Summary
Bu makalede, organik çözücü karışımlarında gama modifiye peptit nükleik asit oligomerlerinden nanoyapıların tasarımı ve kendi kendine montajı için protokoller sağlandığı belirtilmiştir.
Abstract
DNA ve RNA nanoteknolojisindeki mevcut stratejiler, sulu veya önemli ölçüde sulu ortamda çeşitli nükleik asit nanoyapıların kendi kendine biraraya ılmasını sağlar. Bu makalede, organik çözücü karışımlarında nanofiber mimarilerin, benzersiz adreslenebilir, tek iplikli, gama modifiye peptid nükleik asit (γPNA) karolarının kendi kendine montajı yoluyla inşa edilmesini sağlayan ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. Her tek iplikli döşeme (SST), her biri 6 bazdan oluşan iki modüler etki alanından oluşan 12 bazlı bir γPNA oligomerdir. Her etki alanı, uzunlukta mikronlara büyüyebilen nanofiberler oluşturmak için programlanmış tamamlayıcılık kullanarak komşu ipliklerde bulunan karşılıklı olarak ücretsiz bir etki alanına bağlanabilir. SST motifi, 3 sarli salik nanofiberlerin oluşumunu sağlamak için toplam 9 oligomerden yapılmıştır. Çap-monodisperse yapılar oluşturan benzer DNA nanoyapılarının aksine, bu γPNA sistemleri organik çözücü karışımlarında kendi kendine montaj sırasında genişlikleri boyunca biraraya gelen nanolifler oluştururlar. Bu nedenle burada açıklanan kendi kendine montaj protokolleri de geleneksel bir yüzey aktif içerir, Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS), donanmış etkilerini azaltmak için.
Introduction
Çok sayıda karmaşık nanoyapıların başarılı yapısı1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12doğal olarak oluşan nükleik asitler kullanılarak yapılan sulu veya önemli ölçüde sulu medya 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ve RNA11,12 önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Ancak, doğal olarak oluşan nükleik asitler dupleks sarmal konformasyonel değişikliklere uğrar veya organik çözücü karışımlarında termal stabiliteleri azaltmıştır13,14.
Daha önce laboratuvarımız gama-peptit nükleik asitler (γPNA)15 (Şekil 1A)adı verilen gama pozisyonu modifiye edilmiş sentetik nükleik asit taklitleri kullanarak 3 sarlisli nanofiberlerin yapımına yönelik bir yöntem bildirmiştir. Böyle bir gelişme ve sentetik nükleik asit taklit PNA potansiyel uygulamaları için ihtiyaç alan16,17içinde ele alınmıştır. Biz göstermiştir ki, DNA nanoyapılar için sunulan tek iplikli karo (SST) stratejisinin bir adaptasyon yoluyla18,19,20, 9 sırayla farklı γPNA oligomerler DMSO ve DMF gibi belirli polar aprotik organik çözücü karışımları 3-sarmalı nanofiberler oluşturmak için tasarlanmış olabilir. ΓPNA oligarmerleri ticari olarak (R)-dietilen glikol (mini-PEG) modifikasyonları ile sipariş edildi üç γ pozisyonlarında (1, 4 ve 8 baz-pozisyonlar) her 12-baz oligomer Boyunca Sahu ve arktarafından yayınlanan yöntemlere dayalı . 21 Bu gama modifikasyonları, γPNA'nın değiştirilmemiş PNA'ya göre daha yüksek bağlayıcı yakınlığı ve termal stabilitesi ile ilişkili sarmal ön organizasyona neden olur.
Bu makale, solvent çözeltisi ve DNA ile ikame γPNA tabanlı nanoyapıların oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmak bildirilen çalışmamızın biruyarlamasıdır 15. Bu makalenin amacı, γPNA nanofiber'in kendi kendine montajı ve karakterizasyonu için geliştirilen solvent uyarlanmış yöntemler için ayrıntılı protokollerin yanı sıra tasarımın ayrıntılı açıklamalarını sağlamaktır. Böylece, ilk modüler SST stratejisi, sentetik nükleik asit pna taklit kullanarak nanoyapı tasarımı için genel bir platform tanıtmak.
PNA dupleksleri için sarmal adım 10,5 baz başına bir dönüş geçmesi DNA dupleksler ile karşılaştırıldığında dönüş başına 18 baz olduğu bildirilmiştir(Şekil 1B). Bu nedenle, gösterilen γPNA SST'lerin etki alanı uzunluğu, üç üçgen dizili helikler arasındaki etkileşimi etkinleştirmek için tam dönüşün üçte birini veya 120° döndürmeyi karşılamak üzere 6 tabanda ayarlanmıştır. Ayrıca, önceki SST motiflerinin aksine, her SST sadece 2 etki alanı içerir ve üç sarlis demeti oluşturmak için sarar 1 boyutlu şerit benzeri bir yapı oluşturur(Şekil 1C). Her 12-baz γPNA oligomer genel SST motifi arasında mini PEG gruplarının düzgün aralıklı dağılımını sağlamak için 1, 4 ve 8 pozisyonlarda gama modifiye edilir. Ayrıca, motif içinde, oligomerler iki türü vardır: tek bir sarlis ve sarlak yayılan "crossover" iplikçikleri üzerinde var "bitişik" iplikçikler(Şekil 1D). Buna ek olarak, oligomerler P8 ve P6 floresan Cy3 ile etiketlenir (yeşil yıldız) ve biotin (sarı oval), sırasıyla(Şekil 1D),floresan mikroskop ile yapı oluşumunun tespitini sağlamak için. SST motifi, her bir etki alanının komşu bir oligomer üzerindeki ilgili etki alanına programlı tamamlayıcılığı yoluyla 3 sarli salık nanofiberoluşumunu mümkün kılmak için toplam 9 oligomerden oluşur(Şekil 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. γPNA sıra tasarımı
- Caltech23'teki Winfree Lab tarafından geliştirilen DNA Tasarım Araç Kutusu22'yi dizileri tasarlamak için programlama komut dosyaları içeren klasöre indirin.
- Bu sıra lı tasarım klasöründe, ".m" dosya uzantısı ile uyumlu dördüncü nesil bir programlama dili açın ve daha önce indirilen "DNAdesign" klasörünü aşağıdaki komutu kullanarak yola ekleyin:
>> addpath DNAdesign - Daha sonra aşağıdaki komutu kullanarak "PNA3nanofiber.m" adlı aşağıdaki komut dosyasını çalıştırın (Bkz. Ek Şekil 1).
>> PNA3nanofiber - "thisSeqs" ve "thisScore" adlı değişkenler oluşturmak için bu komut dosyasını çalıştırın. "thisSeqs" değişkeni tasarlanmış oligomerlerin dizilerini içerir ve "thisScore" ceza puanıdır.
- En az puanı elde etmek için komut dosyasını birden çok kez çalıştırın. Tablo 1'de20 tür çalıştırmanın bir örneği gösterilmiştir.
- Belirtilen SST yapısal motifi için oluşturulan dizilerin her etki alanının istenilen Watson-Crick tamamlayıcılığını el ile onaylayın. 3 sarli sehpa nanofiber yapının dizi özellikleri Tablo 2'degösterilmiştir.
- Oluşturulan diziler için aşağıdakileri doğrulayın.
- Art arda dört C ve G tabanı kullanmaktan kaçının.
- Floresan mikroskobik çalışmaları sağlamak için floresan boya ve biotin molekülleri ile N-terminal fonksiyonelizasyonu için belirli dizileri manuel olarak seçin.
- Sahu ve ark.tarafından açıklandığı gibi tek iplikçikli oligomerlerde önceden organize edilmiş sarmal konformasyonu sağlamak için omurgaüzerinde en az 3 mini PEG gama modifikasyonu ekleyin. 21.000
2. γPNA stok iplikçiklerinin hazırlanması
- Ticari bir üreticiden yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) saflaştırma ile 50 nmol ölçekli sentezde belirtilen dizilerin γPNA bileşen iplikçiklerini elde edin.
- Deiyonize sudaki her bir ipliği 300 μM konsantrasyona geri alın. Yeniden askıda kalan iplikçikleri -20 °C'lik dondurucuda deney için gerekli olana kadar birkaç aya kadar saklayın.
3. ΓPNA oligomer alt kümelerinin erime eğrisi çalışmaları
- 1x fosfat tamponlu salin (PBS) veya Dimethylformamid (DMF) veya Dimetil sülfoksit (DMSO) gibi tercih edilen polar organik çözücügibi sulu tamponlarda erime eğrisi çalışması yaparak tamamlayıcı 2-oligomer ve 3-oligomer alt kümelerinin farklı kombinasyonları için erime sıcaklık aralıkları elde edin (Şekil 2'yebakınız).
NOT: DMF'nin >%50'deki Termal erime eğrileri üst taban çizgisini kaybetmeye başlar ve kısmen deneyler için gerekli dalga boyunda DMF'nin yüksek emilmesi nedeniyle ciddi bozukluklar gösterir. Bu literatürde önemli bir olgudur24. Ancak bu çözücü koşullarda iplikçik konsantrasyonları başına 5 μM'lik erime eğrileri elde etmek mümkündür.- Aliquot 16.7 μL her oligomer 300 μM stok ve 1x PBS veya 100% (v / v) DMSO veya% 100 (v / v) DMF etkili oligomer başına 5 μM son konsantrasyon elde 1000 μL için son hacmi olun. Bu oligomer alt set karışımını 1 cm optik yola, kuvars cuvette'ye aktarın.
- Programlanabilir sıcaklık bloğu ile donatılmış bir spektrofotometre değişken sıcaklık UV-Vis deneyleri gerçekleştirin.
- 0,5\u20121 °C/dk hızında hem soğutma (annealing) hem de ısıtma (erime) döngüleri için 15\u201290 °C sıcaklık aralığındaki erime eğrileri için veri noktaları toplayın. Numuneleri soğumadan önce 90 °C'de 10 dk ve ısıtmadan önce 15 °C'de saklayın. Isıtma eğrisinin ilk türevinin zirvesinden erime sıcaklığını (Tm)belirleyin.
- 2-oligomer alt kümelerinin erime sıcaklığı aralıklarının tüm çözücü durumlarda 35 °C'nin üzerinde olduğunu doğrulayın. Ayrıca, eşdeğer 2-oligomer alt kümesine ek bir iplikçik içeren karşılık gelen 3-oligomer alt kümelerinin, artan işbirliği nedeniyle Tm'de önemli bir artış gösterdiğini doğrulayın.
NOT: Bu, birden fazla oligomerden oluşan tek bir potun otomatik montajının makul termal stabilite ile istenilen nanoyapıya otomatik olarak katlanabilir olduğunu doğrular.
4. Birden fazla farklı γPNA oligomerleri için kendi kendine montaj protokolü
NOT: γPNA nanoyapılar için kendi kendine montajlı termal rampa protokolü hazırlamak için, yavaş rampa tavlama arzu edilir.
- Üretilen oligomer dizileri söz konusu olduğunda, numuneleri 90 ila 20 °C arasında soğutulan bir termal döngüde 22,5 saat bekletin. Tipik olarak, 2-oligomer ve 3-oligomer γPNA alt kümeleri için elde edilen erime sıcaklığı farklı çözücü koşulları için 40\u201270 °C aralıklarında yer alır.
- Termal döngüciyi aşağıdaki gibi programlayınız: 90 °C'de 5 dakika bekletin, rampa 90'dan 70 °C'ye sabit bir hızda 0,1 °C/dk, rampa 0,1 °C/3 min, rampa 40'tan 20 °C'ye kadar 0,1 °C/dk'da tutun ve 4 C 'de tutun (Tablo 3'ebakınız). Numuneler karakterizasyondan önce 12\u201224 saat boyunca 4 °C'de saklanabilir.
NOT: Nanofiber sistemimizin 2 ve 3- oligomer alt kümeleri 1x PBS'de oluşabilirken, tam mikron ölçekli nanofiberler 1x PBS'de toplanır. Bu nedenle, solvent koşulları, oluşturulan yapının ölçeğine ve büyüklüğüne ve gama modifikasyonlarının türüne ve yoğunluğuna göre optimize edilmelidir. - Mikron ölçekli uzun 3 sarnıç nanofiberler için, %75 DMSO'da anneal toplu numuneler hazırlayın: H2O (v/v), %75 DMF: H2O (v/v), %40 1,4-Dioksan: H2O (v/v) solvent optimizasyonu çalışmalarına dayalı15.
- Anneal toplu işlerini aşağıdaki gibi hazırlayın (bkz. Tablo 4). İlk olarak, ana stoktan 0,67 μL alarak ve deiyonize su kullanarak hacmi 10 μl'a çıkararak her bir oligomer için 300 μM ana stoktan 20 μM konsantrasyonlarda 10 μL alt stok hazırlayın.
- Aliquot 1 μL her oligomer için 20 μM alt stokları ve 200 μL PCR tüp ekleyin. Bu 9 oligomerler için toplam 9 μL hacmi ni hesaplar.
- %75 DMSO için 30 μL susuz DMSO/DMF ve %75 DMF olguları ile ilave 1 μL deiyonize su ekleyerek her oligomerile 500 nM son konsantrasyonlarda 40 μL'lik son bir hacim yapın. 1,4-Dioksan 16 μL ekleyin ve %40 Dioxane çözücü durumu için 40 μL'ye deiyonize su ile hacim yapın.
- 4.2 adımda belirtilen protokolü kullanarak anneal toplu işlerini termal döngücöre ve anneal'a yükleyin.
5. Toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopi görüntüleme
- Boş bir pipet uçları kutusundan bir nem haznesi hazırlayın. Aşağıdaki gibi açıklanan numune akış kanallarının kurumasını önlemek için kutuyu yaklaşık 5 mL su ile doldurun (Bkz. Şekil 3).
- Bir mikroskop slayt, 2 çift taraflı bant şeritler ve nitroselüloz kaplı coverslip ile akış odası hazırlayın. Coverslip'i nitroselülozla kaplamak için, coverslip'i amil asetat ve hava kurusunda %0,1 kolokit içeren bir kabın içine batırın.
- Azotluoz çözeltisini, izoamil asetat çözücü ile amil asetatta %2'lik bir seyreltme yaparak hazırlayın.
- Biotinylated sığır serum albumin (Biotin-BSA) çözeltisi 1 mg Biotin-BSA tartarak ve 1 mL 1x PBS eriterek hazırlayın. Akış 15 μL 1 mg/mL Biotin-BSA 1x PBS tampon akış bir açıda akış kanalı yerleştirerek. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika akış kanalı kuluçka.
- 1 mL 1x PBS BSA 1 mg eriterek yıkama tampon hazırlayın. Fazla Biotin-BSA'yı yıkama tamponunun 15 μL'lik kalıbını çalarak yıkayın. Yüzeyi pasifleştirmek için, nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika boyunca akış kanalını kuluçkaya yatırın.
- Streptavidin çözeltisini 0.5 mg streptavidin ve 1 mg BSA ölçerek hazırlayın ve 1x PBS'nin 1 mL'sini kullanarak eritin. 1 mg/mL BSA içeren 1x PBS'de 0.5 mg/mL streptavidin akışı. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika akış kanalı kuluçka. Akış 15 l yıkama tampon uzak bağlı olmayan Streptavidin yıkamak için.
- %75 DMSO, %75 DMF veya %40 1,4-Dioksan durumunda iplikçik başına 500 nM konsantrasyonda daha önce anneleştirilmiş γPNA oligomerlerinin 15 μL'si akış. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika boyunca akış kanalını kuluçkaya yatırın.
- DMSO'daki 10 mM'lik Trolox stoğundan 10 kat seyrelterek tercih edilen çözücü koşullarında 1 mM Trolox hazırlayın (2.5 mg Trolox ölçün ve DMSO'nun 1 mL'sinde çözünün). Akış kanalındaki bağlanmamış nanoyapıları 1m Trolox'un 15 μL'si ile nanoyapılarla aynı çözücü bileşimine sahip olarak yıkayın.
NOT: Akış kanalındaki >%50 DMSO içeriği, genellikle coverslip-su TIRF açıları için kalibre edilen TIRF sırasında solvent durumunun farklı kırılma indeksi nedeniyle küçük sinyal bozukluklarına neden olur. 10 mM Trolox 10 kat deiyonize su kullanılarak seyreltilerek yapılan 1 mM Trolox ile yıkanarak düzeltilebilir. Bu teknik daha net görüntüler sağlar, ancak akış kanalında iki fazlı mikro kabarcıklar ürettiği için oluşumun meydana gelip gelmediğini değerlendirmek için yararlıdır. Sonuç olarak, nanoyapılar Şekil 4D'degösterildiği gibi iki fazlı arabiriminde görülebilir. - 60x yağ daldırma hedefi ve 1,5 x büyüteç kullanarak TIRF görüntüleme ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak akış kanalını slayt tutucuya ve görüntüye aktarın. Cy3 kanalını izleyerek akış kanalını 60x veya 90x büyütme noktasında tizleyin (Bkz. Şekil 4).
6. İletim elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme
- % 1 sulu uranyl asetat leke çözeltisi hazırlamak için distile su 50 mL uranyl asetat 0,5 g tartın. Şırıngaya bağlı 0,2 μm filtre kullanarak %1 sulu uranyal asetat leke çözeltisini filtreleyin.
NOT: Alternatif olarak, %2 sulu uranyal asetat ticari bir üreticiden satın alınabilir. - 300 örgü boyutunda ticari olarak kullanılabilir formvar destek katmanı kaplı Bakır ızgaraları satın alın.
NOT: Formvar destek tabakasının DMSO gibi çözücüler tarafından 2 dk'dan fazla çözünebileceğini unutmayın. Daha uzun numune kuluçka için, bakır ızgaralarda silikon monoksit ile stabilize edilmiş ticari olarak mevcut formvar, ızgaranın karbon kaplı ızgaralardan daha hidrofilik olmasını sağlayan ve Şekil 5C'degösterildiği gibi güçlü numune koşullarına ve elektron ışınına dayanabilecek şekilde mevcuttur. - Pipet 4 μL numune 15 s için ızgara üzerine. Filtre kağıdını ızgarayla temas ederek numuneyi yanlardan çıkarmak için bir filtre kağıdı kullanın.
- Hemen 5 s için ızgara üzerine leke çözeltisi 4 μL ekleyin.
- Daha önce olduğu gibi leke kapalı Wick ve ızgara kuru olduğundan emin olmak için 1\u20122 dk için ızgara karşı filtre kağıdı tutun. Örnekler genellikle 1\u20122 h içinde boyandıktan sonra görüntülenmelidir. Alternatif olarak, Şebekenin tamamen kuruolması sağlanırsa, ızgaralar görüntülemeden önce 3 gün kadar TEM ızgara depolama kutusunda saklanabilir.
- 10 K ile 150K arasında değişen büyütme ile 80 kV'de işletilen bir iletim elektron mikroskobu kullanarak ızgarayı TEM numune tutucuya ve görüntüye aktarın (Bkz. Şekil 5).
7. ΓPNA-DNA melezleri için DNA ile selektif replasmana dayalı farklı morfolojiler
- Standart tuzsuzlama kullanarak 25 nmol ölçekte sentezlenen ticari oligonükleotid üreticilerinden belirtilen dizilerin DNA oligomerlerini (Bkz. Tablo 5'e bakınız). 20 μM stok konsantrasyonlarında RNase içermeyen deiyonize su kullanarak bu DNA dizilerini yeniden askıya alın.
- DNA ile bitişik γPNA iplikçik değişimleri için, D3, D5 ve D9 dizileri p3, p5 ve p9 iplikçiklerinin yerini alabilir. Benzer şekilde, DNA ile çapraz γPNA iplikçik değişimleri için, D1, D4 ve D7 dizileri p1, p4 ve p7 iplikçiklerinin yerini alabilir.
- Aliquot 1 μL her γPNA veya DNA oligomer için 20 μM alt stokları ve adım 2.7 gibi bir 200 μL PCR tüp ekleyin. Son hacmi 40 μL'ye çıkarmak için 30 μL susuz DMSO ve 1 μL RNase içermeyen deiyonize su ekleyin (bkz. Tablo 6).
- 4.2 adımda belirtilen protokolü kullanarak anneal toplu işlerini termal döngücöre ve anneal'a yükleyin.
- Bölüm 5'teki adımları izleyerek veya bölüm 6'da belirtilen TEM görüntüleme protokolünü kullanarak TIRF protokolünü kullanarak γPNA-DNA hibrid nanoyapıları karakterize edin (Bkz. Şekil 6).
8. SDS değişen konsantrasyonlarda γPNA nanofibers için farklı morfolojileri
- 20 mg SDS ölçerek ve 100 μL deiyonize suyla eriterek %20 (wt/v) SDS ana stokhazırlayın.
- %20 SDS stoğundan 3 μL'lik bir işlem yaparak ve deiyonize su kullanarak hacmi 10°L'ye çıkararak %6 (wt/v) SDS alt stoku hazırlayın.
- 5.25 mM ve 17.5 mM SDS son konsantrasyonlarda γPNA oligomerleri aşağıdaki gibidir. Aliquot 1 μL her γPNA oligomer için 20 μM alt stokları ve adım 2.7 gibi bir 200 μL PCR tüp ekleyin. Sırasıyla 5,25 mM ve 17,5 mM'lik SDS son konsantrasyonlarını elde etmek için son hacmi 40 μL'ye çıkarmak için 30°L susuz DMSO ve %6 ve %20 SDS ekleyin (bkz. Tablo 7).
- 4.2 adımda belirtilen protokolü kullanarak, farklı SDS konsantrasyonlarından oluşan anneal toplu işlerini termal döngüce ve anneal'a yükleyin.
- Bölüm 5'teki adımları izleyerek VEYA bölüm 6'da belirtilen TEM görüntüleme protokolünü kullanarak TIRF protokolünü kullanarak SDS varlığında γPNA nanoyapılarını karakterize edin (Bkz. Şekil 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki bölümlerde tartışılan protokoller, dna nanofiberlerinden uyarlanmış bir SST motifinin, birden fazla γPNA oligomerkullanılarak kendi kendine biraraya getirilmiş nanofiber yapıların sağlam nesli için tasarlanmis tasarımını açıklayabilmiştir. Bu bölümde, açıklanan protokollerin başarılı bir şekilde yeniden canlanmasından elde edilen verilerin yorumlanması açıklanmaktadır.
%75 DMSO'da bulunan γPNA oligomerörneklerinin TIRF görüntülemesi için bölüm 5'te açıklanan protokolü takiben: H2O (v/v) en kolay şekilde Şekil 4A'dagösterildiği gibi mikroskobik gözlemler altında iyi organize edilmiş mimarilerin kanıtlarını sağlar. %75 DMF: H2O (v/v) çözücü durumu spikül şeklinde veya iğne benzeri nanoyapılarla sonuçlanır(Şekil 4B)ve deneyimlerimize göre% 40 1,4 dioksan: H2O (v/v) durumu TIRF mikroskopisi kullanılarak bakıldığında filamentöz nanoyapıların seyrek dekorasyonunu göstermektedir (Şekil 4C). Ayrıca, %75 DMSO'da oluşturulan γPNA nanotüplerin örnekleri: H2O (v/v) tem görüntüleme s›ras›nda nanofiberlerin yüksek büyütme veya nanoskobik çözünürlüklerde birikmesinin, bölüm 6'da belirtilen adımları takiben ortaya ç›kar›l›yor(Şekil 5). Nanoyapıların genişliğinin nicel analizleri, maksimum değerleri 80 nm15'inüzerinde olan 16,3 nm ortanca genişlik gösterdi.
DNA kullanarak daha fazla işlevselleşmesağlamak için organik çözücü karışımlarında γPNA-DNA hibrid nanoyapılar oluşturmaya yönelik bir plan oluşturmak için, SST motifindeki oligomerik pozisyonun izosıralı DNA oligomerleri ile değiştirilmesi ni göz önünde bulundurmak önemlidir. Burada açıklanan nanotüp yapısı için bölüm 7'de belirtilen adımları uyarlayan, bitişik γPNA oligomerlerinin yerini alan izoardiye DNA oligomerleri düz ipliksi yapılar oluştururken, çapraz γPNA oligomerlerinin değiştirilmesi TIRF ve TEM görüntüleme kullanılarak bakıldığında stellat yapıları oluşturur (Şekil 6). Bitişik DNA oligomerleri ile değiştirilen nanoyapıların genişliğinin nicel analizleri, 19 nm15civarında ortanca genişlikgösterdi.
Son olarak, bölüm 8'den gelen adımları uyarlayan γPNA nanofibers, kritik micelle konsantrasyonlarının altında SDS konsantrasyonlarının varlığında azaltılmış donuklukla tutarlı daha ince morfolojiler benimser (CMC, 8.2 mM). γPNA nanofibers da TIRF görüntüleme kullanılarak bakıldığında CMC ile karşılaştırıldığında yüksek SDS konsantrasyonlarında yüksek ağ morfolojileri benimsemek(Şekil 7). SDS varlığında kendi kendine monte edilen γPNA oligomerlerinin TEM görüntülemesi, 5.25 mM SDS durumunun, 8\u201212 nm genişlikleri ile yapısal birleştirmede en önemli azalmaları gösterdiğini göstermektedir (Şekil 7C).
Şekil 1: Peptit nükleik asit oligomerleri karmaşık nanoyapılar için yapı taşları dır.
(A) DNA (PNA), PNA ve MP içeren γPNA birimlerinin kimyasal yapıları. (Şekil Ref21izni ile yeniden basıldı .) (B) PNA-PNA helikleri DNA-DNA heliklerinden daha az bükülmüştür ve 10.5 yerine dönüş başına 18 baza sahip olur. (C) Bu üç sarli saklı yapısal tek telli kiremit (SST) motifi, her biri iki altı baz alana sahip 9 ayrı 12 taban uzunluğundaγPNA oligomerden oluşur. (D) Yapı içinde iki tür oligomer vardır: tek bir sarlis ve sarlak yayılan "crossover" iplikçiklerinde bulunan "bitişik" iplikçikler. (E) Bu 18-baz uzunluğunda yapısal motif mikron ölçekli filamentler oluşturmak için polimerize olabilir. B, C ve E panelleri Ref15'inizniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı çözücü koşullarında belirli γPNA oligomerlerinin temsili erime eğrileri.
6 baz etki alanlarını gösteren 2-oligomer (p4, p5) alt kümesi 1x PBS'de makul termal stabilite (siyah eğri) ile bağlanabilir. 3- oligomer (p4, p5, p6) alt kümesi, 1x PBS'deki (mavi eğri) cooperativity nedeniyle ısısal stabilitenin arttığını gösterir ve çözücü DMF (kırmızı noktalı eğri) gibi organik çözücülere dönüştürüldüğünde Tm'ye göre çok az bir dengesizlik gösterir. Şekil Ref15izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Örnek TIRF görüntüleme için akışkan akış kanalı için akışkan akış şeması.
Akış kanalı montajından sonra γPNA nanofibers TIRF görüntüleme için örnek hazırlanması nda yer alan adımları gösteren adım adım iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ΓPNA nanofiber'in TIRF mikroskopisi farklı çözücü koşullarında kendi kendine monte edilmiştir.
γPNA nanofibers TIRF mikroskobu (5 μm ölçekli bar) kullanılarak görselleştirilirken γPNA oligarleri kendi kendine monte edildiğinde Cy3 kanalı izlenir (A) 75% DMSO: su (v/v), (B) 75% DMF: su (v/v) ve (C) 40% Dioksan: su (v/v) çözücü koşullar. (D) ΓPNA nanofibers kendi kendine% 75 DMSO monte: su (v / v) akış kanalına bağlı su 1mM Trolox suda yıkanır, nanostructures ile dmso-su formu iki fazlı mikrokabarcıklar mikrokabarcık arayüzü boyunca hizalanan. Şekil Ref15izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ΓPNA nanofiberlerin TEM görüntülemesi %75 DMSO'da kendi kendine monte edilmiştir: su. (v/v) formvar destek tabakası bakır 300 örgü ızgaraları kullanarak.
(A) Düşük büyütme (15x) altında görselleştirilen γPNA nanofibers'in TEM görüntüleri. (B) Yüksek büyütme (150x) altında görselleştirilen γPNA nanofibers TEM görüntüleri nanotüplerin genişlik boyunca nanotüplerin nanoskobik çözünürlüklerde birleştirilmesini gösterir. (C) Bakır ızgara üzerinde Formvar-Silikon Monoksit destek tabakası kullanılarak düşük büyütme (10x) altında görselleştirilen γPNA nanofiberlerin TEM görüntüleri, güçlü numune koşullarında görüntülemeye olanak sağlar. Şekil Ref15izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ΓPNA-DNA melezleri için dna ile selektif replasmana dayalı farklı morfolojiler.
(A) TIRF (5 μm ölçekli çubuk) ve (C) TEM görüntüleri (60x büyütme) γPNA-DNA melezlerinin kendi kendine montajı, bitişik γPNA oligomerlerinin (p3, p5, p9) izosıralı DNA oligomerları (D3, D5 D9) ile değiştirilmesi üzerine düz filament morfolojisi benimseyen nanotüpler gösterir. (B) TIRF (5 μm ölçekli çubuk) ve (D) TEM görüntüleri (25x büyütme) γPNA-DNA melezlerinin çapraz γPNA oligarmerlerinin (p1, p4, p7) izosıralı DNA oligomerleri (D1, D4 D7) ile değiştirilmesi üzerine kendi kendine montajını gösteren nanolifleri gösterir. Şekil Ref15izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: ΓPNA nanofibers için farklı morfolojiler SDS değişen konsantrasyonlarda.
TIRF görüntüleri (5 μm ölçekli çubuk) (A) 5.25 mM ve (B) 17.5 mM konsantrasyonlarında SDS varlığında γPNA nanofibers kendi kendine montaj. CMC'den (8,2 mM) daha az SDS konsantrasyonları varlığında kendi kendine montaj floresan yoğunluğuna göre TIRF görüntülerinden daha ince morfolojiler gösterir. (C) Nanofibers için medyan genişliği8\u201212 nm aralığında yer alan sistemin TEM görüntüleri (100x büyütme) ile doğrulanır. CMC'nin önemli ölçüde üzerindeki konsantrasyonlarda γPNA nanotüpleri, yüksek ağ lı nanotüp yapıları aracılığıyla daha yüksek sıralı derlemeler oluşturur. Şekil Ref15izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| MATLAB komut dosyası dize çıkışı "thisSeq" | Penaltı Puanı "thisScore" | ||
| 'acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaat ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata tttcgcttcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttcctttggcggtaaggagga ' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggttttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatctcgt gt ttcaggacgaga cttgcggtgtcgcgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgcctttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgcttcac cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagtttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac ' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatcttttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgtgt ' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctcac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctggggacga ' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtatttttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctg ' | 0.0704 | ||
Tablo 1: γPNA sıra tasarımının potansiyel optimizasyonu için 20 örnek algoritmik sonuç. Sütun 1'deki sıra çıktıları ve 2. En az puanı elde etmek için komut dosyasının yinelenen yinelemeleri gerçekleştirilir.
| γPNA Sıralı Kimlik | Sıra | Etki alanı 1 tamamlayıcısı | Etki alanı 2 tamamlayıcısı |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | p2 etki alanı 1 | p6-Biotin etki alanı 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | p1 etki alanı 1 | p3 etki alanı 2 |
| p3 | N-GACATCTTACTC-C | p7 etki alanı 2 | p2 etki alanı 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5 etki alanı 1 | p9 etki alanı 1 |
| p5 | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4 etki alanı 1 | p6-Biotin etki alanı 2 |
| p6-Biotin | N-Biotin-GTGAACCGAGGG-C | p1 etki alanı 2 | p5 etki alanı 2 |
| p7 | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3 etki alanı 1 | p3 etki alanı 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 etki alanı 1 | p9 etki alanı 2 |
| p9 | N-TCCGCATTCTGT-C | p4 etki alanı 2 | p8-Cy3 etki alanı 2 |
Tablo 2: nanofiberler için γPNA dizi tasarım sonuçları. Bu tabloda belirtildiği gibi tek tek oliomer dizileri oluşturuldu. Altı çizili bazlar mini-PEG ile gama konumu modifikasyonlarını gösterir. Tablo Ref15'inizniyle değiştirildi.
| Sıcaklık Aralığı | Rampa hızı |
| 90 °C | 3 dakika bekletin |
| 90-80 °C | 0.1°C/dakika |
| 80-70 °C | 0.1°C/dakika |
| 70-60 °C | 0.1°C/3 dakika |
| 60-50 °C | 0.1°C/3 dakika |
| 50-40 °C | 0.1°C/3 dakika |
| 40-30 °C | 0.1°C/dakika |
| 30-20 °C | 0.1°C/dakika |
| 4 °C | Süresiz tutun |
Tablo 3: Termal cycler için Anneal rampa protokolü. Tablo Ref15'inizniyle değiştirildi.
| Stok konsantrasyonu | %75 DMSO: su (v/v) anneal numunesi | %75 DMF: su (v/v) anneal numunesi | %40 dioksan: su (v/v) anneal numunesi | Son Konsantrasyon | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| DMSO | - | 30 μL | - | - | % 75 (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | % 75 (v/v) |
| 1,4-dioksan | - | - | - | 16 μL | % 40 (v/v) |
| deiyonize su | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 veya %60 (v/v) |
| Toplam hacim | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tablo 4: Farklı çözücü koşullarında γPNA oligomer in anneal toplu hazırlanması için protokol.
| DNA Dizi Kimliği | Sıra |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tablo 5: ΓPNA'ya yedek oligomer olarak izosequential DNA dizileri. Tablo Ref15'inizniyle değiştirildi.
| Stok konsantrasyonu | DNA Bitişik iplikçik değişimleri | DNA Crossover iplikçik değişimleri | Son Konsantrasyon | |
| γPNA oligomer (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| DNA oliomer (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| DMSO | - | 30 μL | 30 μL | % 75 (v/v) |
| deiyonize su | - | 1 μL | 1 μL | % 25 (v/v) |
| Toplam hacim | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tablo 6: ΓPNA-DNA hibrid nanoyapıların %75 DMSO'da anneal toplu serilerinin hazırlanmasına yönelik protokol: H2O (v/v) bitişik veya çapraz γPNA oligomerlerinin izosequential DNA oligomerleri ile değiştirilmesi yoluyla.
| Stok konsantrasyonu | CMC'nin altındaki SDS konsantrasyonları | CMC'nin üzerindeki SDS konsantrasyonları | Son Konsantrasyon | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| %6 SDS | %6 (wt/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| %20 SDS | %20 (wt/v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| DMSO | - | 30 μL | 30 μL | % 75 (v/v) |
| deiyonize su | - | - | - | % 25 (v/v) |
| Toplam hacim | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tablo 7: ΓPNA nanoyapılarının %75 DMSO'da anneal toplu işlerinin hazırlanmasınayönelik protokol: CMC'nin altında ve üstünde SDS konsantrasyonları varlığında H2O (v/v).
Ek Şekil 1: Programlama komut dosyası PNA3nanofiber.m oligomer dizileri tasarlamak için. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin organik çözücü karışımlarına uyarlanması ve iyileştirilmesi üzerine odaklanılmıştır. Burada açıklanan yöntemler, belirli polar aprotik organik çözücülerin tanımlanmış deneysel alanı içinde modifikasyonlar ve sorun giderme üzerine odaklanmaktadır. Bu alana adapte olacak diğer çekirdekik asit nanoteknoloji protokolleri için henüz keşfedilmemiş bir potansiyel vardır. Bu genellikle benzer organik çözücüler25,26gerçekleştirilir polimer ve peptit sentezi gibi diğer alanlarda entegrasyon yoluyla potansiyel uygulamaları artırabilir. Ayrıca, yukarıda belirtilen protokolleri uygularken uyulması gereken kritik adımlara da odaklanıyoruz.
Numunenin kendi kendine montaj için hazırlanması sırasında, DMSO ve DMF koşulları için suyun hacim yüzdelerinin %25 (v/v) olarak tutulması önemlidir. Buna göre, kendi kendine montaj için kullanılan organik çözücü de susuz stokları olmalıdır tanımak önemlidir. Nanofiber yapılar hidrofobik ve artan su içeriğinde agrega vardır.
Ayrık uzunluklarda yapılar oluşturabilen iskeleli DNA origami yaklaşımlarının aksine, γPNA nanofiber'ler ve daha önce kurulmuş diğer DNA SST nanotüpleri için mevcut SST motif tasarımı ayrık uzunlukların yapılarını vermez. Nanotüpler çok mikron uzunlukları (11 μm'ye kadar) elde etmek için polimerize. Aynı nedenle, yapı oluşumu ile ilişkili verim ölçülemez.
Ancak γPNA'nın yüksüz peptid omurgası nedeniyle yapı oluşumuna bağlı olarak karşı iyon dengesine herhangi bir bağımlılık yoktur. Bu nedenle görüntüleme tamponları, doğal olarak oluşan nükleik asitlerden yapılan nanoyapıların stabilizasyonu için tipik olarak gerekli olan Mg2+ gibi katyonları içermemelidir.
Son olarak, γPNA nanoyapı birleştirme ve farklı çözücü koşullarda toplama da bireysel oligomer konsantrasyonları kendi kendine montaj sırasında tanıtılan bağlıdır. 1 μM ve daha yüksek bireysel oligomerlerin konsantrasyonları donma ve toplama eğilimini artırır ve TIRF veya TEM görüntüleme sırasında nanoyapıların net görüntülemesini etkiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen National Science Foundation hibe 1739308, NSF CAREER hibe 1944130 ve Hava Kuvvetleri Ofis Bilim Araştırma hibe numarası FA9550-18-1-0199 tarafından desteklenmiştir. γPNA dizileri Trucode Gen Onarım, Inc Dr Tumul Srivastava cömert bir hediye vardı. Dr. Erik Winfree ve Dr. Rizal Hariadi'ye DNA Tasarım Araç Kutusu MATLAB kodu hakkındaki yararlı konuşmaları için teşekkür ederiz. Ayrıca Joseph Suhan, Mara Sullivan ve Biyolojik Görüntüleme Merkezi'ne TEM verilerinin toplanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
