Summary
Este artículo proporciona protocolos para el diseño y autoensamble de nanoestructuras a partir de oligómeros de ácido nucleico modificados gamma en mezclas de disolventes orgánicos.
Abstract
Las estrategias actuales en nanotecnología de ADN y ARN permiten el autoensamble de una variedad de nanoestructuras de ácido nucleico en medios acuosos o sustancialmente hidratados. En este artículo, describimos protocolos detallados que permiten la construcción de arquitecturas de nanofibra en mezclas de disolventes orgánicos a través del autoensamble de baldosas de ácido nucleico péptido modificado en gamma, de una sola cadena, direccionables de forma única. Cada tesela de una sola cadena (SST) es un oligómero de 12 bases de LANA compuesto por dos dominios modulares concatenados de 6 bases cada uno. Cada dominio puede unirse a un dominio mutuamente complementario presente en las hebras vecinas utilizando la complementariedad programada para formar nanofibras que pueden crecer a micras de longitud. El motivo SST está hecho de 9 oligómeros totales para permitir la formación de nanofibras de 3 hélices. En contraste con las nanoestructuras de ADN análogas, que forman estructuras monodispersas de diámetro, estos sistemas de ARPna forman nanofibras que se agrupan a lo largo de sus anchuras durante el autoensamble en mezclas de disolventes orgánicos. Por lo tanto, los protocolos de autoensamble descritos aquí también incluyen un tensioactivo convencional, el sulfato de dodetil sódico (SDS), para reducir los efectos de agrupación.
Introduction
Construcción exitosa de numerosas nanoestructuras complejas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 en medios acuosos o sustancialmente hidratados hechos con natural ácidos nucleicos que ocurren tales como ADN1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 y RNA11,12 se ha demostrado en trabajos anteriores. Sin embargo, los ácidos nucleicos de origen natural se someten a cambios de conformación helicoidales dúplex o han reducido las estabilidades térmicas en mezclas de disolventes orgánicos13,14.
Anteriormente, nuestro laboratorio ha informado de un método para la construcción de nanofibras de 3 hélices utilizando imitaciones de ácido nucleico sintético modificado de posición gamma llamadas ácidos nucleicos de péptido gamma (-PNA)15 (Figura 1A). La necesidad de tal desarrollo y aplicaciones potenciales del ácido nucleico sintético imitado PNA se ha discutido en el campo16,17. Hemos demostrado, a través de una adaptación de la estrategia de baldosas de una sola cadena (SST) presentada para las nanoestructuras de ADN18,19,20, que 9 oligómeros de la VNA secuencialmente distintos pueden ser diseñados para formar nanofibras de 3 hélices en mezclas selectas de disolventes orgánicos aproticos polares como DMSO y DMF. Los oligómeros de la APna fueron ordenados comercialmente con modificaciones de (R)-dietilenglicol (mini-PEG) en tres γ posiciones (1, 4 y 8 posiciones de base) a lo largo de cada oligómero de 12 bases basado en métodos publicados por Sahu et al. 21 Estas modificaciones gamma provocan la pre-organización helicoidal que está asociada con la mayor afinidad de unión y la estabilidad térmica de la ADN en relación con la ANP no modificada.
Este artículo es una adaptación de nuestro trabajo reportado en el que investigamos los efectos de la solución solvente y la sustitución por ADN en la formación de nanoestructuras basadas enELPna 15. El objetivo de este artículo es proporcionar descripciones detalladas del diseño, así como protocolos detallados para los métodos adaptados a disolventes que se desarrollaron para el autoensamble y la caracterización de la nanofibra de LAPNA. Por lo tanto, primero presentamos la estrategia modular SST, una plataforma general para el diseño de nanoestructuras utilizando el ácido nucleico sintético imitar PNA.
Se ha informado que el tono helicoidal para los dúplex PNA es de 18 bases por turno en comparación con los dúplex de ADN, que se someten a un giro por 10,5 bases(Figura 1B). Por lo tanto, la longitud de dominio de los SST de la serie de comandos de la serie de datos de la serie de productos se estableció en 6 bases para dar cabida a un tercio de un giro completo o a 120o de rotación para permitir la interacción entre tres hélices triangularmente matrices. Además, a diferencia de los motivos anteriores de SST, cada SST contiene solo 2 dominios, creando efectivamente una estructura de 1 dimensión similar a una cinta que se ajusta para formar un paquete de tres hélices (Figura 1C). Cada oligómero de 12 bases de LA APna se modifica gammamente en las posiciones 1, 4 y 8 para garantizar una distribución uniformemente espaciada de los grupos mini-PEG a través del motivo general de SST. Además, dentro del motivo, hay dos tipos de oligómeros: hebras "contiguas" que existen en una sola hélice y hebras "cruzadas" que abarcan hélices (Figura 1D). Además, los oligómeros P8 y P6 están etiquetados con Cy3 fluorescente (estrella verde) y biotina (oval amarillo), respectivamente (Figura 1D), para permitir la detección de la formación de la estructura mediante microscopía de fluorescencia. En total, el motivo SST está hecho de 9 oligómeros totales para permitir la formación de nanofibras de 3 hélices a través de la complementariedad programada de cada dominio individual al dominio correspondiente en un oligómero vecino (Figura 1E).
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Protocol
1. Diseño de la secuencia de la ADNA
- Descargue DNA Design Toolbox22 desarrollado por Winfree Lab en Caltech23 en la carpeta que contiene scripts de programación para diseñar secuencias.
- Dentro de esa carpeta de diseño de secuencia, abra un lenguaje de programación de cuarta generación compatible con la extensión de archivo ".m" y, a continuación, agregue la carpeta "DNAdesign" descargada anteriormente a la ruta de acceso mediante el siguiente comando:
>> addpath DNAdesign - Posteriormente, ejecute el siguiente script denominado "PNA3nanofiber.m" (consulte la figura complementaria 1) mediante el siguiente comando:
>> PNA3nanofiber - Ejecute este script para crear variables denominadas "thisSeqs" y "thisScore." La variable "thisSeqs" contiene las secuencias de los oligómeros diseñados, y "thisScore" es la puntuación de penalización.
- Ejecute el script varias veces para obtener la puntuación más mínima. En la Tabla 1se muestra una muestra de 20 de este tipo de corridas.
- Confirme manualmente la complementariedad deseada de Watson-Crick de cada dominio de las secuencias generadas para el motivo estructural SST especificado. Las especificaciones de secuencia para la estructura de nanofibra de 3 hélices se muestran en la Tabla 2.
- Compruebe lo siguiente para las secuencias generadas.
- Evite el uso de cuatro bases C y G consecutivas.
- Seleccione manualmente secuencias específicas para la funcionalización N-terminal con colorante fluorescente y moléculas de biotina para permitir estudios de microscopía fluorescente.
- Incluya un mínimo de 3 mini-PEG gamma-modificaciones en la columna vertebral para permitir la conformación helicoidal pre-organizada en los oligómeros de una sola cadena como se describe por Sahu et al. 21
2. Preparación de las hebras de acciones de la APNA
- Obtenga hebras de componentes de la API de secuencias especificadas a escala de 50 nmol con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)purificación de un fabricante comercial.
- Resuspender cada hebra en agua desionizada a concentraciones de 300 m. Almacene las hebras resuspendidas en un congelador de -20 oC hasta varios meses hasta que sea necesario para la experimentación.
3. Estudios de curvas de fusión de subconjuntos de oligómeros de la APS
- Obtener rangos de temperatura de fusión para diferentes combinaciones de subconjuntos complementarios de 2 oligómeros y 3 oligómeros mediante la ejecución de un estudio de curva de fusión en tampones acuosos como la solución salina tamponada de 1x fosfato (PBS) o el disolvente orgánico polar preferido como Dimethylformamida (DMF) o Sulfóxido de dimetil (DMSO) (ver Figura 2).
NOTA: Las curvas de fusión térmica a >50% de DMF comienzan a perder la línea de base superior y muestran graves perturbaciones en parte debido a la alta absorción de DMF en la longitud de onda requerida para los experimentos. Este es un fenómeno notable en la literatura24. Sin embargo, es posible obtener las curvas de fusión a 5 m por concentración de hebra en estas condiciones de disolvente.- Aliquot 16,7 l de la población de 300 m de cada oligómero y hacer que el volumen final se convierta en un DMF de 1000 oL en 1x PBS o 100% (v/v) DMSO o DMF al 100% (v/v) obteniendo efectivamente una concentración final de 5 oM por oligómero. Transfiera esta mezcla de subconjunto de oligómeros a un camino óptico de 1 cm, cubeta de cuarzo.
- Realice experimentos UV-Vis de temperatura variable en un espectrofotómetro equipado con un bloque de temperatura programable.
- Recopile puntos de datos para las curvas de fusión en un rango de temperatura de 15o U201290 oC para ciclos de refrigeración (ancocinamiento) y calefacción (fusión) a una velocidad de 0,5 o 20121 oC/min. Conservar las muestras durante 10 minutos a 90oC antes de enfriar y a 15oC antes de calentar. Determinar la temperatura de fusión (Tm) desde el pico de la primera derivada de la curva de calentamiento.
- Compruebe que los rangos de temperatura de fusión para subconjuntos de 2 oligómeros están por encima de 35 oC en todos los casos de disolvente. Además, compruebe que los subconjuntos de 3 oligómeros correspondientes que contienen una hebra adicional a su subconjunto equivalente de 2 oligómeros muestra un aumento considerable en Tm debido al aumento de la coopertividad.
NOTA: Esto verificaría que un solo autoensamble de múltiples oligómeros puede plegarse de forma cooperativa en la nanoestructura deseada con una estabilidad térmica razonable.
4. Protocolo de autoensamble para múltiples oligómeros distintos de la APS
NOTA: Para diseñar un protocolo de rampa térmica de autoensarmble para nanoestructuras de LAPNA, es deseable el recocido de rampa lenta.
- En el caso de las secuencias de oligómeros generadas, recose las muestras durante 22,5 h en un ciclo térmico que se enfría de 90 a 20 oC. Típicamente, la temperatura de fusión obtenida para subconjuntos de 2 y 3 oligómeros-PNA se encuentra en rangos de 40o U201270 oC para diferentes condiciones de disolvente.
- Programar el ciclor térmico de la siguiente manera: mantener a 90 oC durante 5 min, rampa de 90 a 70 oC a una velocidad constante de 0,1 oC/min, rampa descendente de 70 a 40 oC a una velocidad de 0,1 oC/3 min, rampa descendente de 40 a 20 oC a una velocidad de 0,1 oC/min y mantener a 4 oC (véase la Tabla 3). Las muestras se pueden almacenar en 4 oC durante 12 o 201224 h antes de la caracterización.
NOTA: Mientras que los subconjuntos de 2 y 3 oligómeros de nuestro sistema de nanofibras pueden formarse en 1x PBS, las nanofibras a escala de micrones se agregan en 1x PBS. Por lo tanto, las condiciones del disolvente deben optimizarse en función de la escala y el tamaño de la estructura que se está formando, así como del tipo y la densidad de las modificaciones gamma. - Para nanofibras de 3 hélices largas a escala de micrones, prepare muestras de lotes recocidos en 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxane: H2O (v/v) basado en estudios de optimización dedisolventes 15.
- Preparar lotes recocidos de la siguiente manera (véase la Tabla 4). En primer lugar, preparar sub-stocks de 10 l a 20 m de concentraciones de las poblaciones principales de 300 m para cada oligómero mediante la alícuota de 0,67 l de la población principal y haciendo el volumen a 10 l utilizando agua desionizada.
- Aliquot 1 l de las sub-stocks de 20 m para cada oligómero y agréguelo a un tubo pcR de 200 l. Esto representa un volumen total de 9 ml para 9 oligómeros.
- Agregue 30 l de DMSO/DMF anhidro para los casos de DMSO del 75% y 75% de DMF con 1 l adicional de agua desionizada para hacer un volumen final de 40 ml con cada oligómero a 500 nM de concentraciones finales. Añadir 16 l de 1,4-Dioxano y hacer que el volumen con agua desionizada a 40 l para la condición de disolvente de dioxano 40%.
- Cargue los lotes recocidos en el ciclor térmico y recocido utilizando el protocolo mencionado en el paso 4.2.
5. Imágenes de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF)
- Prepare una cámara de humedad a partir de una caja de puntas de pipeta vacía. Llene la caja con aproximadamente 5 ml de agua para evitar el secado de los canales de flujo de muestra descritos a continuación (ver Figura 3).
- Prepare la cámara de flujo con un portaobjetos de microscopio, 2 tiras de cinta de doble cara y cubreobjetos recubiertos con nitrocelulosa. Para recubrir el cubreobjetos con nitrocelulosa, sumerja el cubreobjetos en un vaso de precipitados que contenga un 0,1% de colodión en acetato de amilo y secado al aire.
- Preparar la solución de nitrocelulosa haciendo una dilución 20 veces de colodión 2% disponible comercialmente en acetato de amilo con disolvente de acetato de isoamilo.
- Preparar la solución de albúmina sérica bovina biotinilada (Biotin-BSA) pesando 1 mg de Biotina-BSA y disolviéndola en 1 ml de 1x PBS. Flujo 15 l de 1 mg/ml Biotina-BSA en 1x Tampón PBS colocando el canal de flujo en un ángulo. Incubar el canal de flujo durante 2-4 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
- Preparar el tampón de lavado disolviendo 1 mg de BSA en 1 ml de 1x PBS. Lave el exceso de Biotina-BSA fluyendo 15 ml del tampón de lavado. Para pasivar la superficie, incubar el canal de flujo durante 2-4 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
- Preparar la solución de estreptavidina midiendo 0,5 mg de estreptavidina y 1 mg de BSA y luego disolver utilizando 1 ml de 1x PBS. Flujo 15 l de 0,5 mg/ml de estreptavidina en 1x PBS que contiene 1 mg/ml de BSA. Incubar el canal de flujo durante 2-4 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Flujo de 15 l del tampón de lavado para lavar la estreptopavidina sin ataduras.
- Flujo de 15 ml de lote previamente recocido de oligómeros de ARPna a 500 nM de concentración por hebra en 75% DMSO, 75% DMF o 40% 1,4-Dioxane condición. Incubar el canal de flujo durante 2-4 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
- Preparar 1 mM trolox en condiciones de disolvente preferidas diluyendo 10 veces de un stock de 10 mM de Trolox en DMSO (medida 2,5 mg de Trolox y disolver en 1 ml de DMSO). Lavar las nanoestructuras no enlazadas en el canal de flujo con 15 ml de Trolox de 1 mM con la misma composición de disolvente que las nanoestructuras.
NOTA: El contenido de DMSO >50% en el canal de flujo produciría perturbaciones de señal menores debido al diferente índice de refracción de la condición del disolvente durante el TIRF que normalmente se calibra para los ángulos TIRF de agua de cobertura. Esto se puede rectificar lavando con 1 mM Trolox hecho diluyendo el Trolox de 10 mM 10 veces usando agua desionizada. Sin embargo, esta técnica proporciona imágenes más claras, pero solo es útil para evaluar si se produjo la formación, ya que produce microburbujas bifásicas en el canal de flujo. Como resultado, las nanoestructuras pueden ser visibles en la interfaz de las dos fases como se muestra en la figura 4D. - Transfiera el canal de flujo al portaobjetos y a la imagen utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con imágenes TIRF utilizando un objetivo de inmersión de aceite de 60x y una lupa de 1,5x. Escanee el canal de flujo con un aumento de 60x o 90x supervisando el canal Cy3 (consulte la figura 4).
6. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)
- Pesar 0,5 g de acetato de uranilo en 50 ml de agua destilada para preparar una solución de tinción de acetato de uranilo acuoso al 1%. Filtrar la solución de tinción de acetato de uranilo acuoso al 1% utilizando un filtro de 0,2 m unido a una jeringa.
NOTA: Alternativamente, 2% acetato de uranilo acuoso podría ser comprado a un fabricante comercial. - Compre rejillas de cobre recubiertas de capa de soporte formvar disponibles comercialmente con tamaño de 300 mallas.
NOTA: Es importante tener en cuenta que la capa de soporte formvar podría ser disuelta por disolventes como DMSO más allá de 2 min. Para una incubación de muestras más larga, están disponibles en el mercado formvar estabilizados con monóxido de silicio en rejillas de cobre que permiten que la rejilla sea más hidrófila que las rejillas recubiertas de carbono y puede soportar condiciones de muestra vigorosas y haz de electrones como se muestra en la Figura 5C. - Pipetear 4 l de muestra en la rejilla durante 15 s. Utilice un pedazo de papel de filtro para eliminar la muestra poniendo el papel de filtro en contacto con la rejilla desde un lado.
- Añadir inmediatamente 4 l de la solución de tinción a la rejilla durante 5 s.
- Quítese la mancha como antes y sostenga el papel del filtro contra la rejilla durante 1-u20122 min para asegurarse de que la rejilla está seca. Por lo general, las muestras deben ser de imagen dentro de 1-u20122 h después de la tinción. Alternativamente, si se garantiza que la rejilla esté completamente seca, las rejillas se pueden almacenar en una caja de almacenamiento de la red TEM hasta 3 días antes de la toma de imágenes.
- Transfiera la rejilla a un soporte de muestra TEM y a una imagen utilizando un microscopio electrónico de transmisión operado a 80 kV con aumento que oscila entre 10 K y 150K (ver Figura 5).
7. Diferentes morfologías para híbridos de ADN-ADN basados en el reemplazo selectivo con ADN
- Obtener oligómeros de ADN de secuencias especificadas (ver Tabla 5) de fabricantes comerciales de oligonucleótidos sintetizados a escala de 25 nmol utilizando desalado estándar. Resuspender estas secuencias de ADN utilizando agua desionizada libre de RNase a concentraciones de stock de 20 m.
- Para los reemplazos contiguos de hebras de ADN, las secuencias D3, D5 y D9 pueden reemplazar las hebras p3, p5 y p9. Del mismo modo, para los reemplazos de hebras de PNA cruzado con ADN, las secuencias D1, D4 y D7 pueden reemplazar las hebras p1, p4 y p7.
- Aliquot 1 l de las sub-stocks de 20 m para cada oligómero de ADN o ADP y agréguelo a un tubo de PCR de 200 l como en el paso 2.7. Añadir 30 l de DMSO anhidro y 1 l de agua desionizada libre de RNase para que el volumen final se realice a 40 l (ver Tabla 6).
- Cargue los lotes recocidos en el ciclor térmico y recocido utilizando el protocolo mencionado en el paso 4.2.
- Caracterice las nanoestructuras híbridas de ADN-ADN mediante el protocolo TIRF siguiendo los pasos de la sección 5 o utilizando el protocolo de imágenes TEM mencionado en la sección 6 (consulte la figura 6).
8. Diferentes morfologías para nanofibras de ADP en diferentes concentraciones de SDS
- Preparar un stock principal de SDS del 20% (wt/v) midiendo 20 mg de SDS y disolviéndolo en 100 ml de agua desionizada.
- Preparar un sub-stock SDS del 6% (wt/v) alícuotando 3 sL de la población de SDS del 20% y haciendo que el volumen sea de 10 oL con agua desionizada.
- Recose los oligómeros de la APS en concentraciones finales de 5,25 mM y 17,5 mM de SDS de la siguiente manera. Aliquot 1 l de las sub-stocks de 20 m para cada oligómero de LANA y agréguelo a un tubo de PCR de 200 l como en el paso 2.7. Añadir 30 l de DMSO anhidro y 1 l de SDS al 6% y 20% para que el volumen final se realice a 40 l para alcanzar concentraciones finales de SDS de 5,25 mM y 17,5 mM, respectivamente (véase el Cuadro 7).
- Cargue los lotes recocidos de diferentes concentraciones de SDS en el ciclor térmico y recocido utilizando el protocolo mencionado en el paso 4.2.
- Caracterice las nanoestructuras de LA ADNA en presencia de SDS utilizando el protocolo TIRF siguiendo los pasos de la sección 5 o utilizando el protocolo de imágenes TEM mencionado en la sección 6 (véase la figura 7).
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Representative Results
Los protocolos discutidos en las secciones anteriores describen el diseño de un motivo SST adaptado a partir de nanofibras de ADN para la generación robusta de estructuras automontadas de nanofibras utilizando múltiples oligómeros de ARPna distintos. Esta sección describe la interpretación de los datos obtenidos de la recreación exitosa de los protocolos descritos.
Siguiendo el protocolo descrito en la sección 5 para la toma de imágenes TIRF de muestras de oligómeros de ARPna recocidos en 75% DMSO: H2O (v/v) proporciona más fácilmente evidencia de arquitecturas bien organizadas bajo observaciones microscópicas como se muestra en la Figura 4A. 75% DMF: La condición del disolvente H2O (v/v) da como resultado nanoestructuras en forma de espiga o en forma de aguja (Figura 4B) y, en nuestra experiencia, la condición 40% 1,4 dioxano: H2O (v/v) muestra una escasa decoración de nanoestructuras filamentosas cuando se ve utilizando la microscopía TIRF (Figura 4C). Además, las muestras de nanotubos de ADP formadas en un 75% de DMSO: H2O (v/v) demuestran la agrupación de nanofibras con resoluciones nanoscópicas o de alto aumento durante las imágenes TEM siguiendo los pasos mencionados en la sección 6 (Figura 5). Los análisis cuantitativos de la anchura de las nanoestructuras mostraron una anchura mediana de 16,3 nm con valores máximos superiores a 80 nm15.
Para diseñar un esquema para generar nanoestructuras híbridas de ADN-ADN en mezclas de disolventes orgánicos para permitir una mayor funcionalización utilizando el ADN, es importante considerar la posición oligomérica en el motivo SST que se sustituye por oligómeros de ADN isosequenial. Adaptación de los pasos mencionados en la sección 7 para el caso de la construcción de nanotubos descrita aquí, los oligómeros de ADN isosecuentes que sustituyen a los oligómeros contiguos de la APS forma estructuras filamentosas rectas, mientras que la sustitución de los oligómeros cruzados de LANA forma estructuras estelares cuando se ven utilizando imágenes TIRF y TEM (Figura 6). Los análisis cuantitativos de la anchura de las nanoestructuras que fueron reemplazadas por oligómeros de ADN contiguos mostraron anchuras medianas alrededor de 19 nm15.
Por último, tras adaptar los pasos de la sección 8, las nanofibras de LA ADN. adoptan morfologías más delgadas consistentes con la reducción de la agrupación en presencia de concentraciones de SDS por debajo de sus concentraciones críticas de micelas (CMC, 8,2 mM). Las nanofibras de LA ADP también adoptan morfologías altamente en red a altas concentraciones de SDS en comparación con su CMC cuando se visualizan utilizando imágenes TIRF (Figura 7). Las imágenes TEM de los oligómeros de la ADNr se automontan en presencia de SDS indican que la condición SDS de 5,25 mM indica las reducciones más sustanciales en la agrupación estructural con anchuras que oscilan entre 8o u201212 nm, como se muestra en (Figura 7C).
Figura 1: Oligómeros de ácido nucleico peptídico como bloques de construcción para nanoestructuras complejas.
(A) Estructuras químicas de las unidades de ADN (ANP), PNA y MP- que contienen APNA. (La figura se ha reimpreso con permiso de la referencia21.) Loshélices PNA-PNA son menos retorcidos que los hélices del ADN-ADN, con 18 bases por turno en lugar de 10,5. (C) Este motivo estructural de baldosas de un solo tren (SST) de tres hélices consta de 9 oligómeros distintos de 12 bases de largo, cada uno con dos dominios de seis bases. (D) Dentro de la estructura hay dos tipos de oligómeros: hebras "contiguas" que existen en una sola hélice y hebras "cruzadas" que abarcan hélices. (E) Este motivo estructural de 18 bases de largo puede polimerizarse para formar filamentos a escala de micras. Los paneles B, C y E se han modificado con permiso de la referencia15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curvas de fusión representativas de oligómeros selectos de LA APS en diferentes condiciones de disolvente.
El subconjunto de 2 oligómeros (p4, p5) que muestra dominios de 6 bases puede unirse con una estabilidad térmica razonable (curva negra) en 1x PBS. El subconjunto 3- oligómero (p4, p5, p6) muestra una mayor estabilidad térmica debido a la cooperatividad en 1x PBS (curva azul) y muestra poca o ninguna inestabilidad con respecto a Tm cuando el disolvente se cambia a disolventes orgánicos como DMF (curva de puntos rojos). La figura se ha modificado con el permiso de la referencia15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gráfico de flujo para el canal de flujo fluido para la toma de imágenes TIRF de muestra.
Un flujo de trabajo paso a paso que indica los pasos que intervienen en la preparación de muestras para la toma de imágenes TIRF de nanofibras de APna después del montaje del canal de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes de microscopía TIRF de nanofibra de LAP se autoensamblan en diferentes condiciones de disolvente.
Nanofibras de LAPna visualizadas mediante microscopía TIRF (barra de escala de 5 m) mientras se supervisa el canal Cy3 cuando los oligómeros de LAPna se automontan en (A) 75% DMSO: agua (v/v), (B) 75% DMF: agua (v/v) y (C) 40% Dioxano: agua (v/v) condiciones de disolvente. (D) Cuando las nanofibras de LA AP se automontan en un 75% de DMSO: el agua (v/v) unida al canal de flujo se lava con 1mM Trolox en agua, las microburbujas bifásicas de forma de agua DMSO con nanoestructuras que se alinean a lo largo de la interfaz de la microburbuja. La figura se ha modificado con el permiso de la referencia15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes TEM de nanofibras de ADNM automontadas en 75% DMSO: agua. (v/v) utilizando rejillas de malla de cobre 300 de capa de soporte formvar.
(A) Imágenes TEM de nanofibras de ADP visualizadas bajo bajo bajo aumento bajo aumento (15x). (B) Las imágenes TEM de nanofibras de LANA visualizadas bajo un alto aumento (150x) muestran la agrupación de nanotubos a lo largo de la anchura a resoluciones nanoscópicas. (C) Las imágenes TEM de nanofibras de ADP visualizadas bajo bajo baja ampliación (10x) utilizando una capa de soporte de monóxido Formvar-Silicon en una cuadrícula de cobre permiten la toma de imágenes en condiciones de muestra vigorosas. La figura se ha modificado con el permiso de la referencia15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Diferentes morfologías para híbridos de ADN-ADN basados en el reemplazo selectivo con ADN.
(A) Las imágenes TIRF (barra de escala de 5 m) y( C) TEM (aumento de 60x) de autoensamble de híbridos de ADN-ADN de LAPna al reemplazar los oligómeros contiguos de LA APS (p3, p5, p9) por oligómeros de ADN isosequenial (D3, D5 D9) muestran nanotubos que adoptan una morfología de filamento recto. (B) Las imágenes TIRF (barra de escala de 5 m) y (D) TEM (aumento de 25x) de autoensamble de híbridos de ADN-ADN de LAPna al reemplazar los oligómeros cruzados (p1, p4, p7) por oligómeros de ADN isosecuente (D1, D4 D7) muestran nanofibers que adoptan una morfología estelar. La figura se ha modificado con el permiso de la referencia15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Diferentes morfologías para nanofibras de ADP en diferentes concentraciones de SDS.
Imágenes TIRF (barra de escala de 5 m) de autoensamble de nanofibras de APna en presencia de SDS a concentraciones de (A) 5,25 mM y (B) 17,5 mM. El autoensamble en presencia de concentraciones de SDS inferiores a la CMC (8,2 mM) muestra morfologías más delgadas a partir de imágenes TIRF basadas en la intensidad de la fluorescencia. (C) Esto se verifica mediante imágenes TEM (aumento de 100x) del sistema en las que la mediana de ancho de las nanofibras se encuentra en el rango de 8o u201212 nm. A concentraciones significativamente superiores a la CMC, los nanotubos de la ADNM parecen formar conjuntos de orden superior a través de estructuras de nanotubos altamente en red. La figura se ha modificado con el permiso de la referencia15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Salida de cadena de script MATLAB "thisSeq" | Puntuación de penalti "thisScore" | ||
| 'acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgtttttatgg ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtggtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga ' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgt cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatctcgt ttcaggacgaga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcaggac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatggtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac ' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccgggcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacaa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctc agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggacga ' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgtgt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcccc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctgg ' | 0.0704 | ||
Tabla 1: 20 resultados algorítmicos de muestra para la optimización potencial del diseño de la secuencia de LAPNA. 20 resultados algorítmicos de muestra con salidas de secuencia en la columna 1 y su puntuación correspondiente en la columna 2. Las iteraciones repetidas del script se realizan para obtener la puntuación más mínima.
| ID de secuencia de LA ADP | Secuencia | Complemento dominio 1 | Complemento dominio 2 |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | dominio p2 1 | p6-Dominio biotina 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | dominio p1 1 | p3 dominio 2 |
| p3 | N-GACATCTTACTC-C | p7 dominio 2 | dominio p2 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | dominio p5 1 | p9 dominio 1 |
| p5 | N-CGCCAGCTCG-C | p4 dominio 1 | dominio p6-Biotina 2 |
| p6-Biotina | N-Biotina-GTGAACCGAGGG-C | dominio p1 2 | dominio p5 2 |
| p7 | N-AGTTTTGATGTC-C | dominio p8-Cy3 1 | p3 dominio 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 dominio 1 | p9 dominio 2 |
| p9 | N-TCCGCATTCTGT-C | p4 dominio 2 | dominio p8-Cy3 2 |
Tabla 2: Resultados del diseño de la secuencia de la TVP para nanofibras. Se generaron secuencias de oligómeros individuales como se indica en esta tabla. Las bases subrayadas indican las modificaciones de la posición gamma con mini-PEG. La tabla se ha modificado con permiso de la referencia15.
| Rango de temperatura | Tasa de rampa |
| 90 oC | Sostenga durante 3 minutos |
| 90-80 oC | 0.1oC/minuto |
| 80-70 oC | 0.1oC/minuto |
| 70-60 oC | 0,1 oC/3 minutos |
| 60-50 oC | 0,1 oC/3 minutos |
| 50-40 oC | 0,1 oC/3 minutos |
| 40-30 oC | 0.1oC/minuto |
| 30-20 oC | 0.1oC/minuto |
| 4 oC | Mantener indefinida |
Tabla 3: Protocolo de rampa de recocido para ciclor térmico. La tabla se ha modificado con permiso de la referencia15.
| Concentración de stock | 75% DMSO: muestra recocido de agua (v/v) | 75% DMF: muestra de recocido de agua (v/v) | 40% dioxano: muestra recocido de agua (v/v) | Concentración final | |
| Oligómero de LANA (x9) | 20 M | 9 l (1 l x 9) | 9 l (1 l x 9) | 9 l (1 l x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 l | - | - | 75 % (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 l | - | 75 % (v/v) |
| 1,4-dioxano | - | - | - | 16 l | 40 % (v/v) |
| agua desionizada | - | 1 l | 1 l | 15 l | 25 o 60% (v/v) |
| Volumen total | - | 40 l | 40 l | 40 l | - |
Tabla 4: Protocolo para la preparación de lotes recocidos de oligómero de LAPNA en diferentes condiciones de disolvente.
| ID de secuencia de ADN | Secuencia |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tabla 5: Secuencias de ADN isosecuentes como oligómeros de reemplazo a LAPNA. La tabla se ha modificado con permiso de la referencia15.
| Concentración de stock | Reemplazos de hebras contiguas de ADN | Reemplazos de cadena de cruce de ADN | Concentración final | |
| Oligómero de LANA (x6) | 20 M | 6 L (1 l x 6) | 6 L (1 l x 6) | 500 nM |
| Oligómero de ADN (x3) | 20 M | 3 l (1 l x 3) | 3 l (1 l x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 l | 30 l | 75 % (v/v) |
| agua desionizada | - | 1 l | 1 l | 25 % (v/v) |
| Volumen total | - | 40 l | 40 l | - |
Tabla 6: Protocolo para la preparación de lotes recocidos de nanoestructuras híbridas de ADN-ADN en 75% DMSO: H2O (v/v) mediante la sustitución de oligómeros contiguos o cruzados de LANA por oligómeros de ADN isosecendential.
| Concentración de stock | Concentraciones de SDS por debajo de CMC | Concentraciones de SDS por encima de CMC | Concentración final | |
| Oligómero de LANA (x9) | 20 M | 9 l (1 l x 9) | 9 l (1 l x 9) | 500 nM |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 l | - | 5,25 mM |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 l | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 l | 30 l | 75 % (v/v) |
| agua desionizada | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Volumen total | - | 40 l | 40 l | - |
Tabla 7: Protocolo para la preparación de lotes recocidos de nanoestructuras de ADP en el 75% de DMSO: H2O (v/v) en presencia de concentraciones de SDS por debajo y por encima de CMC.
Figura complementaria 1: Script de programación PNA3nanofiber.m para diseñar secuencias de oligómeros. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Este artículo se centra en adaptar y mejorar los protocolos de nanotecnología de ácido nucleico existentes hacia las mezclas de disolventes orgánicos. Los métodos descritos aquí se centran en las modificaciones y la solución de problemas dentro de un espacio experimental definido de disolventes orgánicos aproticos polares seleccionados. Todavía existe un potencial inexplorado para que otros protocolos establecidos de nanotecnología de ácido nucleico se adapten dentro de este espacio. Esto podría mejorar las aplicaciones potenciales a través de la integración en otros campos como la síntesis de polímeros y péptidos que normalmente se realizan en disolventes orgánicos similares25,26. Además, nos centramos aquí en los pasos críticos que deben observarse mientras practicamos los protocolos antes mencionados.
Durante la preparación de la muestra para el autoensarma, es importante mantener los porcentajes de volumen de agua en 25% (v/v) para condiciones DMSO y DMF. En consecuencia, es importante reconocer que el disolvente orgánico utilizado para el autoensambleo debe ser también de poblaciones anhidras. Las estructuras de nanofibra son hidrófobas y se agregan en mayor contenido de agua.
A diferencia de los enfoques de origami de ADN con andamios que pueden crear estructuras de longitudes discretas, el diseño actual del motivo SST para nanofibras de APna y otros nanotubos DNA SST previamente establecidos no produce estructuras de longitudes discretas. Los nanotubos polimerizan logrando una gama de longitudes multimicrones (hasta 11 m). Por la misma razón, el rendimiento asociado con la formación de la estructura no se puede cuantificar.
Sin embargo, debido a la columna vertebral del péptido sin sobrecargar de LA ADP, no hay dependencias en el equilibrio de iones de contador en relación con la formación de la estructura. Los búferes de imágenes, por lo tanto, no necesitan incluir cationes como Mg2+ típicamente necesarios para la estabilización de nanoestructuras hechas de ácidos nucleicos de origen natural.
Por último, la agrupación y agregación de nanoestructuras de LA ADN en diferentes condiciones de disolvente también dependen de las concentraciones de oligómeros individuales introducidas durante el autoensamble. Las concentraciones que van desde 1 m y superior de los oligómeros individuales aumentan la propensión a la agrupación y agregación y afectan a la imagen clara de nanoestructuras, ya sea durante las imágenes TIRF o TEM.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros competidores.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1739308 de la National Science Foundation, la subvención NSF CAREER 1944130 y por la subvención FA9550-18-1-0199 de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea. Las secuencias de la ADP fueron un regalo generoso del Dr. Tumul Srivastava de Trucode Gene Repair, Inc. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Erik Winfree y al Dr. Rizal Hariadi por sus útiles conversaciones sobre el código MATLAB de DNA Design Toolbox. También queremos dar las gracias a Joseph Suhan, Mara Sullivan y el Centro de Imágenes Biológicas por su asistencia en la recopilación de datos de TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
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