Summary
Cet article fournit des protocoles pour la conception et l’auto-assemblage de nanostructures à partir d’oligomers d’acide nucléique peptidique gamma modifiés dans les mélanges de solvants organiques.
Abstract
Les stratégies actuelles en nanotechnologie de l’ADN et de l’ARN permettent l’auto-assemblage d’une variété de nanostructures d’acide nucléique dans des médias aqueux ou considérablement hydratés. Dans cet article, nous décrivons des protocoles détaillés qui permettent la construction d’architectures nanofibres dans des mélanges de solvants organiques par l’auto-assemblage de tuiles nucléiques peptides (γPNA) particulièrement adressables, mono-échouées et gamma modifiées. Chaque tuile à brin unique (SST) est un oligomer γPNA de 12 bases composé de deux domaines modulaires concatenated de 6 bases chacune. Chaque domaine peut se lier à un domaine mutuellement complémentaire présent sur les brins voisins en utilisant la complémentarité programmée pour former des nanofibres qui peuvent atteindre des microns de longueur. Le motif SST est composé de 9 oligomers totaux pour permettre la formation de nanofibres à 3 hélices. Contrairement aux nanostructures analogues de l’ADN, qui forment des structures diamètre-monodisperse, ces systèmes γPNA forment des nanofibres qui se regroupent le long de leur largeur lors de l’auto-assemblage dans des mélanges de solvants organiques. Les protocoles d’auto-assemblage décrits ici incluent donc également un surfactant conventionnel, le sulfate de dodecyl de sodium (SDS), pour réduire les effets de regroupement.
Introduction
Construction réussie de nombreuses nanostructurescomplexes 1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12 dans des supports aqueux ou substantiellement hydratés fabriqués à partir de produits naturellement des acides nucléiques tels que l’ADN1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10 et l’ARN11,12 aété montré dans des œuvres antérieures. Cependant, les acides nucléiques naturels subissent des changements conformationnels héliciques duplex ou ont réduit les stabilités thermiques dans les mélanges organiques desolvants 13,14.
Auparavant, notre laboratoire a signalé une méthode de construction de nanofibres à 3 hélices à l’aide d’acides nucléiques synthétiques modifiés à position gamma imitant les acides nucléiques gamma-peptides (γPNA)15 (Figure 1A). La nécessité d’un tel développement et les applications potentielles de l’acide nucléique synthétique imitent pna a été discuté dans ledomaine 16,17. Nous avons montré, grâce à une adaptation de la stratégie de tuile mono-échouée (SST) présentée pour les nanostructuresd’ADN 18,19,20, que 9 oligomers γPNA séquentiellement distincts peuvent être conçus pour former des nanofibres à 3 hélices dans certains mélanges de solvants organiques aprotiques polaires tels que le DMSO et le DMF. Les oligomers γPNA ont été commandés commercialement avec des modifications de (R)-déthylène glycol (mini-PEG) à trois positions de γ (1, 4 et 8 positions de base) le long de chaque oligomer de 12 base basé sur des méthodes publiées par Sahu et coll. 21 Ces modifications gamma provoquent la pré-organisation hélitique associée à l’affinité de liaison plus élevée et à la stabilité thermique de γPNA par rapport à l’ANP non modifié.
Cet article est une adaptation de nos travaux rapportés dans lesquels nous étudions les effets de la solution solvant et de la substitution par l’ADN sur la formation de nanostructures à base de γPNA15. L’objectif de cet article est de fournir des descriptions détaillées de la conception ainsi que des protocoles détaillés pour les méthodes adaptées aux solvants qui ont été développées pour l’auto-assemblage et la caractérisation de la nanofibre γPNA. Ainsi, nous introduisons d’abord la stratégie modulaire SST, une plate-forme générale pour la conception de nanostructures utilisant l’acide nucléique synthétique imiter PNA.
On a signalé que le terrain héliique pour les duplex PNA était de 18 bases par tour par rapport aux duplex d’ADN, qui subissent un tour par 10,5 bases (figure 1B). Par conséquent, la longueur de domaine des SSTs γPNA démontrés a été fixée à 6 bases pour accueillir un tiers d’un tour complet ou 120° de rotation pour permettre l’interaction entre trois hélices triangulaires. En outre, contrairement aux motifs SST précédents, chaque SST contient seulement 2 domaines, créant efficacement une structure en forme de ruban unidimensionnel qui s’enveloppe pour former un faisceau de trois hélices (Figure 1C). Chaque oligomer γPNA de 12 bas est modifié gamma aux positions 1, 4 et 8 afin d’assurer une répartition uniformément espacée des mini-groupes PEG à travers le motif global du SST. De plus, dans le motif, il existe deux types d’oligomers : les brins « contigus » qui existent sur une seule hélice et des brins de « croisement » à hélice(figure 1D). De plus, les oligomeurs P8 et P6 sont étiquetés avec du Cy3 fluorescent (étoile verte) et de la biotine (ovale jaune), respectivement(figure 1D),afin de permettre la détection de la formation de la structure à l’aide de microscopie par fluorescence. Au total, le motif SST est composé de 9 oligomers totaux pour permettre la formation de nanofibres à 3 hélices grâce à la complémentarité programmée de chaque domaine individuel au domaine correspondant sur un oligomer voisin (Figure 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. conception de séquence γPNA
- Téléchargez la boîte à outils dna design22 développée par le Winfree Lab chez Caltech23 dans le dossier contenant des scripts de programmation pour la conception de séquences.
- Dans ce dossier de conception de séquence, ouvrez un langage de programmation de quatrième génération compatible avec l’extension de fichier « .m », puis ajoutez le dossier « DNAdesign » précédemment téléchargé au chemin en utilisant la commande suivante:
>> addpath DNAdesign - Exécutez ensuite le script suivant nommé « PNA3nanofiber.m » (voir figure supplémentaire 1)en utilisant la commande suivante:
>> PNA3nanofiber - Exécutez ce script pour créer des variables appelées « thisSeqs » et « thisScore ». La variable « thisSeqs » contient les séquences des oligomers conçus, et « thisScore » est le score de pénalité.
- Exécutez le script plusieurs fois pour obtenir le score le plus minimal. Un échantillon de 20 courses de ce genre est indiqué dans le tableau 1.
- Confirmez manuellement la complémentarité Watson-Crick souhaitée de chaque domaine des séquences générées pour le motif structurel SST spécifié. Les spécifications de séquence pour la structure nanofibre à 3 hélices sont indiquées dans le tableau 2.
- Vérifiez ce qui suit pour les séquences générées.
- Évitez d’utiliser quatre bases C et G consécutives.
- Sélectionnez manuellement des séquences spécifiques pour la fonctionnalisation terminale N avec des molécules de colorant fluorescent et de biotine pour permettre des études de microscopie fluorescente.
- Inclure un minimum de 3 mini-PEG gamma-modifications sur l’épine dorsale pour permettre la conformation hélioïque pré-organisée chez les oligomers mono-échoués tel que décrit par Sahu et al. 21 ans et plus
2. Préparation des brins de stock γPNA
- Obtenez des brins de composants γPNA de séquences spécifiées à la synthèse à l’échelle de 50 nmol avec chromatographie liquide haute performance (HPLC) purification d’un fabricant commercial.
- Resuspendez chaque brin dans de l’eau déionisée à des concentrations de 300 μM. Conserver les brins résuspendus dans un congélateur à -20 °C jusqu’à plusieurs mois jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à l’expérimentation.
3. Études de la courbe de fusion des sous-ensembles oligomer γPNA
- Obtenez des plages de température de fusion pour différentes combinaisons de sous-ensembles complémentaires de 2 oligomers et de 3 oligomers en exécutant une étude de courbe de fonte dans des tampons aqueux tels que 1x phosphate tamponné salin (PBS) ou solvant organique polaire préféré comme le diméthylformamide (DMF) ou le sulfure de diméthyle (DMSO) (voir figure 2).
REMARQUE: Les courbes de fusion thermique à >50% de DMF commencent à perdre la ligne de base supérieure et montrent des perturbations graves en partie en raison de l’absorption élevée de DMF à la longueur d’onde requise pour les expériences. C’est un phénomène noté dans la littérature24. Il est toutefois possible d’obtenir les courbes de fusion à 5 μM par brin dans ces conditions de solvant.- Aliquot 16,7 μL du stock de 300 μM de chaque oligomer et faire le volume final à un 1000 μL soit en 1x PBS ou 100% (v / v) DMSO ou 100% (v / v) DMF effectivement obtenir 5 μM concentration finale par oligomer. Transférer ce mélange de sous-ensemble oligomer sur un chemin optique de 1 cm, cuvette à quartz.
- Effectuez des expériences UV-Vis à température variable dans un spectrophotomètre équipé d’un bloc de température programmable.
- Recueillir des points de données pour les courbes de fusion sur une plage de température de 15\u201290 °C pour les cycles de refroidissement (annealage) et de chauffage (fusion) à un taux de 0,5\u20121 °C/min. Conserver les échantillons pendant 10 min à 90 °C avant le refroidissement et à 15 °C avant le chauffage. Déterminer la température de fusion (Tm)à partir du pic du premier dérivé de la courbe de chauffage.
- Vérifiez que les plages de température de fusion des sous-ensembles à 2 oligomers sont supérieures à 35 °C dans tous les cas de solvant. En outre, vérifiez que les sous-ensembles correspondants de 3 oligomers qui contiennent un brin supplémentaire à leur sous-ensemble équivalent de 2 oligomers montrent une augmentation considérable de Tm en raison de la co-opérativité accrue.
REMARQUE : Cela permettrait de vérifier qu’un seul pot auto-assemblage de plusieurs oligomers peut se replier en coopération dans la nanostructure désirée avec une stabilité thermique raisonnable.
4. Protocole d’auto-assemblage pour plusieurs oligomers γPNA distincts
REMARQUE : Pour concevoir un protocole de rampe thermique auto-assemblage pour les nanostructures γPNA, il est souhaitable d’annealing à rampe lente.
- Dans le cas des séquences oligomer générées, anneal les échantillons pendant 22,5 h dans un cycleur thermique refroidissant de 90 à 20 °C. En règle générale, la température de fusion obtenue pour les sous-ensembles γPNA de 2 oligomères et de 3 oligomers se situe dans des fourchettes de 40\u201270 °C pour différentes conditions de solvant.
- Programmez le cycleur thermique comme suit : maintenez à 90 °C pendant 5 min, descendre de 90 à 70 °C à un taux constant de 0,1 °C/min, descendre de 70 à 40 °C à un taux de 0,1 °C/3 min, descendre de 40 à 20 °C à un taux de 0,1 °C/min et tenir à 4 °C (voir le tableau 3). Les échantillons peuvent être stockés à 4 °C pendant 12\u201224 h avant la caractérisation.
REMARQUE : Alors que les sous-ensembles de 2 et 3 oligomers de notre système de nanofibres peuvent se former en 1x PBS, les nanofibres à l’échelle micron complète s’agrègent en 1x PBS. Par conséquent, les conditions de solvant doivent être optimisées en fonction de l’échelle et de la taille de la structure en cours de formation ainsi que du type et de la densité des modifications gamma. - Pour les nanofibres à 3 hélices à l’échelle micron, préparez des échantillons de lots anneaux dans 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxane: H2O (v/v) basé sur des études d’optimisation dessolvants 15.
- Préparez les lots anneaux comme suit (voir le tableau 4). Tout d’abord, préparer 10 sous-stocks de μL à des concentrations de 20 μM à partir des stocks principaux de 300 μM pour chaque oligomer en aliquoting 0,67 μL du stock principal et en faisant le volume à 10 μl en utilisant de l’eau déionisée.
- Aliquot 1 μL des sous-stocks de 20 μM pour chaque oligomer et l’ajouter à un tube PCR de 200 μL. Cela représente un volume total de 9 μL pour 9 oligomers.
- Ajouter 30 μL de DMSO/DMF anhydre pour les cas de 75 % de DMSO et 75 % de DMF avec 1 μL supplémentaire d’eau déionisée pour faire un volume final de 40 μL avec chaque oligomer à 500 nM de concentrations finales. Ajouter 16 μL de 1,4 dioxane et faire le volume avec de l’eau déionisée à 40 μL pour l’état de solvant dioxane de 40%.
- Chargez les lots anneaux sur le cycleur thermique et anneal en utilisant le protocole mentionné à l’étape 4.2.
5. Imagerie par microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF)
- Préparez une chambre d’humidité à partir d’une boîte de pointes de pipette vide. Remplissez la boîte d’environ 5 mL d’eau pour éviter le séchage des canaux d’écoulement de l’échantillon décrits comme suit (voir la figure 3).
- Préparez la chambre d’écoulement avec une glissière de microscope, 2 bandes de bande à double face, et le coverslip nitrocellulose-enduit. Pour enrober le coverslip de nitrocellulose, tremper le coverslip dans un bécher contenant 0,1% de collodion dans l’acétate d’amyle et assécher à l’air libre.
- Préparer la solution de nitrocellulose en faisant une dilution 20 fois à partir de collodion disponible dans le commerce 2% en acétate d’amyle avec solvant d’acétate d’isoamyle.
- Préparer la solution biotinylée d’albumine bovine de sérum (Biotin-BSA) en pesant 1 mg de Biotin-BSA et en la dissolvant en 1 mL de 1x PBS. Flow 15 μL de 1 mg/mL Biotin-BSA en tampon 1x PBS en plaçant le canal d’écoulement à un angle. Incuber le canal d’écoulement pendant 2-4 min à température ambiante dans une chambre humidifiée.
- Préparer le tampon de lavage en dissolvant 1 mg de BSA dans 1 mL de 1x PBS. Laver l’excès de Biotin-BSA en coulant 15 μL du tampon de lavage. Pour passer la surface, incuber le canal d’écoulement pendant 2-4 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée.
- Préparer la solution streptavidine en mesurant 0,5 mg de streptavidine et 1 mg de BSA, puis en dissolvant à l’aide de 1 mL de 1x PBS. Débit 15 μL de 0,5 mg/mL de streptavidine dans 1x PBS contenant 1 mg/mL BSA. Incuber le canal d’écoulement pendant 2-4 min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Écoulez 15 μL du tampon de lavage pour laver la Streptavidine non léchée.
- Débit 15 μL de lots précédemment annelés d’oligomers γPNA à 500 nM de concentration par brin dans 75% DMSO, 75% DMF ou 40% 1,4-Dioxane condition. Incuber le canal d’écoulement pendant 2-4 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée.
- Préparer 1 mM trolox dans des conditions de solvant préféré en diluant 10 fois à partir d’un stock de 10 mM de Trolox en DMSO (mesurer 2,5 mg de Trolox et dissoudre dans 1 mL de DMSO). Lavez les nanostructures non liées dans le canal d’écoulement avec 15 μL de 1 mM Trolox ayant la même composition de solvant que les nanostructures.
REMARQUE: Le contenu >50% DMSO dans le canal d’écoulement produirait des perturbations mineures du signal en raison de l’indice différent de réfraction de l’état de solvant pendant TIRF qui est généralement calibré pour les angles TIRF coverslip-eau. Ceci peut être rectifié en lavant avec 1 mM trolox fait en diluant le Trolox de 10 mM 10 fois à l’aide d’eau déionisée. Cette technique fournit des images plus claires, mais n’est utile que pour évaluer si la formation s’est produite, cependant, parce qu’elle produit des micro-bulles en deux phases dans le canal d’écoulement. Par conséquent, les nanostructures peuvent être visibles à l’interface des deux phases, comme le montre la figure 4D. - Transférez le canal d’écoulement vers le support de diapositives et l’image à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de l’imagerie TIRF à l’aide d’un objectif d’immersion d’huile de 60 x et d’une loupe de 1,5 x. Numérisez le canal d’écoulement à 60 x ou 90 x grossissement en surveillant le canal Cy3 (voir la figure 4).
6. Imagerie par microscopie électronique de transmission (TEM)
- Pesez 0,5 g d’acétate d’uranyle dans 50 mL d’eau distillée pour préparer une solution de tache d’acétate d’uranyle 1%. Filtrer la solution de tache d’acétate d’acétate d’uranyl 1% à l’aide d’un filtre de 0,2 μm attaché à une seringue.
REMARQUE : Alternativement, l’acétate d’uranyl aqueux de 2% pourrait être acheté d’un fabricant commercial. - Achetez des grilles en cuivre enduites de couche de support formvar disponibles dans le commerce avec une taille de 300 mailles.
REMARQUE : Il est important de noter que la couche de support formvar pourrait être dissoute par des solvants comme DMSO au-delà de 2 min. Pour une incubation plus longue de l’échantillon, formvar disponible dans le commerce stabilisé avec du monoxyde de silicium sur les grilles de cuivre sont disponibles qui permettent au réseau d’être plus hydrophile que les grilles recouvertes de carbone et peuvent résister à des conditions d’échantillonnage vigoureuses et le faisceau d’électrons comme le montre la figure 5C. - Pipette 4 μL d’échantillon sur la grille pendant 15 s. Utilisez un morceau de papier filtre pour évacuer l’échantillon en mettant le papier filtre en contact avec la grille sur le côté.
- Ajouter immédiatement 4 μL de la solution de tache sur la grille pendant 5 s.
- Évacuez la tache comme avant et maintenez le papier filtre contre la grille pendant 1\u20122 min pour vous assurer que la grille est sèche. Les échantillons doivent généralement être photographiés dans les 1\u20122 h après coloration. Alternativement, si la grille est assurée d’être complètement sèche, les grilles peuvent être stockées dans une boîte de stockage de grille TEM jusqu’à 3 jours avant l’imagerie.
- Transférer la grille sur un porte-spécimens TEM et une image à l’aide d’un microscope électronique de transmission fonctionnant à 80 kV avec grossissement allant de 10 K à 150K (voir figure 5).
7. Différentes morphologies pour les hybrides γPNA-ADN basées sur le remplacement sélectif par l’ADN
- Obtenir des oligomères d’ADN de séquences spécifiées (voir le tableau 5)auprès de fabricants commerciaux d’oligonucléotides synthétisés à l’échelle de 25 nmol à l’aide d’un desalage standard. Resuspendez ces séquences d’ADN à l’aide d’eau déionisée sans RNase à des concentrations de stock de 20 μM.
- Pour les remplacements contigus de brin de γPNA avec l’ADN, les séquences D3, D5 et D9 peuvent remplacer les brins p3, p5 et p9. De même, pour les remplacements de brins de croisement γPNA par de l’ADN, les séquences D1, D4 et D7 peuvent remplacer les brins p1, p4 et p7.
- Aliquot 1 μL des sous-stocks de 20 μM pour chaque oligomer γPNA ou ADN et l’ajouter à un tube PCR de 200 μL comme à l’étape 2.7. Ajouter 30 μL de DMSO anhydre et 1 μL d’eau déionisée sans RNase pour faire le volume final à 40 μL (voir le tableau 6).
- Chargez les lots anneaux sur le cycleur thermique et anneal en utilisant le protocole mentionné à l’étape 4.2.
- Caractériser les nanostructures hybrides γPNA-ADN à l’aide du protocole TIRF en suivant les étapes de la section 5 ou en utilisant le protocole d’imagerie TEM mentionné à la section 6 (voir la figure 6).
8. Différentes morphologies pour les nanofibres γPNA en différentes concentrations de SDS
- Préparez un stock principal de SDS de 20 % (wt/v) en mesurant 20 mg de SDS et en le dissolvant dans 100 μL d’eau déionisée.
- Préparez un sous-stock SDS de 6 % (wt/v) en aliquoting 3 μL du stock SDS de 20 % et en faisant le volume à 10 μL à l’aide d’eau déionisée.
- Anneal les oligomers γPNA en concentrations finales de 5,25 mM et 17,5 mM SDS comme suit. Aliquot 1 μL des sous-stocks de 20 μM pour chaque oligomer γPNA et l’ajouter à un tube PCR de 200 μL comme à l’étape 2.7. Ajouter 30 μL de DMSO anhydre et 1 μL de 6 % et 20 % de SDS pour faire le volume final à 40 μL pour atteindre des concentrations finales de SDS de 5,25 mM et 17,5 mM, respectivement (voir le tableau 7).
- Chargez les lots anneaux de différentes concentrations de SDD sur le cycleur thermique et l’anneal en utilisant le protocole mentionné à l’étape 4.2.
- Caractériser les nanostructures γPNA en présence de SDS à l’aide du protocole TIRF suivant les étapes de la section 5 ou en utilisant le protocole d’imagerie TEM mentionné à la section 6 (voir la figure 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les protocoles discutés dans les sections ci-dessus décrivent la conception d’un motif SST adapté à partir de nanofibres d’ADN pour la génération robuste de structures nanofibres auto-assemblées utilisant plusieurs oligomers γPNA distincts. Cette section décrit l’interprétation des données obtenues à partir de la reconstitution réussie des protocoles décrits.
Suivant le protocole décrit à la section 5 pour l’imagerie TIRF d’échantillons d’oligomers γPNA annelés dans 75 % DMSO : H2O (v/v) fournit le plus facilement des preuves d’architectures bien organisées sous des observations microscopiques comme le montre la figure 4A. 75 % DMF : L’état solvant H2O (v/v) entraîne des nanostructures en forme de spicule ou en forme d’aiguille(figure 4B)et, d’après notre expérience, l’état de 40 % 1,4 dioxane : H2O (v/v) présente une décoration clairsemée de nanostructures filamenteuses lorsqu’on les regarde à l’aide de la microscopie TIRF(figure 4C). De plus, les échantillons de nanotubes γPNA formés à 75 % de DMSO : H2O (v/v) démontrent le regroupement de nanofibres à forte grossissement ou résolutions nanoscopiques au cours de l’imagerie TEM suivant les étapes mentionnées à la section 6 (figure 5). Les analyses quantitatives de la largeur des nanostructures ont montré une largeur médiane de 16,3 nm avec des valeurs maximales au-delà de 80 nm15.
Pour concevoir un schéma visant à générer des nanostructures hybrides γPNA-ADN dans des mélanges de solvants organiques pour permettre une fonctionnalisation plus complète à l’aide de l’ADN, il est important de considérer la position oligomérique dans le motif SST remplacée par des oligomers d’ADN isosequential. L’adaptation des étapes mentionnées à la section 7 pour le cas de la construction de nanotubes décrite ici, les oligomers d’ADN isosequential qui remplacent les oligomers contigus de γPNA forme les structures filamenteuses droites tandis que le remplacement des oligomers de croisement γPNA forme des structures stellaires lorsqu’on les regarde à l’aide de l’imagerie TIRF et TEM (figure 6). Les analyses quantitatives de la largeur des nanostructures qui ont été remplacées par des oligomers d’ADN contigus ont montré des largeurs médianes autour de 19 nm15.
Enfin, lors de l’adaptation des étapes de la section 8, les nanofibres γPNA adoptent des morphologies plus minces compatibles avec un regroupement réduit en présence de concentrations de SDD inférieures à ses concentrations critiques de micelles (CMC, 8,2 mM). les nanofibres γPNA adoptent également des morphologies hautement en réseau à des concentrations élevées de SDS par rapport à son CMC lorsqu’on les regarde à l’aide de l’imagerie TIRF (figure 7). L’imagerie TEM des oligomers γPNA auto-assemblés en présence de SDS indique que l’état SDS de 5,25 mM indique les réductions les plus substantielles du regroupement structurel avec des largeurs allant de 8\u201212 nm comme indiqué dans (Figure 7C).
Figure 1 : Oligomers d’acide nucléique peptide comme éléments constitutifs de nanostructures complexes.
(A) Structures chimiques de l’ADN (PNA), de l’ANP et des unités γPNA contenant des MP. (Figure a été réimprimée avec la permission de Ref21.) (B) Les hélices PNA-PNA sont moins tordues que les hélices ADN-ADN, ayant 18 bases par tour au lieu de 10,5. (C) Ce motif de tuile unique structurale à trois hélices (SST) se compose de 9 oligomers γPNA distincts de 12 base de long, chacun ayant deux domaines à six bases. (D) Dans la structure, il existe deux types d’oligomers : les brins « contigus » qui existent sur une seule hélice et des brins de « croisement » à hélice. (E) Ce motif structurel de 18 bas de long peut polymériser pour former des filaments à l’échelle micron. Les panneaux B, C et E ont été modifiés avec la permission de Ref15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Courbes de fusion représentatives de certains oligomers γPNA dans différentes conditions de solvant.
Le sous-ensemble de 2 oligomers (p4, p5) montrant des domaines à 6 bas peut se lier à une stabilité thermique raisonnable (courbe noire) en 1x PBS. 3- oligomer (p4, p5, p6) sous-ensemble montre une stabilité thermique accrue due à la cooperativité en 1x PBS (courbe bleue) et montre peu ou pas d’instabilité par rapport à Tm lorsque solvant est changé en solvants organiques comme DMF (courbe pointillée rouge). Figure a été modifiée avec la permission de Ref15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Diagramme d’écoulement pour canal d’écoulement fluidique pour l’imagerie TIRF échantillon.
Un workflow étape par étape indiquant les étapes impliquées dans la préparation de l’échantillon pour l’imagerie TIRF des nanofibres γPNA après l’assemblage du canal d’écoulement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Imagerie par microscopie TIRF de nanofibres γPNA autoassemblées dans différentes conditions de solvant.
nanofibres γPNA visualisées à l’aide de la microscopie TIRF (barre d’échelle de 5 μm) tout en surveillant le canal Cy3 lorsque les oligomers γPNA sont auto-assemblés dans (A) 75% DMSO: eau (v/v), (B) 75% DMF: eau (v/v) et (C) 40% Dioxane: eau (v/v) conditions solvant. (D) Lorsque les nanofibres γPNA auto-assemblées en 75% DMSO: l’eau (v/v) liée au canal d’écoulement est lavée avec 1mM Trolox dans l’eau, microbobbles en deux phases de la forme DMSO-eau avec des nanostructures s’alignant le long de l’interface de la microbobble. Figure a été modifiée avec la permission de Ref15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Imagerie TEM des nanofibres γPNA autoassemblées en 75 % DMSO : eau. (v/v) à l’aide de grilles de cuivre de couche de support formvar 300.
(A) Images TEM de nanofibres γPNA visualisées sous faible grossissement (15x). (B) Les images TEM de nanofibres γPNA visualisées sous grossissement élevé (150x) montrent le regroupement de nanotubes le long de la largeur à des résolutions nanoscopiques. (C) Images TEM de nanofibres γPNA visualisées sous faible grossissement (10x) à l’aide d’une couche de soutien au monoxyde formvar-silicium sur une grille de cuivre permet l’imagerie dans des conditions vigoureuses spécimen. Figure a été modifiée avec la permission de Ref15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Différentes morphologies pour les hybrides γPNA-ADN basées sur le remplacement sélectif par l’ADN.
(A) TIRF (barre d’échelle de 5 μm) et (C) images TEM (grossissement 60x) de l’auto-assemblage d’hybrides γPNA-ADN lors du remplacement des oligomers contigus γPNA (p3, p5, p9) avec oligomers d’ADN isosequential (D3, D5 D9) montrent des nanotubes adoptant une morphologie de filament droite. (B) TIRF (barre d’échelle de 5 μm) et (D) images TEM (grossissement 25x) de l’auto-assemblage d’hybrides γPNA-ADN lors du remplacement des oligomers γPNA crossover (p1, p4, p7) par oligomers d’ADN isosequential (D1, D4 D7) montrent des nanofibres adoptant une morphologie stellate. Figure a été modifiée avec la permission de Ref15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Morphologies différentes pour les nanofibres γPNA dans différentes concentrations de SDS.
Images TIRF (barre d’échelle de 5 μm) d’auto-assemblage de nanofibres γPNA en présence de SDS à des concentrations de (A) 5,25 mM et (B) 17,5 mM. L’auto-assemblage en présence de concentrations de SDS inférieures à celles du CMC (8,2 mM) montre des morphologies plus minces à partir d’images TIRF basées sur l’intensité de fluorescence. (C) Ceci est vérifié par des images TEM (grossissement 100x) du système où la largeur médiane des nanofibres se situe dans la gamme de 8\u201212 nm. À des concentrations significativement supérieures au CMC, les nanotubes γPNA semblent former des assemblages d’ordre supérieur grâce à des structures de nanotubes hautement en réseau. Figure a été modifiée avec la permission de Ref15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Matlab script string sortie « thisSeq » | Score de pénalité « thisScore » | ||
| 'acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga ' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatctcgt ttcaggacgaga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac ' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctcac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggacga ' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctg ' | 0.0704 | ||
Tableau 1 : 20 exemples de résultats algorithmiques pour l’optimisation potentielle de la conception des séquences γPNA. 20 exemples de résultats algorithmiques avec des sorties de séquence dans la colonne 1 et leur score correspondant dans la colonne 2. Des itérations répétées du script sont effectuées pour obtenir la partition la plus minimale.
| ID de séquence γPNA | Séquence | Complément domaine 1 | Complément domaine 2 |
| p1 (en) | N-AATAGCGTTCAC-C | p2 domaine 1 | domaine p6-Biotin 1 |
| p2 (en) | N-GCTATTGAGTAA-C | p1 domaine 1 | domaine p3 2 |
| p3 (en) | N-GACATCTTACTC-C | p7 domaine 2 | p2 domaine 2 |
| p4 (en) | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5 domaine 1 | p9 domaine 1 |
| p5 (en) | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4 domaine 1 | domaine p6-Biotin 2 |
| p6-Biotine | N-Biotine-GTGAACCGAGGG-C | p1 domaine 2 | p5 domaine 2 |
| p7 (en) | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3 domaine 1 | p3 domaine 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 domaine 1 | p9 domaine 2 |
| p9 (en) | N-TCCGCATTCTGT-C | p4 domaine 2 | p8-Cy3 domaine 2 |
Tableau 2 : Résultats de conception des séquences γPNA pour les nanofibres. Des séquences d’oligomer individuelles ont été générées comme indiqué dans ce tableau. Les bases soulignées indiquent les modifications de la position gamma avec mini-PEG. Table a été modifié avec la permission de Ref15.
| Plage de température | Taux de rampe |
| 90 °C | Tenir pendant 3 minutes |
| 90-80 °C | 0.1°C/minute |
| 80-70 °C | 0.1°C/minute |
| 70-60 °C | 0.1°C/3 minutes |
| 60-50 °C | 0.1°C/3 minutes |
| 50-40 °C | 0.1°C/3 minutes |
| 40-30 °C | 0.1°C/minute |
| 30-20 °C | 0.1°C/minute |
| 4 °C | Tenir indéfiniment |
Tableau 3 : Protocole de rampe Anneal pour cycleur thermique. Table a été modifié avec la permission de Ref15.
| Concentration des stocks | 75% DMSO: eau (v/v) échantillon anneal | 75% DMF: échantillon anneal d’eau (v/v) | 40% dioxane : échantillon anneal d’eau (v/v) | Concentration finale | |
| oligomer γPNA (x9) | 20 μM (20 μM) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | 75 % (v/v) |
| 1,4 dioxane | - | - | - | 16 μL | 40 % (v/v) |
| Désionisée | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 ou 60% (v/v) |
| Volume total | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tableau 4 : Protocole de préparation des lots anneaux d’oligomer γPNA dans différentes conditions de solvant.
| ID de séquence d’ADN | Séquence |
| D1 (D1) | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 (D3) | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 (en) | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 (en) | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 (en) | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 (en) | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tableau 5 : Séquences d’ADN isosquentielles en tant qu’oligomers de remplacement à γPNA. Table a été modifié avec la permission de Ref15.
| Concentration des stocks | Remplacements de brin contigus d’ADN | Remplacements de brin de croisement d’ADN | Concentration finale | |
| oligomer γPNA (x6) | 20 μM (20 μM) | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| Oligomer d’ADN (x3) | 20 μM (20 μM) | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| Désionisée | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v/v) |
| Volume total | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tableau 6 : Protocole de préparation de lots anneaux de nanostructures hybrides γPNA-ADN dans 75 % DMSO : H2O (v/v) par le remplacement d’oligomers contigus ou croisés γPNA par des oligomers d’ADN isosequential.
| Concentration des stocks | Concentrations de SDS inférieures à la CMC | Concentrations de SDS au-dessus du CMC | Concentration finale | |
| oligomer γPNA (x9) | 20 μM (20 μM) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| 6% DDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| 20% DDS | 20% (wt/v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| Désionisée | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Volume total | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tableau 7 : Protocole de préparation de lots anneaux de nanostructures γPNA dans 75 % DMSO : H2O (v/v) en présence de concentrations de SDS au-dessous et au-dessus du CMC.
Figure supplémentaire 1 : Script de programmation PNA3nanofiber.m pour la conception de séquences oligomer. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cet article met l’accent sur l’adaptation et l’amélioration des protocoles existants de nanotechnologie de l’acide nucléique vers les mélanges de solvants organiques. Les méthodes décrites ici se concentrent sur les modifications et le dépannage dans un espace expérimental défini de certains solvants organiques aprotiques polaires. Il existe encore un potentiel inexploré pour l’adaptation d’autres protocoles établis de nanotechnologie de l’acide nucléique dans cet espace. Ceci pourrait améliorer des applications potentielles par l’intégration dans d’autres domaines tels que la synthèse de polymère et de peptide qui sont typiquement exécutées dans les solvants organiquessemblables 25,26. En outre, nous nous concentrons ici sur les étapes critiques à observer lors de la pratique des protocoles mentionnés ci-dessus.
Lors de la préparation de l’échantillon pour l’auto-assemblage, il est important de maintenir les pourcentages de volume d’eau à 25% (v/v) pour les conditions DMSO et DMF. Par conséquent, il est important de reconnaître que le solvant organique utilisé pour l’auto-assemblage doit également être provenant de stocks anhydres. Les structures nanofibres sont hydrophobes et agrégées dans une teneur accrue en eau.
Contrairement aux approches origami d’ADN échafaudées qui peuvent créer des structures de longueurs discrètes, la conception actuelle du motif SST pour les nanofibres γPNA et d’autres nanotubes SST d’ADN précédemment établis ne donne pas de structures de longueurs discrètes. Les nanotubes polymérisent pour atteindre une gamme de longueurs de plusieurs microns (jusqu’à 11 μm). Pour la même raison, le rendement associé à la formation de la structure ne peut pas être quantifié.
Cependant, en raison de l’épine dorsale non chargée de peptide de γPNA, il n’y a aucune dépendance sur l’équilibre d’ion de compteur par rapport à la formation de structure. Les tampons d’imagerie n’ont donc pas besoin d’inclure des cations comme mg2+ généralement nécessaires à la stabilisation des nanostructures fabriquées à partir d’acides nucléiques naturels.
Enfin, le regroupement et l’agrégation de nanostructures γPNA dans différentes conditions de solvant dépendent également des concentrations individuelles d’oligomer introduites lors de l’auto-assemblage. Des concentrations allant de 1 μM et plus d’oligomers individuels augmentent la propension au regroupement et à l’agrégation et affectent l’imagerie claire des nanostructures pendant l’imagerie TIRF ou TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus en partie par la subvention de la National Science Foundation 1739308, la subvention carrière du FNS en 1944130 et par le numéro de subvention fa9550-18-1-0199 de l’Office of Science de la Force aérienne. γPNA séquences ont été un don généreux du Dr Tumul Srivastava de Trucode Gene Repair, Inc. Nous tenons à remercier le Dr Erik Winfree et le Dr Rizal Hariadi pour leurs conversations utiles sur le code MATLAB de la boîte à outils de conception d’ADN. Nous tenons également à remercier Joseph Suhan, Mara Sullivan et le Center for Biological Imaging pour leur aide dans la collecte de données TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
