Summary
Denne artikel indeholder protokoller for design og selvsamling af nanostrukturer fra gammamod modificerede peptidkernesyre oligomerer i organiske opløsningsmiddelblandinger.
Abstract
Nuværende strategier inden for DNA og RNA nanoteknologi muliggør selvsamling af en række nukleinsyrenanostrukturer i vandige eller væsentligt hydrerede medier. I denne artikel beskriver vi detaljerede protokoller, der muliggør konstruktion af nanofiberarkitekturer i organiske opløsningsmiddelblandinger gennem selvsamling af entydigt adresserbare, enkeltstrengede, gamma-modificerede peptidkernesyre (γPNA) fliser. Hver enkeltstrengede flise (SST) er en 12-base γPNA oligomer bestående af to sammenkædede modulære domæner på 6 baser hver. Hvert domæne kan binde sig til et gensidigt gratis domæne til stede på tilstødende tråde ved hjælp af programmeret komplementaritet til at danne nanofibers, der kan vokse til mikron i længden. SST motivet er lavet af 9 i alt oligomerer for at muliggøre dannelsen af 3-helix nanofibers. I modsætning til analoge DNA nanostrukturer, som danner diameter-monodisperse strukturer, disse γPNA systemer danner nanofibers, der bundt langs deres bredder under selvsamling i organiske opløsningsmiddel blandinger. Selvsamlingsprotokoller, der er beskrevet her, omfatter derfor også et konventionelt overfladeaktivt stof, Natriumdycylsulfat (SDS), for at reducere bundlingeffekter.
Introduction
Vellykket opførelse af en lang række komplekse nanostrukturer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 i vandige eller væsentligt hydrerede medier fremstillet ved hjælp af naturlige forekommende nukleinsyrer som DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 og RNA11,12 er blevet vist i tidligere værker. Naturligt forekommende nukleinsyrer undergår dog duplex-spiralformede konformationelle ændringer eller har reduceret termiske stabiliteter i organiske opløsningsmiddelblandinger13,14.
Tidligere har vores laboratorium rapporteret en metode til opførelse af 3-helix nanofibers ved hjælp af gamma-position modificeret syntetisk nukleinsyre efterligner kaldet gamma-peptid nukleinsyrer (γPNA)15 (Figur 1A). Behovet for en sådan udvikling og potentielle anvendelser af den syntetiske nukleinsyre efterligne PNA er blevet drøftet inden for feltet16,17. Vi har gennem en tilpasning af den enkeltstrengede flisestrategi (SST), der præsenteres for DNA-nanostrukturer18,19,20, vist, at 9 sekventielt adskilte γPNA oligomerer kan designes til at danne 3-helix nanofibers i udvalgte polaraprotiske organiske opløsningsmiddelblandinger som DMSO og DMF. ΓPNA oligomererne blev kommercielt bestilt med ændringer af (R)-diethylenglycol (mini-PEG) ved tre γ-positioner (1, 4 og 8 basispositioner) langs hver 12-base oligomer baseret på metoder offentliggjort af Sahu et al. 21 Disse gamma-modifikationer forårsager den spiralformede præorganisation, der er forbundet med γPNA's højere bindende affinitet og termiske stabilitet i forhold til uændret PNA.
Denne artikel er en tilpasning af vores rapporterede arbejde, hvor vi undersøger virkningerne af opløsningsmiddelopløsning og substitution med DNA på dannelsen af γPNA-baserede nanostrukturer15. Formålet med denne artikel er at give detaljerede beskrivelser af designet samt detaljerede protokoller for opløsningsmiddel-tilpassede metoder, der blev udviklet til selvsamling og karakterisering af γPNA nanofiber. Således introducerer vi først den modulære SST-strategi, en generel platform for nanostrukturdesign ved hjælp af den syntetiske nukleinsyre efterligneR PNA.
Den spiralformede tonehøjde for PNA-duplexer er blevet rapporteret til at være 18 baser pr. tur i forhold til DNA-duplexer, der gennemgår en drejning pr. 10,5 baser (Figur 1B). Derfor blev domænelængden af de demonstrerede γPNA SST'er sat til 6 baser for at rumme en tredjedel af en fuld drejning eller 120° rotation for at muliggøre interaktion mellem tre trekantede helices. Også, i modsætning til tidligere SST motiver, hver SST indeholder kun 2 domæner, effektivt at skabe en 1-dimensionel bånd-lignende struktur, der ombrydes til at danne en tre-helix bundt (Figur 1C). Hver 12-base γPNA oligomer er gamma modificeret på 1, 4 og 8 positioner for at sikre ensartet afstand fordeling af mini-PEG grupper på tværs af den samlede SST motiv. Derudover er der inden for motivet to typer af oligomerer: "sammenhængende" tråde, der findes på en enkelt helix og helix-spænder "crossover" tråde (Figur 1D). Desuden er oligomerer P8 og P6 mærket med fluorescerende Cy3 (grøn stjerne) og biotin (gul oval), henholdsvis (Figur 1D), for at gøre det muligt at detektion af strukturdannelse ved hjælp af fluorescensmikroskopi. I alt er SST-motivet lavet af 9 i alt oligomerer for at muliggøre dannelsen af 3-helix nanofibers gennem programmeret komplementaritet af hvert enkelt domæne til det tilsvarende domæne på en nærliggende oligomer (Figur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. γPNA sekvens design
- Download DNA Design Toolbox22 udviklet af Winfree Lab på Caltech23 i mappen, der indeholder programmering scripts til at designe sekvenser.
- Åbn et fjerde generations programmeringssprog, der er kompatibelt med filtypenavnet ".m", i denne sekvensdesignmappe, og føj derefter mappen "DNAdesign" til stien ved hjælp af følgende kommando:
>> addpath DNAdesign - Kør derefter følgende script med navnet "PNA3nanofiber.m" (se supplerende figur 1) ved hjælp af følgende kommando:
>> PNA3nanofiber - Kør dette script for at oprette variabler kaldet "thisSeqs" og "thisScore". Variablen "thisSeqs" indeholder sekvenserne af de designede oligomerer, og "thisScore" er straffesparkskonkurrencen.
- Kør scriptet flere gange for at opnå den mest minimale score. En stikprøve på 20 sådanne kørsler er vist i tabel 1.
- Bekræft manuelt den ønskede Watson-Crick komplementaritet for hvert domæne af de genererede sekvenser for det angivne SST-strukturelle motiv. Sekvensspecifikationer for 3-helix nanofiberstrukturen er vist i tabel 2.
- Kontroller følgende for genererede sekvenser.
- Undgå at bruge fire på hinanden følgende C- og G-baser.
- Vælg manuelt specifikke sekvenser til N-terminal funktionalisering med fluorescerende farvestof og biotinmolekyler for at muliggøre fluorescerende mikroskopiundersøgelser.
- Medtag mindst 3 mini-PEG gamma-modifikationer på rygraden for at muliggøre præorganiseret spiralformet kropsbygning i de enkeltstrengede oligomerer som beskrevet af Sahu et al. kr.
2. Forberedelse af γPNA-materieltengerne
- Der opnås γPNA-komponenttråde af specificerede sekvenser ved 50 nmol-skalasyntesen med højtydende rensning af væskekromatografi (HPLC) fra en kommerciel producent.
- Opslæmmet hver streng i deioniseret vand til 300 μM koncentrationer. De opsbrugte tråde opbevares i -20 °C i fryseren i op til flere måneder, indtil det er nødvendigt til forsøg.
3. Smeltekurveundersøgelser af delmængder af γPNA oligomer
- Der opnås smeltetemperaturområder for forskellige kombinationer af supplerende 2-oligomer- og 3-oligomer-delmængder ved at køre en smeltekurveundersøgelse i vandige buffere såsom 1x phosphatbuffer (PBS) eller foretrukket polar organisk opløsningsmiddel såsom Dimethylformamid (DMF) eller Dimethylsulfoxid (DMSO) (se figur 2).
BEMÆRK: Termiske smeltekurver ved >50% af DMF begynder at miste den øvre baseline og viser alvorlige forstyrrelser til dels på grund af høj absorbans af DMF ved den bølgelængde, der kræves til forsøgene. Dette er et kendt fænomen i litteraturen24. Det er dog muligt at opnå smeltekurverne ved 5 μM pr. strengkoncentrationer under disse opløsningsmiddelforhold.- Aliquot 16,7 μL fra 300 μM-beholdningen af hver oligomer, og der skal foretages det endelige volumen til 1000 μL enten i 1x PBS eller 100% (v/v) DMSO eller 100% (v/v) DMF, der effektivt opnår 5 μM endelig koncentration pr. oligomer. Overfør denne oligomer delmængde blanding til en 1 cm optisk sti, kvarts cuvette.
- Udfør UV-Vis-eksperimenter med variabel temperatur i et spektrofotometer, der er udstyret med en programmerbar temperaturblok.
- Indsaml datapunkter for smeltekurverne over et temperaturområde på 15\u201290 °C til både afkølings- og varmecyklusser (smeltning) med en hastighed på 0,5\u20121 °C/min. Prøverne opbevares i 10 minutter ved 90 °C før afkøling og ved 15 °C før opvarmning. Smeltetemperaturen (Tm)bestemmes fra toppen af varmekurvens første derivat.
- Kontroller, at smeltetemperaturintervaller for 2-oligomer-undergrupper er over 35 °C i alle opløsningsmiddeltilfælde. Kontroller desuden, at de tilsvarende 3-oligomer-undergrupper, der indeholder en ekstra streng til deres tilsvarende 2-oligomer-delmængde, viser en betydelig stigning i Tm på grund af øget cooperativitet.
BEMÆRK: Dette ville kontrollere, at en enkelt pot selvsamling af flere oligomerer kan foldes sammen i den ønskede nanostruktur med rimelig termisk stabilitet.
4. Selvmonteringsprotokol for flere forskellige γPNA oligomerer
BEMÆRK: For at udtænke en selvmonterings termisk rampeprotokol til γPNA nanostrukturer er langsom rampeglødning ønskelig.
- For 50 00 kr. for oligomersekvenser skal prøverne udgløde i 22,5 timer i en termisk cyclerkøling fra 90 til 20 °C. Smeltetemperatur, der opnås for 2-oligomer og 3-oligomer γPNA-delmængder, ligger typisk i intervaller på 40\u201270 °C for forskellige opløsningsmiddelforhold.
- Den termiske cykler programmerer således: Hold ved 90 °C i 5 min. rampe ned fra 90 til 70 °C med en konstant hastighed på 0,1 °C/min, rampe ned fra 70 til 40 °C med en hastighed på 0,1 °C/3 min, rampe ned fra 40 til 20 °C med en hastighed på 0,1 °C/min og hold ved 4 °C (se tabel 3). Prøver kan opbevares i 4 °C i 12\u201224 h før karakterisering.
BEMÆRK: Mens 2- og 3- oligomer-delmængder af vores nanofibersystem kan dannes i 1x PBS, er den fulde nanofibers i mikronskala samlet i 1x PBS. Derfor bør opløsningsmiddel betingelser optimeres baseret på omfanget og størrelsen af struktur, der dannes samt typen og densiteten af gamma ændringer. - For mikronskala lange 3-helix nanofibers tilberedes glødebiprøver i 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxan: H2O (v/v) baseret på optimeringsundersøgelseraf opløsningsmiddel 15.
- Forbered følgende glødepartier (se tabel 4). Forbered først 10 μL dellagre ved 20 μM-koncentrationer fra de 300 μM hovedlagre for hver oligomer ved at aliquoting 0,67 μL fra hovedbestanden og gøre volumen til 10 μl ved hjælp af deioniseret vand.
- Aliquot 1 μL fra de 20 μM-dellagre for hver oligomer og tilsættes et 200 μL PCR-rør. Dette udgør et samlet volumen på 9 μL for 9 oligomerer.
- Der tilsættes enten 30 μL vandfri DMSO/DMF til 75% DMSO og 75% DMF tilfælde med yderligere 1 μL deioniseret vand for at lave et endeligt volumen på 40 μL med hver oligomer ved 500 nM endelige koncentrationer. Der tilsættes 16 μL 1,4-Dioxan, og volumen med deioniseret vand foretages til 40 μL for 40% Dioxan opløsningsmiddeltilstand.
- Læg glødepartierne på den termiske cycler og glødeglas ved hjælp af den protokol, der er nævnt i trin 4.2.
5. Total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi imaging
- Forbered et fugtighedskammer fra en tom pipettespidsboks. Æsken fyldes med ca. 5 ml vand for at forhindre tørring af de følgende prøveflowkanaler (se figur 3).
- Forbered flowkammer med et mikroskop dias, 2 dobbeltsidet tape strimler, og nitrocellulose-belagt coverslip. At belæggetlip med nitrocellulose, dyppe dækslæbet i et bæger, der indeholder 0,1% collodion i amylacetat og lufttørre.
- Nitrocelluloseopløsningen klargøres ved at foretage en 20-dobling fra kommercielt tilgængelig 2% kollodion i amylacetat med isoamylacetatopløsningsmiddel.
- Der forberedes biotinyleret boalseralbuminopløsning (Biotin-BSA) ved at veje 1 mg Biotin-BSA og opløse det i 1 ml 1x PBS. Flow 15 μL på 1 mg/ml Biotin-BSA i 1x PBS-buffer ved at placere flowkanalen i en vinkel. Inkuber flowkanalen i 2-4 min ved stuetemperatur i et befugtet kammer.
- Vaskebufferen klargøres ved at opløse 1 mg BSA i 1 ml 1x PBS. Den overskydende Biotin-BSA vaskes ved at flyde 15 μL af vaskepudet. For at passivere overfladen inkuberes flowkanalen i 2-4 minutter ved stuetemperatur i et befugtet kammer.
- Streptavidin-opløsningen klargøres ved at måle 0,5 mg streptavidin og 1 mg BSA og derefter opløses ved hjælp af 1 ml 1x PBS. Flow 15 μL på 0,5 mg/ml streptavidin i 1x PBS indeholdende 1 mg/ml BSA. Inkuber flowkanalen i 2-4 min ved stuetemperatur i et befugtet kammer. Flow 15 μL af vaskebufferen til vask ubundet Streptavidin.
- Flow 15 μL tidligere udglødet parti γPNA oligomerer ved 500 nM koncentration pr. streng i enten 75% DMSO, 75% DMF eller 40% 1,4-Dioxan tilstand. Inkuber flowkanalen i 2-4 minutter ved stuetemperatur i et befugtet kammer.
- Der tilberedes 1 mM Trolox i foretrukne opløsningsmiddelforhold ved at fortynde 10 gange fra en 10 mM-bestand trolox i DMSO (foranstaltning 2,5 mg Trolox og opløses i 1 ml DMSO). De ubundne nanostrukturer vaskes i flowkanalen med 15 μL på 1 mM Trolox med samme opløsningsmiddelsammensætning som nanostrukturerne.
BEMÆRK: >50% DMSO-indholdet i flowkanalen ville medføre mindre signalforstyrrelser på grund af det forskellige indeks over brydning af opløsningsmiddeltilstanden under TIRF, som typisk kalibreres til coverslip-water TIRF vinkler. Dette kan afhjælpes ved vask med 1 mM Trolox fremstillet ved at fortynde 10 mM Trolox 10 gange ved hjælp af deioniseret vand. Denne teknik giver klarere billeder, men er kun nyttig til at vurdere, om dannelsen fandt sted, men fordi det producerer tofasede mikrobobler i flowkanalen. Som følge heraf kan nanostrukturer være synlige ved grænsefladen mellem de to faser som vist i figur 4D. - Overfør flowkanalen til diasholderen og billedet ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med TIRF-billeddannelse ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål og en 1,5 x forstørrelsesglas. Scan flowkanalen ved enten 60x eller 90x forstørrelse ved at overvåge Cy3-kanalen (se figur 4).
6. Transmission elektron mikroskopi (TEM) billeddannelse
- 0,5 g uranylacetat vejes i 50 ml destilleret vand for at forberede en 1% vandig uranylacetatpletopløsning. Den vandige uranylactatpletopløsningen filtreres ved hjælp af et 0,2 μm filter, der er fastgjort til en sprøjte.
BEMÆRK: Alternativt kan 2% vandigt uranylacetat købes hos en kommerciel producent. - Køb kommercielt tilgængelige formvar støtte lag belagt kobber gitre med 300-mesh størrelse.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at formvar støtte lag kunne opløses væk af opløsningsmidler som DMSO ud over 2 min. Ved længere prøveinkubation er der kommercielt tilgængelige formvar stabiliseret med siliciummonoxid på kobbergitre, som gør det muligt for nettet at være mere hydrofile end kulstofbelagte net og kan modstå kraftige prøvebetingelser og elektronstråle som vist i figur 5C. - Pipette 4 μL prøve på nettet i 15 s. Brug et stykke filterpapir til at væge prøven af ved at bringe filterpapiret i kontakt med gitteret fra siden.
- Tilsæt straks 4 μL af pletopløsningen på nettet i 5 s.
- Wick off pletten som før og hold filteret papir mod nettet i 1 \u20122 min for at sikre, at nettet er tørt. Prøver skal typisk afbildes inden for 1\u20122 h efter farvning. Hvis gitteret er sikret at være helt tørt, kan gitre også opbevares i en TEM-gitteropbevaringsboks i op til 3 dage før billeddannelse.
- Gitteret overføres til en TEM-prøveholder og et billede ved hjælp af et transmissionselektrekoskop, der betjenes ved 80 kV med forstørrelse fra 10 K til 150K (se figur 5).
7. Forskellige morfologier for γPNA-DNA-hybrider baseret på selektiv erstatning med DNA
- Der fremskafes DNA-oligomerer af specificerede sekvenser (se tabel 5) fra kommercielle oligonucleotidproducenter, der syntetiseres ved 25 nmol-skala ved hjælp af standardafsaltning. Disse DNA-sekvenser opslæmmede ved hjælp af RNase-frit deioniseret vand ved 20 μM-lagerkoncentrationer.
- Til tilstødende γPNA streng udskiftninger med DNA, sekvenser D3, D5 og D9 kan erstatte strenge p3, p5 og p9. Tilsvarende for crossover γPNA streng udskiftninger med DNA, sekvenser D1, D4 og D7 kan erstatte strenge p1, p4 og p7.
- Aliquot 1 μL fra de 20 μM-dellagre for hver γPNA eller DNA-oligomer og tilsættes et 200 μL PCR-rør som i trin 2.7. Der tilsættes 30 μL vandfri DMSO og 1 μL RNasefri deioniseret vand for at gøre det endelige volumen til 40 μL (se tabel 6).
- Læg glødepartierne på den termiske cycler og glødeglas ved hjælp af den protokol, der er nævnt i trin 4.2.
- Karakterisere γPNA-DNA hybrid nanostrukturer ved hjælp af TIRF-protokollen efter trin i afsnit 5 eller ved hjælp af TEM-billeddannelsesprotokol, der er nævnt i afsnit 6 (se figur 6).
8. Forskellige morfologier for γPNA nanofibers i varierende koncentrationer af SDS
- Der klargøres en SDS-hovedbestand på 20 % (wt/v) ved at måle 20 mg SDS og opløse det i 100 μL deioniseret vand.
- Der klargøres en SDS-underlager på 6 % (wt/v) ved at aliquoting 3 μL fra 20% SDS-lageret og gøre volumen til 10 μL ved hjælp af deioniseret vand.
- Anneal γPNA oligomerer i slutkoncentrationer på 5,25 mM og 17,5 mM SDS som følger. Aliquot 1 μL fra de 20 μM-dellagre for hver γPNA oligomer og tilsættes et 200 μL PCR-rør som i trin 2.7. Der tilsættes 30 μL vandfri DMSO og 1 μL på henholdsvis 6 % og 20 % SDS for at gøre det endelige volumen til 40 μL for at opnå SDS-slutkoncentrationer på henholdsvis 5,25 mM og 17,5 mM (se tabel 7).
- Glødepartierne af varierende SDS-koncentrationer indbelastes på den termiske cycler og glødeglas ved hjælp af den protokol, der er nævnt i trin 4.2.
- Karakterisere γPNA nanostrukturer i nærvær af SDS ved hjælp af TIRF-protokollen efter trin i afsnit 5 eller ved hjælp af TEM-billeddannelsesprotokol, der er nævnt i afsnit 6 (se figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protokoller, der diskuteres i afsnittene ovenfor, beskriver udformningen af et tilpasset SST-motiv fra DNA-nanofibers til den robuste generation af selvsamlede nanofibers strukturer ved hjælp af flere, forskellige γPNA oligomerer. I dette afsnit beskrives fortolkningen af data fra en vellykket gengivelse af de beskrevne protokoller.
Efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 5 for TIRF-billeddannelse af prøver af γPNA oligomerer, der er udgød i 75 % DMSO: H2O (v/v) giver lettest velorganiseret arkitektur under mikroskopiske observationer som vist i figur 4A. 75% DMF: H2O (v/v) opløsningsmiddel tilstand resulterer i spicule-formede eller nål-lignende nanostrukturer(Figur 4B) og, efter vores erfaring, 40% 1,4 dioxan: H2O (v / v) tilstand viser sparsomme dekoration af filamentøse nanostrukturer, når de ses ved hjælp af TIRF mikroskopi (Figur 4C). Endvidere demonstrerer prøverne af γPNA nanorør, der er dannet i 75 % DMSO: H2O (v/v), bundtning af nanofibers ved høj forstørrelse eller nanoskopiske opløsninger under TEM-billeddannelse efter trin, der er nævnt i afsnit 6 (Figur 5). Kvantitative analyser af nanostrukturernes bredde viste en medianbredde på 16,3 nm med maksimumsværdier over 80 nm15.
For at udtænke en ordning til generering af γPNA-DNA hybrid nanostrukturer i organiske opløsningsmiddelblandinger for at muliggøre yderligere funktionalisering ved hjælp af DNA, er det vigtigt at overveje den oligomeriske position i SST-motivet, der erstattes med kringlede DNA-oligomerer. Tilpasningstrin, der er nævnt i afsnit 7 for de her beskrevne nanorørskonstruktioner, danner krekventielle DNA-oligomerer, der erstatter de tilstødende γPNA oligomerer, lige trådamenterede strukturer, mens udskiftning af crossover γPNA oligomers danner stellatestrukturer, når de ses ved hjælp af TIRF og TEM-billeddannelse (Figur 6). Kvantitative analyser af bredden af de nanostrukturer , der blev erstattet med sammenhængende DNA-oligomerer, viste medianbredder omkring 19 nm15.
Endelig, ved tilpasning af trin fra afsnit 8, γPNA nanofibers vedtage tyndere morfologier i overensstemmelse med reduceret bundling i nærvær af SDS koncentrationer under sine kritiske micelle koncentrationer (CMC, 8.2 mM). γPNA nanofibre også vedtage meget netværksforbundne morfologier ved høje SDS koncentrationer i forhold til sin CMC, når de ses ved hjælp af TIRF imaging (Figur 7). TEM-billeddannelse af γPNA oligomers, der er selvsamlede i nærvær af SDS, indikerer, at 5,25 mM SDS-tilstanden indikerer de største reduktioner i strukturel bundling med bredder på 8\u201212 nm som vist i (Figur 7C).
Figur 1: Peptid nukleinsyre oligomerer som byggesten til komplekse nanostrukturer.
a)Kemiske DNA-strukturer (PNA), PNA- og MP-holdige γPNA-enheder. (Figuren er blevet genoptrykt med tilladelse fra Ref21.) (B) PNA-PNA helices er mindre snoet end DNA-DNA helices, der har 18 baser per tur i stedet for 10,5. (C) Denne tre-helix strukturelle enkelt strandede flise (SST) motiv består af 9 forskellige 12-base-lange γPNA oligomers, hver har to seks-base domæner. (D) Inden for strukturen er der to typer af oligomerer: "sammenhængende" tråde, der findes på en enkelt helix og helix-spænder "crossover" tråde. (E) Denne 18-base lange strukturelle motiv kan polymerisere til at danne mikron-skala filamenter. Paneler B, C og E er blevet ændret med tilladelse fra Ref15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative smeltekurver for udvalgte γPNA oligomerer under forskellige opløsningsmiddelforhold.
2-oligomer (p4, p5) delmængde viser 6-base domæner kan binde med rimelig termisk stabilitet (sort kurve) i 1x PBS. 3- oligomer (p4, p5, p6) delmængden viser øget termisk stabilitet på grund af samarbejdslighed i 1x PBS (blå kurve) og viser lidt at ingen ustabilitet med hensyn til Tm, når opløsningsmiddel ændres til organiske opløsningsmidler som DMF (rød prikket kurve). Figuren er blevet ændret med tilladelse fra Ref15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flowdiagram for flydende flowkanal til TIRF-billeddannelse af prøver.
En trinvis arbejdsgang, der angiver trin, der er involveret i prøveforberedelse til TIRF-billedbehandling af γPNA-nanofibre efter flowkanalsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: TIRF-mikroskopidannelse af γPNA nanofiber, der er selvsamlede under forskellige opløsningsmiddelforhold.
γPNA nanofibre visualiseret ved hjælp af TIRF-mikroskopi (5 μm skalabar), mens cy3kanalen overvåges, når γPNA oligomerer er selvsamlede i (A) 75% DMSO: vand (v/v), (B) 75% DMF: vand (v/v) og (C) 40% Dioxan: vand (v/v) opløsningsmiddelforhold. D) Når γPNA nanofibers selvsamlede i 75% DMSO: vand (v/v), der er bundet til flowkanalen, vaskes med 1mM Trolox i vand, tofasede mikrobobler af DMSO-vand form med nanostrukturer, der flugter langs mikroboblets grænseflade. Figuren er blevet ændret med tilladelse fra Ref15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: TEM-billeddannelse af γPNA nanofibers, der er selvsamlede i 75 % DMSO: vand. v/v) ved hjælp af formvar støttelag kobber 300 mesh gitre.
a) TEM-billeder af γPNA nanofibers visualiseret under lav forstørrelse (15x). (B)TEM billeder af γPNA nanofibers visualiseret under høj forstørrelse (150x) viser bundling af nanorør langs bredden ved nanoskopiske opløsninger. (C) TEM billeder af γPNA nanofibers visualiseret under lav forstørrelse (10x) ved hjælp af en Formvar-Silicon Monoxide støtte lag på en kobber gitter tillader billeddannelse under kraftige prøvebetingelser. Figuren er blevet ændret med tilladelse fra Ref15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Forskellige morfologier for γPNA-DNA hybrider baseret på selektiv erstatning med DNA.
a) TIRF -hybrider (5 μm skala) og(C)TEM-billeder (60x forstørrelse) af selvsamling af γPNA-DNA-hybrider ved udskiftning af sammenhængende γPNA oligomerer (p3, p5, p9) med isosequential DNA oligomers (D3, D5 D9) viser nanorør, der anvender en lige glødemorfologi. b) TIRF -hybrider (5 μm skala) og(D)TEM-billeder (25x forstørrelse) af selvsamling af γPNA-DNA-hybrider ved udskiftning af crossover γPNA oligomerer (p1, p4, p7) med isosequential DNA oligomers (D1, D4 D7) viser nanofibre, der anvender a stellatydologi. Figuren er blevet ændret med tilladelse fra Ref15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Forskellige morfologier for γPNA nanofibers i varierende koncentrationer af SDS.
TIRF-billeder (5 μm skalabar) af selvsamling af γPNA nanofibre ved tilstedeværelse af SDS i koncentrationer på (A) 5,25 mM og (B) 17,5 mM. Selvmontering i nærvær af SDS-koncentrationer, der er mindre end CMC (8,2 mM), viser tyndere morfologier fra TIRF-billeder baseret på fluorescensintensitet. (C)Dette verificeres af TEM-billeder (100x forstørrelse) af systemet, hvor medianbredden for nanofibers ligger i intervallet 8\u201212 nm. Ved koncentrationer, der ligger betydeligt over CMC, synes γPNA-nanorør at danne højere ordensenheder gennem stærkt netværksforbundne nanorørsstrukturer. Figuren er blevet ændret med tilladelse fra Ref15. Klik her for at se en større version af dette tal.
| MATLAB script streng output "thisSeq" | Straf Score "thisScore" | ||
| »acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg ' | 0.08 | ||
| »ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat « | 0.0544 | ||
| »tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| »gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga ' | 0.0528 | ||
| »cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg « | 0.0656 | ||
| »aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| »gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| »tagccccccagt gggctatctcgt ttcaggacga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| »taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| »aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| »ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| »ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| »actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac « | 0.064 | ||
| »ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| »gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctcac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggggacga « | 0.0688 | ||
| »gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| »tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| »tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| »agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| »cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctg « | 0.0704 | ||
Tabel 1: 20 prøve algoritmiske resultater for potentiel optimering af γPNA sekvens design. 20 prøve algoritmiske resultater med sekvens output i kolonne 1 og deres tilsvarende score i kolonne 2. Gentagne gentagelser af scriptet udføres for at opnå den mest minimale score.
| γPNA-sekvens-id | Sekvens | Domæne 1-komplement | Domæne 2 komplement |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | p2-domæne 1 | p6-Biotin domæne 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | p1-domæne 1 | p3-domæne 2 |
| kr. | N-GACATCTTACTC-C | p7-domæne 2 | p2-domæne 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5-domæne 1 | p9-domæne 1 |
| kr. | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4-domæne 1 | p6-Biotin domæne 2 |
| p6-Biotin | N-Biotin-GTGAACCGAGGG-C | p1-domæne 2 | p5-domæne 2 |
| kr. | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3 domæne 1 | p3-domæne 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 domæne 1 | p9-domæne 2 |
| p9. | N-TCCGCATTCTGT-C | p4-domæne 2 | p8-Cy3 domæne 2 |
Tabel 2: γPNA sekvens design resultater for nanofibers. Individuelle oligomer sekvenser blev genereret som angivet i denne tabel. Understregede baser angiver ændringer af gammapositionen med mini-PEG. Tabellen er blevet ændret med tilladelse fra Ref15.
| Temperaturområde | Rampehastighed |
| 90 °C | Hold i 3 minutter |
| 90-80 °C | 0,1°C/minut |
| 80-70 °C | 0,1°C/minut |
| 70-60 °C | 0,1°C/3 minut |
| 60-50 °C | 0,1°C/3 minut |
| 50-40 °C | 0,1°C/3 minut |
| 40-30 °C | 0,1°C/minut |
| 30-20 °C | 0,1°C/minut |
| 4 °C | Hold på ubestemt tid |
Tabel 3: Gløderampeprotokol for termiskcykelr. Tabellen er blevet ændret med tilladelse fra Ref15.
| Koncentrationen af aktier | 75% DMSO: vand (v/v) glødeprøve | 75% DMF: vand (v/v) glødeprøve | 40% dioxan: vand (v/v) glødeprøve | Endelig koncentration | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | 75 % (v/v) |
| 1,4-dioxan | - | - | - | 16 μL | 40 % (v/v) |
| deioniseret vand | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 eller 60% (v/v) |
| Samlet volumen | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tabel 4: Protokol til fremstilling af glødepartier af γPNA oligomer under forskellige opløsningsmiddelforhold.
| DNA-sekvens-id | Sekvens |
| kr. | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| kr. | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| kr. | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| kr. | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| kr. | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| kr. | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tabel 5: Væsentlige DNA-sekvenser som erstatning for γPNA. Tabellen er blevet ændret med tilladelse fra Ref15.
| Koncentrationen af aktier | DNA-tilstødende streng udskiftninger | DNA Crossover streng udskiftninger | Endelig koncentration | |
| γPNA oligomer (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| DNA oligomer (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| deioniseret vand | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v/v) |
| Samlet volumen | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabel 6: Protokol til fremstilling af glødepartier af hybrid nanostrukturer γPNA-DNA i 75% DMSO: H2O (v/v) gennem udskiftning af sammenhængende eller crossover γPNA oligomerer med isosequential DNA oligomers.
| Koncentrationen af aktier | SDS-koncentrationer under CMC | SDS-koncentrationer over CMC | Endelig koncentration | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| deioniseret vand | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Samlet volumen | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabel 7: Protokol til fremstilling af glødepartier af γPNA nanostrukturer i 75% DMSO: H2O (v/v) ved tilstedeværelse af SDS-koncentrationer under og over CMC.
Supplerende figur 1: Programmering script PNA3nanofiber.m til at designe oligomer sekvenser. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel fokuserer på tilpasning og forbedring af eksisterende nukleinsyre nanoteknologi protokoller mod organiske opløsningsmiddel blandinger. De metoder, der er beskrevet her, fokuserer på modifikationer og fejlfinding inden for et defineret eksperimentelt rum af udvalgte polare aprotiske organiske opløsningsmidler. Der er endnu et uudforsket potentiale for, at andre etablerede nukleinsyrenanoteknologiske protokoller kan tilpasses inden for dette rum. Dette kunne forbedre potentielle anvendelser gennem integration på andre områder såsom polymer og peptid syntese, som typisk udføres i lignende organiskeopløsningsmidler 25,26. Derudover fokuserer vi her på kritiske trin, der skal overholdes, mens vi praktiserer de ovennævnte protokoller.
Under klargøring af prøve til selvmontering er det vigtigt at holde volumenprocenterne af vand på 25 % (v/v) for DMSO- og DMF-forhold. Derfor er det vigtigt at erkende, at det organiske opløsningsmiddel, der anvendes til selvmontering, også bør være fra vandfrie lagre. Nanofiberstrukturerne er hydrofobe og samles i øget vandindhold.
I modsætning til stilladser DNA origami tilgange, der kan skabe strukturer af diskrete længder, den nuværende SST motiv design for γPNA nanofibers og andre tidligere etablerede DNA SST nanorør giver ikke strukturer af diskrete længder. Nanorør polymerisere opnå en række multi-mikron længder (op til 11 μm). Af samme grund kan udbytte i forbindelse med strukturdannelse ikke kvantificeres.
Men på grund af den uopladede peptid rygrad γPNA, der er ingen afhængigheder på counter ion balance i forhold til strukturdannelse. Billeddiagnostiske buffere behøver derfor ikke at medtage kationer som Mg2+ der typisk kræves til stabilisering af nanostrukturer fremstillet af naturligt forekommende nukleinsyrer.
Endelig er γPNA nanostruktur bundling og aggregering under forskellige opløsningsmiddelforhold også afhængige af de individuelle oligomerkoncentrationer, der indføres under selvsamling. Koncentrationer fra 1 μM og højere af de enkelte oligomerer øger tilbøjeligheden til bundtning og sammenlægning og påvirker tydelig billeddannelse af nanostrukturer enten under TIRF eller TEM-billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af National Science Foundation-bevillingen 1739308, NSF CAREER-bevillingen 1944130 og af Air Force Office of Science Research-tilskudsnummeret FA9550-18-1-0199. γPNA sekvenser var en generøs gave fra Dr. Tumul Srivastava af Trucode Gene Repair, Inc. Vi vil gerne takke Dr. Erik Winfree og Dr. Rizal Hariadi for deres nyttige samtaler om DNA Design Toolbox MATLAB kode. Vi vil også gerne takke Joseph Suhan, Mara Sullivan og Center for Biological Imaging for deres hjælp i indsamlingen af TEM data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
