Summary
Denna artikel ger protokoll för utformning och självmontering av nanostrukturer från gamma-modifierad peptid nukleinsyra oligomer i organiska lösningsmedel blandningar.
Abstract
Nuvarande strategier inom DNA och RNA nanoteknik möjliggör självmontering av en mängd olika nukleinsyrananostruktur i vattenhaltiga eller väsentligt hydrerade medier. I den här artikeln beskriver vi detaljerade protokoll som möjliggör konstruktion av nanofiberarkitekturer i organiska lösningsmedelsblandningar genom självmontering av unikt adresserbara, enkelsträngade, gammamodifierade plattor för peptidnukleinsyra (γPNA). Varje enkelsträngad bricka (SST) är en 12-bas γPNA oligomer består av två hopkonkatenerade modulära domäner på 6 baser vardera. Varje domän kan binda till en ömsesidigt gratis domän som finns på angränsande strängar med hjälp av programmerade komplementaritet för att bilda nanofibrer som kan växa till mikrometer i längd. SST-motivet är tillverkat av 9 totalt oligomerer för att möjliggöra bildande av 3-helix nanofibrer. I motsats till analoga DNA-nanostrukturer, som bildar diameter-monodisperse strukturer, dessa γPNA-system bildar nanofibrer som buntar längs sina bredder under självmontering i organiska lösningsmedelsblandningar. Självmonteringsprotokoll som beskrivs här inkluderar därför också ett konventionellt ytaktiva, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), för att minska kombinationseffekter.
Introduction
Framgångsrik konstruktion av talrika komplexa nanostrukturer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 i vattenhaltiga eller väsentligen hydrerade medier som görs med hjälp av naturliga 4 , 5,6,7,8 ,9,10 och RNA11,12 har visats i tidigare arbeten. Men naturligt förekommande nukleinsyror genomgår duplex spiralformade konformationsförändringar eller har minskat termiska stabilities i organiska lösningsmedelblandningar 13,14.
Tidigare har vårt labb rapporterat en metod mot konstruktion av 3-helix nanofibrer med hjälp av gamma-position modifierade syntetisk nukleinsyra härmar kallas gamma-peptid nukleinsyror (γPNA)15 (Figur 1A). Behovet av en sådan utveckling och potentiella tillämpningar av den syntetiska nukleinsyran efterliknar PNA har diskuterats inom området16,17. Vi har visat, genom en anpassning av strategin single-stranded tile (SST) som presenteras för DNA nanostrukturer18,19,20, att 9 sekventiellt distinkta γPNA-oligomerer kan utformas för att bilda 3-helix nanofibrer i utvalda polära aprotiska organiska lösningsmedelsblandningar som DMSO och DMF. γPNA-oligomererna beställdes kommersiellt med modifieringar av (R)-diethyleneglykol (mini-PEG) vid tre γ-positioner (1, 4 och 8 baspositioner) längs varje 12-bas oligomer baserat på metoder som publicerats av Sahu et al. 21 Dessa gamma-modifieringar orsakar den spiralformade förorganisation som är associerad med den högre bindningsaffinitet och termisk stabilitet av γPNA i förhållande till omodifierade PNA.
Denna artikel är en anpassning av vårt rapporterade arbete där vi undersöker effekterna av lösningsmedelslösning och substitution med DNA på bildningen av γPNA-baserade nanostrukturer15. Syftet med denna artikel är att ge detaljerade beskrivningar av konstruktionen samt detaljerade protokoll för lösningsmedelsanpassade metoder som utvecklades för självmontering och karakterisering av γPNA nanofiber. Således introducerar vi först den modulära SST-strategin, en allmän plattform för nanostrukturdesign med hjälp av den syntetiska nukleinsyran som efterliknar PNA.
Den spiralformade stigningen för PNA-duplex har rapporterats vara 18 baser per varv i jämförelse med DNA-duplex, som genomgår ett varv per 10,5 baser (Figur 1B). Därför domän-längd på den påvisade γPNA SSTs sattes till 6 baser för att rymma en tredjedel av en fullständig sväng eller 120° av rotation för att möjliggöra interaktion mellan tre triangulärt arrayed helices. Också, till skillnad från tidigare SST-motiv, innehåller varje SST bara 2 domäner, effektivt skapa en 1-dimensionell band-liknande struktur som sveper för att bilda en tre-helix bunt (Figur 1C). Varje 12-bas γPNA oligomer är gamma modifierad vid 1, 4 och 8 positioner för att säkerställa enhetligt fördelade fördelning av mini-PEG grupper över den totala SST motiv. Dessutom, inom motivet, det finns två typer av oligomerer: "sammanhängande" strängar som finns på en enda spiral och helix-spänner "crossover" strängar (Figur 1D). Dessutom är oligomererna P8 och P6 märkta med fluorescerande Cy3 (grön stjärna) respektive biotin (gul oval),föratt möjliggöra detektering av strukturbildning med hjälp av fluorescensmikroskopi. Sammantaget är SST-motivet gjort av 9 totalt oligomerer för att möjliggöra bildandet av 3-helix nanofibrer genom programmerad komplementaritet av varje enskild domän till motsvarande domän på en angränsande oligomer (Figur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. γPNA sekvens design
- Ladda ner DNA Design Toolbox22 som utvecklats av Winfree Lab på Caltech23 i mappen som innehåller programmeringsskript för att utforma sekvenser.
- Öppna ett fjärde generationens programmeringsspråk som är kompatibelt med filtillägget ".m" inom den sekvensens designmapp och lägg sedan till mappen "DNAdesign" som tidigare har hämtats till sökvägen med följande kommando:
>> addpath DNAdesign - Därefter köra följande skript med namnet "PNA3nanofiber.m" (se Kompletterande bild 1) med följande kommando:
>> PNA3nanofiber - Kör det här skriptet för att skapa variabler som kallas "thisSeqs" och "thisScore". Variabeln "thisSeqs" innehåller sekvenserna för de utformade oligomererna, och "thisScore" är straffpoängen.
- Kör skriptet flera gånger för att erhålla den mest minimala poängen. Ett urval av 20 sådana körningar visas i tabell 1.
- Bekräfta manuellt den önskade Watson-Crick-komplementariteten hos varje domän av de genererade sekvenserna för det angivna SST-strukturmotivet. Sekvensspecifikationer för 3-helix nanofiberstrukturen visas i tabell 2.
- Verifiera följande för genererade sekvenser.
- Undvik att använda fyra på varandra följande C- och G-baser.
- Välj manuellt specifika sekvenser för N-terminal funktionalisering med fluorescerande färgämne och biotinmolekyler för att möjliggöra fluorescerande mikroskopistudier.
- Inkludera ett minimum av 3 mini-PEG gamma-modifieringar på ryggraden för att möjliggöra förorganiserad spiralformig konformation i den enkelsträngade oligomerer som beskrivs av Sahu et al. 21
2. Beredning av γPNA lager strängar
- Få γPNA-komponentsträngar av angivna sekvenser vid 50 nmol-skalasyntes med högpresterande vätskekromatografi (HPLC)rening från en kommersiell tillverkare.
- Resuspend varje sträng i avjoniserat vatten till 300 μM koncentrationer. Förvara de återanvända strängarna i -20 °C frys upp till flera månader tills det behövs för experiment.
3. Smältkurva studier av γPNA oligomer delmängder
- Få smälttemperaturintervall för olika kombinationer av komplementära 2-oligomer och 3-oligomer understunder genom att köra en smältkurvastudie i vattenhaltiga buffertar som 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) eller föredraget polartiskt organiskt lösningsmedel som Dimetylformamid (DMF) eller Dimetylsulfoxid (DMSO) (se figur 2).
OBS: Termiska smältkurvor vid >50% av DMF börjar förlora den övre baslinjen och uppvisar allvarliga störningar delvis på grund av hög absorbans av DMF vid den våglängd som krävs för experimenten. Detta är ett noterat fenomen i litteraturen24. Det är emellertid möjligheten som erhåller smälta buktar på 5 μM per strandar koncentrationer i dessa lösningsmedel villkorar.- Alikvot 16,7 μL från 300 μM-stocken av varje oligomer och gör den slutliga volymen till en 1000 μL antingen i 1x PBS eller 100% (v/v) DMSO eller 100% (v/v) DMF effektivt erhålla 5 μM slutkoncentration per oligomer. Överför denna oligomer undergrupp blandning till en 1 cm optisk väg, kvarts cuvette.
- Utför UV-Vis-experiment med variabel temperatur i en spektrofotometer utrustad med ett programmerbart temperaturblock.
- Samla in datapunkter för smältkurvorna över ett temperaturområde på 15\u201290 °C för både kylnings-(glödgning) och uppvärmnings(smältning) cykler med en hastighet av 0,5\u20121 °C/min. Förvara proverna i 10 min vid 90 °C före avkylning och vid 15 °C före uppvärmning. Bestäm smälttemperaturen (Tm) från toppen av värmekurvans första derivat.
- Kontrollera att smälttemperaturintervall för underuppsättningar med 2 oligomer ligger över 35 °C i alla lösningsmedelsfall. Kontrollera dessutom att motsvarande delmängder med 3 oligomer som innehåller ytterligare en delmängd till deras motsvarande delmängd 2-oligomer visar en avsevärd ökning av Tm på grund av ökad co-operativity.
OBS: Detta skulle kontrollera att en enda pott självmontering av flera oligomerer kan kooperativt vika in önskad nanostruktur med rimlig termisk stabilitet.
4. Självmonteringsprotokoll för flera distinkta γPNA-oligomer
OBS: För att utforma ett självmonterings termisk ramp protokoll för γPNA nanostrukturer, är långsam-ramp glödgning önskvärt.
- När det gäller oligomersekvenser som genereras, glödg proven för 22,5 h i en termisk cyclerkylning från 90 till 20 °C. Typiskt, smälttemperatur erhålls för 2-oligomer och 3-oligomer γPNA delmängder ligger i intervall om 40\u201270 °C för olika lösningsmedel villkor.
- Programmera termiska cyclern enligt följande: håll vid 90 °C i 5 min, ramp ned från 90 till 70 °C vid en konstant hastighet av 0,1 °C/min, ramp ned från 70 till 40 °C vid en hastighet av 0,1 °C/3 min, ramp ner från 40 till 20 °C vid en hastighet av 0,1 °C/min och håll vid 4 °C (se tabell 3). Prover kan lagras i 4 °C i 12\u201224 h före karakterisering.
OBS: Medan 2- och 3- oligomer undergrupper av vårt nanofibersystem kan bildas i 1x PBS, hela mikronskala nanofibrer aggregat i 1x PBS. Därför bör lösningsmedelsförhållanden optimeras baserat på skalan och storleken på struktur som bildas samt typ och densitet gamma modifieringar. - För mikronskala långa 3-helix nanofibrer, preparera glödgda batchprover i 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxan: H2O (v/v) baserat på studier av lösningsmedelsoptimering15.
- Bered glödgningssatser enligt följande (se tabell 4). Först bereda 10 μL dellager vid 20 μM-koncentrationer från de 300 μM-huvudlagren för varje oligomer genom alikvotering av 0,67 μL från huvudlagret och gör volymen till 10 μl med hjälp av avjoniserat vatten.
- Alikvot 1 μL från de 20 μM-dellagren för varje oligomer och tillsätt den i ett 200 μL PCR-rör. Detta står för en total volym på 9 μL för 9 oligomerer.
- Tillsätt antingen 30 μL vattenfritt DMSO/DMF för fallen med 75 % DMSO och 75 % DMF med ytterligare 1 μL avjoniserat vatten för att göra en slutlig volym på 40 μL med varje oligomer vid 500 nM slutkoncentrationer. Tillsätt 16 μL av 1,4-Dioxan och gör volymen med avjoniserat vatten till 40 μL för det 40% Dioxan lösningsmedelstillståndet.
- Fyll på glödgningssatserna på termisk cycler och glödgning med hjälp av det protokoll som nämns i steg 4.2.
5. Total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi avbildning
- Förbered en fuktighetskammare från en tom pipettspetslåda. Fyll lådan med ca 5 mL vatten för att förhindra torkning av de provflödeskanaler som beskrivs på följande sätt (se figur 3).
- Förbered flödeskammare med mikroskopsglas, 2 dubbelsidiga tejpremsor och nitrocellulosabelagda täckskop. För att belägga täckkolen med nitrocellulosa, doppa täckkollet i en bägare som innehåller 0,1% collodion i amylacetat och lufttorka.
- Bered nitrocellulosalösningen genom att göra en 20-faldig utspädning från kommersiellt tillgänglig 2% collodion i amylacetat med isoamylacetatlösningsmedel.
- Förbered biotinylerad lösning för serumalbumin av nötkreatur (Biotin-BSA) genom att väga 1 mg Biotin-BSA och lösa upp den i 1 mL av 1x PBS. Flöde 15 μL på 1 mg/mL Biotin-BSA i 1x PBS-buffert genom att placera flödeskanalen i vinkel. Inkubera flödeskanalen i 2–4 min i rumstemperatur i en befuktad kammare.
- Förbered tvättbufferten genom att lösa upp 1 mg BSA i 1 mL på 1x PBS. Tvätta överskottet Biotin-BSA genom att flöda 15 μL av tvättbufferten. För att passivera ytan, inkubera flödeskanalen i 2–4 minuter i rumstemperatur i en befuktad kammare.
- Bered streptavidinlösningen genom att mäta 0,5 mg streptavidin och 1 mg BSA och därefter upplösas med hjälp av 1 mL på 1x PBS. Flöde 15 μL på 0,5 mg/mL streptavidin i 1x PBS innehållande 1 mg/mL BSA. Inkubera flödeskanalen i 2–4 min i rumstemperatur i en befuktad kammare. Flöde 15 μL av tvättbufferten för att tvätta bort obundet Streptavidin.
- Flöde 15 μL av tidigare glödgat parti γPNA-oligomerer vid 500 nM-koncentration per strand i antingen 75% DMSO, 75% DMF eller 40% 1,4-Dioxan-tillstånd. Inkubera flödeskanalen i 2–4 minuter i rumstemperatur i en befuktad kammare.
- Förbered 1 mM Trolox i föredragna lösningsmedelsförhållanden genom att späda 10-faldig från ett 10 mM-lager trolox i DMSO (mått 2,5 mg Trolox och lös upp i 1 mL DMSO). Tvätta de obundna nanostrukturerna i flödeskanalen med 15 μL på 1 mM Trolox som har samma lösningsmedelssammansättning som nanostrukturerna.
OBS: Den >50% DMSO innehåll i flödet kanalen skulle ge mindre signalstörningar på grund av de olika index för refraktion av lösningsmedel skick under TIRF som typiskt kalibreras för coverslip-vatten TIRF vinklar. Detta kan åtgärdas genom tvättning med 1 mM Trolox som görs genom att späda ut 10 mM Trolox 10-faldig med hjälp av avjoniserat vatten. Denna teknik ger tydligare bilder men är endast användbart för att bedöma om bildandet inträffade, men eftersom det ger tvåfas mikro-bubblor i flödeskanalen. Som ett resultat av detta kan nanostrukturer vara synliga vid gränssnittet mellan de två faserna enligt figur 4D. - Överför flödeskanalen på bildhållaren och bilden med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med TIRF-avbildning med hjälp av ett 60x olje-nedsänkningsmål och en 1,5x förstoringsapparat. Skanna flödeskanalen med antingen 60x eller 90x förstoring genom att övervaka Cy3-kanalen (se bild 4).
6. Avbildning av transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Väg 0,5 g uranylacetat i 50 mL destillerat vatten för att bereda en 1% vattenhaltig uranylacetatfläckslösning. Filtrera den 1% vattenhaltiga uranylaceacetat-fläcklösningen med hjälp av ett 0,2 μm filter som är fäst vid en spruta.
OBS: Alternativt kunde 2% vattenhaltigt uranylacetat köpas från en kommersiell tillverkare. - Köp kommersiellt tillgängliga formvar stödskikt belagda Koppargaller med 300-maskstorlek.
OBS: Det är viktigt att notera att formvar stödlagret kunde lösas bort av lösningsmedel som DMSO bortom 2 min. För längre provinkubation finns det kommersiellt tillgängliga formvar som stabiliserats med kiselmonoxid på koppargaller som gör att gallret kan vara mer hydrofilt än kolbelagda galler och klarar kraftiga provförhållanden och elektronstråle enligt figur 5C. - Pipett 4 μL prov på gallret för 15 s. Använd en bit filterpapper för att veke bort provet genom att ta med filterpapperet i kontakt med gallret från sidan.
- Tillsätt omedelbart 4 μL av fläcklösningen på gallret i 5 s.
- Wick bort fläcken som tidigare och håll filterpapper mot gallret för 1 \u20122 min för att se till att gallret är torrt. Prover ska normalt avbildas inom 1\u20122 h efter infärgning. Alternativt, om nätet är säkerställt att vara helt torr, kan galler lagras i en TEM rutnät lagringsbox i upp till 3 dagar före bildbehandling.
- Överför gallret till en TEM-preparathållare och bild med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop som manövreras vid 80 kV med förstoring som sträcker sig från 10 K till 150K (se figur 5).
7. Olika morfologier för γPNA-DNA-hybrider baserade på selektiv ersättning med DNA
- Erhåll DNA-oligomerer av angivna sekvenser (se tabell 5) från kommersiella oligonukleotidtillverkare som syntetiseras vid 25 nmol-skala med hjälp av standarddesalting. Resuspend dessa DNA-sekvenser med hjälp av RNase-fritt avjoniserat vatten vid 20 μM lager koncentrationer.
- För sammanhängande γPNA-strängerersättning med DNA kan sekvenserna D3, D5 och D9 ersätta strängar p3, p5 och p9. På samma sätt kan för crossover γPNA-stränger ersättare med DNA, sekvenser D1, D4 och D7 ersätta strängar p1, p4 och p7.
- Alikvot 1 μL från dellagren på 20 μM för varje γPNA- eller DNA-oligomer och tillsätt den till ett 200 μL PCR-rör som i steg 2.7. Tillsätt 30 μL vattenfritt DMSO och 1 μL RNasefritt avjoniserat vatten för att göra slutvolymen till 40 μL (se tabell 6).
- Fyll på glödgningssatserna på termisk cycler och glödgning med hjälp av det protokoll som nämns i steg 4.2.
- Karakterisera γPNA-DNA hybrid nanostrukturer med HJÄLP av TIRF-protokollet följande steg i avsnitt 5 eller med hjälp av TEM imaging protokoll som nämns i avsnitt 6 (se figur 6).
8. Olika morfologier för γPNA nanofibrer i varierande koncentrationer av SDS
- Förbered ett SDS-huvudbestånd på 20 % (wt/v) genom att mäta 20 mg SDS och lösa upp det i 100 μL avjoniserat vatten.
- Bered en dellager på 6 % (wt/v) SDS genom alikvotering av 3 μL från 20% SDS-lagret och gör volymen till 10 μL med hjälp av avjoniserat vatten.
- Glödg γPNA-oligomererna i slutkoncentrationer på 5,25 mM och 17,5 mM SDS enligt följande. Alikvot 1 μL från de 20 μM-dellagren för varje γPNA-oligomer och tillsätt den till ett 200 μL PCR-rör som i steg 2.7. Tillsätt 30 μL vattenfritt DMSO och 1 μL på 6 % respektive 20 % SDS för att göra den slutliga volymen till 40 μL för att uppnå SDS-slutkoncentrationer på 5,25 mM respektive 17,5 mM (se tabell 7).
- Ladda glödgningssatserna av varierande SDS-koncentrationer på termisk cycler och glödgning med hjälp av det protokoll som nämns i steg 4.2.
- Karakterisera γPNA nanostrukturer i närvaro av SDS med hjälp av TIRF-protokollet följer steg i avsnitt 5 eller med hjälp av TEM imaging protokoll som nämns i avsnitt 6 (se figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protokoll som diskuteras i avsnitten ovan beskriver utformningen av ett anpassat SST-motiv från DNA-nanofibrer för den robusta generationen självmonterade nanofiberstrukturer med hjälp av flera, distinkta γPNA-oligomerer. Detta avsnitt beskriver tolkningen av uppgifter som erhållits från framgångsrika rekreation av de protokoll som beskrivs.
Efter det protokoll som beskrivs i avsnitt 5 för TIRF bildframställning av prover av γPNA oligomerer glödgat i 75% DMSO: H2O (v / v) ger lätt bevis för välorganiserade arkitekturer under mikroskopiska observationer som visas i figur 4A. 75% DMF: H2O (v/v) lösningsmedelstillstånd resulterar i spicule-formade eller nålliknande nanostrukturer (Figur 4B) och, enligt vår erfarenhet, den 40% 1,4 dioxan: H2O (v /v) skick visar gles dekoration av filamentösa nanostrukturer när de ses med hjälp av TIRF mikroskopi (Figur 4C). Vidare visar proverna av γPNA-nanorör som bildas i 75% DMSO: H2O (v/v) att bunta av nanofibrer vid hög förstoring eller nanoskopiska upplösningar under TEM-avbildning följande steg som nämns i avsnitt 6 (figur 5). Kvantitativa analyser av nanostrukturernas bredd visade en medianbredd på 16,3 nm med maxvärden utöver 80 nm15.
För att utforma ett system för att generera γPNA-DNA hybrid nanostrukturer i organiska lösningsmedel blandningar för att möjliggöra ytterligare funktionalisering med hjälp av DNA, är det viktigt att överväga oligomeric position i SST-motivet ersätts med isosequential DNA oligomerers. Anpassning av steg som nämns i avsnitt 7 för fallet med nanotube konstruera beskrivs här, isosequential DNA-oligomerer som ersätter den sammanhängande γPNA oligomerer former rak filamentous strukturer medan ersättning av crossover γPNA oligomerer bildar stellate strukturer när de ses med hjälp av TIRF och TEM imaging (Figur 6). Kvantitativa analyser av bredden på de nanostrukturer som ersattes med sammanhängande DNA-oligomerer visade medianbredder runt 19 nm15.
Slutligen, vid anpassning steg från avsnitt 8, γPNA nanofibrer anta tunnare morfologier överensstämmer med minskad kombinationserbjudanden i närvaro av SDS koncentrationer under dess kritiska micelle koncentrationer (CMC, 8,2 mM). γPNA nanofibrer också anta mycket nätverksanslutna morfologier vid höga SDS koncentrationer i jämförelse med dess CMC när de ses med hjälp av TIRF imaging (Figur 7). TEM-avbildning av γPNA-oligomerer som är självmonterade i närvaro av SDS indikerar att 5,25 mM SDS-villkoret indikerar de mest påtagliga minskningarna av strukturella kombinationserbjudanden med bredder som sträcker sig 8\u201212 nm enligt bilden i (Figur 7C).
Bild 1: Peptidnukleinsyraoligomer som byggstenar för komplexa nanostrukturer.
(A) Kemiska strukturer av DNA (PNA), PNA och MP-innehållande γPNA-enheter. (Figure har tryckts om med tillstånd från Ref21.) (B) PNA-PNA helices är mindre vridna än DNA-DNA-helices, med 18 baser per varv istället för 10,5. (C) Detta tre-helix strukturella enda strandade kakel (SST) motiv består av 9 distinkta 12-bas-lång γPNA oligomerer, var och en har två sex-bas domäner. (D) Inom strukturen finns två typer av oligomerer: "sammanhängande" strängar som finns på en enda spiral och helix-spänner "crossover" strängar. (E) Detta 18-bas långa strukturella motiv kan polymerisera för att bilda mikron-skala glödtrådar. Panelerna B, C och E har ändrats med tillstånd från Ref15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Representativa smältkurvor av utvalda γPNA-oligomerer i olika lösningsmedelsförhållanden.
2-oligomer (p4, p5) delmängd som visar 6-bas domäner kan binda med rimlig termisk stabilitet (svart kurva) i 1x PBS. 3- oligomer (p4, p5, p6) delmängd visar ökad termisk stabilitet på grund av cooperativity i 1x PBS (blå kurva) och visar lite till ingen instabilitet med avseende på Tm när lösningsmedel ändras till organiska lösningsmedel som DMF (röd prickade kurva). Figur har ändrats med tillstånd från Ref15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Flödesdiagram för fluidisk flödeskanal för prov-TIRF-avbildning.
Ett steg-för-steg arbetsflöde som anger steg inblandade i prov förberedelse för TIRF imaging av γPNA nanofibrer efter flöde kanal montering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: TIRF-mikroskopiavbildning av γPNA nanofiber självmonterad i olika lösningsmedelsförhållanden.
γPNA nanofibrer visualiseras med hjälp av TIRF-mikroskopi (5 μm skala bar) samtidigt som övervakning av Cy3 kanal när γPNA oligomerer är självmonterade i (A) 75% DMSO: vatten (v/ v), (B) 75% DMF: vatten (v/v) och (C) 40% Dioxan: vatten (v/v) lösningsmedelsförhållanden. (D) När γPNA nanofibrer självmonterade i 75% DMSO: vatten (v/ v) bundet till flödeskanalen tvättas med 1mM Trolox i vatten, tvåfas mikrobubblor av DMSO-vattenform med nanostrukturer som stämmer in längs gränssnittet för mikrobubblan. Figur har ändrats med tillstånd från Ref15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: TEM-avbildning av γPNA nanofibrer självmonterade i 75 % DMSO: vatten. (v/v) med hjälp av Formvar stödlager koppar 300 nätgaller.
(A) TEM-bilder av γPNA nanofibrer visualiseras under låg förstoring (15x). (B) TEM-bilder av γPNA nanofibrer visualiseras under hög förstoring (150x) visar buntning av nanorör längs bredden vid nanoskopiska upplösningar. (C) TEM bilder av γPNA nanofibrer visualiseras under låg förstoring (10x) med hjälp av en Formvar-Silicon Monoxide stödskikt på en Koppar rutnät tillåter avbildning under kraftiga exemplar villkor. Figur har ändrats med tillstånd från Ref15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Olika morfologier för γPNA-DNA-hybrider baserade på selektiv ersättning med DNA.
(A) TIRF (5 μm skala bar) och (C) TEM bilder (60x förstoring) av självmontering av γPNA-DNA hybrider vid ersättande sammanhängande γPNA olligomer (p3, p5, p9) med isosequential DNA oligomer (D3, D5 D9) visar nanorör anta en rak filament morfologi. (B) TIRF (5 μm skala bar) och (D) TEM bilder (25x förstoring) av självmontering av γPNA-DNA hybrider vid byte av crossover γPNA olligomer (p1, p4, p7) med isosequential DNA oligomer (D1, D4 D7) visa nanofibrer som antar en stellate morfologi. Figur har ändrats med tillstånd från Ref15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Olika morfologier för γPNA nanofibrer i varierande koncentrationer av SDS.
TIRF-bilder (5 μm skala bar) av självmontering av γPNA nanofibrer i närvaro av SDS vid koncentrationer av (A) 5,25 mM och (B) 17,5 mM. Självmontering i närvaro av SDS-koncentrationer mindre än CMC (8,2 mM) visar tunnare morfologier från TIRF-bilder baserade på fluorescensintensitet. (C) Detta verifieras av TEM bilder (100x förstoring) av systemet där median bredd för nanofibrer ligger i intervallet 8\u201212 nm. Vid koncentrationer betydligt över CMC, γPNA nanorör verkar bilda högre ordning församlingar genom mycket nätverksanslutna nanotube strukturer. Figur har ändrats med tillstånd från Ref15. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| MATLAB-skriptsträngutmatning "thisSeq" | Straffpoäng "thisScore" | ||
| 'acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg ' | 0.08 | ||
| "ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat " | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| "gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga ' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| "gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatctcgt ttcaggacgaga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| "taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| "aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtctc attactgaagac ' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatccctctct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctcac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggacga ' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctg ' | 0.0704 | ||
Tabell 1: 20 exempelalgoritmiska resultat för potentiell optimering av γPNA-sekvensdesign. 20 prov algoritmiska resultat med sekvensutgångar i kolumn 1 och deras motsvarande poäng i kolumn 2. Upprepade iterationer av skriptet utförs för att få den mest minimala poängen.
| γPNA Sekvens-ID | Sekvens | Domän 1 komplement | Domän 2 komplement |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | p2-domän 1 | p6-Biotin domän 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | p1-domän 1 | p3-domän 2 |
| p3 | N-GACATCTTACTC-C | p7-domän 2 | p2-domän 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5-domän 1 | p9 domän 1 |
| p5 | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4-domän 1 | p6-Biotin domän 2 |
| p6-Biotin | N-Biotin-GTGAACCGAGGG-C | p1-domän 2 | p5-domän 2 |
| p7 | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3 domän 1 | p3-domän 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7-domän 1 | p9 domän 2 |
| p9 | N-TCCGCATTCTGT-C | p4-domän 2 | p8-Cy3 domän 2 |
Tabell 2: γPNA-sekvensdesignresultat för nanofibrer. Enskilda oligomer sekvenser genererades som anges i denna tabell. Understrukna baser anger gamma-position-modifieringarna med mini-PEG. Tabell har ändrats med tillstånd från Ref15.
| Temperaturområde | Ramphastighet |
| 90 °C | Håll i 3 minuter |
| 90-80 °C | 0,1°C/minut |
| 80-70 °C | 0,1°C/minut |
| 70-60 °C | 0,1°C/3 minuter |
| 60-50 °C | 0,1°C/3 minuter |
| 50–40 °C | 0,1°C/3 minuter |
| 40–30 °C | 0,1°C/minut |
| 30–20 °C | 0,1°C/minut |
| 4 °C | Håll obestämd |
Tabell 3: Anneal rampprotokoll för termisk cycler. Tabell har ändrats med tillstånd från Ref15.
| Lagerkoncentration | 75% DMSO: vatten (v / v) glödgning prov | 75% DMF: vatten (v /v) glödgning prov | 40% dioxan: vatten (v/v) glödgningsprov | Slutlig koncentration | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | 75 % (v/v) |
| 1,4-dioxan | - | - | - | 16 μL | 40 % (v/v) |
| avjoniserat vatten | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 eller 60% (v/v) |
| Total volym | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tabell 4: Protokoll för att förbereda glödgningspartier med γPNA-oligomer i olika lösningsmedelsförhållanden.
| DNA-sekvens-ID | Sekvens |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tabell 5: Isosequential DNA-sekvenser som ersättningsoligomer till γPNA. Tabell har ändrats med tillstånd från Ref15.
| Lagerkoncentration | DNA Sammanhängande strandersättning | DNA Crossover strand ersättare | Slutlig koncentration | |
| γPNA-oligomer (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| DNA-oligomer (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| avjoniserat vatten | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v/v) |
| Total volym | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabell 6: Protokoll för att förbereda glödgningspartier med γPNA-DNA hybridnanostruktur i 75 % DMSO: H2O (v/v) genom ersättning av sammanhängande eller crossover γPNA-oligomerer med isosequential DNA-oligomerer.
| Lagerkoncentration | SDS-koncentrationer under CMC | SDS-koncentrationer över CMC | Slutlig koncentration | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| 20% SDS | 20 % (wt/v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| avjoniserat vatten | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Total volym | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabell 7: Protokoll för att förbereda glödgningspartier med γPNA-nanostrukturer i 75 % DMSO: H2O (v/v) i närvaro av SDS-koncentrationer under och över CMC.
Kompletterande figur 1: Programmering script PNA3nanofiber.m för utformning av oligomer sekvenser. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel fokuserar på att anpassa och förbättra befintliga nukleinsyra nanoteknik protokoll mot organiska lösningsmedel blandningar. De metoder som beskrivs här fokuserar på modifieringar och felsökning inom ett definierat experimentellt utrymme av utvalda polära aprotiska organiska lösningsmedel. Det finns ännu en outforskad potential för att andra etablerade nukleinsyrananoteknikprotokoll ska anpassas inom detta utrymme. Detta skulle kunna förbättra potentiella tillämpningar genom integration inom andra områden såsom polymer och peptid syntes som vanligtvis utförs i liknande organiska lösningsmedel25,26. Dessutom fokuserar vi här på kritiska steg som ska observeras medan vi övar ovan nämnda protokoll.
Under beredningen av prov för självmontering är det viktigt att hålla volymprocenten vatten på 25% (v/v) för DMSO och DMF villkor. Följaktligen är det viktigt att inse att det organiska lösningsmedel som används för självmontering bör vara från vattenfria lager också. Nanofiberstrukturerna är hydrofoba och ballasterade i ökad vattenhalt.
Till skillnad från scaffolded DNA origami metoder som kan skapa strukturer av diskreta längder, den nuvarande SST motiv design för γPNA nanofibrer och andra tidigare etablerade DNA SST nanorör inte avkastning strukturer av diskreta längder. Nanorör polymerisera uppnå en rad multi-mikron längder (upp till 11 μm). Av samma anledning kan inte avkastning som är associerad med strukturbildning kvantifieras.
På grund av den oladdade peptidstamnätet i γPNA finns det dock inga beroenden på räknarjonsbalans i förhållande till strukturbildning. Imaging buffertar, därför behöver inte inkludera katjoner som Mg2 + normalt krävs för stabilisering av nanostrukturer gjorda av naturligt förekommande nukleinsyror.
Slutligen är γPNA nanostrukturbuntning och aggregering i olika lösningsmedelsförhållanden också beroende av de enskilda oligomerkoncentrationer som införs vid självmontering. Koncentrationer som varierar från 1 μM och högre av enskilda oligomerer ökar benägenheten för kombinationserbjudanden och aggregering och påverkar tydlig avbildning av nanostrukturer antingen under TIRF eller TEM-avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation grant 1739308, NSF CAREER grant 1944130 och av Air Force Office of Science Research grant number FA9550-18-1-0199. γPNA sekvenser var en generös gåva från Dr Tumul Srivastava av Trucode Gene Repair, Inc. Vi vill tacka Dr Erik Winfree och Dr Rizal Hariadi för deras hjälp samtal om DNA Design Toolbox MATLAB kod. Vi vill också tacka Joseph Suhan, Mara Sullivan och Center for Biological Imaging för deras hjälp vid insamlingen av TEM-data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
