Summary
Hier beschreven is een protocol om te bestuderen hoe sigarettenrook extract bacteriële kolonisatie in longepelliële cellen beïnvloedt.
Abstract
Het roken van sigaretten is de belangrijkste etiologische oorzaak voor longemfyseem en chronische obstructieve longziekte (COPD). Het roken van sigaretten bevordert ook de gevoeligheid voor bacteriële infecties in de luchtwegen. Echter, de effecten van het roken van sigaretten op bacteriële infecties in menselijke long epitheelcellen moeten nog grondig worden bestudeerd. Hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding van sigaretten roken extracten (CSE), behandeling van menselijke long epitheelcellen met CSE, en bacteriële infectie en infectie bepaling. CSE werd bereid met een conventionele methode. Longepeppitheelcellen werden behandeld met 4% CSE voor 3 h. CSE-behandelde cellen werden toen besmet met Pseudomonas bij een veelheid van infectie (MOI) van 10. Bacteriële belastingen van de cellen werden bepaald door drie verschillende methoden. De resultaten toonden aan dat CSE de pseudomonasbelasting in longepelleelcellen verhoogde. Dit protocol biedt daarom een eenvoudige en reproduceerbare aanpak om het effect van sigarettenrook op bacteriële infecties in longepeleliële cellen te bestuderen.
Introduction
Het roken van sigaretten beïnvloedt de volksgezondheid van miljoenen mensen wereldwijd. Veel schadelijke ziekten, waaronder longkanker en chronische obstructieve longziekte (COPD), worden gemeld te worden gerelateerd aan het roken van sigaretten1,2. Het roken van sigaretten verhoogt de gevoeligheid voor acute microbiële infecties in het ademhalingssysteem3,4,5. Bovendien blijkt uit toenemend bewijs dat het roken van sigaretten de pathogenese van veel chronische aandoeningen6,7,8versterkt . Bijvoorbeeld, het roken van sigaretten kan verhogen virale of bacteriële infecties die COPD verergering veroorzaken9. Onder de bacteriële pathogenen die etiologisch bijdragen aan acute verergering van COPD, een opportunistische gram-negatieve bacillus pathogene, Pseudomonas aeruginosa, veroorzaakt infecties die correleren met slechte prognoses en hogere sterftecijfers10,11. COPD-exacerbatie verergert de ziekte door de pathologische progressie te versnellen. Er zijn geen effectieve therapieën tegen COPD-exacerbatie, behalve voor het antisymptomatische beheer12. COPD-verergering bevordert de sterfte van patiënten, vermindert de kwaliteit van leven en verhoogt de economische lasten voor de samenleving13.
De luchtwegen luchtweg is een open systeem, voortdurend onderworpen aan verschillende microbiële pathogenen die extern aanwezig zijn. Opportunistische bacteriële pathogenen worden meestal gedetecteerd in de bovenste luchtwegen, maar soms worden waargenomen in de onderste luchtwegen14,15. In diermodellen kan P. aeruginosa worden gedetecteerd in alveololatorzakjes zodra 1 uur na infectie16. Als een belangrijk afweermechanisme, immuuncellen zoals macrofagen of neutrofielen elimineren de bacteriën in de luchtwegen. Longepeppitheelcellen, als de eerste fysiologische barrière, vervullen een unieke rol in de gastheerverdediging tegen microbiële infecties. Longepeppitheelcellen kunnen microbiële invasie, kolonisatie of replicatie reguleren onafhankelijk van immuuncellen17. Sommige moleculen gevonden in epitheliale cellen, waaronder PPARg, oefenen antibacteriële functies uit, waardoor bacteriële kolonisatie en replicatie in longepitheelcellen18reguleren. Het roken van sigaretten kan de moleculen veranderen en de normale afweerfunctie in longepitheelcellen19,20aantasten. Recente studies rapporteerden directe blootstelling van sigarettenrook aan longepepelleiële cellen met behulp van robotrookapparatuur21,22. Blootstelling aan rook kan echter op andere manieren worden uitgevoerd, waaronder de toepassing van CSE. Bereiding van CSE is een reproduceerbare benadering met mogelijke toepassingen in andere celtypen, waaronder vasculaire endotheelcellen die indirect worden blootgesteld aan sigarettenrook.
Dit rapport beschrijft een protocol om sigarettenrook extract te genereren om bacteriële belasting in longepelliële cellen te veranderen. CSE verhoogt de bacteriële belasting van P. aeruginosa, en het kan bijdragen aan de herhaling van bacteriële infecties meestal gezien in COPD verergering. Voor de bereiding van CSE wordt een conventionele methode gebruikt. Longepeppitheelcellen, in hun exponentiële groeistadium, worden behandeld met 4% CSE voor 3 uur. Als alternatief kunnen monolaag-gekweekte longepelleliale cellen direct worden blootgesteld aan sigarettenrook in een lucht-vloeibare interface. CSE-behandelde cellen worden vervolgens uitgedaagd met Pseudomonas bij een veelheid van infectie (MOI) van 10. De bacteriën worden gepropageerd met een bepaalde schudsnelheid om ervoor te zorgen dat de morfologie van hun flagella intact blijft om hun volledige invasieve capaciteit te behouden. Gentamycine wordt gebruikt om de bacteriën te doden die in het kweekmedium achterblijven, waardoor de potentiële besmetting tijdens de daaropvolgende bepaling van de bacteriële belasting wordt verminderd. Het protocol maakt ook gebruik van GFP-gelabelde Pseudomonas, die is gebruikt als een krachtig instrument bij het bestuderen van Pseudomonas infectie in verschillende modellen. Een representatieve stam is P. fluorescens Migula23. De mate van infectie of bacteriële belasting na de CSE-behandeling wordt op drie manieren bepaald: de druppelplaatmethode met kolonietelling, kwantitatieve PCR met Pseudomonas 16S rRNA-specifieke primers, of flow cytometrie in cellen die besmet zijn met fluorescerende Pseudomonas. Dit protocol is een eenvoudige en reproduceerbare benadering om het effect van sigarettenrook op bacteriële infecties in longepeleliële cellen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 100% CSE-preparaat
- Teken 10 mL serumvrije celkweekmedia (DMEM/F12 voor BEAS-2B-cellen; luchtwegepeelcelbasismedium voor HSAEC-cellen) in een spuit van 60 mL.
- Bevestig omgekeerd een op de juiste wijze bijgesneden pipetpunt van 1 mL aan het mondstuk van de spuit als adapter om de sigaret (3R4F) vast te houden.
- Verwijder het filter van de sigaret. Bevestig een sigaret aan de tipadapter en verbrand de sigaret.
- Trek 40 mL rookhoudende lucht in 10 mL serumvrije media. Meng de rook met het medium door krachtig te schudden (30 s per trekpleister).
- Herhaal stap 1.4 ongeveer 11x in ~ 7 min totdat de sigaret volledig is uitgebrand.
- Filter de 10 mL gerookte media met een 0,22 μm filter om micro-organismen en onoplosbare deeltjes uit te sluiten. Breng over op een gesloten steriele buis. Bereid de 100% CSE niet meer dan 30 min voor de volgende test.
2. Pseudomonas cultuur
- Inocula bevroren P. aeruginosa (stam PAO1) of P. fluorescens Migula (stam PAO143) in een Tryptic Sojabrouwsel (TSB) agarplaat voor nachtelijke cultuur bij 37 °C.
OPMERKING: Om voldoende bacteriën te verkrijgen voor het kweken, verspreid zoveel mogelijk bacteriën op de TSB agar plaat mogelijk. - Verzamel een bacterie-uitstrijkje en incubeer in 20 mL TSB met 5% van glycerol als koolstofbron.
- Schud de bacteriële suspensie in een couveuse van 37 °C bij 200 tpm gedurende 1 uur tot de OD600-waarde = 0,6.
LET OP: Laat de schudsnelheid niet hoger zijn dan 200 rpm. Hogere schudsnelheden kunnen de morfologie van de bacteriële flagella beschadigen en de bacteriële invasie in longepidia beïnvloeden. Evenzo, beperk de schudden tijd tot 1 uur om zeer invasieve bacteriën te verkrijgen. Meet de OD600-waarde om het aantal bacteriën te schatten. Een OD600 = 1 komt overeen met ~109 kolonievormende eenheden (CFU)/mL.
3. Menselijke longepeppitheelcelcultuur en CSE-behandeling
- Kweek menselijke BEAS-2B cellen in HITES medium (500 mL DMEM/F12, 2,5 mg insuline, 2,5 mg transferrine, 2,5 mg natriumseleniet, 2,5 mg transferrine, 10 μM hydrocortison, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES en 2 mM L-glutamine) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) zoals eerder beschreven24.
- Cultuur menselijke primaire kleine luchtweg epitheelcellen (HSAEC) in de luchtwegen epitheelcel cultuur medium (500 mL van Airway Cell Basal Medium, 500 μg/mL HSA, 0,6 μM linolzuur, 0,6 μg/mL lecithine, 6 mM L-glutamine, 0,4% extract P, 1,0 μM epinephrinum, 5 μg/mL transferrine, 10 nM T3, 1 μg/mL hydrocortison, rh EGF 5 ng/mL en 5 μg/mL rh insuline). Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO2.
- Dissociate de cellen met 1 mL van 0,25% trypsine gedurende 5 minuten totdat de cellen volledig loskomen van de onderkant van de plaat.
- Voeg 10 mL van het complete HITES-medium toe om trypsine te neutraliseren en de cellen te verzamelen in een buis van 15 mL. Centrifuge bij 4 °C bij 300 x g gedurende 5 minuten.
LET OP: Controleer zorgvuldig de tijd voor trypsinevertering door microscopie, omdat overdigestie celdood kan veroorzaken. - Gooi de supernatant weg en verhoog de cellen in 2 mL hites-medium met 10% FBS.
- Pipette 10 μL van de bovenstaande celopsuspensie op de plaat en plaats deze in een geautomatiseerde celteller om de concentratie in cellen/mL te verkrijgen.
- Plaat BEAS-2B cellen bij een concentratie van 3 ×10 5 cellen/mL in 6 putplaten in een totaal volume van 2 mL in HITES medium aangevuld met 10% van FBS voor nachtcultuur.
- Behandel de cellen op ongeveer 80% samenvloeiing, of 5 x 105 cellen/mL, met 4% CSE voor 3 h. Vóór de behandeling met CSE wijzigt u het medium met HITES-medium met 1% van FBS.
4. Bacteriële infectie
- Voeg P. aeruginosa of P. fluorescen Migula (~1 × 107 CFU/mL) toe aan elke put van de CSE-behandelde cellen en broed gedurende 1 uur bij 37 °C in 5% CO2.
- Aspirate de supernatants en vervang door 2 mL van verse HITES medium te behandelen met 4% CSE en 100 μg/mL gentamicine.
OPMERKING: Gentamicine wordt gebruikt omdat het niet in staat is om menselijke longepelleliale cellulaire membranen te penetreren. Zo kan het doden alle bacteriën in het medium, maar niet degenen die de long epitheelcellen binnengedrongen. - Na 1 uur CSE/gentamicine behandeling bij 37 °C in 5% CO2,de supernatants aanzuigen en de cellen 3x wassen met PBS voor de daaropvolgende bacteriële concentratie.
OPMERKING: Om de geïnternaliseerde bacteriën te bevestigen, werden cellen die besmet zijn met GFP-gelabelde P. fluorescens Migula waargenomen onder fluorescerende microscopie.
5. Bepaling van de bacteriële concentratie volgens de druppelplaatmethode
- Om bacteriële belasting in geïnfecteerde cellen te bepalen met de druppelplaatmethode, wast u de met gentamycine behandelde cellen 2x met 2 mL koude PBS.
- Voeg 1 mL cellysebuffer (0,5% triton X-100 in PBS) toe aan elke put.
- Verdun de celllysaten die de geïnternaliseerde bacteriën bevatten in een gradiënt (1:10, 1:100, 1:1.000 en 1:10.000) voor de volgende inenting op de TSB agarplaat.
- Na 16 uur incubatie, verkrijg de resultaten van CFU door het tellen van de bacteriële kolonies.
6. RT-qPCR detectie van bacteriële 16S rRNA
- Behandel de pseudomonasgeïnfecteerde longepelleliale cellen (~ 1 x 106 cellen /mL) met gentamycine zoals hierboven beschreven. Spoel het medium aan en was de cellen 2x met 2 mL koude PBS.
- Voeg 0,35 mL van de guanidium thiocyanaat buffer per put van een 6 goed plaat. Verzamel de cellen met een celschraper. Pipette het lysaat in een microcentrifuge buis en meng zachtjes met de pipet.
- Voeg hetzelfde volume (0,35 mL) vers bereide 70% ethanol toe aan het lysaat en meng goed. Breng alle monsters over naar een spinkolom die in een 2 mL-opvangbuis is geplaatst. Centrifuge bij 10.000 x g voor 30 s bij 20-25 °C. Gooi vervolgens de buffer in de opvangbuis weg.
- Was de kolom met 0,7 mL wasbuffer 1. Centrifuge de kolom op 10.000 x g voor 30 s. Was de kolom 2x met 0,5 mL buffer om het membraangebonden RNA te wassen. Herhaal de centrifugatie op 10.000 x g gedurende 2 minuten.
- Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 mL-opvangbuis. Voeg 30–50 μL RNase-vrij water toe. Centrifuge op 10.000 x g gedurende 1 min. Verzamel de doorstroom en meet de RNA-concentratie.
- Voer een omgekeerde transcriptiereactie uit volgens het protocol van de fabrikant. Meng 1 μg totaal RNA met 10 mL reactiebuffer, 1 μL omgekeerde transcriptase en RNase-vrij water voor een reactie van 20 μL. Voer de omgekeerde transcriptiereactie uit bij 37 °C gedurende 1 uur en vervolgens 95 °C gedurende 5 minuten.
- Meng de cDNA-sjablonen (1 μL van elke omgekeerde transcriptiereactie hierboven), 5 μL van de Master Mix met SYBR-kleurstof, 1 μL van elke 200 nM-specifieke primers en water in een mengsel van 20 μL voor de volgende PCR-analyse, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
OPMERKING: De volgende zijn de primers gericht op de 16S rRNA van P. aeruginosa: forward 5′-CAAAACTGAGCAGAGTACG-3′; reverse 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH werd gebruikt als een lading controle met de volgende primers: vooruit: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; achteruit: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′. - Gebruik de vergelijkende CT-methode om de expressie te bepalen.
7. Detectie van fluorescerende Pseudomonas met stroomcytometrie
- Behandel de bovenstaande fluorescerende Pseudomonas-geïnfecteerdelongepelleëlcellen (~ 1 x 106 cellen/mL) met gentamycine zoals eerder beschreven. Spoel het medium aan en was de cellen 2x met 2 mL koude PBS.
- Analyseer de monsters met een stroomcytometer op een golflengte van 509 nm voor de detectie van GFP. Beëindig elke lezing op 100.000 tellingen. Analyseer de verkregen gegevens met gerelateerde software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een diagram wordt gebruikt om het protocol in figuur 1te illustreren. Longepitheel BEAS-2B cellen werden behandeld met CSE en uitgedaagd met Pseudomonas. Pseudomonas in het kweekmedium werden gedood door de toegevoegde gentamycine en de cellen werden onderworpen aan de drop plate assay, RT-qPCR detectie van Pseudomonas ribos ribos RNA, en flow cytometrie. In vergelijking met de controle heeft de behandeling met CSE de bacteriële infectie in de druppelplaatmethoden aanzienlijk verhoogd(figuur 2). Overeenkomstige invloed heeft CSE op bacteriële belasting in HSAEC(figuur 3). De levensvatbaarheid van de cel veranderde niet aanzienlijk na 3 uur van 4% CSE-behandeling, in 1 uur van Pseudomonas-infectie of in 1 uur van gentamycinebehandeling (figuur 4 figuur 5 figuur 6). De 16S rRNA-target RT-qPCR-methode (figuur 7) en flow cytometrie (figuur 8) vertoonden vergelijkbare resultaten. Resultaten van fluorescerende microscopie bleek dat GFP-gelabelde bacteriën colocalized met BEAS-2B cellen in een P. fluorescens Migula infectie experiment (Figuur 9). Deze resultaten suggereren dat het roken van sigaretten verhoogde Pseudomonas belasting in BEAS-2B cellen.
Figuur 1: Schematische presentatie van het protocol om de effecten van sigarettenrook op Pseudomonas-infectie in longepelelische cellen te bestuderen. Longepepepelial cellen gekweekt in celcultuur inserts of conventionele cultuur platen of longorganoïden werden blootgesteld aan sigarettenrook voor 16 min via roken robot of behandeld met voorbereid 4% CSE voor 3 uur. Deze cellen werden vervolgens besmet met P. aeruginosa gedurende 1 h (MOI = 10). Gentamycine werd gebruikt om levende Pseudomonas in het cultuurmiddel te elimineren. De bovenstaande cellen waren onderworpen aan de drop plate methode, qRT-PCR, of flow cytometrie benaderingen om de bacteriële belasting te bepalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Drop plate methode om bacteriële belasting in longepitheelBEAS-2B cellen te bepalen. BEAS-2B cellen werden behandeld met 4% CSE voor 3 uur. Cellen werden vervolgens onderworpen aan P. aeruginosa (stam PAO1) infectie voor 1 uur, gevolgd door gentamycine behandeling voor nog eens 1 uur. De cellen werden gelysed en de cellysates werden verdund om TSB platen voor 16 h te inenten. Kolonies werden geteld; de CFU-nummers worden geïllustreerd in het perceel. Grafiek toont gemiddelde ± SD en "*" geeft P < 0,05 aan. De resultaten zijn representatief voor n = 3 experimenten. Twee-weg ongepaard Student t-testwerd gebruikt voor rook-behandelde en onbehandelde groepen. P < 0,05 geeft statistische significantie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Drop plate methode om bacteriële belasting in HSAEC cellen te bepalen. Menselijke primaire kleine luchtweg epitheelcellen werden behandeld met 4% CSE voor 3 h. Cellen werden vervolgens onderworpen aan P. aeruginosa (stam PAO1) infectie voor 1 uur, gevolgd door gentamycine behandeling voor nog eens 1 uur. De cellen werden lysed en de cellysates werden verdund om op TSB platen voor 16 h te inenten. Kolonies werden geteld; de CFU-nummers worden geïllustreerd in het perceel. Grafiek toont gemiddelde ± SD en "*" geeft P < 0,05 aan. De resultaten zijn representatief voor n = 3 experimenten. Twee-weg ongepaard Student t-testwerd gebruikt voor rook-behandelde en onbehandelde groepen. P < 0,05 geeft statistische significantie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Bepaling van de celrevolzaamheid in met CSE behandelde longepelleeliële BEAS-2B-cellen. Longepepepitheel BEAS-2B cellen werden behandeld met 4% CSE voor 3 uur. Cellen werden gekleurd met trypan blauw en de levensvatbaarheid van de cel werd gemeten met celteller. Grafiek toont gemiddelde ± SD. Resultaten zijn representatief voor n = 3 experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Bepaling van de levensvatbaarheid van cellen in pseudomonas-geïnfecteerdelongepeleliële BEAS-2B cellen. Longepepepitheel BEAS-2B cellen werden besmet met P. aeruginosa (MOI = 10) gedurende 1 uur. Cellen werden gekleurd met trypan blauw en de levensvatbaarheid van de cel werd gemeten met een cel teller. Grafiek toont gemiddelde ± SD. Resultaten zijn representatief voor n = 3 experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Bepaling van de celre levensvatbaarheid in met gentamycine behandelde longepelleeliële BEAS-2B cellen. Longepeppitheel BEAS-2B cellen werden behandeld met 100 μg/mL gentamycine gedurende 1 uur. Cellen werden gekleurd met trypan blauw en de levensvatbaarheid van de cel werd gemeten met een cel teller. Grafiek toont gemiddelde ± SD. Resultaten zijn representatief voor n = 3 experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: qRT-PCR om bacteriële belasting in longepelleelcellen te bepalen. Behandelde cellen in figuur 2 werden onderworpen aan de totale RNA-extractie. Een gelijkwaardige hoeveelheid RNA van elk monster werd omgekeerd getranscribeerd in cDNA, en de hoeveelheid 16S RNA van P. aeruginosa werd bepaald met kwantitatieve PCR met behulp van specifieke primerpars. Resultaten van qPCR worden uitgezet in de grafiek. Grafiek toont gemiddelde ± SD en "*" geeft P < 0,05 aan. De resultaten zijn representatief voor n = 3 experimenten. Twee-weg ongepaard Student t-testwerd gebruikt voor rook-behandelde en onbehandelde groepen. P < 0,05 geeft statistische significantie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Flow cytometrie om bacteriële belasting in longepelleelcellen te bepalen. BEAS-2B cellen werden behandeld met CSE en geïnfecteerd met P. fluorescens Migula (stam PAO143). Geïnfecteerde cellen werden behandeld met gentamycine en verteerd met trypsine om een celsuspensie te maken. Celsuspensies werden doorgegeven door de stroomcytometer en fluorescerende Pseudomonas-positievecellen werden bepaald op een golflengte van 509 nm. Resultaten van flow cytometrie worden uitgezet in de grafiek. Grafiek toont gemiddelde ± SD en "*" geeft P < 0,05 aan. De resultaten zijn representatief voor n = 3 experimenten. Twee-weg ongepaard Student t-testwerd gebruikt voor rook behandeld en onbehandelde groepen. P < 0,05 geeft statistische significantie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Observatie van bacteriële infectie met fluorescerende microscopie. BEAS-2B cellen werden besmet met P. fluorescens Migula (stam PAO143) gedurende 1 uur. De cellen werden behandeld met gentamycine voor nog eens 1 uur en gewassen 2x met koude PBS. De GFP-gelabelde bacteriën werden waargenomen onder een fluorescerende microscoop op een golflengte van 480 nm en BEAS-2B cellen werden gevisualiseerd met een fasebeeld. De beelden zijn samengevoegd en het representatieve resultaat wordt weergegeven. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacteriële invasie in longepelleiële cellen is een cruciale stap in de pathogenese van bacteriële infecties. Het proces van bacteriële invasie in de cellen kan worden opgesplitst in de volgende drie stappen: Ten eerste, de bacteriën contact en hechten zich aan het oppervlak van de epitheelcel met behulp van hun flagella. Ten tweede ondergaan de bacteriën ofwel internalisatie of dringen het cellulaire membraan binnen. Ten slotte repliceren en koloniseren de bacteriën de cellen als ze met succes ontsnappen aan cellulaire afweermechanismen25,26. Benaderingen voor de observatie van bacteriële infecties in longmicrofagen zijn al lang ontwikkeld, maar met beperkte kennis van longepepitheelcellen27,28. Deze studie bepaalde bacteriële belasting in de longeppitheelcellen via drie benaderingen: een druppelplaattest, RT-qPCR voor Pseudomonas ribos ribos 16S RNA en flow cytometrie. Alle drie de benaderingen werken goed met vergelijkbare gevoeligheden. Het kiezen van de benaderingen om bacteriële belasting in longepelleiële cellen te bepalen, hangt af van de beschikbaarheid van apparatuur en tijd. In deze experimenten, het houden van de bacteriële flagella onbeschadigd en intact is cruciaal voor een succesvolle long epitheelcel infectie29. Een kortere schudtijd met beperkte snelheid kan helpen om bacteriële binnenvallende capaciteit verder te bevorderen30.
Een belangrijk obstakel bij de bepaling van de bacteriële concentratie in longepitheelcellen is de bacteriële besmetting van het kweekmedium. In celinfectie experimenten, de bacteriën worden toegevoegd aan de cultuur medium voor een bepaalde periode (dat wil zeggen, 1 uur). Binnen die tijd dringt een deel van die bacteriële belasting met succes het cytoplasmatische compartiment binnen, maar residuen kunnen zich hechten aan het buitenste membraan van de cellen. Een antibioticum, gentamycine, wordt gebruikt om de bacteriën te doden in het kweekmedium en de residuen die aan het buitenste membraan van de cellen31. Gentamycine wordt beschouwd als niet doorlatend voor het cellulaire membraan en zal dus geen invloed hebben op de bacteriën die al in de cellen. Behandeling met gentamycine maakt het ideaal voor dit systeem om de mogelijke besmetting van buiten de geïnfecteerde longepelliële cellen uit te sluiten.
Om de effecten van sigarettenrook op bacteriële infectie in longepeliële cellen te bestuderen, moeten longcellen worden blootgesteld aan sigarettenrook voorafgaand aan bacteriële infectie in cellulaire modellen. Een conventionele aanpak is het voorbereiden van verse CSE om cellen te behandelen. Het genereren van CSE is een kosteneffectieve methode voor studies. CSE is gemakkelijk te hanteren, het proces van het maken van CSE is eenvoudig, en CSE intratracheale injectie is effectief in het genereren van emfyseem in diermodellen in een korte periode32. Benaderingen van directe blootstelling aan sigaretten zijn ook ontwikkeld voor zowel in vitro cellulaire modellen en in vivo knaagdiermodellen. Zes maanden van dagelijkse blootstelling aan sigarettenrook aan muizen wordt veel gebruikt om emfyseem te genereren33. Directe blootstelling aan sigarettenrook vereist ingewikkelde apparatuur die het verbranden van sigaretten en celkweeksystemen combineert. Het verbranden van sigaretten sigaretten produceert sigarettenrook, maar genereert ook een hoeveelheid warmte die de temperatuur en vochtigheid van de kweekkamer kan beïnvloeden. Gelukkig, recente technieken maken directe sigaret rook blootstelling gemakkelijker21. Een Internationale Organisatie voor Normalisatie (ISO) protocol is geïmplementeerd voor directe sigaret rook blootstelling experimenten22. Blootstelling aan de sigarettenrook kan één of meerdere keren worden uitgevoerd. Bovendien, samen met de vooruitgang van celkweektechnieken, long primaire epitheelcellen kunnen ook worden gekweekt op transparante inserts om een confluente long epitheelcel monolayer34te verkrijgen . Longepeppitheelcelmonolagen bootsen structureel de fysiologische omstandigheden in longweefsels na. Cellen kunnen dan worden blootgesteld aan apicale gasvormige rook of lucht op de lucht-vloeistof interface35. Bovendien is de cultuur van longorganoïden ontstaan in de huidige longstudies36,37. Het zal interessant zijn om te weten hoe sigarettenrook bacteriële infectie in longorganoïden beïnvloedt. De beschreven aanpak kan menselijke infectie nabootsen in weefsels in plaats van gekweekte cellen en kan verdere inzichten in lagere luchtwegbacteriële infectie mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een National Institutes of Health R01 subsidies HL125435 en HL142997 (aan CZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
