Summary
Beskrivs här är ett protokoll för att studera hur cigarettrök extrakt påverkar bakteriell kolonisering i lungepitelceller.
Abstract
Cigarettrökning är den stora etiologiska orsaken till lungemfysem och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). Cigarettrökning främjar också mottaglighet för bakteriella infektioner i andningsorganen. Emellertid, effekterna av cigarettrökning på bakteriella infektioner i mänskliga lungepitelceller har ännu inte studerats grundligt. Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för beredning av cigarettrökning extrakt (CSE), behandling av mänskliga lungepitetelceller med CSE, och bakteriell infektion och infektion bestämning. CSE utarbetades med en konventionell metod. Lung epitelial celler behandlades med 4% CSE för 3 h. CSE-behandlade celler var, då, infekterade med Pseudomonas vid en multiplicity av infektion (MOI) av 10. Bakteriebelastningar av cellerna bestämdes genom tre olika metoder. Resultaten visade att CSE ökade Pseudomonas belastning i lung epitelceller. Detta protokoll, ger därför en enkel och reproducerbar strategi för att studera effekten av cigarettrök på bakteriella infektioner i lungepitelceller.
Introduction
Cigarettrökning påverkar folkhälsan för miljontals människor världen över. Många skadliga sjukdomar, inklusive lungcancer och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), rapporteras vara relaterade till cigarettrökning1,2. Cigarettrökning ökar mottagligheten för akuta mikrobiella infektioner i andningsorganen3,4,5. Dessutom visar montering bevis att cigarettrökning förstärker patogenesen vid många kroniska sjukdomar6,7,8. Till exempel kan cigarettrökning öka virus- eller bakterieinfektioner som orsakar KOL-exacerbation9. Bland de bakteriella patogener som etiologiskt bidrar till akut förvärring av KOL, en opportunistisk gramnegativ bacilluspatogen, Pseudomonas aeruginosa, orsakar infektioner som korrelerar med dåliga prognoser och högre mortalitet10,11. KOL-exacerbation förvärrar sjukdomen genom att påskynda patologisk progression. Det finns inga effektiva terapier mot KOL-exacerbation förutom den antisymtomatiska förvaltningen12. KOL-exacerbation främjar patientdödlighet, minskar livskvaliteten, och ökar den ekonomiska bördan för samhället13.
Luftvägarna luftvägarna är ett öppet system, kontinuerligt utsätts för olika mikrobiella patogener närvarande externt. Opportunistiska bakteriella patogener detekteras vanligtvis i de övre luftvägarna men ibland observeras i de nedreluftvägarna 14,15. I djurmodeller P. aeruginosa kan detekteras i alveolar säckar så snart 1 h efter infektion16. Som en stor försvarsmekanism eliminerar immunceller som makrofager eller neutrofiler bakterierna i luftvägarna. Lungepitelceller, som den första fysiologiska barriären, utför en unik roll i värdförsvaret mot mikrobiella infektioner. Lungepitelceller kan reglera mikrobiell invasion, kolonisering eller replikation oberoende av immunceller17. Vissa molekyler som finns i epitelceller, inklusive PPARg, utövar antibakteriella funktioner och reglerar därigenom bakteriekoloniisering och replikation i lungepitelceller18. Cigarettrökning kan förändra molekylerna och försämra normal försvarsfunktion i lungepitelceller19,20. Nyligen genomförda studier rapporterade direkt exponering av cigarettrök till lungepitelceller med hjälp av robot rökningapparat 21,22. Exponering för rök kan utföras på andra sätt, dock, inklusive tillämpning av CSE. Beredning av CSE är ett reproducerbart tillvägagångssätt med potentiella tillämpningar i andra celltyper, inklusive vaskulära endotelceller som indirekt utsätts för cigarettrök.
Denna rapport beskriver ett protokoll för att generera cigarettrök extrakt för att ändra bakteriell belastning i lungeptelceller. CSE ökar bakteriebelastningen av P. aeruginosa, och det kan bidra till att bakterieinfektioner som vanligtvis ses vid KOL-exacerbation återkommer. En konventionell metod används för beredning av CSE. Lungepitelceller, vid deras exponentiella tillväxtstadium, behandlas med 4% CSE för 3 h. Alternativt kan monoskikt-odlade lungepitelceller direkt exponeras för cigarettrök i ett luftflytande gränssnitt. CSE-behandlade celler utmanas sedan med Pseudomonas vid en multiplicity av infektion (MOI) av 10. Bakterierna sprids med en viss skakningshastighet för att säkerställa morfologi av deras flagella förblir intakt för att behålla sin fulla invasiva kapacitet. Gentamycin används för att döda de bakterier som finns kvar i odlingsmediet och minskar därmed den potentiella kontamineringen under den efterföljande bestämningen av bakteriebelastningen. Protokollet använder också GFP-märkt Pseudomonas, som har utnyttjats som ett kraftfullt verktyg för att studera Pseudomonas infektion i olika modeller. En representativ stam är P. fluorescens Migula23. Graden av infektion eller bakteriell belastning efter CSE-behandling bestäms på tre sätt: metoden drop plate med koloniräkning, kvantitativ PCR med hjälp av Pseudomonas 16S rRNA-specifika primers, eller flödescytometri i celler infekterade med fluorescerande Pseudomonas. Detta protokoll är en enkel och reproducerbar metod för att studera effekten av cigarettrök på bakteriella infektioner i lungepitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 100% CSE förberedelse
- Rita 10 mL serumfritt cellodlingsmedi (DMEM/F12 för BEAS-2B-celler; luftvägsepitetelcellsbasalt medium för HSAEC-celler) till en 60 mL-spruta.
- Sätt omvänt fast en lämpligt trimmad 1 mL pipettspets på munstycket på sprutan som en adapter för att hålla i cigaretten (3R4F).
- Ta bort cigarettens filter. Fäst en cigarett på spetsadaptorn och förbränna cigaretten.
- Rita 40 mL rökhaltig luft i 10 mL serumfria medier. Blanda röken med mediet genom att kraftigt skaka (30 s per drag).
- Upprepa steg 1,4 ca 11x i ~ 7 min tills cigaretten är helt utbränd.
- Filtrera 10 mL rökt media med ett 0,22 μm filter för att utesluta eventuella mikroorganismer och olösliga partiklar. Överför till ett slutet sterilt rör. Förbered 100% CSE inte mer än 30 min före den efterföljande analysen.
2. Pseudomonas kultur
- Inokulera fryst P. aeruginosa (stam PAO1) eller P. fluorescens Migula (stam PAO143) i en Tryptisk Soy Broth (TSB) agarplatta för övernattningskultur vid 37 °C.
OBS: För att få tillräckligt med bakterier för odling, sprida så mycket bakterier på TSB agar plattan som möjligt. - Samla ett bakteriet utstryk och inkubera i 20 mL TSB med 5% av glycerol som kolkälla.
- Skaka bakterieupphängningen i en 37 °C-inkubator vid 200 rpm i 1 h tills OD600-värdet = 0,6.
FÖRSIKTIGHET: Låt inte skakhastigheten överstiga 200 varv/min. Högre skakning hastigheter kan skada morfologi av bakteriell flagella och påverkar bakteriell invasionen i lungepedelia. Likaså begränsa skakningstiden till 1 h för att få mycket invasiva bakterier. Mät OD600-värdet för att uppskatta antalet bakterier. En OD600 = 1 motsvarar ~109 kolonibildande enheter (CFU)/mL.
3. Human lungepitelcellodling och CSE-behandling
- Kultur mänskliga BEAS-2B-celler i HITES-medium (500 mL DMEM/F12, 2,5 mg insulin, 2,5 mg transferrin, 2,5 mg natriumsenite, 2,5 mg transferrin, 10 μM hydrokortison, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES och 2 mM L-glutamin) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) som tidigarebeskrivits 24.
- Kultur humana primära små luftvägarna epitelceller (HSAEC) i luftvägarna epitelial cell odling medium (500 mL av Airway Cell Basal Medium, 500 μg/mL HSA, 0,6 μM linolsyra, 0,6 μg/mL lecitin, 6 mM L-glutamin, 0,4% extrakt P, 1,0 μM adrenalin, 5 μg/mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL hydrokortison, rh EGF 5 ng/mL och 5 μg/mL rh insulin). Inkubera cellerna vid 37 °C i 5 % CO2.
- Dissociate cellerna med 1 mL av 0.25% trypsin för 5 min tills cellerna helt lösgöra från botten av plattan.
- Lägg till 10 mL av komplett HITES-medium för att neutralisera trypsin och samla in cellerna i ett 15 mL-rör. Centrifugera vid 4 °C vid 300 x g i 5 min.
FÖRSIKTIGHET: Övervaka noga tiden för trypsin-matsmältning genom mikroskopi, eftersom översmältning kan orsaka celldöd. - Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 2 mL av HITES-medium med 10% FBS.
- Pipetter 10 μL av ovanstående cellupphängning på plattan och för in den i en automatiserad cellräknare för att erhålla koncentrationen i celler/mL.
- Plate BEAS-2B celler i en koncentration av 3 × 105 celler/mL i 6 brunnsplattor i en total volym av 2 mL i HITES-medium kompletterat med 10% av FBS för övernattningskultur.
- Behandla cellerna vid ungefär 80% konfluency, eller 5 x 105 celler/mL, med 4% CSE för 3 h. Innan CSE-behandling, byt medium med HITES-medium med 1% av FBS.
4. Bakteriell infektion
- Lägg P. aeruginosa eller P. fluorescens Migula (~1 × 107 CFU/mL) till varje brunn av de CSE-behandlade cellerna och inkubera i 1 h vid 37 °C i 5 % CO2.
- Aspirera supernatanterna och ersätt med 2 mL färskt HITES-medium för att behandla med 4% CSE och 100 μg/mL gentamicin.
OBS: Gentamicin används eftersom det inte kan tränga in i mänskliga lungepitelcellulära membran. Således kan det döda alla bakterier i mediet men inte de som invaderade lungepitelcellerna. - Efter 1 h cse/gentamicinbehandling vid 37 °C i 5% CO2, aspirera supernatanterna och tvätta cellerna 3x med PBS för den påföljande bakteriekoncentrationsbestämningen.
OBS: För att bekräfta de internaliserade bakterierna observerades celler infekterade med GFP-märkt P. fluorescens Migula under fluorescerande mikroskopi.
5. Bestämning av bakteriekoncentration med hjälp av droppplattans metod
- För att bestämma bakteriebelastning i infekterade celler med droppplattan metoden, tvätta gentamycin-behandlade cellerna 2x med 2 mL kall PBS.
- Lägg till 1 mL celllysbuffert (0,5 % triton X-100 i PBS) till varje brunn.
- Späd cellen lysates innehållande de internaliserade bakterierna i en gradient (1:10, 1:100, 1:1,000, och 1:10,000) för följande inokulering till TSB agar plattan.
- Efter 16 h inkubation, erhåll resultaten av CFU genom att räkna bakteriekolonierna.
6. RT-qPCR detektion av bakteriell 16S rRNA
- Behandla Pseudomonas-infekteradelungepitelceller (~1 x 106 celler/mL) med gentamycin enligt beskrivningen ovan. Aspirera mediet och tvätta cellerna 2x med 2 mL kallt PBS.
- Tillsätt 0,35 mL av guanidiumtiocyanat-lysbufferten per brunn av en 6 brunnsplatta. Samla in cellerna med en cellskrapa. Pipettera lysate till ett mikrocentrifugrör och blanda försiktigt med pipetten.
- Tillsätt samma volym (0,35 mL) nyberedd 70% etanol i lysate och blanda väl. Överför alla prover till en spinnkolonn som placeras i ett 2 mL uppsamlingsrör. Centrifugera vid 10 000 x g i 30 s vid 20–25 °C. Sedan, kasta bufferten i insamlingsröret.
- Tvätta kolonnen med 0,7 mL tvättbuffert 1. Centrifugera kolonnen vid 10 000 x g i 30 s. Tvätta kolonnen 2x med 0,5 mL buffert för att tvätta det membranbundna RNA. Upprepa centrifugeringen vid 10 000 x g i 2 min.
- Placera kolonnen i ett nytt 1,5 mL uppsamlingsrör. Tillsätt 30–50 μL RNasefritt vatten. Centrifugera vid 10 000 x g i 1 min. Samla in genomströmningen och mät RNA-koncentrationen.
- Utför en omvänd transkriptionsreaktion enligt tillverkarens protokoll. Blanda 1 μg av totalt RNA med 10 mL reaktionsbuffert, 1 μL bakåt transkriptas och RNase-fritt vatten för en 20 μL-reaktion. Genomför den omvända transkriptionsreaktionen vid 37 °C i 1 h och därefter 95 °C i 5 min.
- Blanda ihop cDNA-mallarna (1 μL av varje omvänd transkriptionsreaktion ovan), 5 μL av Master Mix som innehåller SYBR-färgämne, 1 μL av varje 200 nM specifika grundfärger och vatten i en 20 μL-blandning för följande PCR-analys, enligt tillverkarens rekommendationer.
OBS: Följande är de primers inriktning 16S rRNA av P. aeruginosa: framåt 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3′; omvänd 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH användes som en lastning kontroll med följande primers: framåt: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; omvänd: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′. - Använd jämförande CT-metoden för att bestämma uttrycket.
7. Detektion av fluorescerande Pseudomonas med flödescytometri
- Behandla ovanstående fluorescerande Pseudomonas-infekterade lungepitelceller (~1 x 106 celler/mL) med gentamycin som tidigare beskrivits. Aspirera mediet och tvätta cellerna 2x med 2 mL kallt PBS.
- Analysera proverna med en flödescytometer vid en våglängd på 509 nm för detektion av GFP. Avsluta varje läst på 100.000 räkningar. Analysera de förvärvade uppgifterna med tillhörande programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett diagram används för att illustrera protokollet i bild 1. Lungepitetelcellerna BEAS-2B behandlades med CSE och utmanades med Pseudomonas. Pseudomonas i odlingsmediet dödades av den tillsatta gentamycin och cellerna utsattes för droppplattan analys, RT-qPCR upptäckt av Pseudomonas ribosome 16S RNA och flöde cytometry. Jämfört med kontroll ökade CSE-behandlingen väsentligt bakteriell infektion i drop plate-metoder (Figur 2). Motsvarande, CSE påverkas bakteriebelastning i HSAEC (Bild 3). Cellens livskraft ändrades inte avsevärt efter 3 h av 4% CSE-behandling, i 1 h av Pseudomonas-infektion, eller i 1 h gentamycinbehandling (Figur 4 Figur 5 Figur 6). 16S rRNA-target RT-qPCR-metoden (Figur 7) och flödescytometri (figur 8) visade liknande resultat. Resultat från fluorescerande mikroskopi visade att GFP-märkta bakterier colocalized med BEAS-2B celler i en P. fluorescens Migula infektion experiment (Figur 9). Dessa resultat tyder på att cigarettrökning ökade Pseudomonas belastning i BEAS-2B celler.
Figur 1: Schematisk presentation av protokollet för att studera cigarettrök effekter på Pseudomonas infektion i lungepitelceller. Lung epitelceller som odlas i cellodling infogar eller konventionella kultur plattor eller lung organoider utsattes för cigarettrök i 16 min via rökning robot eller behandlas med beredda 4% CSE för 3 h. Dessa celler var sedan infekterade med P. aeruginosa för 1 h (MOI = 10). Gentamycin användes för att eliminera levande Pseudomonas i odlingsmediet. Ovanstående celler var föremål för metoden drop plate, qRT-PCR, eller flöde cytometri metoder för att bestämma den bakteriella belastningen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Droppplatta metod för att bestämma bakteriell belastning i lungepitel- BEAS-2B-celler. BEAS-2B celler behandlades med 4% CSE för 3 h. Celler utsattes sedan för P. aeruginosa (stam PAO1) infektion för 1 h följt av gentamycin behandling för ytterligare 1 h. Celler var lysed och cellen lysates späddes ut för att inokulera TSB plattor för 16 h. Kolonier räknades; CFU-numren illustreras i handlingen. Graf visar medelvärde ± SD och "*" betecknar P < 0,05. Resultat är representativa för n = 3 experiment. Tvåvägs unpaired Student t-test användes för rökbehandlade och obehandlade grupper. P < 0,05 anger statistisk signifikans. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Droppplatta metod för att bestämma bakteriell belastning i HSAEC-celler. Mänskliga primära små luftvägarna epitelial celler behandlades med 4% CSE för 3 h. Celler utsattes sedan för P. aeruginosa (stam PAO1) infektion för 1 h följt av gentamycin behandling för ytterligare 1 h. Cellerna var lysed och cellen lysates späddes för att inokulera på TSB plattor för 16 h. Kolonier räknades; CFU-numren illustreras i handlingen. Graf visar medelvärde ± SD och "*" betecknar P < 0,05. Resultat är representativa för n = 3 experiment. Tvåvägs unpaired Student t-test användes för rökbehandlade och obehandlade grupper. P < 0,05 anger statistisk signifikans. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Bestämning av cellernas bärkraft i CSE-behandlade lungepitelceller BEAS-2B. Lung epitelial BEAS-2B celler behandlades med 4% CSE för 3 h. Celler var färgas med trypan blå och cellens livskraft mättes med cellräknare. Graf visar medelvärde ± SD. Resultaten är representativa för n = 3 experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Bestämning av cellernas livskraft i Pseudomonas-infekterade lungepitelceller BEAS-2B. Lung epitelial BEAS-2B celler var infekterade med P. aeruginosa (MOI = 10) för 1 h. Celler var färgas med trypan blå och cellen livskraft mättes med en cellräknare. Graf visar medelvärde ± SD. Resultaten är representativa för n = 3 experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Bestämning av cellernas livskraft i gentamycinbehandlade lungepitelceller BEAS-2B. Lung epitelial BEAS-2B celler behandlades med 100 μg/mL gentamycin för 1 h. Celler var färgas med trypan blå och cellen livskraft mättes med en cellräknare. Graf visar medelvärde ± SD. Resultaten är representativa för n = 3 experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 7: qRT-PCR för att bestämma bakteriebelastning i lungepitelceller. Behandlade celler i figur 2 utsattes för total RNA-extraktion. En motsvarande mängd RNA från varje prov var omvänd transkriberas till cDNA, och mängden 16S RNA av P. aeruginosa bestämdes med kvantitativa PCR med hjälp av specifika primer par. Resultat från qPCR ritas i grafen. Graf visar medelvärde ± SD och "*" betecknar P < 0,05. Resultat är representativa för n = 3 experiment. Tvåvägs unpaired Student t-test användes för rökbehandlade och obehandlade grupper. P < 0,05 anger statistisk signifikans. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 8: Flödescytometri för att bestämma bakteriebelastning i lungepitelceller. BEAS-2B celler behandlades med CSE och infekterade med P. fluorescens Migula (stam PAO143). Infekterade celler behandlades med gentamycin och smält med trypsin att göra en cell suspension. Cell suspensioner passerades genom flöde cytometer och fluorescerande Pseudomonas-positiva celler fastställdes vid en våglängd av 509 nm. Resultat från flödescytometri plottas i grafen. Graf visar medelvärde ± SD och "*" betecknar P < 0,05. Resultat är representativa för n = 3 experiment. Tvåvägs unpaired Student t-test användes för rökbehandlade och obehandlade grupper. P < 0,05 anger statistisk signifikans. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 9: Observation av bakterieinfektion med fluorescerande mikroskopi. BEAS-2B celler var infekterade med P. fluorescens Migula (stam PAO143) för 1 h. Cellerna behandlades med gentamycin i ytterligare 1 h och tvättas 2x med kalla PBS. De GFP-märkta bakterierna observerades under ett fluorescerande mikroskop vid en våglängd på 480 nm och BEAS-2B celler visualiserades med en fas bild. Bilderna slogs samman, och det representativa resultatet visas. Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriell invasion i lungepitelceller är ett avgörande steg i patogenesen vid bakteriella infektioner. Processen för bakteriell invasion i cellerna kan brytas ner i följande tre steg: För det första, bakterierna kontakt och hålla sig till ytan av epitelcellen med hjälp av sin flagella. För det andra, bakterierna genomgår antingen internalisering eller penetrera cellmembranet. Slutligen, bakterierna replikera och kolonisera cellerna om de lyckas fly cellulära försvarsmekanismer25,26. Tillvägagångssätt för observation av bakteriella infektioner i lungmikrofager har länge utvecklats men med begränsad kunskap om lungepitelceller27,28. Denna studie bestämde bakteriebelastning i lungepitelcellerna via tre tillvägagångssätt: en droppplatta assay, RT-qPCR för Pseudomonas ribosome 16S RNA, och flödescytometri. Alla tre tillvägagångssätt fungerar bra med liknande känslighet. Att välja de metoder för att bestämma bakteriell belastning i lungepitelceller beror på tillgången på utrustning och tid. I dessa experiment, att hålla den bakteriella flagella oskadad och intakt är avgörande för framgångsrik lungepitelcellinfektion29. En kortare skakningstid med begränsad hastighet kan bidra till att ytterligare främja bakteriell invaderande kapacitet30.
Ett stort hinder vid bestämning av bakteriekoncentrationen i lungepitelceller är bakteriekontaminering från odlingsmediet. I cellinfektionsexperiment tillsätts bakterierna i odlingsmediet under en specifik tidsperiod (dvs. 1 h). Inom den tiden, en del av denna bakteriebelastning framgångsrikt invaderar cytoplasmat fack, men rester kan fästa på den yttre membran av cellerna. Ett antibiotikum, gentamycin, används för att döda bakterierna i odlingsmediet och de rester som fästs vid cellernasyttre membran 31. Gentamycin anses inte permeabla för cellmembranet och kommer därmed inte att påverka bakterierna redan inom cellerna. Behandling med gentamycin gör den idealisk för detta system för att utesluta den potentiella kontaminering från utanför de infekterade lungepitelcellerna.
För att studera cigarettrökens effekter på bakterieinfektion i lungepitelceller måste lungceller exponeras för cigarettrök före bakteriell infektion i cellulära modeller. En konventionell strategi förbereder färska CSE för att behandla celler. Generering av CSE är en kostnadseffektiv metod för studier. CSE är lätt att hantera, processen att göra CSE är enkel, och CSE intratrakeal injektion är effektiv i generering av emfysem i djurmodeller i en kort tidsperiod32. Tillvägagångssätt för direkt cigarettexponering har också utvecklats för både in vitro cellulära modeller och in vivo gnagare modeller. Sex månader av daglig cigarettrök exponering för möss används ofta för att generera emfysem33. Direkt cigarettrök exponering kräver komplicerad utrustning som kombinerar cigarettförbränning och cell system kultur. Cigarettförbränning producerar cigarettrök, men genererar också en summa mängd värme som kan påverka kulturkammarens temperatur och fuktighet. Lyckligtvis, senaste tekniker gör direkt cigarettrök exponering lättare21. En Internationell organisation för standardisering (ISO) protokoll har genomförts för direkt experiment cigarettrök exponering22. Exponering för cigarettröken kan utföras en eller flera gånger. Dessutom, tillsammans med utvecklingen av cellodling tekniker, lung primära epitelceller skulle också kunna odlas på transparenta insatser för att få en confluent lungepitelcell monolayer34. Lung epitelial cell monolayers efterliknar strukturellt de fysiologiska förhållandena i lungvävnader. Celler kan sedan utsättas för apikal gasformig rök eller luft vid luft-vätskegränssnittet35. Vidare har kultur av lungorganoider framkommit i nuvarande lungstudier36,37. Det ska bli intressant att veta hur cigarettrök påverkar bakteriell infektion i lungorganoider. Den beskrivna metoden kan efterlikna människors infektion i vävnader i stället för odlade celler och kan göra möjliga ytterligare insikter i nedre luftvägsbakteriell infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett National Institutes of Health R01-bidrag HL125435 och HL142997 (till CZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
