Summary

Préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires

Published: May 15, 2020
doi:

Summary

Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour préparer les plis vocaux des rats pour l’étude neuromusculaire histochimique.

Abstract

Le but de ce tutoriel est de décrire la préparation du pli vocal du rat pour l’étude neuromusculaire histochimique. Ce protocole décrit les procédures de dissection laryngée chez le rat, de congélation éclair et de cryosection des plis vocaux. Cette étude décrit comment cryosectionner les plis vocaux dans les plans longitudinal et transversal. Une nouveauté de ce protocole est le suivi laryngé pendant la cryosection qui assure une identification précise des muscles laryngés intrinsèques et réduit le risque de perte de tissu. Les figures démontrent la cryosection progressive dans les deux plans. Vingt-neuf hémi-larynges de rats ont été cryosectionnés et suivis depuis l’émergence du cartilage thyroïdien jusqu’à l’apparition de la première section qui comprenait le pli vocal complet. Le pli vocal complet a été visualisé pour tous les animaux des deux plans. Il y avait une grande variabilité dans la distance entre l’apparition du cartilage thyroïdien et l’apparition du pli vocal complet dans les deux plans. Le poids n’était pas corrélé à la profondeur des repères laryngés, ce qui suggère que la variabilité individuelle et d’autres facteurs liés à la préparation des tissus peuvent être responsables de la grande variabilité de l’apparence des points de repère pendant la section. Cette étude détaille une méthodologie et présente des données morphologiques pour préparer le pli vocal du rat à l’investigation neuromusculaire histochimique. En raison de la grande variabilité individuelle, les repères laryngés doivent être suivis de près pendant la cryosection pour éviter la sursection des tissus et la perte de tissus. L’utilisation d’une méthodologie cohérente, y compris une préparation adéquate des tissus et la connaissance des points de repère dans le larynx du rat, aidera à obtenir des résultats cohérents dans toutes les études et aidera les nouveaux chercheurs intéressés à utiliser le pli vocal du rat comme modèle pour étudier les mécanismes neuromusculaires laryngés.

Introduction

Le larynx du rat est un modèle bien établi pour étudier les adaptations laryngées neuromusculaires structurelles et fonctionnelles au développement, au vieillissement, à la maladie et aux agents pharmacologiques1,2,3,4,5. La cohérence des méthodes histologiques est essentielle à cette ligne de travail, car il existe de multiples subtilités impliquées dans la préparation et l’analyse musculaires ainsi que des défis associés à la taille, à la forme et à la topographie des muscles laryngés encapsulés dans les cartilages laryngés1,6,7,8,9,10,11 . En raison de la petite taille des muscles laryngés intrinsèques du rat, l’intégration, la congélation et la cryosection systématiques sont essentielles pour obtenir des résultats cohérents et précis. Par exemple, lors de la section du pli vocal du rat dans le plan coronal, les jonctions neuromusculaires (NMJ) de quatre des muscles laryngés intrinsèques sont situées à moins de 1,8 mm de profondeur tissulaire11. Par conséquent, une surveillance précise de l’anatomie du muscle laryngé pendant la cryosection est impérative pour identifier avec précision la ou les sections d’intérêt et éviter la sursection des tissus. La sursection du muscle cible peut entraîner une identification inexacte du nombre et de la topographie des NMJ11 ou peut entraîner une réduction globale de la taille de l’échantillon si le muscle cible est écarté en raison d’une confusion d’orientation de repère12. Au fur et à mesure que de nouveaux modèles pour l’étude du muscle laryngé et de leurs adaptations respectives sont développés, des procédures opératoires normalisées sont essentielles pour garantir que les résultats sont précis, fiables et reproductibles dans toutes les études.

L’objectif de cet article est de détailler la préparation du pli vocal du rat pour une analyse longitudinale et transversale optimale. Des méthodes détaillées utilisées régulièrement dans notre laboratoire sont décrites pour identifier les repères musculaires cibles lors de la cryosection. Bien que des méthodes similaires soient utilisées dans plusieurs laboratoires, des détails plus détaillés sont fournis ici que dans la littérature pour assurer une réplication fiable et précise lorsqu’elle est mise en œuvre par des chercheurs novices. L’objectif de ce tutoriel est de fournir une méthodologie standard pour l’évaluation immunohistochimique (IHC) du pli vocal du rat afin d’améliorer la cohérence entre les laboratoires et les investigations.

Protocol

Cette étude a été réalisée en conformité avec le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Faculté de médecine de l’Université de New York. 1. Disséquer le larynx du rat Euthanasier le rat selon le protocole approuvé par l’institution. Raser le cou ventral de la mandibule au manubrium et écouvillonner avec de l’alcool pour éviter la contamination de la fourrure dans les échantillons de tissus. Sous une lunette de dissection ave…

Representative Results

Les résultats représentatifs faisaient partie d’une étude en cours sur les effets de l’exercice vocal sur le système neuromusculaire laryngé. Vingt-neuf rats mâles Fischer 344/bruns de Norvège (12 âgés de 9 mois, 17 âgés de 24 mois) ont été pesés et euthanasiés par inhalation de CO2 suivie d’une thoracotomie bilatérale. Les procédures ont suivi le protocole décrit pour étiqueter les NMJ et la taille des fibres des muscles ta latéraux et médiaux. La distanc…

Discussion

La préparation des plis vocaux des rats pour l’analyse neuromusculaire peut présenter divers défis. Non seulement les muscles laryngés sont petits et entourés de cartilage, ce qui rend difficile l’extraction directe du muscle cible, mais une grande variabilité a également été observée entre les animaux en profondeur des repères anatomiques laryngés. Pour le muscle, le protocole du plan de coupe transversale, des sections complètes du pli vocal sont apparues entre 21 et 85 sections (10 μm par section) ap…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par les subventions F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) et K23DC014517 (Johnson, PI) du National Institute on Deafness and other Communication Disorders des National Institutes of Health.

Materials

2-Methylbutane Certified Fisher Chemical 35514
Aluminum Foil Fisherbrand 1213101
Cryo Tongs SS Thermo Scientific 11679123
Cryostat Leica Biosystems CM3050
Cryostat blades C.L. Sturkey D554X50 22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm Thermo Scientific 41-741
Disposable Underpads Medline 23-666-062
Dissection kit Thermo Scientific 9996969
DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190136
Frozen Section Medium Fisher Healthcare 23-730-571
Ice Bucket Bel-Art 11999054
Immunostain Moisture Chamber Ted Pella Inc NC9425474
Needle holders Assi ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply Quick Medical 9023
Orbital shaker Troemner 02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes Fisherbrand 5408129
Specimen Storage Bags Fisherbrand 19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL Polar Ware 114231B
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Task wiper Kimberly-Clark Professional™ 34155 06666A
Timer Fisherbrand 2261840
Vannas Pattern Scissors Assi ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.

References

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Cite This Article
Lenell, C., Shembel, A. C., Johnson, A. M. Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses. J. Vis. Exp. (159), e61327, doi:10.3791/61327 (2020).

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