige Methode für Studien. CSE ist einfach zu handhaben, der Prozess der Herstellung von CSE ist einfach, und CSE intratracheal Injektion ist wirksam bei der Erzeugung von Emphysem in Tiermodellen in kurzer Zeit32. Ansätze zur direkten Zigarettenexposition wurden auch für In-vitro-Zellmodelle und in vivo Nagetiermodelle entwickelt. Sechs Monate tägliche Zigarettenrauchexposition gegenüber Mäusen wird häufig verwendet, um Emphysem33zu erzeugen. Die direkte Rauchexposition von Zigaretten erfordert komplizierte Geräte, die Zigarettenverbrennungs- und Zellkultursysteme kombinieren. Zigarettenverbrennung erzeugt Zigarettenrauch, erzeugt aber auch eine Menge Wärme, die die Temperatur und Feuchtigkeit der Kulturkammer beeinflussen kann. Glücklicherweise erleichtern die jüngsten Techniken die direkte Rauchexposition bei Zigaretten21. Ein ISO-Protokoll (International Organization for Standardization) wurde für direkte Zigarettenrauchexpositionsexperimente implementiert22. Die Exposition gegenüber dem Zigarettenrauch kann ein- oder mehrmals durchgeführt werden. Zusätzlich könnten neben dem Fortschritt der Zellkulturtechniken auch primäre Epithelzellen der Lunge auf transparenten Inserts angebaut werden, um eine konfluente Lungenepithelzellmonoschicht34zu erhalten. Lungenepithelzellmonolayer imitieren strukturell die physiologischen Bedingungen im Lungengewebe. Die Zellen können dann an der Luft-Flüssig-Schnittstelle35apikalgasen Rauch oder Luft ausgesetzt werden. Darüber hinaus ist die Kultur der Lungenorganoide in aktuellen Lungenstudien36,37entstanden. Es wird interessant sein zu wissen, wie Zigarettenrauch bakterielle Infektionen in Lungenorganoiden beeinflusst. Der beschriebene Ansatz kann menschliche Infektionen in Geweben anstelle von kultivierten Zellen imitieren und weitere Erkenntnisse in der unteren Atemwegs-Bakterieninfektion ermöglichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von einem National Institutes of Health R01 Zuschüsse HL125435 und HL142997 (zu CZ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F.
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M.
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
