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Bioengineering

कार्बनिक सॉल्वेंट मिश्रण में जटिल नैनोस्ट्रक्चर में गामा-संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड की आत्म-असेंबली

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61351
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

यह लेख कार्बनिक विलायक मिश्रण में गामा-संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड ओलिगोमर से नैनोस्ट्रक्चर के डिजाइन और आत्म-असेंबली के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Abstract

डीएनए और आरएनए नैनोटेक्नोलॉजी में वर्तमान रणनीतियां जलीय या काफी हद तक हाइड्रेटेड मीडिया में विभिन्न प्रकार के न्यूक्लिक एसिड नैनोस्ट्रक्चर की आत्म-असेंबली को सक्षम करती हैं। इस लेख में, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो विशिष्ट रूप से पता करने योग्य, एकल-फंसे, गामा-संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (γPNA) टाइल्स के आत्म-असेंबली के माध्यम से कार्बनिक सॉल्वेंट मिश्रण में नैनोफाइबर आर्किटेक्चर के निर्माण को सक्षम करते हैं। प्रत्येक एकल-फंसे टाइल (एसएसटी) एक 12-बेस है γPNA ओलिगोमर जो प्रत्येक 6 ठिकानों के दो जटिल मॉड्यूलर डोमेन से बना है। प्रत्येक डोमेन नैनोफाइबर बनाने के लिए प्रोग्राम किए गए पूरकता का उपयोग करके पड़ोसी किस्में पर मौजूद पारस्परिक रूप से मानार्थ डोमेन से बांध सकता है जो लंबाई में माइक्रोन तक बढ़ सकता है। एसएसटी आकृति 9 कुल ओलिगोमर से बना है ताकि 3-हेलिक्स नैनोफाइबर का गठन किया जा सके। अनुरूप डीएनए नैनोस्ट्रक्चर के विपरीत, जो व्यास-मोनोडिस्पर्स संरचनाएं बनाते हैं, ये γPNA सिस्टम नैनोफाइबर बनाते हैं जो कार्बनिक विलायक मिश्रण में आत्म-असेंबली के दौरान अपनी चौड़ाई के साथ बंडल करते हैं। यहां वर्णित स्व-असेंबली प्रोटोकॉल में बंडलिंग प्रभावों को कम करने के लिए एक पारंपरिक सर्फेक्टेंट, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) भी शामिल है।

Introduction

जलीय या काफी हद तक हाइड्रेटेड मीडिया में1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12 में कई जटिल नैनोस्ट्रक्चर का सफल निर्माण किया गया। स्वाभाविक रूप से होने वाले न्यूक्लिक एसिड जैसे डीएनए1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10और आरएनए11,12 पिछले कार्यों में दिखाए गए हैं। हालांकि , स्वाभाविक रूप से होने वाले न्यूक्लिक एसिड डुप्लेक्स पेचिक अनुरूप परिवर्तनों से गुजरते हैं या कार्बनिक विलायक मिश्रण13,14में थर्मल स्टैबिलिटी कम हो गए हैं ।

इससे पहले, हमारी प्रयोगशाला ने गामा-पोजीशन संशोधित सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड की नकल का उपयोग करके 3-हेलिक्स नैनोफाइबर के निर्माण की दिशा में एक विधि की सूचना दी है जिसे गामा-पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (γPNA)15 (चित्रा 1A) कहा जाता है। 16,17के क्षेत्र में सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड की नकलपीएनए के इस तरह के विकास और संभावित अनुप्रयोगों की आवश्यकता पर चर्चा की गई है । हमने डीएनए नैनोस्ट्रक्चर18, 19,20के लिए प्रस्तुत एकल-फंसे टाइल (एसएसटी) रणनीति के अनुकूलन के माध्यम से दिखाया है कि 9 क्रमिक रूप से अलग γPNA ओलिगोमर को डीएमएसओ और डीएमएफ जैसे चुनिंदा ध्रुवीय एप्रोटिक ऑर्गेनिक सॉल्वैंट मिश्रणों में 3-हेलिक्स नैनोफाइबर बनाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। γPNA ओलिगोमर को साहू एट अलद्वारा प्रकाशित तरीकों के आधार पर प्रत्येक 12-आधार अल्पाहार के साथ तीन γ-पदों (1, 4 और 8 आधार-पदों) पर (आर-डाईथिलीन ग्लाइकोल (मिनी-खूंटी) के संशोधनों के साथ व्यावसायिक रूप से आदेश दिया गया था। 21 ये गामा-संशोधनों के कारण पेचिक पूर्व-संगठन जो असंशोधित पीएनए के सापेक्ष γPNA की उच्च बाध्यकारी आत्मीयता और थर्मल स्थिरता से जुड़ा हुआ है।

यह लेख हमारे रिपोर्ट किए गए कार्य का एक अनुकूलन है जिसमें हम γPNA-आधारित नैनोस्ट्रक्चर15के गठन पर डीएनए के साथ सॉल्वेंट समाधान और प्रतिस्थापन के प्रभावों की जांच करते हैं। इस लेख का उद्देश्य डिजाइन के विस्तृत विवरण के साथ-साथ विलायक-अनुकूलित तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है जो स्व-असेंबली और γPNA नैनोफाइबर के लक्षण वर्णन के लिए विकसित किए गए थे। इस प्रकार, हम पहले मॉड्यूलर एसएसटी रणनीति पेश करते हैं, जो सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड की नकल पीएनए का उपयोग करके नैनोस्ट्रक्चर डिजाइन के लिए एक सामान्य मंच है।

पीएनए डुप्लेक्स के लिए हेलीकल पिच डीएनए डुप्लेक्स की तुलना में प्रति मोड़ 18 कुर्सियां होने की सूचना दी गई है, जो प्रति १०.५ ठिकानों(चित्रा 1B)एक मोड़ से गुजरता है । इसलिए, प्रदर्शन γPNA एसएसटी की डोमेन-लंबाई 6 ठिकानों पर निर्धारित की गई थी ताकि एक तिहाई पूर्ण मोड़ या 120 डिग्री रोटेशन को समायोजित किया जा सके ताकि तीन त्रिकोणीय सरणी हेलीस के बीच बातचीत को सक्षम किया जा सके। इसके अलावा, पिछले एसएसटी रूपांकनों के विपरीत, प्रत्येक एसएसटी में सिर्फ 2 डोमेन होते हैं, जो प्रभावी रूप से 1-आयामी रिबन जैसी संरचना बनाते हैं जो तीन-हेलिक्स बंडल(चित्रा 1C)बनाने के लिए लपेटता है। प्रत्येक 12-आधार γPNA अल्पाधिकार 1, 4 और 8 पदों पर संशोधित गामा है ताकि समग्र एसएसटी आकृति में मिनी-खूंटी समूहों का समान रूप से दूरी वितरण सुनिश्चित किया जा सके। इसके अतिरिक्त, आकृति के भीतर, दो प्रकार के ओलिगोमर होते हैं: "समीपस्थ" किस्में जो एकल हेलिक्स और हेलिक्स-फैले "क्रॉसओवर" किस्में(चित्रा 1D)पर मौजूद हैं। इसके अलावा, ओलिगोमर पी 8 और पी 6 को फ्लोरोसेंट Cy3 (ग्रीन स्टार) और बायोटिन (येलो ओवल) के साथ क्रमशः(चित्रा 1D)के साथ चिह्नित किया जाता है, ताकि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संरचना गठन का पता लगाया जा सके। कुल मिलाकर, एसएसटी आकृति 9 कुल ओलिगोमर से बना है ताकि प्रत्येक डोमेन की प्रोग्राम पूरकता के माध्यम से पड़ोसी ओलिगोमर(चित्रा 1E)पर संबंधित डोमेन के माध्यम से 3-हेलिक्स नैनोफाइबर के गठन को सक्षम किया जा सके।

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Protocol

1. γPNA अनुक्रम डिजाइन

  1. कैलटेक23 में विनफ्रे लैब द्वारा विकसित डीएनए डिजाइन टूलबॉक्स22 को डिजाइनिंग दृश्यों के लिए प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट वाले फ़ोल्डर में डाउनलोड करें।
  2. उस अनुक्रम डिजाइन फ़ोल्डर के भीतर, फ़ाइल एक्सटेंशन ".m" के साथ संगत चौथी पीढ़ी की प्रोग्रामिंग भाषा खोलें, और फिर निम्नलिखित कमांड का उपयोग करके पथ में पहले से डाउनलोड किए गए "DNAdesign" फ़ोल्डर जोड़ें:
    और भी बढ़िया है विकास द्वार डीएनडीसाइन
  3. बाद में निम्नलिखित आदेश का उपयोग कर "PNA3nanofiber.m" (अनुपूरक चित्रा 1देखें) नाम की निम्नलिखित स्क्रिप्ट चलाएं:
    PNA3nanofiber
  4. "thisSeqs" और "thisScore" नामक चर बनाने के लिए इस स्क्रिप्ट को चलाएं। परिवर्तनीय "thisSeqs" में डिज़ाइन किए गए ओलिगोमर के दृश्य शामिल हैं, और "यहस्कोर" पेनल्टी स्कोर है।
  5. सबसे कम स्कोर प्राप्त करने के लिए स्क्रिप्ट को कई बार चलाएं। टेबल 1में ऐसे 20 रन का नमूना दिखाया गया है ।
  6. मैन्युअल रूप से निर्दिष्ट एसएसटी संरचनात्मक आकृति के लिए उत्पन्न दृश्यों के प्रत्येक डोमेन की वांछित वाटसन-क्रिक पूरकता की पुष्टि करें। 3-हेलिक्स नैनोफाइबर संरचना के लिए अनुक्रम विनिर्देश तालिका 2में दिखाए गए हैं।
  7. उत्पन्न दृश्यों के लिए निम्नलिखित को सत्यापित करें।
    1. लगातार चार सी और जी बेस का इस्तेमाल करने से बचें।
    2. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी अध्ययन को सक्षम करने के लिए फ्लोरोसेंट डाई और बायोटिन अणुओं के साथ एन-टर्मिनल कार्यात्मकता के लिए मैन्युअल रूप से विशिष्ट दृश्यों का चयन करें।
    3. साहू एट अलद्वारा वर्णित एकल-फंसे ओलिगोमर्स में पूर्व-संगठित पेचिक संरचना को सक्षम करने के लिए रीढ़ की हड्डी पर न्यूनतम 3 मिनी-खूंटी गामा-संशोधन शामिल करें। 21

2. γPNA स्टॉक किस्में की तैयारी

  1. एक वाणिज्यिक निर्माता से उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) शुद्धिकरण के साथ 50 एनएमोल स्केल संश्लेषण पर निर्दिष्ट दृश्यों के γPNA घटक किस्में प्राप्त करें।
  2. प्रत्येक कतरा को 300 माइक्रोन्ड सांद्रता में फिर से रखना। प्रयोग के लिए आवश्यक होने तक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कई महीनों तक पुनर्नसंरित किस्में स्टोर करें।

3. γPNA अल्पाभ सबसेट के पिघलने वक्र अध्ययन

  1. 1x फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) या पसंदीदा ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वेंट जैसे डिमेथाइलफार्मेमाइड (डीएमएफ) या डिमेथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) (चित्रा देखें)जैसे जलीय बफ़र्स में पिघल वक्र अध्ययन चलाकर पूरक 2-ओलिगोमर और 3-ओलिगोमर सबसेट के विभिन्न संयोजनों के लिए पिघलने वाले तापमान पर्वतमाला प्राप्त करें।
    नोट: डीएमएफ के 50% पर थर्मल पिघलने वाले घटता ऊपरी आधार रेखा खोने लगते हैं और प्रयोगों के लिए आवश्यक तरंगदैर्ध्य पर डीएमएफ के उच्च अवशोषण के कारण आंशिक रूप से गंभीर गड़बड़ी दिखाते हैं। साहित्यमेंयह एक विख्यात घटना है . हालांकि इन विलायक स्थितियों में 5 माइक्रोनएम प्रति स्ट्रैंड सांद्रता पर पिघलने वाले घटता प्राप्त करना संभव है।
    1. प्रत्येक ओलिगोमर के 300 माइक्रोन स्टॉक से अलीकोट 16.7 माइक्रोन करें और 1x पीबीएस या 100% (v/v) DMSO या 100% (v/v) DMF में 1000 माइक्रोनल के लिए अंतिम मात्रा में अंतिम मात्रा में बनाएं। इस ओलिगोमर सबसेट मिश्रण को 1 सेमी ऑप्टिकल पथ, क्वार्ट्ज क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
    2. प्रोग्राम करने योग्य तापमान ब्लॉक से लैस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में चर तापमान यूवी-विस प्रयोग करें।
    3. 0.5\u20121 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से कूलिंग (एनीलिंग) और हीटिंग (पिघलने) चक्रों दोनों के लिए 15 \u201290 डिग्री सेल्सियस की तापमान सीमा पर पिघलने वाले घटता के लिए डेटा अंक एकत्र करें । सैंपल को ठंडा होने से पहले 90 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट और गर्म होने से पहले 15 डिग्री सेल्सियस पर रखें। हीटिंग वक्र के पहले व्युत्पन्न के शिखर से पिघलने का तापमान (टीएम)निर्धारित करें।
    4. सत्यापित करें कि पिघलने का तापमान 2-ओलिगोमर सबसेट के लिए होता है जो सभी सॉल्वेंट मामलों में 35 डिग्री सेल्सियस से ऊपर होते हैं। इसके अतिरिक्त, सत्यापित करें कि संबंधित 3-ओलिगोमर सबसेट जिसमें उनके समकक्ष 2-ओलिगोमर सबसेट के लिए एक अतिरिक्त कतरा होता है, बढ़ी हुई सह-परिचालन के कारण टीएम में काफी वृद्धि दिखाता है।
      नोट: यह सत्यापित करेगा कि कई ओलिगोमर्स का एक बर्तन स्वयं-असेंबली उचित थर्मल स्थिरता के साथ वांछित नैनोस्ट्रक्चर में सहकारी रूप से गुना कर सकता है।

4. कई अलग-अलग γPNA ओलिगोमर के लिए स्व-असेंबली प्रोटोकॉल

नोट: नैनोस्ट्रक्चर γPNA के लिए एक आत्म-असेंबली थर्मल रैंप प्रोटोकॉल ईजाद करने के लिए, धीमी गति से रैंप एनीलिंग वांछनीय है।

  1. उत्पन्न ओलिगोमर दृश्यों के मामले में, थर्मल साइकिलर में 90 से 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने वाले 22.5 घंटे के लिए नमूनों को एनील करें। आमतौर पर, 2-ओलिगोमर और 3-ओलिगोमर γPNA सबसेट के लिए प्राप्त पिघलने का तापमान विभिन्न विलायक स्थितियों के लिए 40\u201270 डिग्री सेल्सियस की श्रेणियों में झूठ बोलता है।
  2. थर्मल साइकिलर को इस प्रकार प्रोग्राम करें: 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें, 0.1 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम की स्थिर दर से 90 से 70 डिग्री सेल्सियस तक रैंप, 0.1 डिग्री सेल्सियस/3 मिनट की दर से 70 से 40 डिग्री सेल्सियस तक रैंप, 0.1 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से 40 से 20 डिग्री सेल्सियस नीचे रैंप और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ (टेबल 3देखें)। नमूनों को लक्षण वर्णन से पहले 12 \u201224 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: जबकि हमारे नैनोफाइबर सिस्टम के 2-और 3-ओलिगोमर सबसेट 1x पीबीएस में बन सकते हैं, 1x PBS में कुल पूर्ण माइक्रोन-स्केल नैनोफाइबर। इसलिए, गामा संशोधनों के प्रकार और घनत्व के साथ-साथ संरचना के पैमाने और आकार के आधार पर विलायक स्थितियों को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  3. माइक्रोन स्केल लॉन्ग 3-हेलिक्स नैनोफाइबर के लिए, ७५% DMSO में ऐनल बैच के नमूने तैयार करें: एच2ओ (v/v), ७५% DMF: H2O (v/v), ४०% 1,4-Dioxane: H2O (v/v) विलायक अनुकूलन अध्ययन पर आधारित15।
  4. इस प्रकार के रूप में एनील बैच तैयार करें (तालिका 4देखें)। सबसे पहले, मुख्य स्टॉक से 0.67 माइक्रोन को अलीकोट करके प्रत्येक ओलिगोमर के लिए 300 माइक्रोन मुख्य स्टॉक से 20 माइक्रोन सांद्रता पर 10 माइक्रोन उप-स्टॉक तैयार करें और डिओनाइज्ड पानी का उपयोग करके वॉल्यूम को 10 माइक्रोन करें।
  5. प्रत्येक अल्पायु के लिए 20 माइक्रोन उप-स्टॉक से 1 μL अलीकोट और इसे 200 माइक्रोन पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। यह 9 ओलिगोमर के लिए कुल 9 माइक्रोन की मात्रा के लिए खातों ।
  6. 500 एनएम अंतिम सांद्रता पर प्रत्येक अल्पाधिकार के साथ 40 माइक्रोन की अंतिम मात्रा बनाने के लिए 75% DMSO/DMF के लिए 75% DMSO/DMF के 75% डीएमएफ मामलों में अतिरिक्त 1 माइक्रोन के साथ डीरियोनाइज्ड पानी के साथ या तो 30 माइक्रोन जोड़ें। 1,4-डायोक्सेन के 16 माइक्रोन जोड़ें और 40% डायोक्सेन सॉल्वेंट स्थिति के लिए डिओनाइज्ड पानी के साथ वॉल्यूम को 40 माइक्रोन करें।
  7. स्टेप 4.2 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके थर्मल साइकिलर और एनील पर एनील बैचों को लोड करें।

5. कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

  1. एक खाली पिपेट टिप्स बॉक्स से एक आर्द्रता कक्ष तैयार करें। इस प्रकार वर्णित नमूना प्रवाह चैनलों के सूखने को रोकने के लिए लगभग 5 एमएल पानी के साथ बॉक्स भरें (चित्र 3देखें)।
  2. माइक्रोस्कोप स्लाइड, 2 डबल-तरफा टेप स्ट्रिप्स, और नाइट्रोसेल्यूलोस-कोटेड कवरस्लिप के साथ फ्लो चैंबर तैयार करें। नाइट्रोसेल्यूलोस के साथ कवरस्लिप को कोट करने के लिए, एमिल एसीटेट और एयर-ड्राई में 0.1% कोलोडियन युक्त बीकर में कवरस्लिप को डुबोएं।
    1. आइसोअमिल एसीटेट सॉल्वेंट के साथ एमिल एसीटेट में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2% कोलोडियन से 20 गुना कमजोर करके नाइट्रोसेल्यूलोज समाधान तैयार करें।
  3. बायोटिनीलेटेड गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बायोटिन-बीएसए) समाधान 1 मिलीग्राम बायोटिन-बीएसए का वजन करके और इसे 1x पीबीएस के 1 एमएल में भंग करके तैयार करें। फ्लो चैनल को एक कोण पर रखकर 1x पीबीएस बफर में 1 मिलीग्राम/एमएल बायोटिन-बीएसए के 15 माइक्रोन प्रवाह करें । एक आर्द्रीकृत कक्ष में कमरे के तापमान पर 2-4 मिनट के लिए प्रवाह चैनल को इनक्यूबेट करें।
  4. 1x पीबीएस के 1 मिलील में 1 मिलीग्राम बीएसए को घोलकर वॉश बफर तैयार करें। वॉश बफर के 15 माइक्रोन प्रवाहित करके अतिरिक्त बायोटिन-बीएसए को धोएं। सतह को निष्क्रिय करने के लिए, एक आर्द्रीकृत कक्ष में कमरे के तापमान पर 2-4 मिनट के लिए प्रवाह चैनल को इनक्यूबेट करें।
  5. स्ट्रेप्टाविडिन समाधान को 0.5 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाविडिन और 1 मिलीग्राम बीएसए को मापकर तैयार करें और फिर 1x पीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करके भंग करें। 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए युक्त 1x पीबीएस में 0.5 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टाविडिन का प्रवाह 15 माइक्रोन। एक आर्द्रीकृत कक्ष में कमरे के तापमान पर 2-4 मिनट के लिए प्रवाह चैनल को इनक्यूबेट करें। अनबाउंड स्ट्रेप्टाविडिन को धोने के लिए वॉश बफर के 15 माइक्रोन प्रवाह करें।
  6. 75% DMSO, 75% DMF या 40% 1,4-Dioxane हालत में प्रति कतरा 500 एनएम एकाग्रता पर γPNA ओलिगोमर्स के पहले एनील्ड बैच के पहले से एनील्ड बैच के प्रवाह 15 माइक्रोन। एक आर्द्रीकृत कक्ष में कमरे के तापमान पर 2-4 मिनट के लिए प्रवाह चैनल को इनक्यूबेट करें।
  7. डीएमएसओ में ट्रोलॉक्स के 10 एमएम स्टॉक से 10 गुना पतला करके पसंदीदा सॉल्वेंट परिस्थितियों में 1 एमएम ट्रॉलॉक्स तैयार करें (2.5 मिलीग्रामग्राम ट्रॉलॉक्स को मापें और डीएमएसओ के 1 मिलील में भंग करें)। नैनोस्ट्रक्चर के समान विलायक संरचना वाले 1 एमएम ट्रोलॉक्स के 15 माइक्रोन के साथ प्रवाह चैनल में अनबाउंड नैनोस्ट्रक्चर धोएं।
    नोट: प्रवाह चैनल में 50% DMSO सामग्री टीआईआरएफ के दौरान सॉल्वेंट स्थिति के अपवर्तन के विभिन्न सूचकांक के कारण मामूली संकेत गड़बड़ी का उत्पादन करेगी जो आमतौर पर कवरलिप-पानी टीआईआरएफ कोणों के लिए अंशांकित किया जाता है। इसे डिओनाइज्ड पानी का उपयोग करके 10 एमएम ट्रोलॉक्स 10 गुना को कमजोर करके बनाए गए 1 एमएम ट्रोलॉक्स से धोकर सुधारा जा सकता है। यह तकनीक स्पष्ट छवियां प्रदान करती है लेकिन यह आकलन करने के लिए केवल उपयोगी है कि क्या गठन हुआ, हालांकि, क्योंकि यह प्रवाह चैनल में दो चरण माइक्रो-बुलबुले पैदा करता है। नतीजतन, नैनोस्ट्रक्चर दो चरणों के इंटरफेस पर दिखाई दे सकते हैं जैसा कि चित्र 4डीमें दिखाया गया है।
  8. 60x तेल विसर्जन उद्देश्य और 1.5x आवर्धक का उपयोग करके TIRF इमेजिंग से लैस फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्लाइड धारक और छवि पर प्रवाह चैनल स्थानांतरित करें। Cy3 चैनल की निगरानी करके 60x या 90x आवर्धन पर प्रवाह चैनल को स्कैन करें (चित्रा 4देखें)।

6. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) इमेजिंग

  1. 1% जलीय यूरेबिल एसीटेट दाग समाधान तैयार करने के लिए 50 एमएल आसुत पानी में 0.5 ग्राम यूरेसिल एसीटेट का वजन करें। एक सिरिंज से जुड़े 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके 1% जलीय यूरेनाइल एसीटेट दाग समाधान को फ़िल्टर करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 2% जलीय यूरेसिल एसीटेट एक वाणिज्यिक निर्माता से खरीदा जा सकता है।
  2. 300-जाल आकार के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फॉर्मवर समर्थन लेपित कॉपर ग्रिड खरीदें।
    नोट: यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फॉर्मवर सपोर्ट लेयर को 2 मिनट से आगे डीएमएसओ जैसे सॉल्वैंट्स द्वारा भंग किया जा सकता है। इनक्यूबेशन लंबे समय तक, तांबे के ग्रिड पर सिलिकॉन मोनोऑक्साइड के साथ स्थिर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फॉर्मवर उपलब्ध हैं जो ग्रिड को कार्बन-लेपित ग्रिड की तुलना में अधिक हाइड्रोफिलिक होने की अनुमति देते हैं और चित्र 5 सीमें दिखाए गए जोरदार नमूना स्थितियों और इलेक्ट्रॉन बीम का सामना कर सकते हैं।
  3. 15 एस के लिए ग्रिड पर नमूना के पिपेट 4 माइक्रोन। फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करने के लिए पक्ष से ग्रिड के संपर्क में फिल्टर कागज लाकर नमूना बाती ।
  4. तुरंत 5 एस के लिए ग्रिड पर दाग समाधान के 4 μL जोड़ें।
  5. पहले की तरह दाग से बाती और 1 \ u20122 मिनट के लिए ग्रिड के खिलाफ फिल्टर पेपर पकड़ सुनिश्चित करने के लिए ग्रिड सूखी है । नमूनों को आम तौर पर धुंधला करने के बाद 1 \u20122 h के भीतर चित्रित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, यदि ग्रिड को पूरी तरह से सूखा होना सुनिश्चित किया जाता है, तो ग्रिड को इमेजिंग से पहले 3 दिनों तक टेम ग्रिड स्टोरेज बॉक्स में संग्रहित किया जा सकता है।
  6. ग्रिड को 80 केवी पर संचालित ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक टेम नमूना धारक और छवि में स्थानांतरित करें, जिसमें 10 K से 150K तक आवर्धन (चित्र 5देखें)।

7. डीएनए के साथ चयनात्मक प्रतिस्थापन के आधार पर γPNA-डीएनए संकर के लिए विभिन्न मॉर्फोलोजी

  1. मानक डीसल्टिंग का उपयोग करके 25एनएमओल पैमाने पर संश्लेषित वाणिज्यिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड निर्माताओं से निर्दिष्ट दृश्यों (तालिका 5 देखें) के डीएनए ओलिगोमर प्राप्त करें। 20 माइक्रोनएम स्टॉक सांद्रता पर RNase मुक्त deionized पानी का उपयोग कर इन डीएनए दृश्यों को फिर से खर्च करें ।
  2. डीएनए के साथ समीपस्थ γPNA स्ट्रैंड प्रतिस्थापन के लिए, दृश्यों D3, D5 और D9 किस्में p3, p5 और p9 की जगह ले सकते हैं । इसी तरह, डीएनए के साथ क्रॉसओवर γPNA स्ट्रैंड रिप्लेसमेंट के लिए, दृश्यों D1, D4 और D7 किस्में p1, p4 और p7 की जगह ले सकते हैं ।
  3. प्रत्येक γPNA या डीएनए ओलिगोमर के लिए 20 माइक्रोन उप-स्टॉक से 1 μL अलीकोट करें और इसे चरण 2.7 के रूप में 200 माइक्रोन पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। 40 माइक्रोन (तालिका 6देखें) के लिए अंतिम मात्रा बनाने के लिए निर्जल डीएमएसओ के 30 माइक्रोल और आरएनएसई-मुक्त डिओनाइज्ड पानी के 1 माइक्रोन जोड़ें।
  4. स्टेप 4.2 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके थर्मल साइकिलर और एनील पर एनील बैचों को लोड करें।
  5. धारा 5 में कदमों के बाद टीआईआरएफ प्रोटोकॉल का उपयोग करके या धारा 6 में उल्लिखित TEM इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके γPNA-डीएनए हाइब्रिड नैनोस्ट्रक्चर की विशेषता है (चित्र 6देखें)।

8. एसडीएस की अलग-अलग सांद्रता में नैनोफाइबर γPNA के लिए विभिन्न मॉर्फोलॉजी

  1. 20 मिलीग्राम एसडीएस को मापकर और इसे 100 माइक्रोनयुक्त पानी में घोलकर 20% (डब्ल्यूटी/वी) एसडीएस मुख्य स्टॉक तैयार करें।
  2. 20% एसडीएस स्टॉक से 3 माइक्रोन को अलीकोट करके 6% (डब्ल्यूटी/v) एसडीएस सब-स्टॉक तैयार करें और डिएकाइज्ड पानी का उपयोग करके वॉल्यूम को 10 माइक्रोल तक पहुंचाएं ।
  3. एनील 5.25 mm और 17.5 m SDS की अंतिम सांद्रता में ओलिगोमर γPNA इस प्रकार है। प्रत्येक γPNA ओलिगोमर के लिए 20 माइक्रोन उप-स्टॉक से 1 μL अलीकोट और इसे चरण 2.7 में 200 माइक्रोन पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। क्रमशः 5.25 m m और 17.5 mM की एसडीएस अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए 40 माइक्रोन करने के लिए अंतिम मात्रा बनाने के लिए निर्जल डीएमएसओ के 30 माइक्रोन और 6% और 20% एसडीएस के 1 माइक्रोन जोड़ें (तालिका 7देखें)।
  4. चरण 4.2 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके थर्मल साइकिलर और एनील पर अलग-अलग एसडीएस सांद्रता के एनील बैचों को लोड करें।
  5. धारा 5 में चरणों का पालन करते हुए टीआईआरएफ प्रोटोकॉल का उपयोग करके एसडीएस की उपस्थिति में नैनोस्ट्रक्चर γPNA विशेषताएं या धारा 6 में उल्लिखित TEM इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके (चित्र 7देखें)।

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Representative Results

उपरोक्त वर्गों में चर्चा किए गए प्रोटोकॉल कई, विशिष्ट γPNA ओलिगोमर का उपयोग करके स्वयं-इकट्ठे नैनोफाइबर संरचनाओं की मजबूत पीढ़ी के लिए डीएनए नैनोफाइबर से एक अनुकूलित एसएसटी आकृति के डिजाइन का वर्णन करते हैं। यह अनुभाग वर्णित प्रोटोकॉल के सफल मनोरंजन से प्राप्त डेटा की व्याख्या का वर्णन करता है।

75% DMSO में एनील्ड γPNA ओलिगोमर के नमूनों की TIRF इमेजिंग के लिए धारा 5 में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद: एच2ओ (v/v) सबसे आसानी से सूक्ष्म टिप्पणियों के तहत अच्छी तरह से संगठित आर्किटेक्चर के सबूत प्रदान करता है जैसा कि चित्र 4 एमें दिखाया गया है। ७५% DMF: एच2O (v/v) स्पिक्यूल के आकार या सुई की तरह नैनोस्ट्रक्चर(चित्रा 4B)में हल करने की स्थिति परिणाम है और, हमारे अनुभव में, ४०% १,४ dioxane: एच2O (v/v) हालत जब TIRF माइक्रोस्कोपी(चित्रा 4C)का उपयोग कर देखा फिलामेंटल नैनोस्ट्रक्चर की विरल सजावट से पता चलता है । इसके अलावा, 75% DMSO में गठित नैनोट्यूब γPNA के नमूने: एच2ओ (v/v) धारा 6(चित्रा 5)में उल्लिखित कदमों के बाद TEM इमेजिंग के दौरान उच्च आवर्धन या नैनोस्कोपिक संकल्पों पर नैनोफाइबर के बंडलिंग का प्रदर्शन करता है। नैनोस्ट्रक्चर की चौड़ाई के मात्रात्मक विश्लेषणों में 80 एनएम 15 से अधिक अधिकतम मूल्यों के साथ16.3एनएम की औसत चौड़ाई दिखाई गई .

डीएनए का उपयोग करके आगे कार्यात्मकता सक्षम करने के लिए कार्बनिक विलायक मिश्रण में γPNA-डीएनए हाइब्रिड नैनोस्ट्रक्चर पैदा करने की दिशा में एक योजना तैयार करने के लिए, एसएसटी मोटिफ में ओलिगोमेरिक स्थिति को आइसोसेक्वेंट डीएनए ओलिगोमर्स के साथ प्रतिस्थापित किया जाना महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित नैनोट्यूब निर्माण के मामले के लिए धारा 7 में उल्लिखित कदमों को अनुकूलित करना, आइसोसेक्वेंटियल डीएनए ओलिगोमर जो समीपस्थ γPNA ओलिगोमर को प्रतिस्थापित करते हैं, सीधे फिलामेंटस संरचनाएं बनाता है जबकि क्रॉसओवर γPNA ओलिगोमर का प्रतिस्थापन तिरफ और टेम इमेजिंग(चित्रा 6)का उपयोग करके देखे जाने पर स्टेलेट संरचनाएं बनाता है। समीपस्थ डीएनए ओलिगोमर के साथ प्रतिस्थापित नैनोस्ट्रक्चर की चौड़ाई के मात्रात्मक विश्लेषणों से पता चला कि 19 एनएम15के आसपास औसत चौड़ाई है ।

अंत में, धारा 8 से कदम ढालने पर, γPNA नैनोफाइबर अपनी महत्वपूर्ण मिसेल सांद्रता (सीएमसी, 8.2 mM) के नीचे एसडीएस सांद्रता की उपस्थिति में कम बंडलिंग के अनुरूप पतले मॉर्फोलॉजी अपनाते हैं। γPNA नैनोफाइबर भी अपने सीएमसी की तुलना में उच्च एसडीएस सांद्रता पर अत्यधिक नेटवर्क वाले मॉर्फोलॉजियों को अपनाते हैं, जब उन्हें टीआईआरएफ इमेजिंग(चित्रा 7)का उपयोग करके देखा जाता है। एसडीएस की उपस्थिति में γPNA ओलिगोमर स्व-इकट्ठा होने की टेम इमेजिंग से संकेत मिलता है कि 5.25 एमएम एसडीएस स्थिति 8\u201212 एनएम तक की चौड़ाई के साथ संरचनात्मक बंडलिंग में सबसे अधिक कटौती का संकेत देती है जैसा कि(चित्रा 7C)में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: जटिल नैनोस्ट्रक्चर के लिए ब्लॉक बनाने के रूप में पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड ओलिगोमर।
}डीएनए की रासायनिक संरचनाएं (पीएनए), पीएनए और एमपी युक्त γPNA इकाइयां। (चित्रा रेफरी21से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित किया गया है .) (ख)पीएनए-पीएनए हेलीक्लीज डीएनए-डीएनए हेलीक्लीज की तुलना में कम मुड़ रहे हैं, जिनके पास १०.५ के बजाय प्रति मोड़ 18 कुर्सियां हैं । (ग)इस तीन हेलिक्स स्ट्रक्चरल सिंगल स्ट्रैंडल टाइल (एसएसटी) मोटिफ में 9 अलग-अलग 12-बेस-लॉन्ग γPNA ओलिगोमर होते हैं, जिनमें से प्रत्येक में दो छह-बेस डोमेन होते हैं । (घ)संरचना के भीतर दो प्रकार के ओलिगोमर्स होते हैं: "समीपस्थ" किस्में जो एक ही हेलिक्स और हेलिक्स-फैले "क्रॉसओवर" किस्में पर मौजूद हैं। (ई)यह 18 आधार लंबी संरचनात्मक आकृति माइक्रोन पैमाने पर तंतुओं के रूप में बहुलक कर सकते हैं । पैनल बी, सी और ई रेफरी15से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि विभिन्न विलायक स्थितियों में चुनिंदा γPNA ओलिगोमर के घटता पिघला।
2-ओलिगोमर (पी 4, पी 5) 6-बेस डोमेन दिखाने वाला सबसेट 1x पीबीएस में उचित थर्मल स्थिरता (ब्लैक कर्व) के साथ बांध सकता है। 3-ओलिगोमर (पी 4, पी 5, पी 6) सबसेट 1x पीबीएस (ब्लू वक्र) में सहयोगशीलता के कारण थर्मल स्थिरता में वृद्धि दिखाता है और टीएम के संबंध में कोई अस्थिरता नहीं दिखाता है जब सॉल्वेंट को डीएमएफ (रेड डॉटेड कर्व) जैसे ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स में बदल दिया जाता है । रेफरी15से अनुमति लेकर चित्रा में संशोधन किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: नमूना TIRF इमेजिंग के लिए तरल प्रवाह चैनल के लिए प्रवाह चार्ट।
एक कदम-दर-कदम कार्यप्रवाह जो फ्लो चैनल असेंबली के बाद नैनोफाइबर के γPNA के टीआईआरएफ इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी में शामिल कदमों का संकेत देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: γPNA नैनोफाइबर स्वयं की TIRF माइक्रोस्कोपी इमेजिंग अलग विलायक परिस्थितियों में इकट्ठे हुए ।
γPNA नैनोफाइबर ने एसआईआरएफ माइक्रोस्कोपी (5 माइक्रोन स्केल बार) का उपयोग करके कल्पना की, जबकि γPNA ओलिगोमर(ए)७५% DMSO: पानी (v/v),(B)७५% DMF: पानी (v/v) और(सी)४०% Dioxane: पानी (v/v) सॉल्वेंट शर्तों में स्वयं इकट्ठे होते हैं । (घ)जब γPNA नैनोफाइबर स्वयं ७५% DMSO में इकट्ठे: पानी (v/v) प्रवाह चैनल के लिए बाध्य पानी में 1mM Trolox के साथ धोया जाता है, DMSO के दो चरण माइक्रोबबल-पानी के रूप में नैनोस्ट्रक्चर माइक्रोबबल के इंटरफेस के साथ संरेखित । रेफरी15से अनुमति लेकर चित्रा में संशोधन किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: नैनोफाइबर के γPNA TEM इमेजिंग स्वयं ७५% DMSO में इकट्ठे: पानी । (v/v) फॉर्मवर सपोर्ट लेयर कॉपर 300 मेश ग्रिड का उपयोग करना।
(A)कम आवर्धन (15x) के तहत कल्पना की गई γPNA नैनोफाइबर की टेम छवियां। (ख)उच्च आवर्धन (150x) के तहत कल्पना किए गए नैनोफाइबर के γPNA की टेम छवियां नैनोस्कोपिक संकल्पों पर चौड़ाई के साथ नैनोट्यूब की बंडलिंग दिखाती हैं । (ग)कॉपर ग्रिड पर फॉर्मवर-सिलिकॉन मोनोऑक्साइड सपोर्ट लेयर का उपयोग करके कम आवर्धन (10x) के तहत कल्पना किए गए γPNA नैनोफाइबर की टेम छवियां जोरदार नमूना स्थितियों के तहत इमेजिंग की अनुमति देती हैं। रेफरी15से अनुमति लेकर चित्रा में संशोधन किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: डीएनए के साथ चयनात्मक प्रतिस्थापन के आधार पर γPNA-डीएनए संकर के लिए विभिन्न मॉर्फोलोजी।
(A)टीआईआरएफ (5 माइक्रोन स्केल बार) और(सी)टीईएम इमेज (60x आवर्धन) γPNA-डीएनए हाइब्रिड की आत्म-असेंबली को स्थिर γPNA ओलिगोमर (पी 3, पी 5, पी9) को आइसोसेक्वेंटियल डीएनए ओलिगोमर (D3, D5 D9) के साथ नैनो को सीधे फिला मॉर्टिोलॉजी अपनाने पर दिखाते हैं । (B)टीआईआरएफ (5 माइक्रोन स्केल बार) और(डी)टेम छवियां (25x आवर्धन) γPNA-डीएनए संकर की आत्म-असेंबली की जगह क्रॉसओवर γPNA ओलिगोमर्स (पी 1, पी 4, पी 7) को आइसोसेक्वेंटियल डीएनए ओलिगोमर्स (D1, D4 D7) शो नैनोबर्फिस एक स्टेलेट मॉर्फोलॉजी अपनाते हैं । रेफरी15से अनुमति लेकर चित्रा में संशोधन किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: एसडीएस की अलग-अलग सांद्रता में नैनोफाइबर γPNA के लिए अलग-अलग मॉर्फोलॉजी।
ए) 5.25 m m और(B)17.5 mM की सांद्रतामें एसडीएस की उपस्थिति में γPNA नैनोफाइबर की स्व-असेंबली की टीआईआरएफ छवियां (5 माइक्रोन स्केल बार)। सीएमसी (8.2 एमएम) से कम एसडीएस सांद्रता की उपस्थिति में स्व-असेंबली फ्लोरेसेंस तीव्रता के आधार पर टीआईआरएफ छवियों से पतले मॉर्फोलोजी दिखाती है। (ग)यह प्रणाली के TEM छवियों (100x आवर्धन) द्वारा सत्यापित किया जाता है जहां नैनोफाइबर के लिए औसत चौड़ाई 8 \ u201212 एनएम की सीमा में निहित है । सीएमसी से काफी ऊपर सांद्रता पर, γPNA नैनोट्यूब अत्यधिक नेटवर्क नैनोट्यूब संरचनाओं के माध्यम से उच्च क्रम विधानसभाओं के रूप में दिखाई देते हैं। रेफरी15से अनुमति लेकर चित्रा में संशोधन किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

MATLAB स्क्रिप्ट स्ट्रिंग आउटपुट "thisSeq" पेनल्टी स्कोर "इसस्कोर"
' acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacccccc ctcgttgcccgc ttttaggcggggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgtatg ' 0.08
' cctcccccgccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgtttttat acgccattccccaa cggtcgttggaa gagatacaagg tatctcatttac atagcagtaat ' 0.0544
' tcgcaggagaca ctgcgggataa aacggctctattcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctctctct aaatggccgtt acattttaccaa cggcttggta ' 0.0688
' gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgacccccc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttttt ggcggtaaagga ' 0.0528
' सीजीजीगाकासी सीटीसीसीसीसीटीसी जीटीएगगागगाग जीटीजीटीकैटकग जीसीएटागटकैग तात्जीसीक्टगटीसीटीटीसीटीसीटीग तात्जीटीसीटीटीसीटीसीटीटीसीटीटीसी 0.0656
' aatgagccgttc taggcagata ctttcgccacaa cgaaagcagtcccc gcacgggggatg caatacgcccta gtattggggaa ttgttttcctc ' 0.0592
' gatggagacccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaata gcaacctctgg cgtttcggccga ' 0.0688
' tagccccccagt gggctctctctt ttcaggacgagagगट cgcaagatatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacccttt ' 0.0656
' tagcaacagaagac tgcctaccactc tttggagag tagcccctgcg gggctcccatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtagt ' 0.0736
'aatgtgtctc cccccttc cgccaagaaggg gtgctgttattgc cagcacgtagtag gatagattagtc cctcgttgggc ccgaggtcaaac gcataagtga' 0.0768
' ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaagaagcat accgaggaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgctc tgtagggcc tgttcagggcac ' 0.0576
' ctgtaaggtctc ttacagtgctt cacgcaagcac ttcggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcg gtccgcctatttttttag ' 0.072
' actccaatcttttttt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggggc atagatggtt ctgcgggggtag ccgcaggtcc attactgaagac ' 0.064
' ggttgttccacg acaacctgagc ttatgtgcttca ttgccgcg gggcaattc cgtgagaaga ctactgacataa cagtaggatgg cgctcgcatcgt ' 0.0688
' गैटगक्टगटीसीटीटी सीएएटीसीटीसीटीटी एजीसीजीगाग कैटाएकाग टगगगटीसीटीसीएसी ̈गगग सीटीएजीजीटीसीसीटीसीटी सीसीजीटीटीसीटीसी सीटीजीजीजीगागा ' 0.0688
' gaagggtctaatg accttcatttg gcagttcaggat ttggtagcggg taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtagg ctccgccactt ' 0.0576
' tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcagggcctagttccg acgagtatttcccc actcgttttg ccgcctcaaaat ' 0.0624
'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgga ccacacttactg gtgtggtcgct tcaagagccga ggcgttggat aacgccct cagtaagatag' 0.0656
' agaggtctgtgatt cggtttgagt cggtttactcac actttcccaa gaagtccatcccc aatacgggatgg tagcccaccg gggctaaggcga ttgctggcccct ' 0.0688
' cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaat cgtgtcctctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcctg ' 0.0704

तालिका 1: γPNA अनुक्रम डिजाइन के संभावित अनुकूलन के लिए 20 नमूना एल्गोरिथम परिणाम। कॉलम 1 में अनुक्रम आउटपुट और कॉलम 2 में उनके संबंधित स्कोर के साथ 20 नमूना एल्गोरिथम परिणाम। सबसे कम स्कोर प्राप्त करने के लिए स्क्रिप्ट के दोहराए गए पुनरावृत्ति किए जाते हैं।

γPNA अनुक्रम आईडी अनुक्रम डोमेन 1 पूरक डोमेन 2 पूरक
पी 1 एन-AATAGGTTCAC-C पी 2 डोमेन 1 पी 6-बायोटिन डोमेन 1
पी 2 एन-GCTATTGAGTAA-सी पी 1 डोमेन 1 पी 3 डोमेन 2
पी 3 एन-जीएकैटेटेक्टैक-सी पी 7 डोमेन 2 पी 2 डोमेन 2
पी 4 एन-CTGGCGTGCGGA-C पी5 डोमेन 1 पी9 डोमेन 1
पी 5 एन-सीजीसीसीसीसीसीसीटीसीजी-सी पी 4 डोमेन 1 पी6-बायोटिन डोमेन 2
पी6-बायोटिन एन-बायोटिन-जीटीगाक्गैगजीजीजी-सी पी 1 डोमेन 2 पी5 डोमेन 2
पी7 एन-एजीटीटीटीजीजीटीसी-सी पी8-Cy3 डोमेन 1 पी 3 डोमेन 1
पी8-Cy3 एन-Cy3-AAAACTACAGAAGAA-सी पी 7 डोमेन 1 पी9 डोमेन 2
पी9 एन-टीसीसीकैटटीसीटी-सी पी 4 डोमेन 2 पी8-Cy3 डोमेन 2

तालिका 2: नैनोफाइबर के लिए γPNA अनुक्रम डिजाइन परिणाम। इस तालिका में दर्शाए गए व्यक्तिगत अल्पाधिकार दृश्यों को उत्पन्न किया गया था। रेखांकित कुर्सियां मिनी खूंटी के साथ गामा-स्थिति संशोधनों का संकेत देती हैं। रेफरी15से अनुमति लेकर टेबल में बदलाव किया गया है ।

तापमान सीमा रैंप दर
90 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए पकड़ो
90-80 डिग्री सेल्सियस 0.1 डिग्री सेल्सियस/मिनट
80-70 डिग्री सेल्सियस 0.1 डिग्री सेल्सियस/मिनट
70-60 डिग्री सेल्सियस 0.1 डिग्री सेल्सियस/
60-50 डिग्री सेल्सियस 0.1 डिग्री सेल्सियस/
50-40 डिग्री सेल्सियस 0.1 डिग्री सेल्सियस/
40-30 डिग्री सेल्सियस 0.1 डिग्री सेल्सियस/मिनट
30-20 डिग्री सेल्सियस 0.1 डिग्री सेल्सियस/मिनट
4 डिग्री सेल्सियस अनिश्चितकालीन पकड़ो

तालिका 3: थर्मल साइकिलर के लिए एनील रैंप प्रोटोकॉल। रेफरी15से अनुमति लेकर टेबल में बदलाव किया गया है ।

स्टॉक एकाग्रता 75% DMSO: पानी (v/v) एनील नमूना 75% DMF: पानी (v/v) एनियल नमूना 40% डायोक्सेन: पानी (v/v) एनील नमूना अंतिम एकाग्रता
γPNA ओलिगोमर (x9) 20 माइक्रोन 9 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 9) 9 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 9) 9 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 9) 500 एनएम
डीएमएसओ - 30 माइक्रोन - - 75% (v/v)
डीएमएफ - - 30 माइक्रोन - 75% (v/v)
1,4-डायोक्सेन - - - 16 माइक्रोन 40% (v/v)
डिवोनाइज्ड वाटर - 1 माइक्रोल 1 माइक्रोल 15 माइक्रोन 25 या 60% (v/v)
कुल मात्रा - 40 माइक्रोन 40 माइक्रोन 40 माइक्रोन -

तालिका 4: विभिन्न सॉल्वेंट परिस्थितियों में γPNA ओलिगोमर के एनील बैच तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल।

डीएनए सीक्वेंस आईडी अनुक्रम
D1 5'-AaTAGGTTCAC-3'
D3 5'-GACATCTTACTC-3'
D4 5'-CTGGCGTGCGGA-3'
D5 5'-CGCCAGCCCTCG-3'
D7 5'-AGTTTTGATGTC-3'
D9 5'-TCCGCATTCTGT-3'

तालिका 5: γPNA के लिए प्रतिस्थापन ओलिगोमर के रूप में आइसोसेक्वेनेंटियल डीएनए अनुक्रम। रेफरी15से अनुमति लेकर टेबल में बदलाव किया गया है ।

स्टॉक एकाग्रता डीएनए समीपस्थ स्ट्रैंड प्रतिस्थापन डीएनए क्रॉसओवर स्ट्रैंड रिप्लेसमेंट अंतिम एकाग्रता
γPNA ओलिगोमर (x6) 20 माइक्रोन 6 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 6) 6 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 6) 500 एनएम
डीएनए ओलिगोमर (x3) 20 माइक्रोन 3 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 3) 3 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 3) 500 एनएम
डीएमएसओ - 30 माइक्रोन 30 माइक्रोन 75% (v/v)
डिवोनाइज्ड वाटर - 1 माइक्रोल 1 माइक्रोल 25% (v/v)
कुल मात्रा - 40 माइक्रोन 40 माइक्रोन -

तालिका 6: 75% डीएमएसओ में γPNA-डीएनए हाइब्रिड नैनोस्ट्रक्चर के एनियल बैच तैयार करनेके लिए प्रोटोकॉल: एच2ओ (v/v) समीपस्थ या क्रॉसओवर γPNA ओलिगोमर्स के प्रतिस्थापन के माध्यम से आइसोसक्विंटिनियल डीएनए ओलिगोमर्स के साथ।

स्टॉक एकाग्रता सीएमसी के नीचे एसडीएस सांद्रता सीएमसी के ऊपर एसडीएस सांद्रता अंतिम एकाग्रता
γPNA ओलिगोमर (x9) 20 माइक्रोन 9 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 9) 9 माइक्रोन (1 माइक्रोन x 9) 500 एनएम
6% एसडीएस 6% (wt/v) 1 माइक्रोल - 5.25 mM
20% एसडीएस 20% (wt/v) - 1 माइक्रोल 17.5 mM
डीएमएसओ - 30 माइक्रोन 30 माइक्रोन 75% (v/v)
डिवोनाइज्ड वाटर - - - 25% (v/v)
कुल मात्रा - 40 माइक्रोन 40 माइक्रोन -

तालिका 7: सीएमसी के नीचे और ऊपर एसडीएस सांद्रता की उपस्थिति में 75% डीएमएसओ: एच2ओ (v/v)में γPNA नैनोस्ट्रक्चर के एनियल बैच तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल।

अनुपूरक चित्रा 1: प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट PNA3nanofiber.m अल्पाभ दृश्यों को डिजाइन करने के लिए। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह लेख कार्बनिक विलायक मिश्रण की ओर मौजूदा न्यूक्लिक एसिड नैनो टेक्नोलॉजी प्रोटोकॉल को अनुकूल बनाने और बेहतर बनाने पर केंद्रित है। यहां वर्णित तरीकों का चयन ध्रुवीय एपरोटिक कार्बनिक सॉल्वैंट्स के एक परिभाषित प्रयोगात्मक अंतरिक्ष के भीतर संशोधनों और समस्या निवारण पर ध्यान केंद्रित । इस अंतरिक्ष के भीतर अन्य स्थापित न्यूक्लिक एसिड नैनोटेक्नोलॉजी प्रोटोकॉल के लिए अभी तक बेरोज़गार क्षमता है । इससे पॉलीमर और पेप्टाइड संश्लेषण जैसे अन्य क्षेत्रों में एकीकरण के माध्यम से संभावित अनुप्रयोगों में सुधार हो सकता है जो आमतौर पर इसी तरह के जैविक सॉल्वैंट्स25,26में किया जाता है । इसके अतिरिक्त, हम यहां उपर्युक्त प्रोटोकॉल का अभ्यास करते समय देखे जाने वाले महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

सेल्फ असेंबली के लिए सैंपल तैयार करने के दौरान डीएमएसओ और डीएमएफ की शर्तों के लिए पानी के वॉल्यूम प्रतिशत को 25% (v/v) पर रखना जरूरी है । तदनुसार, यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि स्वयं-असेंबली के लिए उपयोग किया जाने वाला ऑर्गेनिक सॉल्वेंट निर्जल स्टॉक से भी होना चाहिए। नैनोफाइबर संरचनाएं हाइड्रोफोबिक हैं और पानी की मात्रा में वृद्धि हुई हैं।

मचान डीएनए ओरिगेमी दृष्टिकोणों के विपरीत जो असतत लंबाई की संरचनाएं बना सकते हैं, नैनोफाइबर और अन्य पहले स्थापित डीएनए एसएसटी नैनोट्यूब γPNA के लिए वर्तमान एसएसटी आकृति डिजाइन असतत लंबाई की संरचनाओं को नहीं उपजता है। नैनोट्यूब बहु-माइक्रोन लंबाई (11 माइक्रोन तक) की एक श्रृंखला को प्राप्त करने के लिए बहुलक हैं। इसी कारण से, संरचना गठन से जुड़ी उपज की मात्रा निर्धारित नहीं की जा सकती है।

हालांकि, γPNA की बिना चार्ज पेप्टाइड बैकबोन के कारण, संरचना गठन के संबंध में काउंटर आयन बैलेंस पर कोई निर्भरता नहीं है। इमेजिंग बफ़र्स, इसलिए, प्राकृतिक रूप से होने वाले न्यूक्लिक एसिड से बने नैनोस्ट्रक्चर के स्थिरीकरण के लिए आमतौर पर आवश्यक एमजी2 + जैसे cations को शामिल करने की आवश्यकता नहीं है।

अंत में, विभिन्न सॉल्वेंट स्थितियों में नैनोस्ट्रक्चर बंडलिंग और एकत्रीकरण γPNA भी आत्म-असेंबली के दौरान पेश की गई व्यक्तिगत अल्पाहार सांद्रता पर निर्भर हैं। 1 माइक्रोन और व्यक्तिगत ओलिगोमर के उच्च से लेकर सांद्रता बंडलिंग और एकत्रीकरण के लिए प्रवृत्ति को बढ़ाती है और टीआईआरएफ या टेम इमेजिंग के दौरान नैनोस्ट्रक्चर की स्पष्ट इमेजिंग को प्रभावित करती है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 1739308, एनएसएफ कैरियर ग्रांट 1944130 और वायु सेना कार्यालय द्वारा विज्ञान अनुसंधान अनुदान संख्या FA9550-18-1-0199 द्वारा समर्थित किया गया था। γPNA सीक्वेंस ट्रूकोड जीन रिपेयर, इंक के डॉ तुमुल श्रीवास्तव की ओर से उदार उपहार थे । हम डीएनए डिजाइन टूलबॉक्स मैटलैब कोड पर उनकी उपयोगी बातचीत के लिए डॉ एरिक विनफ्रे और डॉ रिज़ल हरियादी को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम TEM डेटा के संग्रह में उनकी सहायता के लिए जोसेफ सुहान, मारा सुलिवान और सेंटर फॉर बायोलॉजिकल इमेजिंग का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γPNA strands/oligomers Trucode Gene Repair Inc. Section 2.1
UV-Vis Spectrophotometer Agilent Varian Cary 300 Section 3.1.2
Quartz cuvettes Starna 29-Q-10 Section 3.1.1
Thermal cycler Bio Rad C1000 touch Section 4.1
0.2 mL PCR tubes VWR 53509-304 Section 4.5
Anhydrous DMF VWR EM-DX1727-6 Section 4.6
Anhydrous DMSO VWR EM-MX1457-6 Section 4.6
Anhydrous 1,4-Dioxane Fisher Scientific AC615121000 Section 4.6
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 75800-994 Section 3.1.1
Microscope slides VWR 89085-399 Section 5.2
Glass cover slips VWR 48382-126 Section 5.2
2% Collodion in Amyl Acetate Sigma-Aldrich 9817 Section 5.2
Isoamyl Acetate VWR 200001-180 Section 5.2
Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) Sigma-Aldrich A8549 Section 5.3
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 Section 5.4
Streptavidin Sigma-Aldrich 189730 Section 5.5
Trolox Sigma-Aldrich 238813 Section 5.7
Total Internal Reflection Fluorescence microscope Nikon Nikon Ti2-E Section 5.8
Transmission Electron Microscope Joel JEM 1011 Section 6.6
Tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 6.3
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Section 6.1
Formvar, 300 mesh, Copper grids Ted Pella Inc. 1701-F Section 6.2
Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids Ted Pella Inc. 1829 Section 6.2
DNA oligomers/strands IDT Section 7.1
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) VWR 97064-860 Section 8.1

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References

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कार्बनिक सॉल्वेंट मिश्रण में जटिल नैनोस्ट्रक्चर में गामा-संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड की आत्म-असेंबली
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