Summary
Denne artikkelen inneholder protokoller for design og selvmontering av nanostrukturer fra gammamodifiserte peptidkjerner i organiske løsemiddelblandinger.
Abstract
Nåværende strategier i DNA og RNA nanoteknologi gjør det mulig å selvmontering av en rekke nukleinsyre nanostrukturer i vandige eller vesentlig hydrerte medier. I denne artikkelen beskriver vi detaljerte protokoller som muliggjør bygging av nanofiberarkitekturer i organiske løsemiddelblandinger gjennom selvmontering av unikt adresserbare, en strandede, gammamodifiserte peptidkjernesyre (γPNA) fliser. Hver enkelt strandet flis (SST) er en 12-base γPNA oligomer består av to sammenføyde modulære domener av 6 baser hver. Hvert domene kan binde seg til et gjensidig gratis domene til stede på nærliggende tråder ved hjelp av programmert komplementaritet for å danne nanofiber som kan vokse til mikron i lengde. SST-motivet er laget av 9 totale oligomerer for å muliggjøre dannelse av 3-helix nanofiber. I motsetning til analoge DNA nanostrukturer, som danner diameter-monodisperse strukturer, disse γPNA systemer danner nanofiber som bunter langs bredden under selvmontering i organiske løsemiddel blandinger. Selvmonteringsprotokoller beskrevet her inkluderer derfor også et konvensjonelt overflateaktivt middel, Natrium dodecylsulfat (SDS), for å redusere bunteeffekter.
Introduction
Vellykket bygging av mange komplekse nanostrukturer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 i vandige eller vesentlig hydrerte medier laget ved hjelp av naturlige nukleinsyrer som DNA1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 og RNA11,12 har blitt vist i tidligere verk. Men naturlig forekommende nukleinsyrer gjennomgår dupleks spiralformede konformasjonsendringer eller har reduserte termiske stabilities i organiske løsemiddelblandinger13,14.
Tidligere har laboratoriet vårt rapportert en metode mot bygging av 3-helix nanofiber ved hjelp av gamma-posisjon modifisert syntetisk nukleinsyre etterligner kalt gamma-peptid nukleinsyrer (γPNA)15 (Figur 1A). Behovet for en slik utvikling og potensielle anvendelser av syntetisk nukleinsyre etterligne PNA har blitt diskutert innenfeltet 16,17. Vi har vist, gjennom en tilpasning av single-stranded flis (SST) strategi presentert for DNA nanostructures18,19,20, at 9 sekvensielt distinkte γPNA oligomers kan utformes for å danne 3-helix nanofiber i utvalgte polare aprotiske organiske løsemiddel blandinger som DMSO og DMF. ΓPNA oligomers ble kommersielt bestilt med modifikasjoner av (R)-dietylenglykol (mini-PEG) ved tre γ-posisjoner (1, 4 og 8 base-posisjoner) langs hver 12-base oligomer basert på metoder publisert av Sahu et al. 21 Disse gammamodifikasjonene forårsaker den spiralformede pre-organisasjonen som er forbundet med den høyere bindende affiniteten og termisk stabiliteten til γPNA i forhold til umodifisert PNA.
Denne artikkelen er en tilpasning av vårt rapporterte arbeid der vi undersøker effekten av løsningsmiddelløsning og substitusjon med DNA på dannelsen av γPNA-baserte nanostrukturer15. Målet med denne artikkelen er å gi detaljerte beskrivelser av design samt detaljerte protokoller for løsemiddel-tilpassede metoder som ble utviklet for selvmontering og karakterisering av γPNA nanofiber. Dermed introduserer vi først den modulære SST-strategien, en generell plattform for nanostrukturdesign ved hjelp av syntetisk nukleinsyre etterligneR PNA.
Den spiralformede banen for PNA-duplekser er rapportert å være 18 baser per sving i forhold til DNA-duplekser, som gjennomgår en sving per 10,5 baser (figur 1B). Derfor ble domenelengden til de demonstrerte γPNA-SSTene satt til 6 baser for å imøtekomme en tredjedel av en full sving eller 120° rotasjon for å muliggjøre samhandling mellom tre trekantede helices. I motsetning til tidligere SST-motiver inneholder også hver SST bare 2 domener, og skaper effektivt en 1-dimensjonal båndlignende struktur som brytes for å danne en tre-helix-bunt (figur 1C). Hver 12-base γPNA oligomer er gamma modifisert på 1, 4 og 8 posisjoner for å sikre jevnt fordelt distribusjon av mini-PEG grupper på tvers av det totale SST motiv. I tillegg, innenfor motivet, er det to typer oligomers: "sammenhengende" tråder som finnes på en enkelt helix og helix-spenner "crossover" tråder (Figur 1D). I tillegg er oligomers P8 og P6 merket med fluorescerende Cy3 (grønn stjerne) og biotin (gul oval), henholdsvis (Figur 1D), for å muliggjøre påvisning av strukturdannelse ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Til sammen er SST-motivet laget av 9 totale oligomerer for å muliggjøre dannelsen av 3-helix nanofiber gjennom programmert komplementaritet av hvert enkelt domene til det tilsvarende domenet på en nærliggende oligomer (figur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. γPNA sekvens design
- Last ned DNA Design Toolbox22 utviklet av Winfree Lab på Caltech23 i mappen som inneholder programmeringsskript for å designe sekvenser.
- Åpne et fjerde generasjons programmeringsspråk som er kompatibelt med filtypen ".m", i denne sekvensutformingsmappen, og legg deretter til den tidligere nedlastede "DNAdesign"-mappen i banen ved hjelp av følgende kommando:
>> addpath DNAdesign - Deretter kjører du følgende skript kalt "PNA3nanofiber.m" (se Supplerende figur 1) ved hjelp av følgende kommando:
>> PNA3nanofiber - Kjør dette skriptet for å opprette variabler kalt "thisSeqs" og "thisScore." Variabelen "thisSeqs" inneholder sekvensene til de utformede oligomers, og "thisScore" er straffepoengsummen.
- Kjør skriptet flere ganger for å få mest mulig minimal poengsum. Et utvalg på 20 slike kjøringer vises i tabell 1.
- Bekreft manuelt ønsket Watson-Crick komplementaritet for hvert domene i de genererte sekvensene for det angitte SST strukturelle motivet. Sekvensspesifikasjoner for nanofiberstrukturen med 3 helix er vist i tabell 2.
- Kontroller følgende for genererte sekvenser.
- Unngå å bruke fire påfølgende C- og G-baser.
- Velg manuelt spesifikke sekvenser for N-terminal funksjonalisering med fluorescerende fargestoff og biotinmolekyler for å muliggjøre fluorescerende mikroskopistudier.
- Inkluder minst 3 mini-PEG gamma-modifikasjoner på ryggraden for å muliggjøre forhåndsorganisert spiralformet konformasjon i enkelttrådet oligomers som beskrevet av Sahu et al. 21.
2. Utarbeidelse av γPNA lager tråder
- Få γPNA komponenttråder av spesifiserte sekvenser ved 50 nmol skala syntese med høy ytelse flytende kromatografi (HPLC)rensing fra en kommersiell produsent.
- Gjenbruk hver streng i deionisert vann til 300 μM konsentrasjoner. Oppbevar de resuspenderte trådene i -20 °C fryser opptil flere måneder til det er nødvendig for eksperimentering.
3. Smeltekurvestudier av γPNA oligomer-undergrupper
- Få smeltetemperaturområder for ulike kombinasjoner av komplementære 2-oligomer- og 3-oligomerundergrupper ved å kjøre en smeltekurvestudie i vandige buffere som 1x fosfatbufret saltvann (PBS) eller foretrukket polar organisk løsningsmiddel som Dimetylformamid (DMF) eller Dimetylsulfoksid (DMSO) (se figur 2).
MERK: Termiske smeltekurver ved > 50% av DMF begynner å miste den øvre grunnlinjen og viser alvorlige forstyrrelser delvis på grunn av høy absorbans av DMF ved bølgelengden som kreves for eksperimentene. Dette er et kjent fenomen i litteraturen24. Det er imidlertid mulig å oppnå smeltekurvene ved 5 μM per trådkonsentrasjoner under disse løsemiddelforholdene.- Aliquot 16,7 μL fra 300 μM lager av hver oligomer og gjøre det endelige volumet til en 1000 μL enten i 1x PBS eller 100% (v / v) DMSO eller 100% (v / v) DMF effektivt få 5 μM endelig konsentrasjon per oligomer. Overfør denne oligomer undergruppeblandingen til en 1 cm optisk bane, kvarts cuvette.
- Utfør UV-Vis-eksperimenter med variabel temperatur i et spektrofotometer utstyrt med en programmerbar temperaturblokk.
- Samle datapunkter for smeltekurvene over et temperaturområde på 15\u201290 °C for både kjøling (gløde) og oppvarmingssykluser (smeltende) med en hastighet på 0,5\u20121 °C/min. Oppbevar prøvene i 10 min ved 90 °C før avkjøling og ved 15 °C før oppvarming. Bestem smeltetemperaturen (Tm) fra toppen av det første derivatet av varmekurven.
- Kontroller at smeltetemperaturområder for 2-oligomer undergrupper er over 35 °C i alle løsemiddeltilfeller. I tillegg må du kontrollere at de tilsvarende 3-oligomer-undergruppene som inneholder en ekstra tråd til tilsvarende 2-oligomer-undergruppe, viser en betydelig økning i Tm på grunn av økt samstatus.
MERK: Dette vil bekrefte at en enkelt gryte selvmontering av flere oligomerer kan samarbeide sammen i ønsket nanostruktur med rimelig termisk stabilitet.
4. Selvmonteringsprotokoll for flere forskjellige γPNA-oligomerer
MERK: For å utarbeide en selvmontering termisk rampe protokoll for γPNA nanostrukturer, sakte-rampe annealing er ønskelig.
- Ved oligomersekvenser generert, kan du anneal prøvene i 22,5 timer i en termisk cycler kjøling fra 90 til 20 °C. Vanligvis ligger smeltetemperatur oppnådd for 2-oligomer og 3-oligomer γPNA-undergrupper i områder på 40 \\ u201270 ° C for forskjellige løsemiddelforhold.
- Programmer den termiske cycler som følger: hold ved 90 °C i 5 min, ned fra 90 til 70 °C med en konstant hastighet på 0,1 °C/min, rampe ned fra 70 til 40 °C med en hastighet på 0,1 °C/3 min, rampe ned fra 40 til 20 °C med en hastighet på 0,1 °C/min og hold ved 4 °C (se tabell 3). Prøver kan lagres i 4 °C i 12\u201224 h før karakterisering.
MERK: Mens 2- og 3-oligomer-undergrupper av vårt nanofibersystem kan danne seg i 1x PBS, aggregerer de fullstendige mikronskala nanofiberene i 1x PBS. Derfor bør løsemiddelforhold optimaliseres basert på omfanget og størrelsen på strukturen som dannes, samt type og tetthet av gammamodifikasjoner. - For mikron skala lange 3-helix nanofiber, forberede anneal batch prøver i 75% DMSO: H2O (v / v), 75% DMF: H2O (v / v), 40% 1,4-Dioxane: H2O (v / v) basert på løsemiddeloptimalisering studier 15.
- Klargjøre glødepartier på følgende måte (se tabell 4). Først forberede 10 μL sub-aksjer ved 20 μM konsentrasjoner fra 300 μM hovedlagrene for hver oligomer ved å aliquoting 0,67 μL fra hovedlageret og gjøre volumet til 10 μl ved hjelp av deionisert vann.
- Aliquot 1 μL fra 20 μM sub-aksjer for hver oligomer og legge den til en 200 μL PCR rør. Dette utgjør et totalt volum på 9 μL for 9 oligomers.
- Tilsett enten 30 μL vannfri DMSO/DMF for 75% DMSO og 75% DMF tilfeller med ytterligere 1 μL av deionisert vann for å lage et endelig volum på 40 μL med hver oligomer ved 500 nM endelige konsentrasjoner. Tilsett 16 μL 1,4-Dioxane og gjør volumet med deionisert vann til 40 μL for 40% Dioxane løsemiddel tilstand.
- Legg de glødende batchene på den termiske cycleren og gløden ved hjelp av protokollen som er nevnt i trinn 4.2.
5. Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi avbildning
- Forbered et fuktighetskammer fra en tom pipettespissboks. Fyll esken med ca. 5 ml vann for å unngå tørking av prøvestrømningskanalene som er beskrevet som følger (se figur 3).
- Forbered strømningskammeret med et mikroskopsklie, 2 dobbeltsidige tapestrimler og nitrocellulosebelagt coverlip. For å belegge dekkslipsen med nitrocellulose, dypp dekkslipset i et beger som inneholder 0,1% kollodion i amylacetat og lufttørt.
- Forbered nitrocelluloseløsningen ved å lage en 20-ganger fortynning fra kommersielt tilgjengelig 2% kollodion i amylacetat med isoamylacetatløsningsmiddel.
- Forbered biotinylert storfe serumalbumin (Biotin-BSA) oppløsning ved å veie 1 mg Biotin-BSA og oppløse den i 1 ml 1x PBS. Strømning 15 μL på 1 mg/ml Biotin-BSA i 1x PBS-buffer ved å plassere strømningskanalen i en vinkel. Inkuber strømningskanalen i 2–4 min ved romtemperatur i et fuktet kammer.
- Forbered vaskebufferen ved å oppløse 1 mg BSA i 1 ml 1x PBS. Vask overflødig Biotin-BSA ved å flyte 15 μL av vaskebufferen. For å passivere overflaten, inkubere strømningskanalen i 2–4 minutter ved romtemperatur i et fuktet kammer.
- Forbered streptavidinoppløsningen ved å måle 0,5 mg streptavidin og 1 mg BSA og deretter oppløses ved hjelp av 1 ml 1x PBS. Strømning 15 μL på 0,5 mg/ml streptavidin i 1x PBS som inneholder 1 mg/ml BSA. Inkuber strømningskanalen i 2–4 min ved romtemperatur i et fuktet kammer. Strøm 15 μL av vaskebufferen for å vaske bort ubundet Streptavidin.
- Strømning 15 μL av tidligere glødet batch av γPNA oligomers ved 500 nM konsentrasjon per tråd i enten 75% DMSO, 75% DMF eller 40% 1,4-Dioxane tilstand. Inkuber strømningskanalen i 2–4 minutter ved romtemperatur i et fuktet kammer.
- Forbered 1 mM Trolox i foretrukne løsemiddelforhold ved å fortynne 10 ganger fra en 10 mM lager trolox i DMSO (mål 2,5 mg Trolox og oppløses i 1 ml DMSO). Vask de ubundne nanostrukturene i strømningskanalen med 15 μL på 1 mM Trolox som har samme løsemiddelsammensetning som nanostrukturene.
MERK: >50 % DMSO-innholdet i strømningskanalen vil gi mindre signalforstyrrelser på grunn av den forskjellige indeksen for brytning av løsemiddeltilstanden under TIRF, som vanligvis kalibreres for TIRF-vinkler med dekkglassvann. Dette kan rettes ved å vaske med 1 mM Trolox laget ved å fortynne 10 mM Trolox 10 ganger ved hjelp av deionisert vann. Denne teknikken gir klarere bilder, men er bare nyttig for å vurdere om dannelse skjedde, men fordi den produserer tofasede mikrobobler i strømningskanalen. Som et resultat kan nanostrukturer være synlige i grensesnittet til de to fasene som vist i figur 4D. - Overfør strømningskanalen videre til glideholderen og bildet ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med TIRF-bildebehandling ved hjelp av et 60x oljenedsenkingsmål og et 1,5x forstørrelsesprogram. Skann strømningskanalen ved enten 60x eller 90x forstørrelse ved å overvåke Cy3-kanalen (se figur 4).
6. Overføring elektron mikroskopi (TEM) avbildning
- Vei 0,5 g uranylacetat i 50 ml destillert vann for å lage en 1% vandig uranylacetatflekkoppløsning. Filtrer den 1 % vandige uranylacetatflekken ved hjelp av et 0,2 μm filter festet til en sprøyte.
MERK: Alternativt kan 2 % vandig uranylacetat kjøpes fra en kommersiell produsent. - Kjøp kommersielt tilgjengelige formvar støttelag belagt kobbergitter med 300-mesh størrelse.
MERK: Det er viktig å merke seg at støttelaget i formvar kan oppløses av løsemidler som DMSO utover 2 min. For lengre prøveinkubasjon er kommersielt tilgjengelig formvar stabilisert med silisiummonoksid på kobbernett tilgjengelig som gjør at nettet kan være mer hydrofilt enn karbonbelagte rutenett og tåler kraftige prøveforhold og elektronstråle som vist i figur 5C. - Pipette 4 μL prøve på gitteret i 15 s. Bruk et filterpapir til å fjerne prøven ved å bringe filterpapiret i kontakt med rutenettet fra siden.
- Tilsett umiddelbart 4 μL av flekkoppløsningen på gitteret i 5 s.
- Vek av flekken som før, og hold filterpapiret mot gitteret i 1\u20122 min for å forsikre deg om at gitteret er tørt. Eksempler bør vanligvis avbildes innen 1\u20122 h etter farging. Hvis rutenettet er sikret å være helt tørt, kan rutenett lagres i en LAGRINGsboks for TEM-rutenett i opptil 3 dager før bildebehandling.
- Overfør gitteret til en TEM-prøveholder og bilde ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop som betjenes ved 80 kV med forstørrelse fra 10 K til 150 K (se figur 5).
7. Ulike morfologier for γPNA-DNA hybrider basert på selektiv erstatning med DNA
- Få DNA-oligomerer av spesifiserte sekvenser (se tabell 5) fra kommersielle oligonukleotidprodusenter syntetisert ved 25 nmolskala ved hjelp av standard desalting. Resuspend disse DNA-sekvensene ved hjelp av RNase-fritt deionisert vann ved 20 μM lagerkonsentrasjoner.
- For sammenhengende γPNA tråd erstatninger med DNA, sekvenser D3, D5 og D9 kan erstatte tråder p3, p5 og p9. Tilsvarende, for crossover γPNA strand erstatninger med DNA, sekvenser D1, D4 og D7 kan erstatte tråder p1, p4 og p7.
- Aliquot 1 μL fra 20 μM sub-aksjer for hver γPNA eller DNA oligomer og legge den til en 200 μL PCR rør som i trinn 2.7. Tilsett 30 μL vannfri DMSO og 1 μL RNasefritt deionisert vann for å gjøre det endelige volumet til 40 μL (se tabell 6).
- Legg de glødende batchene på den termiske cycleren og gløden ved hjelp av protokollen som er nevnt i trinn 4.2.
- Karakterisere γPNA-DNA hybrid nanostrukturer ved hjelp av TIRF-protokollen ved å følge trinnene i avsnitt 5 eller ved hjelp av TEM bildeprotokoll nevnt i avsnitt 6 (se figur 6).
8. Ulike morfologier for γPNA nanofiber i varierende konsentrasjoner av SDS
- Forbered en 20% (wt / v) SDS hovedlager ved å måle 20 mg SDS og oppløse den i 100 μL av deionisert vann.
- Forbered en 6% (wt / v) SDS sub-lager ved å aliquoting 3 μL fra 20% SDS lager og gjør volumet til 10 μL ved hjelp av deionisert vann.
- Anneal γPNA oligomers i endelige konsentrasjoner på 5,25 mM og 17,5 mM SDS som følger. Aliquot 1 μL fra 20 μM sub-aksjer for hver γPNA oligomer og legge den til en 200 μL PCR rør som i trinn 2.7. Tilsett 30 μL vannfri DMSO og 1 μL på henholdsvis 6 % og 20 % SDS for å gjøre det endelige volumet til 40 μL for å oppnå SDS endelige konsentrasjoner på henholdsvis 5,25 mM og 17,5 mM (se tabell 7).
- Last de glødende batchene med varierende SDS-konsentrasjoner på den termiske cycleren og gløden ved hjelp av protokollen som er nevnt i trinn 4.2.
- Karakterisere γPNA nanostrukturer i nærvær av SDS ved hjelp av TIRF-protokollen ved å følge trinnene i avsnitt 5 eller bruke TEM-bildeprotokoll nevnt i avsnitt 6 (se figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollene som diskuteres i avsnittene ovenfor beskriver utformingen av et tilpasset SST-motiv fra DNA nanofiber for den robuste generasjonen av selvmonterte nanofiberstrukturer ved hjelp av flere, distinkte γPNA-oligomerer. Denne delen beskriver tolkningen av data hentet fra vellykket rekreasjon av protokollene som er beskrevet.
Etter protokollen beskrevet i avsnitt 5 for TIRF-avbildning av prøver av γPNA oligomerer glødet i 75% DMSO: H2O (v / v) gir mest lett bevis på godt organiserte arkitekturer under mikroskopiske observasjoner som vist i figur 4A. 75 % DMF: H2O (v/v) løsemiddeltilstand resulterer i spicule-formet eller nålelignende nanostrukturer (figur 4B) og etter vår erfaring viser 40% 1,4 dioksan: H2O (v/v) tilstand sparsom dekorasjon av filamentøse nanostrukturer sett ved hjelp av TIRF-mikroskopi (figur 4C). Videre viser prøvene av γPNA nanorør dannet i 75% DMSO: H2O (v / v) bunting av nanofiber ved høy forstørrelse eller nanoskopiske oppløsninger under TEM-bildebehandling følgende trinn nevnt i avsnitt 6 (figur 5). Kvantitative analyser av nanostrukturens bredde viste en median bredde på 16,3 nm med maksimumsverdier utover 80 nm15.
For å utarbeide en ordning mot å generere γPNA-DNA hybrid nanostrukturer i organiske løsemiddelblandinger for å muliggjøre ytterligere funksjonalisering ved hjelp av DNA, er det viktig å vurdere den oligomeriske posisjonen i SST-motivet som erstattes med isosequential DNA oligomers. Tilpasning trinn nevnt i avsnitt 7 for tilfelle av nanotube konstruere beskrevet her, isosequential DNA oligomers som erstatter sammenhengende γPNA oligomers danner rette filamentøse strukturer mens utskifting av crossover γPNA oligomers danner stellate strukturer sett ved hjelp av TIRF og TEM imaging (Figur 6). Kvantitative analyser av bredden på nanostrukturene som ble erstattet med sammenhengende DNA-oligomerer viste medianbredder rundt 19 nm15.
Til slutt, ved tilpasning av trinn fra avsnitt 8, γPNA nanofiber vedta tynnere morfologier i samsvar med redusert bunting i nærvær av SDS konsentrasjoner under sine kritiske micelle konsentrasjoner (CMC, 8.2 mM). γPNA nanofiber vedtar også svært nettverksmorfologier ved høye SDS-konsentrasjoner i forhold til CMC sett ved hjelp av TIRF-bildebehandling (figur 7). TEM-avbildning av γPNA oligomers selvmontert i nærvær av SDS indikerer at 5,25 mM SDS-tilstanden indikerer de mest betydelige reduksjonene i strukturell bunting med bredder som strekker seg 8\u201212 nm som vist i (figur 7C).
Figur 1: Peptidkjernesyre oligomers som byggeklosser for komplekse nanostrukturer.
(A)Kjemiske strukturer av DNA (PNA), PNA og MP-inneholdende γPNA-enheter. (Figuren er trykket på nytt med tillatelse fra Ref21.) (B)PNA-PNA helices er mindre vridd enn DNA-DNA helices, har 18 baser per sving i stedet for 10,5. (C) Dette tre-helix strukturelle enkelt strandet flis (SST) motiv består av 9 forskjellige 12-base-lang γPNA oligomers, hver har to seks-base domener. (D)Innenfor strukturen er det to typer oligomers: "sammenhengende" tråder som finnes på en enkelt helix og helix-spenner "crossover" tråder. (E) Dette 18-base lange strukturelle motivet kan polymerisere for å danne mikron-skala filamenter. Panel B, C og E er endret med tillatelse fra Ref15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative smeltekurver for utvalgte γPNA-oligomerer under forskjellige løsemiddelforhold.
2-oligomer (p4, p5) delsett som viser 6-base domener kan binde med rimelig termisk stabilitet (svart kurve) i 1x PBS. 3- oligomer (p4, p5, p6) undergruppen viser økt termisk stabilitet på grunn av cooperativity i 1x PBS (blå kurve) og viser liten eller ingen ustabilitet med hensyn til Tm når løsemiddel endres til organiske løsemidler som DMF (rød prikket kurve). Figuren er endret med tillatelse fra Ref15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Strømningsdiagram for flytende strømningskanal for eksempel-TIRF-bildebehandling.
En trinnvis arbeidsflyt som angir trinn som er involvert i prøveklargjøring for TIRF-avbildning av γPNA nanofiber etter montering av strømningskanaler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: TIRF mikroskopiavbildning av γPNA nanofiber selvmontert under forskjellige løsemiddelforhold.
γPNA nanofiber visualiseres ved hjelp av TIRF-mikroskopi (5 μm skala bar) mens du overvåker Cy3-kanalen når γPNA oligomers er selvmontert i (A) 75% DMSO: vann (v / v), (B) 75% DMF: vann (v / v) og (C) 40% Dioxane: vann (v / v) løsemiddel forhold. (D)Når γPNA nanofiber selvmontert i 75% DMSO: vann (v / v) bundet til strømningskanalen vaskes med 1mM Trolox i vann, tofasede mikrobobler av DMSO-vannform med nanostrukturer som samordner seg langs grensesnittet til mikroboblen. Figuren er endret med tillatelse fra Ref15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TEM-avbildning av γPNA nanofiber selvmontert i 75% DMSO: vann. (v/v) ved hjelp av formvar støttelag kobber 300 nettinggitter.
(A) TEM-bilder av γPNA nanofiber visualisert under lav forstørrelse (15x). (B) TEM-bilder av γPNA nanofiber visualisert under høy forstørrelse (150x) viser bunting av nanorør langs bredden ved nanoskopiske oppløsninger. (C) TEM-bilder av γPNA nanofiber visualisert under lav forstørrelse (10x) ved hjelp av et Støttelag for Formvar-Silisiummonoksid på et kobbergitter gjør det mulig å avbilde under kraftige prøveforhold. Figuren er endret med tillatelse fra Ref15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ulike morfologier for γPNA-DNA hybrider basert på selektiv erstatning med DNA.
(A) TIRF (5 μm skala bar) og (C) TEM bilder (60x forstørrelse) av selvmontering av γPNA-DNA hybrider ved utskifting sammenhengende γPNA oligomers (p3, p5, p9) med isosequential DNA oligomers (D3, D5 D9) viser nanorør vedta en rett filament morfologi. (B) TIRF (5 μm skala bar) og (D) TEM bilder (25x forstørrelse) av selvmontering av γPNA-DNA hybrider ved utskifting crossover γPNA oligomers (p1, p4, p7) med isosequential DNA oligomers (D1, D4 D7) viser nanofiber vedta en stellate morfologi. Figuren er endret med tillatelse fra Ref15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Ulike morfologier for γPNA nanofiber i varierende konsentrasjoner av SDS.
TIRF-bilder (5 μm skala bar) av selvmontering av γPNA nanofiber i nærvær av SDS ved konsentrasjoner av (A) 5,25 mM og (B) 17,5 mM. Selvmontering i nærvær av SDS-konsentrasjoner mindre enn CMC (8,2 mM) viser tynnere morfologier fra TIRF-bilder basert på fluorescensintensitet. (C) Dette bekreftes av TEM-bilder (100x forstørrelse) av systemet der median bredde for nanofiber ligger i området 8 \\ u201212 nm. Ved konsentrasjoner betydelig over CMC ser γPNA nanorør ut til å danne høyere ordresamlinger gjennom svært nettverksde nanorørstrukturer. Figuren er endret med tillatelse fra Ref15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| MATLAB skript streng utdata "thisSeq" | Straffepoeng "thisScore" | ||
| 'acttcgctaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga ' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatctcgt ttcaggacgaga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgtttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac ' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctcac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggacga ' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctg ' | 0.0704 | ||
Tabell 1: 20 sample algoritmiske resultater for potensiell optimalisering av γPNA sekvens design. 20 eksempel algoritmiske resultater med sekvensutganger i kolonne 1 og deres tilsvarende poengsum i kolonne 2. Gjentatte iterasjoner av skriptet utføres for å oppnå den mest minimale poengsummen.
| γPNA sekvens-ID | Sekvens | Domene 1 komplement | Domene 2 komplement |
| P1 (andre personer) | N-AATAGCGTTCAC-C | p2-domene 1 | p6-Biotin-domene 1 |
| P2 (andre) | N-GCTATTGAGTAA-C | p1-domene 1 | p3-domene 2 |
| P3 (andre personer) | N-GACATCTTACTC-C | p7-domene 2 | p2-domene 2 |
| P4 (andre personer) | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5-domene 1 | p9-domene 1 |
| P5 (andre personer) | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4-domene 1 | p6-Biotin-domene 2 |
| P6-Biotin | N-Biotin-GTGAACCGAGGG-C | p1-domene 2 | p5-domene 2 |
| P7 | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3-domene 1 | p3-domene 1 |
| P8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7-domene 1 | p9-domene 2 |
| S. 19. | N-TCCGCATTCTGT-C | p4-domene 2 | p8-Cy3-domene 2 |
Tabell 2: γPNA sekvens design resultater for nanofiber. Individuelle oligomersekvenser ble generert som angitt i denne tabellen. Understrekede baser indikerer gamma-posisjon modifikasjoner med mini-PEG. Tabellen er endret med tillatelse fra Ref15.
| Temperaturområde | Rampe hastighet |
| 90 °C | Hold i 3 minutter |
| 90-80 °C | 0,1°C/minutt |
| 80-70 °C | 0,1°C/minutt |
| 70-60 °C | 0.1°C/3 minutter |
| 60-50 °C | 0.1°C/3 minutter |
| 50-40 °C | 0.1°C/3 minutter |
| 40-30 °C | 0,1°C/minutt |
| 30-20 °C | 0,1°C/minutt |
| 4 °C (andre) | Hold deg på ubestemt tid |
Tabell 3: Anneal rampeprotokoll for termisk cycler. Tabellen er endret med tillatelse fra Ref15.
| Lagerkonsentrasjon | 75% DMSO: vann (v / v) anneal prøve | 75 % DMF: vann (v/v) glødeprøve | 40% dioksan: vann (v/ v) anneal prøve | Endelig konsentrasjon | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 000 000 000 000 |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v/v) |
| DMF (andre | - | - | 30 μL | - | 75 % (v/v) |
| 1,4-dioksan | - | - | - | 16 μL | 40 % (v/v) |
| deionisert vann | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 eller 60 % (v/v) |
| Totalt volum | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tabell 4: Protokoll for klargjøring av glødepartier av γPNA oligomer under forskjellige løsemiddelforhold.
| DNA-sekvens-ID | Sekvens |
| D1 Leilighet | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 (andre personer) | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 (andre personer) | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tabell 5: Isosequential DNA-sekvenser som erstatning oligomers til γPNA. Tabellen er endret med tillatelse fra Ref15.
| Lagerkonsentrasjon | DNA Contiguous strand erstatninger | DNA Crossover strand erstatninger | Endelig konsentrasjon | |
| γPNA oligomer (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 000 000 000 000 |
| DNA oligomer (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 000 000 000 000 |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| deionisert vann | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v/v) |
| Totalt volum | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabell 6: Protokoll for klargjøring av glødepartier av γPNA-DNA hybrid nanostrukturer i 75% DMSO: H2O ( v/ v) gjennom utskifting av sammenhengende eller crossover γPNA oligomers med isosequential DNA oligomers.
| Lagerkonsentrasjon | SDS-konsentrasjoner under CMC | SDS-konsentrasjoner over CMC | Endelig konsentrasjon | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 000 000 000 000 |
| 6 % SD-er | 6% (t/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| 20% SDS | 20% (t./v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| deionisert vann | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Totalt volum | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabell 7: Protokoll for klargjøring av glødepartier av γPNA nanostrukturer i 75% DMSO: H2O ( v/ v) i nærvær av SDS konsentrasjoner under og over CMC.
Supplerende figur 1: Programmeringsskript PNA3nanofiber.m for å designe oligomersekvenser. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen fokuserer på å tilpasse og forbedre eksisterende nukleinsyre nanoteknologi protokoller mot organiske løsemiddel blandinger. Metodene som er beskrevet her, fokuserer på modifikasjoner og feilsøking i et definert eksperimentelt rom for utvalgte polare aprotiske organiske løsemidler. Det er ennå uutforsket potensial for andre etablerte nukleinsyre nanoteknologi protokoller som skal tilpasses i dette rommet. Dette kan forbedre potensielle applikasjoner gjennom integrering på andre felt som polymer og peptidsyntese som vanligvis utføres i lignende organiske løsemidler25,26. I tillegg fokuserer vi her på kritiske skritt som skal observeres mens vi praktiserer de ovennevnte protokollene.
Under utarbeidelsen av prøven for selvmontering er det viktig å holde volumprosentene av vann på 25% (v / v) for DMSO og DMF forhold. Derfor er det viktig å erkjenne at det organiske løsningsmidlet som brukes til selvmontering, også skal være fra vannfrilagre. Nanofiberstrukturene er hydrofobe og aggregert i økt vanninnhold.
I motsetning til stillas DNA origami tilnærminger som kan skape strukturer av diskrete lengder, gir dagens SST motiv design for γPNA nanofiber og andre tidligere etablerte DNA SST nanorør ikke strukturer av diskrete lengder. Nanorør polymeriserer å oppnå en rekke multimikronlengder (opptil 11 μm). Av samme grunn kan ikke utbyttet forbundet med strukturdannelse kvantifiseres.
Men på grunn av den uladede peptid ryggraden i γPNA, er det ingen avhengigheter på motionbalanse i forhold til strukturdannelse. Bildebuffere trenger derfor ikke å inkludere cations som Mg2 + vanligvis nødvendig for stabilisering av nanostrukturer laget av naturlig forekommende nukleinsyrer.
Til slutt er γPNA nanostrukturbunling og aggregering under forskjellige løsemiddelforhold også avhengig av de enkelte oligomerkonsentrasjonene som ble introdusert under selvmontering. Konsentrasjoner fra 1 μM og høyere av individuelle oligomerer øker tilbøyeligheten til bunting og aggregering og påvirker klar avbildning av nanostrukturer enten under TIRF- eller TEM-avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Science Foundation stipend 1739308, NSF CAREER stipend 1944130 og av Air Force Office of Science Research stipend nummer FA9550-18-1-0199. γPNA sekvenser var en sjenerøs gave fra Dr. Tumul Srivastava av Trucode Gene Repair, Inc. Vi vil gjerne takke Dr. Erik Winfree og Dr. Rizal Hariadi for deres nyttige samtaler om DNA Design Toolbox MATLAB kode. Vi vil også takke Joseph Suhan, Mara Sullivan og Center for Biological Imaging for deres hjelp til innsamling av TEM-data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
