Summary
מאמר זה מספק פרוטוקולים עבור תכנון והרכבה עצמית של nanostructures מ אוליגומרים חומצת פפטיד שונה גמא תערובות ממיסים אורגניים.
Abstract
האסטרטגיות הנוכחיות ב- DNA וננוטכנולוגיה של RNA מאפשרות הרכבה עצמית של מגוון ננו-מבנים של חומצות גרעין במדיה מימית או hydrated באופן משמעותי. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים בניית ארכיטקטורות ננופייבר בתערובות ממס אורגניות באמצעות הרכבה עצמית של אריחי חומצת פפטיד (γPNA) הניתנים לטיפול ייחודי, חד-תקעים, שעברו שינוי גמא. כל אריח חד-תקע (SST) הוא אוליגומר γPNA בן 12 בסיסים המורכב משני תחומים מודולריים שרשור של 6 בסיסים כל אחד. כל תחום יכול להיקשר לתחום משלים הדדית נוכח על גדילים שכנים באמצעות השלמה מתוכנתת כדי ליצור nanofibers שיכול לגדול מיקרונים באורך. מוטיב SST עשוי 9 אוליגומרים סה"כ כדי לאפשר היווצרות של nanofibers 3-סליל. בניגוד לננו-מבנים אנלוגיים של דנ"א, אשר יוצרים מבנים קוטר-מונודיספרז, מערכות γPNA אלה יוצרות ננו-פייברים המארזים לאורך רוחבם במהלך הרכבה עצמית בתערובות ממס אורגניות. פרוטוקולי הרכבה עצמית המתוארים כאן ולכן כוללים גם פעילי שטח קונבנציונליים, נתרן דודצ'יל סולפט (SDS), כדי להפחית את השפעות הצרור.
Introduction
בנייה מוצלחת של ננו-מבניםמורכבים רבים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 במדיה מיקווית או hydrated באופן משמעותי עשה באמצעות חומצות גרעין טבעיות כגון DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ו- RNA 11,12 הוצגו בעבודות קודמות. עם זאת, חומצות גרעין המתרחשות באופן טבעי עוברות שינויים קונפורמיים דו-סטריים או צמצמו את היוצקותהתרמיות בתערובות ממס אורגני 13,14.
בעבר, המעבדה שלנו דיווחה על שיטה לבניית ננו-פייברים עם 3 סלילים באמצעות חיקויי חומצות גרעין סינתטיות שעברו מיקום גמא הנקראים חומצות גרעין גמא-פפטיד (γPNA)15 (איור 1A). הצורך בפיתוח כזה ויישומים פוטנציאליים של חומצת גרעין סינתטי לחקות PNA נדונה בתוךהשדה 16,17. הראינו, באמצעות הסתגלות של אריח חד גדילי (SST) אסטרטגיה שהוצגו עבור nanostructures DNA18,19,20, כי 9 אוליגומרים γPNA ברור ברצף יכול להיות מתוכנן ליצור nanofibers סליל 3 בתערובות ממס אורגני קוטבי נבחר כגון DMSO ו- DMF. אוליגומרים γPNA הוזמנו מסחרית עם שינויים של (R)-diethylene גליקול (מיני PEG) בשלוש עמדות γ (1, 4 ו 8 עמדות בסיס) לאורך כל אוליגומר 12 בסיס מבוסס על שיטות שפורסמו על ידי Sahu et al. 21 שינויים אלה גמא לגרום טרום ארגון helical המשויך זיקה מחייבת גבוהה יותר ויציבות תרמית של γPNA יחסית PNA ללא שינוי.
מאמר זה הוא התאמה של העבודה המדווחת שלנו שבו אנו חוקרים את ההשפעות של פתרון ממס והחלפה עם DNA על היווצרות של nanostructures מבוססי γPNA15. מטרת מאמר זה היא לספק תיאורים מפורטים של העיצוב, כמו גם פרוטוקולים מפורטים עבור שיטות מותאמות ממס שפותחו עבור הרכבה עצמית ואפיון של nanofiber γPNA. לכן, אנו מציגים לראשונה את אסטרטגיית SST מודולרית, פלטפורמה כללית עבור עיצוב nanostructure באמצעות חומצת גרעין סינתטי לחקות PNA.
המגרש הסללי לדופלקסים של PNA דווח על 18 בסיסים לכל סיבוב בהשוואה לדופלקסים של דנ"א, שעוברים סיבוב אחד לכל 10.5 בסיסים (איור 1B). לכן, אורך התחום של SSTs γPNA הפגינו נקבע על 6 בסיסים כדי להכיל שליש סיבוב מלא או 120° של סיבוב כדי לאפשר אינטראקציה בין שלושה helices מערך משולש. כמו כן, שלא כמו מוטיבים קודמים של SST, כל SST מכיל רק 2 תחומים, ויוצר ביעילות מבנה חד-ממדי דמוי רצועת הכלים העוטף ליצירת צרור שלוש סלילים (איור 1C). כל אוליגומר γPNA בן 12 בסיסים משתנה ב-1, 4 ו-8 המיקומים כדי להבטיח חלוקה במים אחידים של קבוצות מיני-PEG במוטיב SST הכולל. בנוסף, בתוך המוטיב ישנם שני סוגים של אוליגומרים: גדילים "רציפים" הקיימים על סליל יחיד וגדילי "קרוסאובר" פורשים סליל (איור 1D). בנוסף, אוליגומרים P8 ו- P6 מסומנים עם Cy3 פלואורסצנטי (כוכב ירוק) וביוטין(אליפסה צהובה),בהתאמה ( איור 1D ), כדי לאפשר זיהוי של היווצרות מבנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסך הכל, מוטיב SST עשוי 9 אוליגומרים סה"כ כדי לאפשר היווצרות של nanofibers 3-סלילים באמצעות השלמה מתוכנתת של כל תחום בודד לתחום המתאים על אוליגומר שכן (איור 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב רצף γPNA
- הורד את ארגז הכלים לעיצוב DNA22 שפותח על ידי מעבדת Winfree ב Caltech23 לתוך התיקייה המכילה סקריפטים תכנות לעיצוב רצפים.
- בתוך תיקיית עיצוב רצף זו, פתח שפת תיכנות מהדור הרביעי התואמת לסיומת הקובץ ".m" ולאחר מכן הוסף את התיקיה "DNAdesign" שהורדת בעבר לנתיב באמצעות הפקודה הבאה:
>> הוסף עיצוב DNAdesign - לאחר מכן הפעל את קובץ ה- Script הבא בשם "PNA3nanofiber.m" (ראה איור משלים 1) באמצעות הפקודה הבאה:
>> PNA3נאנופייבר - הפעל קובץ Script זה כדי ליצור משתנים הנקראים "thisSeqs" ו- "ThisScore". המשתנה "thisSeqs" מכיל את הרצפים של האוליגומרים המעוצבים, ו-"thisScore" הוא ציון העונשין.
- הפעל את קובץ ה- Script מספר פעמים כדי לקבל את הציון המינימלי ביותר. מדגם של 20 ריצות כאלה מוצג בטבלה 1.
- אשר באופן ידני את המשלימות הרצויה של Watson-Crick של כל תחום של הרצפים שנוצרו עבור המוטיב המבני שצוין של SST. מפרטי רצף עבור מבנה nanofiber 3 סליל מוצגים בטבלה 2.
- אמת את הפרטים הבאים עבור רצפים שנוצרו.
- הימנע משימוש בארבעה בסיסי C ו- G רצופים.
- בחר באופן ידני רצפים ספציפיים לפונקציונליזציה של N-terminal עם מולקולות צבע פלואורסצנטי וביוטין כדי לאפשר מחקרי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיים.
- כלול לפחות 3 מיני-PEG גמא-שינויים על עמוד השדרה כדי לאפשר קונפורמציה סללי מאורגן מראש אוליגומרים חד נטושים כפי שתואר על ידי Sahu et al. 21
2. הכנת גדילי מניות γPNA
- השג גדילי רכיב γPNA של רצפים שצוינו בסינתזה בקנה מידה של 50 נמול עם טיהור כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעל ביצועים גבוהים מיצרן מסחרי.
- תן מחדש כל גדיל במים deionized ל 300 ריכוזי μM. אחסן את הגדילים המתווסכלים במקפיא ב-20 מעלות צלזיוס עד מספר חודשים עד לצורך בניסויים.
3. מחקרי עקומת היתוך של תת-קבוצות אוליגומר γPNA
- השג טווחי טמפרטורה נמסים עבור שילובים שונים של תת-קבוצות משלימות של 2 אוליגומר ו- 3 אוליגומרים על-ידי הפעלת מחקר עקומת התכה במאגרים מימיים כגון 1x phosphate buffered saline (PBS) או ממס אורגני קוטבי מועדף כגון דימתילפורממיד (DMF) או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) (ראה איור 2).
הערה: עקומות התכה תרמית ב- >50% מ- DMF מתחילות לאבד את קו הבסיס העליון ומראות הפרעות חמורות בין השאר בגלל ספיגה גבוהה של DMF באורך הגל הנדרש לניסויים. זוהי תופעה ידועה בספרות24. עם זאת ניתן להשיג את עקומות ההיתוך ב 5 מיקרומטר לכל ריכוזי גדיל בתנאים ממס אלה.- Aliquot 16.7 μL מתוך 300 μM המניות של כל אוליגומר ולעשות את הנפח הסופי 1000 μL או ב 1x PBS או 100% (v / v) DMSO או 100% (v / v) DMF ביעילות להשיג 5 μM ריכוז סופי לכל אוליגומר. מעבירים את תערובת התת-קבוצה האוליגומרית לנתיב אופטי באורך 1 ס"מ, קובט קוורץ.
- בצע ניסויי UV-Vis בטמפרטורה משתנה בספקטרופוטומטר המצויד בבלוק טמפרטורה ניתן לתיכנות.
- לאסוף נקודות נתונים עבור עקומות ההיתוך על פני טווח טמפרטורות של 15 \u201290 °C (690 °F) עבור מחזורי קירור (חישול) וחימום (נמס) בקצב של 0.5\u20121 °C/min. שמור את הדגימות במשך 10 דקות ב 90 מעלות צלזיוס לפני הקירור ב 15 °C (60 °F) לפני החימום. לקבוע את טמפרטורתההיתוך(T m ) מהשיא של הנגזרת הראשונה של עקומת החימום.
- ודא כי טווחי טמפרטורת ההיתוך עבור תת-קבוצות 2-אוליגומר הם מעל 35 °C (60 °F) בכל המקרים ממס. בנוסף, ודא כי תת-קבוצות 3-oligomer המתאימות המכילות גדיל נוסף לתתת-הקבוצה המקבילה שלהם 2-oligomer מראה עלייה ניכרת ב- Tm עקב שיתוף פעולה מוגבר.
הערה: זה יוודא כי הרכבה עצמית סיר יחיד של אוליגומרים מרובים יכול לקפל שיתוף פעולה לתוך nanostructure הרצוי עם יציבות תרמית סבירה.
4. פרוטוקול הרכבה עצמית עבור אוליגומרים נפרדים מרובים של γPNA
הערה: כדי לתכנן פרוטוקול רמפה תרמית להרכבה עצמית עבור nanostructures γPNA, חישול רמפה איטית רצוי.
- במקרה של רצפי אוליגומר שנוצר, anneal את הדגימות עבור 22.5 שעות בקירור רוכב תרמי מ 90 °C (60 °F). בדרך כלל, טמפרטורת ההיתוך המתקבלת עבור 2-אוליגומר ו 3-אוליגומר γPNA subsets לשכב בטווחים של 40 \u201270 °C (70 °F) עבור תנאי ממס שונים.
- לתכנת את האופניים התרמיים כדלקמן: להחזיק ב 90 °C (60 °F) במשך 5 דקות, רמפה למטה מ 90 °C (70 °F) בקצב קבוע של 0 °C (70 °F/ min, רמפה למטה מ 70 °C (70 °F) בקצב של 0 °C (70 °F/3 דקות, רמפה למטה מ 40 °C (60 °F) בקצב של 0 °C (60 °F/ min) ולהחזיק ב 4 °C (ראה טבלה 3). ניתן לאחסן דגימות ב- 4 °C (70 °F) עבור 12\u201224 שעות לפני האפיון.
הערה: בעוד 2- ו 3- oligomer subsets של מערכת nanofiber שלנו יכול להיווצר PBS 1x, nanofibers בקנה מידה מיקרון מלא לצבור PBS 1x. לכן, תנאי ממס צריך להיות אופטימיזציה בהתבסס על קנה המידה והגודל של המבנה שנוצר, כמו גם את סוג וצפיפות של שינויים גמא. - עבור מיקרון בקנה מידה ארוך 3-סליל nanofibers, להכין דגימות אצווה anneal ב 75% DMSO: H2O (v / v), 75% DMF: H2O (v / v), 40% 1,4-דיוקסן: H2O (v / v) מבוסס על מחקריאופטימיזציה ממס 15.
- הכן אצוות אנאליות כדלקמן (ראה טבלה 4). ראשית, להכין 10 μL תת מניות ב 20 μM ריכוזים מן 300 μM המניות העיקריות עבור כל אוליגומר על ידי aliquoting 0.67 μL מהמלאי הראשי ולהפוך את הנפח ל 10 μl באמצעות מים deionized.
- Aliquot 1 μL מ 20 μM תת מניות עבור כל אוליגומר ולהוסיף אותו צינור PCR 200 μL. זה מהווה נפח כולל של 9 μL עבור 9 אוליגומרים.
- הוסף 30 μL של DMSO / DMF נטול מים עבור 75% DMSO ו 75% מקרי DMF עם μL נוסף של מים deionized לעשות נפח סופי של 40 μL עם כל אוליגומר ב 500 ננומטר ריכוזים סופיים. הוסף 16 μL של 1,4-דיוקסן ולעשות את הנפח עם מים deionized ל 40 μL עבור 40% מצב ממס דיוקסן.
- טען את אצוות anneal על רוכב האופניים התרמי anneal באמצעות הפרוטוקול שהוזכר בשלב 4.2.
5. סה"כ הדמיית מיקרוסקופיה של השתקפות פנימית (TIRF)
- הכינו תא לחות מתיבת טיפים ריקה של פיפטה. מלאו את הקופסה בכ-5 מ"ל מים כדי למנוע ייבוש של תעלות הזרימה לדוגמה המתוארות כדלקמן (ראו איור 3).
- הכינו תא זרימה עם מגלשת מיקרוסקופ, 2 רצועות סרט דו-צדדיות וכיסוי מצופה ניטרוסלולוז. כדי לצפות את כיסוי עם nitrocellulose, לטבול את כיסוי בתוך מקור המכיל 0.1% קנודיון אטיל אצטט ויבש באוויר.
- הכן את פתרון nitrocellulose על ידי ביצוע דילול 20-פי 20 מ מסחרי זמין 2% קנודיה אטיל אצטט עם ממס אצטט isoamyl.
- הכן ביוטינילציה בסרום בסרום (Biotin-BSA) פתרון על ידי שקילה 1 מ"ג של ביוטין-BSA והמסתו ב 1 מ"ל של 1x PBS. זרימה 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל ביוטין-BSA במאגר PBS 1x על ידי הצבת ערוץ הזרימה בזווית. הדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
- הכן את מאגר לשטוף על ידי המסת 1 מ"ג של BSA ב 1 מ"ל של 1x PBS. לשטוף את עודף ביוטין-BSA על ידי זורם 15 μL של מאגר לשטוף. כדי להעביר את פני השטח, הדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
- הכן את פתרון סטרפטבידין על ידי מדידת 0.5 מ"ג של סטרפטבידין ו 1 מ"ג של BSA ולאחר מכן המסה באמצעות 1 מ"ל של 1x PBS. זרימה 15 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל סטרפטבידין ב 1x PBS המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA. הדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. זרימה 15 μL של מאגר לשטוף לשטוף את סטרפטבידין מאוגד.
- זרימה 15 μL של אצווה annealed בעבר של אוליגומרים γPNA ב 500 nM ריכוז לכל גדיל או 75% DMSO, 75% DMF או 40% 1,4-מצב דיוקסן. להדגירה את ערוץ הזרימה במשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
- הכן 1 mM Trolox בתנאי ממס מועדפים על ידי דילול 10-פי מ"מ מלאי של 10 מ"מ של טרולוקס ב- DMSO (למדוד 2.5 מ"ג של טרולוקס להתמוסס ב 1 מ"ל של DMSO). לשטוף את nanostructures מאוגדים בערוץ הזרימה עם 15 μL של 1 mM Trolox בעל הרכב ממס זהה ננו.
הערה: תוכן DMSO של >50% בערוץ הזרימה יגרום להפרעות אות קלות עקב האינדקס השונה של שבירה של מצב הממס במהלך TIRF אשר מכויל בדרך כלל עבור זוויות TIRF של מים מכסים. זה יכול להיות מתוקן על ידי שטיפה עם 1 mM Trolox שנעשו על ידי דילול 10 mM Trolox 10-פי באמצעות מים deionized. טכניקה זו מספקת תמונות ברורות יותר, אך שימושית רק להערכת אם היווצרות התרחשה, עם זאת, מכיוון שהיא מייצרת מיקרו-בועות דו-פאזיות בערוץ הזרימה. כתוצאה מכך, ננו-מבנים עשויים להיות גלויים בממשק של שני השלבים כפי שמוצג איור 4D. - העבר את ערוץ הזרימה אל מחזיק השקופית והתמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בהדמיית TIRF באמצעות מטרה של טבילת שמן פי 60 וזכוכית מגדלת של פי 1.5. סרוק את ערוץ הזרימה בהגדלה של 60x או 90x על-ידי ניטור ערוץ Cy3 (ראה איור 4).
6. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) הדמיה
- לשקול 0.5 גרם של אצטט אורניל ב 50 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין 1% אצטט אורניל אצטט פתרון. סנן את תותב הכתם של 1% אורניל אצטט מים באמצעות מסנן μm 0.2 המחובר למזרק.
הערה: לחילופין, ניתן לרכוש 2% אצטט אורניל מימי מיצרניל מסחרי. - רכשו רשתות נחושת מצופות Formvar מסחריות עם רשת שינוי בגודל 300 רשתות שינוי.
הערה: חשוב לציין כי שכבת התמיכה formvar יכול להיות מומס משם על ידי ממיסים כמו DMSO מעבר 2 דקות. עבור דגירה מדגם ארוך יותר, formvar זמין מסחרית התייצב עם חד תחמוצת הסיליקון על רשתות נחושת זמינים המאפשרים לרשת להיות הידרופילי יותר מאשר רשתות מצופות פחמן והוא יכול לעמוד בתנאי מדגם נמרצים קרן אלקטרונים כפי שמוצג באיור 5C. - פיפטה 4 μL של מדגם על הרשת עבור 15 s. השתמש בפיסת נייר סינון כדי לבטל את הדגימה על-ידי הבאת נייר הסינון במגע עם הרשת מהצד.
- מיד להוסיף 4 μL של פתרון הכתם על הרשת עבור 5 s.
- פתיל את הכתם כמו קודם ולהחזיק את נייר המסנן נגד הרשת במשך 1\u20122 דקות כדי לוודא את הרשת יבשה. יש לדמיין דוגמאות בדרך כלל בטווח של 1\u20122 שעות לאחר הכתם. לחלופין, אם הרשת מובטחת להיות יבש לחלוטין, רשתות ניתן לאחסן בתיבת אחסון רשת TEM עד 3 ימים לפני הדמיה.
- העבר את הרשת למחזיק דגימת TEM ולתמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור המופעל ב- 80 kV עם הגדלה הנעה בין 10 K ל- 150K (ראה איור 5).
7. מורפולוגיות שונות עבור כלאיים γPNA-DNA מבוסס על החלפה סלקטיבית עם DNA
- השג אוליגומרים DNA של רצפים שצוינו (ראה טבלה 5) מיצרני אוליגונוקלאוטיד מסחרי מסונתז ב 25 סולם nmol באמצעות התפלה סטנדרטית. השתמשו מחדש ברצפי הדנ"א האלה באמצעות מים לא מיונים נטולי RNase בריכוזי מלאי של 20 מיקרומטר.
- להחלפת גדילי γPNA רציפים בדנ"א, רצפים D3, D5 ו-D9 יכולים להחליף גדילים p3, p5 ו-p9. באופן דומה, עבור החלפת גדיל γPNA מוצלב עם DNA, רצפים D1, D4 ו D7 יכול להחליף גדילים p1, p4 ו p7.
- Aliquot 1 μL מתוך 20 μM תת מניות עבור כל γPNA או DNA אוליגומר ולהוסיף אותו צינור PCR 200 μL כמו בשלב 2.7. הוסף 30 μL של DMSO נטול מים נטולי מים נטולי RNase כדי להפוך את הנפח הסופי ל 40 μL (ראה טבלה 6).
- טען את אצוות anneal על רוכב האופניים התרמי anneal באמצעות הפרוטוקול שהוזכר בשלב 4.2.
- לאפיין ננו-מבנים היברידיים γPNA-DNA באמצעות פרוטוקול TIRF לאחר שלבים בסעיף 5 או באמצעות פרוטוקול הדמיית TEM המוזכר בסעיף 6 (ראה איור 6).
8. מורפולוגיות שונות עבור nanofibers γPNA בריכוזים משתנים של SDS
- הכן 20% (wt / v) SDS המניה העיקרית על ידי מדידת 20 מ"ג של SDS והמסתו ב 100 μL של מים deionized.
- הכן 6% (wt /v) SDS תת מניות על ידי aliquoting 3 μL מ 20% מניית SDS ו ביצוע נפח 10 μL באמצעות מים deionized.
- אנאל אוליגומרים γPNA בריכוזים הסופיים של 5.25 mM ו 17.5 mM SDS כדלקמן. Aliquot 1 μL מתוך 20 μM תת מניות עבור כל אוליגומר γPNA ולהוסיף אותו צינור PCR 200 μL כמו בשלב 2.7. הוסף 30 μL של DMSO נטול מים ו μL אחד של 6% ו 20% SDS כדי להפוך את הנפח הסופי ל 40 μL כדי להשיג ריכוזים סופיים SDS של 5.25 mM ו 17.5 mM, בהתאמה (ראה טבלה 7).
- לטעון את האצוות anneal של ריכוזי SDS שונים על רוכב האופניים התרמי anneal באמצעות הפרוטוקול שהוזכר בשלב 4.2.
- לאפיין ננו-מבנים γPNA בנוכחות SDS באמצעות פרוטוקול TIRF בעקבות שלבים בסעיף 5 או באמצעות פרוטוקול הדמיית TEM המוזכר בסעיף 6 (ראה איור 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקולים שנדונו בסעיפים לעיל מתארים את העיצוב של מוטיב SST מותאם של ננו-פייברים DNA עבור הדור החזק של מבני nanofibers בהרכבה עצמית באמצעות אוליגומרים γPNA מרובים, ברורים. סעיף זה מתאר את הפרשנות של נתונים המתקבלים מהבילוי המוצלח של הפרוטוקולים המתוארים.
בעקבות הפרוטוקול המתואר בסעיף 5 להדמיית TIRF של דגימות של אוליגומרים γPNA annealed ב 75% DMSO: H2O (v / v) בקלות רבה מספק ראיות של ארכיטקטורות מאורגנות היטב תחת תצפיות מיקרוסקופיות כפי שמוצג איור 4A. 75% DMF: H2O (v/v) מצב ממס תוצאות ננו בצורת spicule או מחט כמו ננו (איור 4B) ו, מניסיוננו, 40% 1,4 דיוקסאן: H2O (v / v) מצב מראה קישוט דליל של nanostructures filamentous כאשר צפו באמצעות מיקרוסקופ TIRF (איור 4C). יתר על כן, הדגימות של צינוריות γPNA שנוצרו ב- DMSO 75%: H2O (v/v) מדגימות מאגדות של ננו-פייברים ברזולוציות הגדלה או ננוסקופיות גבוהות במהלך הדמיית TEM בעקבות שלבים המוזכרים בסעיף 6 (איור 5). ניתוחים כמותיים של רוחב הננו-מבנים הראו רוחב חציוני של 16.3 ננומטריה עם ערכים מרביים מעבר ל- 80ננומטרי 15.
להפקת תוכנית ליצירת ננו-מבנים היברידיים γPNA-DNA בתערובות ממס אורגניות כדי לאפשר פונקציונליזציה נוספת באמצעות DNA, חשוב לשקול את המיקום האוליגומרי במוטיב SST המוחלף באוליגומרים DNA isosequential. התאמת שלבים המוזכרים בסעיף 7 למקרה של מבנה הננו-צינור המתואר כאן, היא אוליגומרים DNA isosequential המחליפים את oligomers γPNA רציף יוצר מבנים ישרים filamentous ואילו החלפת אוליגומרים γPNA מוצלב יוצר מבנים stellate כאשר צפו באמצעות TIRF ו TEM הדמיה (איור 6). ניתוחים כמותיים של רוחב הננו-מבנים שהוחלפו באוליגומרים של דנ"א רציפים הראו רוחב חציוני סביב 19ננו-מ"ר 15.
לבסוף, עם התאמת צעדים מסעיף 8, nanofibers γPNA לאמץ morphologies דק עולה בקנה אחד עם מאגד מופחת בנוכחות ריכוזי SDS מתחת ריכוזי micelle הקריטי שלה (CMC, 8.2 mM). nanofibers γPNA גם לאמץ morphologies מרושת מאוד בריכוזי SDS גבוהים בהשוואה CMC שלה כאשר צפו באמצעות הדמיה TIRF (איור 7). הדמיית TEM של אוליגומרים γPNA בהרכבה עצמית בנוכחות SDS מצביעה על כך שמצב SDS של 5.25 מ"מ מצביע על ההפחתות המשמעותיות ביותר במאגוזנים מבניים ברוחב הנע בין 8\u201212 nm כפי שמוצג ב -איור 7C).
איור 1: אוליגומרים של חומצות גרעין פפטיד כאבני בניין לננו-מבנים מורכבים.
(א)מבנים כימיים של יחידות DNA (PNA), PNA ו- MP המכילות γPNA. (איור הודפס מחדש באישור שופט21.) (B)helices PNA-PNA הם פחות מעוותים מאשר helices DNA-DNA, בעל 18 בסיסים לכל סיבוב במקום 10.5. (C)מוטיב זה של אריח יחיד תקוע מבני בעל שלושה סלילים (SST) מורכב מתשעה אוליגומרים נפרדים באורך 12 בסיסים של γPNA, שלכל אחד מהם שני תחומים של שישה בסיסים. (D)בתוך המבנה ישנם שני סוגים של אוליגומרים: גדילים "רציפים" הקיימים על סליל יחיד וגדילי "קרוסאובר" פורשים סליל. (E)מוטיב מבני זה באורך 18 בסיסים יכול ליצור תריסים בקנה מידה מיקרון. לוחות B, C ו- E שונו באישור Ref15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומות המסה מייצגות של אוליגומרים נבחרים של γPNA בתנאי ממס שונים.
ערכת משנה 2-oligomer (p4, p5) המציגה תחומים בעלי 6 בסיסים יכולה להיקשר עם יציבות תרמית סבירה (עקומה שחורה) ב- PBS 1x. 3- oligomer (p4, p5, p6) תת קבוצה מראה יציבות תרמית מוגברת עקב שיתוף פעולה ב 1x PBS (עקומה כחולה) ומראה מעט מאוד חוסר יציבות ביחס Tm כאשר ממס משתנה ממיסים אורגניים כמו DMF (עקומה מנוקדת אדומה). איור השתנה באישור של Ref15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תרשים זרימה עבור ערוץ זרימה נוזלי להדמיית TIRF לדוגמה.
זרימת עבודה שלב אחר שלב המציינת שלבים המעורבים בהכנה לדוגמה להדמיית TIRF של ננו-פייברים של γPNA לאחר הרכבת ערוץ הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיית מיקרוסקופיה TIRF של ננופייבר γPNA בהרכבה עצמית בתנאי ממס שונים.
γPNA nanofibers דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה TIRF (5 סרגל סולם מיקרומטר) תוך ניטור ערוץ Cy3 כאשר γPNA oligomers הם עצמי התאספו (A) 75% DMSO: מים (v / v), (B) 75% DMF: מים (v / v) ו -C) 40% דיוקסן: מים (v / v) תנאי ממס. (D)כאשר ננופייברים γPNA התאספו עצמית ב 75% DMSO: מים (v / v) מאוגדים לערוץ הזרימה נשטף עם 1mM Trolox במים, microbubbles דו פאזי של DMSO-מים טופס עם nanostructures יישור לאורך הממשק של microbubble. איור השתנה באישור של Ref15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיית TEM של ננו-פייברים γPNA שהורכבו בעצמם ב-75% DMSO: מים. (v/v) באמצעות formvar תמיכה נחושת שכבה 300 רשתות רשת שינוי.
(A) תמונות TEM של ננופייברים γPNA המדמיין תחת הגדלה נמוכה (15x). (B) תמונות TEM של ננופייברים γPNA דמיינו תחת הגדלה גבוהה (150x) מראה מאגד של צינוריות לאורך הרוחב ברזולוציות ננוסקופיות. (C) תמונות TEM של ננופייברים γPNA דמיינו תחת הגדלה נמוכה (10x) באמצעות שכבת תמיכה Formvar-סיליקון חד חמצני ברשת נחושת מאפשר הדמיה בתנאי דגימה נמרצים. איור השתנה באישור של Ref15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מורפולוגיות שונות עבור כלאיים γPNA-DNA המבוססים על החלפה סלקטיבית בדנ"א.
(A) TIRF (סרגל בקנה מידה של 5 מיקרומטר) ו - (C) תמונות TEM (הגדלה של 60x) של הרכבה עצמית של כלאיים γPNA-DNA בעת החלפת אוליגומרים רציפים γPNA (p3, p5, p9) עם אוליגומרים DNA isosequential (D3, D5 D9) להראות צינוריות לאמץ מורפולוגיה תמיסת ישר. (B) TIRF (סרגל בקנה מידה של 5 מיקרומטר)ותמונותTEM (הגדלה של 25x) של הרכבה עצמית של כלאיים γPNA-DNA בעת החלפת אוליגומרים γPNA מוצלב (p1, p4, p7) עם אוליגומרים DNA isosequential (D1, D4 D7) להראות nanofibers אימוץ מורפולוגיה stellate. איור השתנה באישור של Ref15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מורולוגיות שונות עבור ננו-פייברים של γPNA בריכוזים משתנים של SDS.
תמונות TIRF (סרגל בקנה מידה של 5 מיקרומטר) של הרכבה עצמית של nanofibers γPNA בנוכחות SDS בריכוזים של (A) 5.25 מ"מו - B ) 17.5 mM. הרכבה עצמית בנוכחות ריכוזי SDS פחות מאשר CMC (8.2 mM) מראה morphologies דק יותר מתמונות TIRF מבוסס על עוצמת פלואורסצנטיות. (C) פעולה זו מאומתת על-ידי תמונות TEM (הגדלה של 100x) של המערכת שבה הרוחב החציוני עבור ננו-פייברים נמצא בטווח של 8\u201212 nm. בריכוזים משמעותיים מעל CMC, ננו-צינוריות γPNA מופיעות ויוצרות מכלים מסדר גבוה יותר באמצעות מבני ננו-צינוריות מרושתים מאוד. איור השתנה באישור של Ref15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פלט מחרוזת סקריפט MATLAB "thisSeq" | ניקוד עונש "ניקוד זה" | ||
| 'acttcgctaaaa cgaagtgaggaa קגטאטצ'ט אקאגאאקאקאקאטק ctcgttgcccgc טטגצג גגטגאטקטג קאטקאטאגאק גטגטגטקטאטאג ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg קקטקגקטאגה tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa גאגטאקאגטג טאקטאק אטאגאטאטאט ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa אקגקטאטאק ccacttgccccg אגטגאקאגאט tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa טקגאקאצ'ק cgtggacaataa אגטגטאטג acagatgcgaaa אטקטקט גגגטאגאגאגה ' | 0.0528 | ||
| 'cgggaaccac ctcccgtttagg צטגצ'קאטאקטאאא גקטאקטקג gtaagccgatga gtגטקטקטצ'יאטקטקטאג טטגצ'קקטגג ' | 0.0656 | ||
| 'אטאגגצ'יטאגצ'אגצ'ט טאגגאטאטאה ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg קאטאקגצ'טה ג'טגאגאגואה ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccc קטקטקקטגט ccagacaggc אגטקאגאטאג טגקטאטאג גטקאטאג גטקטאטה גטאקגקטג cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'תגccccccagt gggctatctcgt ttcaggacga גטהגטגטגג cgcaagagtatt actgggaatact גטאקטגה taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'טאגקאקאגאק tgcctaccactc טטגאגאגטג תגcccctgcgg gggctattcatc gtקטגטגאגה ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc קקטקטק cgccaagaaggg gtgctttgc cagcacgactaa גטגאטטגטק cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca צטגטגגטקים גטאגאצ'ק tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgtcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt קגקאאגצ'ק טטגטגאגאגאקאגאקאקאטקט גאגאקאגאטג gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag צגגטקטקטק אטקטגאגאק ' | 0.064 | ||
| 'גטגטאקטגאגאק טטגטגקטקה ttgccccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa קגטגאגאטאג cgctcgcatcgt' | 0.0688 | ||
| 'גאטגטקט caaatcccttct agcgttagaagg קטאאאקאג טטגצ'טקאק אגאגטגאגג ccgtagtcgttcc ctgtggacga | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag טאקאאאאאטצ'אאט אcgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'אקטג גגאקטקאג ttcggcaggcgg gccgaacgctaa אגאגטאגטאגג אקטגאטק actcgtattttg ccgcctcaaaat' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca אטקצ'טגאגה ccacacttactg gtgtggggct טקאגאגצ'אגה גטטגטגאט אאקגקט קגטאגטאג ' | 0.0656 | ||
| 'אגאטגאטאט אקטקטגטגט cggtttactcac אקטקצ'אגצ'אק גאאגטק אטאגטאגאטג טאגקאקאקאצ'י גטגטאגצגה ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag גאקאגגאטג קטגקטקטצ'ה טגגגטאגטאגט gcctcacagcga ctttagtcgctg ' | 0.0704 | ||
טבלה 1: 20 תוצאות אלגוריתמיות לדוגמה למיטוב פוטנציאלי של עיצוב רצף γPNA. 20 תוצאות אלגוריתמיות לדוגמה עם פלטי רצף בעמודה 1 והציון המתאים להן בעמודה 2. חזרות חוזרות ונשנות של התסריט מבוצעות כדי להשיג את הציון המינימלי ביותר.
| מזהה רצף γPNA | רצף | השלמת תחום 1 | השלמת תחום 2 |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | תחום p2 1 | p6-ביוטין דומיין 1 |
| עמ' 2 | נ-גקטטגטאה-סי | תחום p1 1 | תחום p3 2 |
| עמ' 3 | N-גקטקטטק-C | תחום p7 2 | תחום p2 2 |
| עמ' 4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | תחום p5 1 | תחום p9 1 |
| עמ' 5 | N-CGקאגצ'קCG-C | תחום p4 1 | p6-ביוטין דומיין 2 |
| p6-ביוטין | נ-ביוטין-GTGAACCGAGGG-C | תחום p1 2 | תחום p5 2 |
| עמ' 7 | N-AGTTGATGTC-C | תחום p8-Cy3 1 | תחום p3 1 |
| עמ' 8-סיי3 | N-סיי3-AAAACTACAGAA-C | תחום p7 1 | תחום p9 2 |
| עמ' 9 | N-TCCGCATTCTGT-C | קבוצת מחשבים p4 2 | תחום p8-Cy3 2 |
טבלה 2: תוצאות עיצוב רצף γPNA עבור ננופייברים. רצפי אוליגומרים בודדים נוצרו כמצוין בטבלה זו. בסיסים עם קו תחתון מציינים את השינויים במיקום הגמא עם mini-PEG. הטבלה שונתה באישור Ref15.
| טווח טמפרטורות | קצב שיפוע |
| 90 °C (60 °F) | החזק למשך 3 דקות |
| 90-80 מעלות צלזיוס | 0.1°C/דקה |
| 80-70 מעלות צלזיוס | 0.1°C/דקה |
| 70-60 מעלות צלזיוס | 0.1°C/3 דקות |
| 60-50 מעלות צלזיוס | 0.1°C/3 דקות |
| 50-40 מעלות צלזיוס | 0.1°C/3 דקות |
| 40-30 מעלות צלזיוס | 0.1°C/דקה |
| 30-20 מעלות צלזיוס | 0.1°C/דקה |
| 4 °C (60 °F) | החזק ללא הגבלת זמן |
טבלה 3: פרוטוקול רמפה Anneal עבור רוכב אופניים תרמי. הטבלה שונתה באישור Ref15.
| ריכוז מלאי | 75% DMSO: מים (v/v) מדגם אנאלי | 75% DMF: מים (v/v) מדגם אנאלי | 40% דיוקסן: מים (v /v) מדגם Anneal | ריכוז סופי | |
| אוליגומר γPNA (x9) | 20 מיקרומטר | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 ננונומט |
| DMSO (DMSO) | - | 30 מיקרו-לל | - | - | 75% (v/v) |
| DMF | - | - | 30 מיקרו-לל | - | 75% (v/v) |
| 1,4 דיוקסן | - | - | - | 16 מיקרו-לל | 40% (v/v) |
| מים דה-מיונים | - | 1 μL | 1 μL | 15 מיקרו-לל | 25 או 60% (v/v) |
| נפח כולל | - | 40 מיקרו-ל' | 40 מיקרו-ל' | 40 מיקרו-ל' | - |
טבלה 4: פרוטוקול להכנת אצוות anneal של אוליגומר γPNA בתנאים ממס שונים.
| מזהה רצף DNA | רצף |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-גקטקטק-3' |
| D4 (4) | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 (5) | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 (7) | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
טבלה 5: רצפי דנ"א Isosequential כמו אוליגומרים חלופיים כדי γPNA. הטבלה שונתה באישור Ref15.
| ריכוז מלאי | תחליפי גדילים רציפים של DNA | תחליפי גדילים מוצלב DNA | ריכוז סופי | |
| אוליגומר γPNA (x6) | 20 מיקרומטר | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 ננונומט |
| אוליגומר DNA (x3) | 20 מיקרומטר | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 ננונומט |
| DMSO (DMSO) | - | 30 מיקרו-לל | 30 מיקרו-לל | 75% (v/v) |
| מים דה-מיונים | - | 1 μL | 1 μL | 25% (v/v) |
| נפח כולל | - | 40 מיקרו-ל' | 40 מיקרו-ל' | - |
טבלה 6: פרוטוקול להכנת אצוות anneal של nanostructures היברידית γPNA-DNA ב 75% DMSO: H2O ( v/ v) באמצעות החלפת אוליגומרים γPNA רציף או מוצלב עם אוליגומרים DNA isosequential.
| ריכוז מלאי | ריכוזי SDS מתחת ל- CMC | ריכוזי SDS מעל CMC | ריכוז סופי | |
| אוליגומר γPNA (x9) | 20 מיקרומטר | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 ננונומט |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5.25 מטר |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 μL | 17.5 מ"מ |
| DMSO (DMSO) | - | 30 מיקרו-לל | 30 מיקרו-לל | 75% (v/v) |
| מים דה-מיונים | - | - | - | 25% (v/v) |
| נפח כולל | - | 40 מיקרו-ל' | 40 מיקרו-ל' | - |
טבלה 7: פרוטוקול להכנת אצוות anneal של nanostructures γPNA ב 75% DMSO: H2O ( v/ v) בנוכחות ריכוזי SDS מתחת ומעל CMC.
איור משלים 1: תסריט תכנות PNA3nanofiber.m לעיצוב רצפי אוליגומרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתמקד בהתאמת ושיפור פרוטוקולי ננוטכנולוגיה של חומצות גרעין קיימות כלפי תערובות ממס אורגניות. השיטות המתוארות כאן מתמקדות בשינויים ובפתרון בעיות בתוך מרחב ניסיוני מוגדר של ממיסים אורגניים אפרוטיים קוטביים נבחרים. יש עדיין פוטנציאל שלא נחקר עבור פרוטוקולים אחרים הוקמה חומצת גרעין ננוטכנולוגיה להיות מותאם בתוך שטח זה. זה יכול לשפר יישומים פוטנציאליים באמצעות אינטגרציה בתחומים אחרים כגון סינתזת פולימר ופפטיד אשר מבוצעים בדרך כלל ממיסיםאורגניים דומים 25,26. בנוסף, אנו מתמקדים כאן בצעדים קריטיים שיש לצפות בהם תוך תרגול הפרוטוקולים הנ"ל.
במהלך הכנת מדגם להרכבה עצמית, חשוב לשמור על אחוזי נפח של מים ב 25% (v / v) עבור תנאי DMSO ו- DMF. לפיכך, חשוב להכיר בכך שהמס האורגני המשמש להרכבה עצמית צריך להיות גם ממלאי נטול מים. מבני הננופייבר הם הידרופוביים ומצטברים בתכלית מים מוגברת.
שלא כמו פיגומים DNA אוריגמי גישות שיכולים ליצור מבנים של אורכים דיסקרטיים, עיצוב מוטיב SST הנוכחי עבור nanofibers γPNA ו צינורות SST DNA אחרים הוקמה בעבר אינו מניב מבנים של אורכים דיסקרטיים. צינורות פולימריזציה השגת מגוון של אורכי מיקרון רב (עד 11 מיקרון). מאותה סיבה, לא ניתן לכמת את התשואה הקשורה להיווצרות המבנה.
עם זאת, בשל עמוד השדרה פפטיד טעון של γPNA, אין תלות באיזון יון נגדי ביחס להיווצרות מבנה. מאגרי הדמיה, אם כן, אינם צריכים לכלול ציטוטים כמו Mg2+ הנדרשים בדרך כלל לייצוב של ננו-מבנים המיוצרים מחומצות גרעין טבעיות.
לבסוף, γPNA nanostructure מארוז וצבירה בתנאי ממס שונים תלויים גם ריכוזי אוליגומר בודדים הציג במהלך הרכבה עצמית. ריכוזים הנעים בין 1 μM ומעלה של אוליגומרים בודדים מגבירים את הנטייה לאריגה וצבירה ומשפיעים על הדמיה ברורה של ננו-מבנים במהלך הדמיית TIRF או TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע 1739308, מענק קריירה NSF 1944130 ועל ידי משרד חיל האוויר של מחקר מדעי מענק מספר FA9550-18-1-0199. רצפי γPNA היו מתנה נדיבה מד"ר טאמול Srivastava של תיקון גנים Trucode, Inc. ברצוננו להודות לד"ר אריק ווינפרי ודר"ר ריזאל הריאדי על השיחות המועילות שלהם על קוד MATLAB של ארגז הכלים לעיצוב דנ"א. ברצוננו להודות גם לג'וזף סוהאן, מארה סאליבן והמרכז להדמיה ביולוגית על עזרתם באיסוף נתוני TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
