Summary
В данной статье приводятся протоколы проектирования и самосверки наноструктур из гамма-модифицированных олигомеров пептидной нуклеиновой кислоты в органических растворителях.
Abstract
Современные стратегии в области нанотехнологий ДНК и РНК позволяют самостоятельно саблировать различные наноструктуры нуклеиновой кислоты в аквеозных или существенно увлажненых средствах массовой информации. В этой статье мы описываем подробные протоколы, которые позволяют строительство архитектуры нановофиберы в органических растворителей смесей через самостоятельной сборки однозначно адресной, одной нити, гамма-модифицированной пептидной нуклеиновой кислоты (КПНА) плитки. Каждая однотяговая плитка (SST) является 12-базовым олигомером, состоящим из двух конкатенатных модульных доменов по 6 оснований каждая. Каждый домен может связываться с взаимно бесплатным доменом, присутствующим на соседних нитей, используя запрограммированную взаимодополняемость для формирования нанов, которые могут вырасти до микрон в длину. Мотив SST состоит из 9 полных олигомеров, позволяющих сформировать 3-спиральные нановофиберы. В отличие от аналогичных наноструктур ДНК, которые образуют структуры диаметра-монодисперса, эти системы ЗПНА образуют нановофиберы, которые склеивать по ширине во время самосвала в органических растворителях. Протоколы самосъемки, описанные здесь, включают также обычный сурфактант, Сульфат додекила натрия (SDS), чтобы уменьшить эффекты комплектации.
Introduction
Успешное строительство многочисленных сложныхнаноструктур 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 в аквеозных или существенно увлажненых средствах массовой информации, сделанных с использованием Естественные нуклеиновые кислоты,такие как ДНК 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 и РНК11,12 были показаны в предыдущих работах. Однако естественные нуклеиновые кислоты претерпевает дуплексные аформатические изменения или снижают тепловые стабилности ворганических растворителях 13,14.
Ранее наша лаборатория сообщила о методе строительства 3-спиральных нановофилов с использованием гамма-позиции модифицированных синтетических нуклеиновой кислоты, имитирующих гамма-пептидные нуклеиновые кислоты(ЗПНА) 15 (рисунок 1A). Необходимость такого развития и потенциального применения синтетической нуклеиновой кислоты имитировать ПНА была обсужденав поле 16,17. Мы показали, через адаптацию одной нити плитки (SST) стратегии, представленнойдля ДНК наноструктур 18,19,20, что 9 последовательно различных олигомеры ПНА могут быть разработаны для формирования 3-спирали нановонфиль в некоторых полярных априотических органических растворителей смесей, таких как DMSO и DMF. Олигомеры КПНА были коммерчески заказаны с модификациями (R)-дитиленгликоль (мини-ПЕГ) на трех γ позициях (1, 4 и 8 базовых позиций) вдоль каждого 12-базового олигомера на основе методов, опубликованных Саху и др. 21 Эти гамма-модификации вызывают гелиную доорганизации, которая связана с более высокой связывающей сродством и тепловой устойчивостью ЗПНА по отношению к неизмененной ПНА.
Эта статья является адаптацией нашей работы, в которой мы исследуем влияние растворителя раствора и замены с ДНК на формирование наноструктур на основеПНА 15. Целью данной статьи является предоставление подробных описаний конструкции, а также подробные протоколы для растворителя адаптированных методов, которые были разработаны для самосвалки и характеристики нановофиберы . Таким образом, мы впервые представляем модульную стратегию SST, общую платформу для проектирования наноструктур с использованием синтетической нуклеиновой кислоты, имитирующих PNA.
Helical шаг для PNA дуплексов, как сообщается, 18 баз в свою очередь, по сравнению с дуплексами ДНК, которые проходят один поворот на 10,5 баз (Рисунок 1B). Таким образом, длина домена продемонстрированные SSTs ЗПНА была установлена на 6 основаниях для размещения одной трети полного поворота или 120 "вращения, чтобы обеспечить взаимодействие между тремя треугольно массивными геликами. Кроме того, в отличие от предыдущих мотивов SST, каждый SST содержит всего 2 домена, эффективно создавая 1-мерную ленту, как структура, которая обертывания, чтобы сформировать три спирали расслоение (Рисунок 1C). Каждый 12-базовый олигомер PNA изменяется на 1, 4 и 8 позициях, чтобы обеспечить равномерное распределение мини-PEG групп по всему мотиву SST. Кроме того, в мотиве, Есть два типа олигомеров: "смежные" нити, которые существуют на одной спирали и спирали охватывающих "кроссовер" нити (Рисунок 1D). Кроме того, олигомеры P8 и P6 помечены флуоресцентными Cy3 (зеленая звезда) и биотином (желтыйовал), соответственно (рисунок 1D), чтобы обеспечить обнаружение формирования структуры с помощью флуоресцентной микроскопии. В общей сложности, SST мотив состоит из 9 всего олигомеров, чтобы образование 3-спирали нановонфиберы через запрограммированную взаимодополняемость каждого отдельного домена к соответствующему домену на соседнем олигомере (Рисунок 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Конструкция последовательности ЗПНА
- Загрузите dna Design Toolbox22, разработанный лабораторией Уинфри в Caltech23, в папку, содержащую сценарии программирования для проектирования последовательностей.
- В этой папке дизайна последовательности откройте язык программирования четвертого поколения, совместимый с расширением файла ".m", а затем добавьте ранее загруженную папку "DNAdesign" в путь, используя следующую команду:
(gt;gt; аддпат DNAdesign) - Впоследствии запустите следующий скрипт под названием "PNA3nanofiber.m" (см. Дополнительный рисунок 1) с использованием следующей команды:
(gt;gt; PNA3nanofiber) - Запустите этот скрипт для создания переменных под названием "thisSeqs" и "thisScore". Переменная "thisSeqs" содержит последовательности разработанных олигомеров, и "thisScore" является пенальти.
- Запустите скрипт несколько раз, чтобы получить самый минимальный балл. Образец из 20 таких пробежек показан в таблице 1.
- Вручную подтвердите желаемую взаимодополняемость Watson-Crick каждой области генерируемых последовательностей для указанного структурного мотива SST. Технические характеристики последовательности для 3-спиральной нановонфильной структуры показаны в таблице 2.
- Про проверь следующие для генерируемых последовательностей.
- Избегайте использования четырех последовательных баз C и G.
- Вручную выберите конкретные последовательности для N-терминальной функционализации с флуоресцентными красителями и молекулами биотина, чтобы флуоресцентная микроскопия исследований.
- Включите как минимум 3 мини-ПЕГ гамма-модификации на позвоночнике, чтобы обеспечить заранее организованную конформацию helical в одноярусных олигомерах, как описано Саху и др. 21 год
2. Подготовка нитей запасов ЗПНА
- Получить стренгоум компонентов ЦПНА указанных последовательностей при синтезе 50 нмольных шкал с высокой производительностью жидкой хроматографии (HPLC)очистки от коммерческого производителя.
- Повторное использовать каждую нить в деионизированной воде до 300 мкм концентраций. Храните перерасходные пряди в морозильной камере -20 градусов по Цельсию до нескольких месяцев, пока это необходимо для экспериментов.
3. Исследования кривой плавления олигомерных подмножего ЗПНА
- Получить плавления температурных диапазонов для различных комбинаций дополнительных 2-олигомер и 3-олигомер подмножества, запуская исследование кривой расплава в aqueous буферных буферных солевые (PBS) или предпочтительным полярным органическим растворителем, таким как Диметилформамид (DMF) или Диметил sulfoxide (DMSO) (см. рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловые кривые плавления на йgt;50% DMF начинают терять верхний базовый уровень и показывают серьезные нарушения отчасти из-за высокой абсорбности DMF на длине волны, необходимой для экспериментов. Это отмеченное явление в литературе24. Однако в этих условиях растворителя можно получить кривые плавления на уровне 5 мкм на одну прядь.- Aliquot 16,7 МКЛ из 300 МКМ фонда каждого олигомера и сделать окончательный объем до 1000 йл либо в 1x PBS или 100% (V / V) DMSO или 100% (v/v) DMF эффективно получения 5 МКМ окончательной концентрации на олигомер. Перенесите эту олигомерную подмножество смеси на 1 см оптической траектории, кварцевой кювет.
- Выполняйте эксперименты с переменной температурой UV-Vis в спектрофотометре, оснащенном программируемым температурным блоком.
- Сбор точек данных для кривых плавления в пределах температурного диапазона 15–201290 градусов по Цельсию как для охлаждения (энналя) так и для нагрева (плавления) циклов со скоростью 0,5–20121 градусов по Цельсию/мин. Храните образцы в течение 10 минут при 90 градусов по Цельсию перед охлаждением и при 15 градусов по Цельсию перед нагреванием. Определите температуруплавления (Тм)от пика первой производной от кривой нагрева.
- Убедитесь, что диапазоны температуры плавления для 2-олигомерных подмножего во всех растворителях выше 35 градусов по Цельсию. Кроме того, убедитесь, что соответствующие 3-олигомерные подмножества, содержащие дополнительную нить к их эквивалентному 2-олигомеру, свидетельствуют о значительном увеличении Тм в связи с повышением кооперативности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит убедиться, что один горшок самосожверки нескольких олигомеров может совместно сложить в нужную наноструктуру с разумной тепловой стабильности.
4. Протокол самосвалов для нескольких различных олигомеров ЗПНА
ПРИМЕЧАНИЕ: Для разработки протокола самосвалов теплового пандуса для наноструктур ЗПНА желательно медленно рампы.
- В случае сгенерированных олигомерных последовательностей, аннеал образцов для 22,5 ч в тепловом циклере охлаждения от 90 до 20 градусов по Цельсию. Как правило, температура плавления, полученная для подмножего 2-олигомера и 3-олигомера ЗПНА, находится в диапазонах от 40 до 201270 градусов по Цельсию для различных условий растворителя.
- Программа теплового цикла следующим образом: удерживайте при 90 градусов по Цельсию в течение 5 минут, с 90 до 70 градусов по Цельсию при постоянной скорости 0,1 градусов по Цельсию/мин, с 70 до 40 градусов по Цельсию со скоростью 0,1 градусов по Цельсию/3 мин, рампы вниз от 40 до 20 градусов по Цельсию со скоростью 0,1 градусов по Цельсию и держать на 4 градусов по Цельсию (см. таблицу 3). Образцы могут храниться в 4 кк в течение 12-201224 ч до характеристики.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как 2- и 3-олигомерные подмножества нашей нановофиберной системы могут образовываться в 1x PBS, полный микрон-масштаб нановофибер агрегат в 1x PBS. Поэтому условия растворителя должны быть оптимизированы в зависимости от масштаба и размера формуемой структуры, а также типа и плотности гамма-модификаций. - Для микрон масштаба длинные 3-спирали нановолокна, подготовить аннеальные образцы партии в 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-диоксан: H2O (v/v) на основе исследованийоптимизации растворителя 15.
- Подготовка аннеальных партий следующим образом (см. таблицу 4). Во-первых, подготовь 10 суб-запасов хл при концентрациях 20 МКМ из основных запасов 300 МКМ для каждого олигомера путем алицитирования 0,67 МКЛ из основного запаса и увеличения объема до 10 мкл с использованием деионизированной воды.
- Aliquot 1 йл из 20 мкм суб-запасов для каждого олигомера и добавить его в 200 йл ПЦР трубки. Это составляет общий объем 9 йл для 9 олигомеров.
- Добавьте либо 30 МКЛ ангидроуса DMSO/DMF для 75% DMSO и 75% случаев DMF с дополнительным 1 йл деионизированной воды, чтобы сделать окончательный объем 40 МКЛ с каждым олигомером при 500 нМ окончательных концентрациях. Добавьте 16 йл 1,4-диоксана и сделайте объем с деионизированной водой до 40 йл для 40% диоксанового растворителя.
- Загрузите аннеальные партии на тепловой циклер и аннеал, используя протокол, упомянутый в шаге 4.2.
5. Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопии изображения
- Подготовь камеру влажности из пустой коробки наконечников пипетки. Заполните коробку примерно 5 мл воды, чтобы предотвратить высыхание каналов потока образца, описанных следующим образом (см. рисунок 3).
- Подготовьте камеру потока с помощью слайда микроскопа, двух двусторонних ленточных полос и нитроцеллюлозы. Чтобы покрыть крышку нитроцеллюлозой, окуните крышку в стакан, содержащий 0,1% коллодиона в ацетате амила и сухом воздухе.
- Приготовьте раствор нитроцеллюлозы, сделав 20-кратное разбавление из коммерчески доступных 2% коллодиона в ацетате амила с растворителем изоамилового ацетата.
- Приготовьте раствор биотинилированной сыворотки крупного рогатого скота (Biotin-BSA), взвесив 1 мг биотин-BSA и растворив его в 1 мл 1x PBS. Поток 15 л 1 мг/мл биотин-BSA в 1x буфере PBS, поместив канал потока под углом. Инкубировать канал потока в течение 2-4 минут при комнатной температуре в увлажненной камере.
- Подготовка мыть буфер путем растворения 1 мг BSA в 1 мл 1x PBS. Вымойте избыток Biotin-BSA, протекая 15 йл буфера стирки. Чтобы пройти поверхность, инкубировать канал потока в течение 2-4 минут при комнатной температуре во влажной камере.
- Подготовка стрептавидин раствора путем измерения 0,5 мг стрептавидина и 1 мг BSA, а затем растворения с помощью 1 мл 1x PBS. Поток 15 л 0,5 мг/мл стрептавидина в 1x PBS, содержащий 1 мг/мл BSA. Инкубировать канал потока в течение 2-4 минут при комнатной температуре в увлажненной камере. Поток 15 йл буфера мытья, чтобы смыть неограниченный стрептавидин.
- Поток 15 йл ранее annealed партии олигомеров ЗПНА при концентрации 500 нм на прядь либо в 75% DMSO, 75% DMF или 40% 1,4-диоксан состояние. Инкубировать канал потока в течение 2-4 минут при комнатной температуре в увлажненной камере.
- Приготовьте 1 мМЧ тролок в предпочтительных растворителях, разбавляя 10 раз из 10 мМ запаса Trolox в DMSO (мера 2,5 мг Trolox и растворяются в 1 мл DMSO). Вымойте нескоенные наноструктуры в канале потока с 15 йл 1 мМ Trolox, имеющих тот же состав растворителя, что и наноструктуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание DMSO в канале потока составило бы незначительные нарушения сигнала из-за разного индекса преломления растворителя во время TIRF, который обычно откалибровывается для углов TIRF. Это может быть исправлено путем мытья с 1 мМ Trolox сделал путем разбавления 10 мМ Trolox 10 раз с помощью деионизированной воды. Этот метод обеспечивает более четкие изображения, но полезен только для оценки того, образование произошло, однако, потому что он производит двухф фаза микро-пузыри в канале потока. В результате наноструктуры могут быть видны на стыке двух этапов, как показано на рисунке 4D. - Перенесите канал потока на держатель слайда и изображение с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного tiRF-изображением с использованием 60-х целей погружения в масло и 1,5-х увеличитель. Сканирование канала потока на 60x или 90x увеличение путем мониторинга канала Cy3 (см. рисунок 4).
6. Передача электронной микроскопии (TEM) изображения
- Взвесить 0,5 г уранил ацетата в 50 мл дистиллированной воды, чтобы подготовить 1% aqueous уранил ацетат пятно раствора. Фильтр 1% aqueous уранил ацетат пятно раствор с помощью фильтра 0,2 мкм прилагается к шприцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, 2% aqueous уранил ацетат может быть приобретен у коммерческого производителя. - Покупка коммерчески доступных formvar поддержки слоя покрытием Медные сетки с 300-сетки размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что слой поддержки формвара может быть растворен растворителями, такими как DMSO, более чем за 2 мин. Для более длительной инкубации образца, коммерчески доступны формвар стабилизировался с окисью кремния на медных сетках доступны, которые позволяют сетке быть более гидрофильной, чем углеродного покрытия сетки и может выдержать энергичные условия образца и электронный луч, как показано на рисунке 5C. - Pipette 4 МКЛ образца на сетку в течение 15 с. Используйте лист фильтровальной бумаги, чтобы фитиль от образца, в результате чего фильтровальной бумаги в контакте с сеткой со стороны.
- Немедленно добавьте 4 qL раствора пятна на решетку для 5 s.
- Wick от пятна, как и раньше, и держать фильтровальную бумагу против сетки в течение 1'u20122 мин, чтобы убедиться, что сетка сухая. Образцы, как правило, должны быть изображены в течение 1'u20122 ч после окрашивания. Кроме того, если сетка будет полностью сухой, сетки могут храниться в ящике для хранения сетки TEM за 3 дня до получения изображений.
- Передача сетки держатель образца TEM и изображение с помощью передачи электронного микроскопа работает на 80 кВ с увеличением от 10 K до 150K (см. Рисунок 5).
7. Различные морфологии для гибридов ЗПНА-ДНК на основе селективной замены ДНК
- Получить ДНК олигомеры указанных последовательностей (см. таблицу 5) от коммерческих производителей олигонуклеотида синтезируется в 25 нмоль масштаба с использованием стандартного дезавуирования. Resuspend эти последовательности дна используя RNase-свободно деионизированную воду на концентрациях штока 20 qM.
- Для смежных замен нитей ЗПНА с ДНК, последовательности D3, D5 и D9 могут заменить нити p3, p5 и p9. Аналогичным образом, для замены прядей кроссовера PNA с ДНК, последовательности D1, D4 и D7 могут заменить пряди p1, p4 и p7.
- Aliquot 1 йл из 20 мкм суб-запасов для каждого ОЛИО или ДНК-олигомера и добавить его в 200 мкл ПЦР трубки, как в шаге 2,7. Добавьте 30 МКЛ ангидроуса DMSO и 1 йл деионизированной воды без RNase, чтобы сделать окончательный объем до 40 йл (см. таблицу 6).
- Загрузите аннеальные партии на тепловой циклер и аннеал, используя протокол, упомянутый в шаге 4.2.
- Характеризуйте гибридные наноструктуры ПНА-ДНК с помощью протокола TIRF, следуя следующим шагам в разделе 5 или используя протокол изображения TEM, упомянутый в разделе 6 (см. рисунок 6).
8. Различные морфологии для нановофибер ЗПНА в различных концентрациях SDS
- Подготовь 20% (wt/v) основной запас SDS, измерив 20 мг SDS и растворив его в 100 МКЛ деионизированной воды.
- Подко запаса SDS на 6% (wt/v) путем алицитирования 3 МКЛ из 20% запасов SDS и увеличения объема до 10 йл с использованием деионизированной воды.
- Аннеал олигомеры ЗПНА в конечных концентрациях 5,25 мм и 17,5 мМ СДС следующим образом. Aliquot 1 йл из 20 суб-запасов ЗМ для каждого олигомера ЗПНА и добавить его в 200 ЗЛ ПЦР трубки, как в шаге 2,7. Добавьте 30 МКЛ ангидроуса DMSO и 1 МКЛ 6% и 20% SDS, чтобы сделать окончательный объем до 40 МКЛ для достижения окончательных концентраций SDS 5,25 мм и 17,5 мм, соответственно (см. таблицу 7).
- Загрузите аннеальные партии различных концентраций SDS на тепловой циклер и аннеал, используя протокол, упомянутый в шаге 4.2.
- Характеризуйте наноструктуры ПНА в присутствии SDS с помощью протокола TIRF, следуя следующим шагам в разделе 5 или используя протокол изображения TEM, упомянутый в разделе 6 (см. рисунок 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протоколы, обсуждаемые в вышеуказанных разделах, описывают дизайн адаптированного мотива SST из нановофибер ДНК для надежного поколения самосборных структур нановофибер с использованием нескольких, отчетливых олигомеров. В этом разделе описывается толкование данных, полученных в результате успешного воссоздания описанных протоколов.
В соответствии с протоколом, описанным в разделе 5 для TIRF изображения образцов oligomers ПНА annealed в 75% DMSO: H2O (v/v) наиболее легко предоставляет доказательства хорошо организованной архитектуры под микроскопическими наблюдениями, как показано на рисунке 4A. 75% DMF: H2O (v/v) растворитель состояние приводит к пряной формы или иглы, как наноструктуры (Рисунок 4B) и, по нашему опыту, 40% 1,4 диоксана: H2O (V / V) состояние показывает редкое украшение нитевидных наноструктур при просмотре с помощью микроскопии TIRF (Рисунок 4C). Кроме того, образцы нанотрубок ЗПНА, сформированные в 75% DMSO: H2O (v/v), демонстрируют комплектацию нановофибер при высоком увеличении или наноскопических разрешениях во время визуализации TEM следующие шаги, упомянутые в разделе 6(рисунок 5). Количественный анализ ширины наноструктур показал медианную ширину 16,3 нм с максимальными значениями за 80 нм15.
Для разработки схемы генерации гибридных наноструктур ЗПНА-ДНК в органических растворителях, позволяющих продолжить функционализацию с использованием ДНК, важно учитывать олигомерное положение в мотиве SST, заменяемое олигомерами ДНК. Адаптация шагов, упомянутых в разделе 7 для случае нанотрубки построить описано здесь, isosequential ДНК олигомеры, которые заменяют смежные Олигомеры ПНА образует прямые нити структур в то время как замена кроссовера ЗПНА олигомеры формы stellate структур при просмотре с помощью TIRF и TEM изображений (Рисунок 6). Количественный анализ ширины наноструктур, которые были заменены смежными олигомерами ДНК, показал медианную ширину около 19 нм15.
Наконец, при адаптации шагов из раздела 8, нановофибрики ПНА принимают более тонкие морфологии, соответствующие уменьшенной комплектации в присутствии концентраций SDS ниже критических концентраций мицелла (CMC, 8,2 мМ). Нановофибры ПНА также принимают высокосетеные морфологии при высоких концентрациях SDS по сравнению с его CMC при просмотре с помощью TIRF-изображения(рисунок 7). Тем-изображения олигомеров ЗПНА, собранных в присутствии SDS, указывают на то, что состояние SDS размером 5,25 мМ указывает на наиболее существенное сокращение структурной комплектации с шириной от 8 до 201212 нм, как показано нарисунке 7C.
Рисунок 1: Олигомеры пептидной нуклеиновой кислоты в качестве строительных блоков для сложных наноструктур.
(A)Химические структуры ДНК (ПНА), ПНА и МП-содержащих блоков ЗПНА. (Рисунок был перепечатан с разрешения Ref21.) (B) PNA-PNA helices менее скручены, чем ДНК-ДНК-хелики, имеющие 18 оснований за поворот вместо 10,5. (C) Этот трех-спираль структурных одной мель плитки (SST) мотив состоит из 9 различных 12-базовых длиной Олигомеры, каждый из которых имеет два шести базовых доменов. (D)В структуре есть два типа олигомеров: "смежные" нити, которые существуют на одной спирали и спирали охватывающих "кроссовер" нити. (E)Этот 18-базовый структурный мотив может полимеризуться, чтобы сформировать микрон-масштабные нити. Панели B, C и E были изменены с разрешения Ref15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные кривые расплава некоторых олигомеров ВПНА в различных условиях растворителя.
2-олигомер (p4, p5) подмножество, показывающее 6-базовые домены, может связываться с разумной тепловой стабильностью (черная кривая) в 1x PBS. 3- олигомер (p4, p5, p6) подмножество показывает повышенную тепловую стабильность из-за кооператорности в 1x PBS (голубая кривая) и показывает практически нет нестабильности по отношению к Tm, когда растворитель изменен на органические растворители, такие как DMF (красная пунктирная кривая). Рисунок был изменен с разрешения Ref15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Диаграмма потока для канала жидкого потока для образца изображения TIRF.
Пошаговая рабочий процесс, указывающий на шаги, связанные с подготовкой образца для tiRF-изображения нановофибры ВПНА после сборки канала потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: TiRF микроскопическая визуализация нановофибры ЗПНА, самостоятельно собранной в различных условиях растворителя.
Нановолокна ПНА визуализированы с помощью микроскопии TIRF (бар масштаба 5 мкм) при мониторинге канала Cy3, когда олигомеры ПНА самосборляются в (A) 75% DMSO: вода (v/v), (B) 75% DMF: вода (v/v) и (C) 40% Диоксан: вода (v/v) растворитель условия. (D) Когда нановолокна ПНА самосборка в 75% DMSO: вода (v/v) связана с каналом потока промывается с 1mM Trolox в воде, двухтуапные микропузырьки DMSO-воды форме с наноструктурами выравнивания вдоль интерфейса microbubble. Рисунок был изменен с разрешения Ref15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: TEM-изображение нановофибер ЗПНА, самостоятельно собранных в 75% DMSO: вода. v/v) с использованием слоя поддержки формвара меди 300 сетчатых сеток.
(A)TEM изображения нановофибер ЗПНА визуализированы под низким увеличением (15x). (B) TEM изображения нановофиб ЗПНА визуализированы под высоким увеличением (150x) показывает комплектации нанотрубок по ширине при наноскопических разрешениях. (C) TEM изображения нановофибер ЗПНА визуализированы при низком увеличении (10x) с помощью опорного слоя Formvar-Silicon Monoxide на медной сетке позволяет изображения в энергичных условиях образца. Рисунок был изменен с разрешения Ref15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Различные морфологии для гибридов ЗПНА-ДНК на основе селективной замены ДНК.
(A) TIRF (5 мкм шкала бар) и (C) TEM изображения (60x увеличение) самособрания гибридов ЗПНА-ДНК при замене смежных олигомеров (p3, p5, p9) с isosequential ДНК олигомеры (D3, D5 D9) показывают нанотрубки принятия прямой фила морфологии. (B) TIRF (5 мкм шкала бар) и (D) TEM изображения (25x увеличение) самособрания гибридов ЗПНА-ДНК при замене кроссовера Олигомеры (p1, p4, p7) с isosequential ДНК олигомеры (D1, D4 D7) показывают нановофиберы принятия стеллат морфологии. Рисунок был изменен с разрешения Ref15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Различные морфологии для нановофибер ЗПНА в различных концентрациях SDS.
TIRF изображения (5 мкм шкалы бар) самосображения нановофибры ЗПНА в присутствии SDS приконцентрациях( A ) 5,25 мм и (B) 17,5 мм. Самосборка в присутствии концентраций SDS меньше, чем CMC (8,2 мМ) показывает более тонкие морфологии из изображений TIRF на основе интенсивности флуоресценции. (C)Это проверено изображениями TEM (100x увеличение) системы, где средняя ширина нановофиберы находится в диапазоне 8'u201212 нм. При концентрациях, значительно выше CMC, нанотрубки ПНА, как представляется, образуют более высокие сборки порядка через высоко сетевые структуры нанотрубок. Рисунок был изменен с разрешения Ref15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Выход строки скрипта MATLAB "thisSeq" | Пенальти Оценка "thisScore" | ||
| 'acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggcggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgacccc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga ' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacagggg aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatctcgt ttcaggacgaga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtcccctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttctc attactgaagac ' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgccccccac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggacga ' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttctct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagtagt gcctcacagcga ctttagtcgctg ' | 0.0704 | ||
Таблица 1: 20 образцовых алгоритмических результатов для потенциальной оптимизации конструкции последовательности КПНА. 20 примерных алгоритмических результатов с выходами последовательности в столбце 1 и соответствующей оценкой в столбце 2. Повторные итерации скрипта выполняются для получения минимального балла.
| Идентификатор последовательности ЗПНА | Последовательности | Домен 1 дополнение | Домен 2 дополнение |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | p2 домен 1 | p6-Биотин домен 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | p1 домен 1 | p3 домен 2 |
| p3 | N-GACATCTTACTC-C | p7 домен 2 | p2 домен 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5 домен 1 | p9 домен 1 |
| p5 | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4 домен 1 | p6-Биотин домен 2 |
| p6-Биотин | N-биотин-GTGAACCGAGGG-C | p1 домен 2 | p5 домен 2 |
| p7 | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3 домен 1 | p3 домен 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 домен 1 | p9 домен 2 |
| p9 | N-TCCGCATTCTGT-C | p4 домен 2 | p8-Cy3 домен 2 |
Таблица 2: Результаты проектирования последовательности ПНА для нановофибер. Отдельные олигомеры последовательности были созданы, как указано в этой таблице. Подчеркнутые основания указывают на гамма-позиционые модификации с мини-ПЕГ. Таблица была изменена с разрешения Ref15.
| Диапазон температур | Скорость рампы |
| 90 КК | Задержись на 3 минуты |
| 90-80 градусов по Цельсию | 0,1 градусов по Цельсию/минута |
| 80-70 градусов по Цельсию | 0,1 градусов по Цельсию/минута |
| 70-60 градусов по Цельсию | 0,1 градусов по Цельсию/3 минуты |
| 60-50 градусов по Цельсию | 0,1 градусов по Цельсию/3 минуты |
| 50-40 градусов по Цельсию | 0,1 градусов по Цельсию/3 минуты |
| 40-30 градусов по Цельсию | 0,1 градусов по Цельсию/минута |
| 30-20 градусов по Цельсию | 0,1 градусов по Цельсию/минута |
| 4 КК | Держите на неопределенный срок |
Таблица 3: Протокол аннеал рампы для теплового цикла. Таблица была изменена с разрешения Ref15.
| Концентрация запасов | 75% DMSO: водная (v/v) аннеальная выборка | 75% DMF: водная (v/v) аннеальная проба | 40% диоксан: водная (v/v) аннеальная проба | Окончательная концентрация | |
| ЗПНА олигомер (x9) | 20 МКМ | 9 хл (1 х 9) | 9 хл (1 х 9) | 9 хл (1 х 9) | 500 нм |
| Дмсо | - | 30 мкл | - | - | 75% (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 мкл | - | 75% (v/v) |
| 1,4 диоксана | - | - | - | 16 йл | 40% (v/v) |
| деионизированная вода | - | 1 йл | 1 йл | 15 мкл | 25 или 60% (v/v) |
| Общий объем | - | 40 мкл | 40 мкл | 40 мкл | - |
Таблица 4: Протокол по подготовке аннеальных партий олигомера ВПНА в различных растворителях.
| Идентификатор последовательности ДНК | Последовательности |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-ГАКАТКТАКТК-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGGGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCG-3' |
| D7 | 5'-АГТТТГАТГТК-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Таблица 5: Isosequential последовательности ДНК в качестве замены олигомеров на ЗПНА. Таблица была изменена с разрешения Ref15.
| Концентрация запасов | Замены ДНК смежных нитей | Замена нити ДНК кроссовера | Окончательная концентрация | |
| Олигомер ПНА (x6) | 20 МКМ | 6 хл (1 х 6) | 6 хл (1 х 6) | 500 нм |
| Олигомер ДНК (x3) | 20 МКМ | 3 йл (1 х 3) | 3 йл (1 х 3) | 500 нм |
| Дмсо | - | 30 мкл | 30 мкл | 75% (v/v) |
| деионизированная вода | - | 1 йл | 1 йл | 25% (v/v) |
| Общий объем | - | 40 мкл | 40 мкл | - |
Таблица 6: Протокол для подготовки аннеальных партий гибридных наноструктур ЗПНА-ДНК в 75% DMSO: H2O (v/v)путем замены смежных или кроссоверных олигомеров ПНА на олигомеры ДНК.
| Концентрация запасов | Концентрации SDS ниже CMC | Концентрации SDS выше CMC | Окончательная концентрация | |
| ЗПНА олигомер (x9) | 20 МКМ | 9 хл (1 х 9) | 9 хл (1 х 9) | 500 нм |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 йл | - | 5,25 мМ |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 йл | 17,5 мм |
| Дмсо | - | 30 мкл | 30 мкл | 75% (v/v) |
| деионизированная вода | - | - | - | 25% (v/v) |
| Общий объем | - | 40 мкл | 40 мкл | - |
Таблица 7: Протокол для подготовки аннеальных партий наноструктур ЗПНА в 75% DMSO: H2O (v/v)при наличии концентраций SDS ниже и выше CMC.
Дополнительная цифра 1: Программирование скрипт PNA3nanofiber.m для разработки олигомер последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья посвящена адаптации и улучшению существующих протоколов нанотехнологий нуклеиновой кислоты к органическим растворителям. Описанные здесь методы сосредоточены на модификациях и устранении неполадок в определенном экспериментальном пространстве отдельных полярных аэротических органических растворителей. Существует еще неисследованный потенциал для других установленных нуклеиновой кислоты нанотехнологии протоколы должны быть адаптированы в этом пространстве. Это может улучшить потенциальное применение за счет интеграции в других областях, таких как синтез полимеров и пептидов, которые обычно выполняются ваналогичных органических растворителей 25,26. Кроме того, мы сосредоточиваемся здесь на критических шагах, которые необходимо соблюдать при отработки вышеупомянутых протоколов.
При подготовке пробы для самосожверки важно сохранить процент объема воды на уровне 25% (v/v) для условий DMSO и DMF. Соответственно, важно признать, что органический растворитель, используемый для самосвечения, должен быть также из запасов ангидроуса. Структуры нановофиберы гидрофобны и агрегатируются по повышенному содержанию воды.
В отличие от эшафотовых подходов ДНК оригами, которые могут создавать структуры дискретной длины, текущий дизайн мотива SST для нановофибер ИПНА и других ранее установленных нанотрубок DNA SST не дает структур дискретных длин. Нанотрубки полимеризируют достижение диапазона длинами в несколько микрон (до 11 мкм). По этой же причине урожайность, связанная с формированием структуры, не может быть количественно оценена.
Однако, из-за незаряженного пептидного костяка ЗПНА, нет зависимости от противовеса ионов по отношению к формированию структуры. Таким образом, буферы изображения не должны включать такие такие цитации, как Mg2, обычно необходимые для стабилизации наноструктур, сделанных из естественных нуклеиновых кислот.
И наконец, комплектация и агрегация наноструктуры ПНА в различных растворителях также зависят от индивидуальных концентраций олигомеров, введенных во время самосожертвовки. Концентрации от 1 МКм и выше отдельных олигомеров увеличивают склонность к комплектации и агрегации и влияют на четкое изображение наноструктур либо во время TIRF, либо во время визуализации TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Грантом Национального научного фонда 1739308, грантом NSF CAREER 1944130 и грантом Управления научных исследований ВВС FA9550-18-1-0199. Последовательности ПНА были щедрым подарком от доктора Тумула Шриваставы из Trucode Gene Repair, Inc. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Эрика Уинфри и д-ра Ризала Хариади за их полезные беседы по коду инструментария DNA Design MATLAB. Мы также хотели бы поблагодарить Джозефа Сухана, Мару Салливан и Центр биологической визуализации за помощь в сборе данных TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
