Summary
이 문서는 유기 용매 혼합물에서 감마 변형 펩타이드 핵산 올리고머로부터 나노 구조의 설계 및 자체 조립을 위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
DNA 및 RNA 나노 기술의 현재 전략은 수성 또는 실질적으로 수화 된 매체에서 다양한 핵산 나노 구조의 자체 조립을 가능하게한다. 본 기사에서는 유일무이한 주소 지정, 단일 가닥, 감마 변형 펩타이드 핵산(γPNA) 타일의 자체 조립을 통해 유기 용매 혼합물에서 나노섬유 아키텍처를 시공할 수 있는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 각 단일 가닥 타일(SST)은 각각 6개의 베이스의 2개의 결합된 모듈형 도메인으로 구성된 12기 γPNA 올리고머이다. 각 도메인은 프로그래밍된 보완성을 사용하여 인접한 가닥에 존재하는 상호 무료 도메인에 결합하여 길이의 미크론으로 성장할 수 있는 나노 섬유를 형성할 수 있습니다. SST 모티프는 3-나선 나노 섬유의 형성을 가능하게하기 위해 9 총 올리고머로 만들어집니다. 직경 단분산 구조를 형성하는 유사한 DNA 나노 구조와 는 달리, 이러한 γPNA 시스템은 유기 용매 혼합물에서 자체 조립 중에 폭을 따라 번들되는 나노 섬유를 형성합니다. 따라서 여기에 설명된 자가 조립 프로토콜에는 번들 효과를 줄이기 위해 기존의 계면활성제인 도데실 설페이트 나트륨(SDS)도 포함됩니다.
Introduction
수많은 복잡한나노구조1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12의 수성 또는 실질적으로 수화된 세포의 성공적인 시공은 DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 및 RNA11,12와 같은 자연발생적인 핵산을 사용하여 이루어진 수성 또는 실질적으로 수화된 매체로 나타났다. 그러나, 자연적으로 발생하는 핵산은 이중 백액 형성 변화를 겪거나 유기 용매혼합물(13,14)에서열성 능력을 감소시키는 것이다.
이전에는 감마-펩타이드 핵산(γPNA)15(도 1A)라고불리는 감마 위치 변형 합성 핵산 모방을 이용한 3-나선 나노섬유의 시공을 향한 방법을 보고하였다. 이러한 개발 및 합성 핵산 모방 PNA의 잠재적 인 응용에 대한 필요성은 필드 내에서 논의되었다16,17. DNA나노구조(18,19,20)에제시된 단일 가닥 타일(SST) 전략의 적응을 통해, 9개의 순차적으로 구별되는 γPNA 올리고머는 DMSO 및 DMF와 같은 일부 극성 아프로틱 유기 용매 혼합물에서 3-나선 나노섬유를 형성하도록 설계될 수 있음을 보여주었다. γPNA 올리고머는 사후 등에서공표한 방법에 기초하여 각각의 12베이스 올리고머를 따라 3개의 γ 위치(1, 4 및 8 기저 위치)에서 (R)-diethylene 글리콜(mini-PEG)을 수정하여 상업적으로 주문하였다. 21 이러한 감마 변형은 수정되지 않은 PNA에 비해 γPNA의 더 높은 결합 친화성 및 열 안정성과 관련된 헬리칼 사전 조직을 유발합니다.
본 기사는 우리가 γPNA 기반 나노 구조의 형성에 DNA와 용매 용액 및 대체의 효과를 조사하는 우리의보고 된 작업의적응이다 (15. 이 문서의 목적은 설계에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 γPNA 나노 섬유의 자체 조립 및 특성화를 위해 개발 된 용매 적응 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 따라서, 먼저 합성 핵산을 이용한 나노구조 설계를 위한 일반적인 플랫폼인 모듈식 SST 전략을 소개한다.
PNA 이중제의 헬리칼 피치는 10.5베이스(도1B)당1회전을 겪는 DNA 듀플렉스에 비해 턴당 18개의 베이스로 보고되었다. 따라서, 시연된 γPNA SST의 도메인 길이는 3개의 삼각형 배열 헬리액 사이의 상호 작용을 가능하게 하기 위해 전체 회전의 1/3 또는 120° 회전의 1/3을 수용하기 위해 6개의 베이스로 설정되었다. 또한, 이전 SST 모티브와 달리 각 SST에는 2개의 도메인만 포함되어 있어 3개의 나선 번들(그림1C)을형성하기 위해 랩하는 1차원 리본 모양구조를 효과적으로 만듭니다. 각 12기 γPNA 올리고머는 1, 4 및 8 위치에서 감마 변형되어 전체 SST 모티프에 걸쳐 미니 PEG 그룹의 균일간격 분포를 보장합니다. 또한, 모티프 내에서, 올리고머의 두 가지 유형이 있다: 단일 나선과 나선 에 걸쳐 "크로스 오버"가닥에 존재하는 "연속"가닥(그림 1D). 또한, 올리고머 P8 및 P6는 형광 현미경을 이용한 구조 형성의 검출을 가능하게 하기 위해각각 형광 Cy3(녹색 별) 및 비오틴(yellow oval)으로 표시되어 있다. SST 모티프는 9개의 총 올리고머로 이루어져 각 개별 도메인의 프로그래밍된 보완성을 통해 인접한 올리고머(그림1E)에해당하는 도메인에 대한 3-나선 나노섬유의 형성을 가능하게 한다.
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Protocol
1. γPNA 서열 설계
- Caltech23의 Winfree Lab에서 개발한 DNA 디자인 툴박스22를 시퀀스 설계를 위한 프로그래밍 스크립트가 포함된 폴더에 다운로드합니다.
- 해당 시퀀스 디자인 폴더 내에서 파일 확장 ".m"과 호환되는 4세대 프로그래밍 언어를 열고 다음 명령을 사용하여 이전에 다운로드한 "DNAdesign" 폴더를 경로에 추가합니다.
>> 애드패스 DNADESIGN - 그런 다음 다음 명령을 사용하여 "PNA3nanofiber.m"라는 다음 스크립트를 실행합니다(보충 도 1참조).
>> PNA3nanofiber - 이 스크립트를 실행하여 "thisSeqs"와 "thisScore"라는 변수를 만듭니다. 변수 "thisSeqs"는 설계된 올리고머의 시퀀스를 포함하고, "thisScore"는 페널티 점수입니다.
- 스크립트를 여러 번 실행하여 가장 최소한의 점수를 얻습니다. 이러한 실행 20개 샘플이 표 1에표시됩니다.
- 지정된 SST 구조 모티프에 대해 생성된 서열의 각 도메인의 원하는 왓슨 크릭 상호 보완성을 수동으로 확인합니다. 3-나선 나노 섬유 구조에 대한 서열 사양은 표 2에도시된다.
- 생성된 시퀀스에 대해 다음을 확인합니다.
- 4개의 연속 C 및 G 베이스를 사용하지 마십시오.
- 형광염염료 및 비오틴 분자를 사용하여 N 단말 기능화를 위한 특정 서열을 수동으로 선택하여 형광 현미경 연구를 가능하게 합니다.
- Sahu 등외에서설명한 단일 좌초 올리고머에서 사전 조직된 백본에 최소 3개의 미니 PEG 감마 변형을 포함한다. 21
2. γPNA 재고 가닥의 준비
- 상용 제조업체로부터 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제를 통해 50nmol 스케일 합성에서 지정된 서열의 γPNA 성분 가닥을 획득한다.
- 각 가닥을 300 μM 농도로 재보선다. 재중단 된 가닥을 -20 °C 냉동고에 실험에 필요할 때까지 최대 몇 개월까지 보관하십시오.
3. γPNA 올리고머 잠수함의 용융 곡선 연구
- 1x 인산염 완충식염(PBS) 또는 디메틸설프산화물(DMSO)과 같은 바람직한 극성 유기 용매와 같은 수성 완충제에서 용융 곡선 연구를 실행하여 보완적인2-올리고머 및 3-올리고머 서브셋의 다양한 조합에 대한 용융 온도 범위를 얻을 수 있습니다.
참고: DMF의 열용 곡선 >50%는 상부 기준선을 잃기 시작하고 실험에 필요한 파장에서 DMF의 높은 흡수력 으로 인해 부분적으로 심한 교란을 보이기 시작합니다. 이것은 문학24에서주목되는 현상이다. 그러나 이러한 용매 조건에서 가닥 농도당 5 μM에서 용융 곡선을 얻을 수 있다.- 각 올리고머의 300 μM 스톡에서 16.7 μL을 알리쿼트 16.7 μL로 만들고 최종 부피는 1x PBS 또는 100% (v/v) DMSO 또는 100% (v/v) DMF에서 올리고머당 5μM 최종 농도를 효과적으로 획득한다. 이 올리고머 서브셋 혼합물을 1cm 광학 경로, 석영 큐벳으로 옮킨다.
- 프로그래밍 가능한 온도 블록을 갖춘 분광계에서 가변 온도 UV-Vis 실험을 수행합니다.
- 냉각(annealing) 및 가열(용융) 사이클에 대해 15\u201290°C의 온도 범위에서 용융 곡선에 대한 데이터 포인트를 0.5\u20121°C/min의 속도로 수집합니다. 냉각 하기 전에 90°C에서 10 분 동안 샘플을 유지 하 고 가열 하기 전에 15°C에서. 가열 곡선의 첫 번째 유도체의 피크에서 용융 온도(Tm)를결정합니다.
- 2-올리고머 잠수함의 용융 온도 범위가 모든 용매 케이스에서 35°C 이상인지 확인합니다. 또한, 상응하는 2-올리고머 서브셋에 추가 가닥을 포함하는 해당 3-올리고머 서브세트가 공동 작동성 증가로 인해Tm이 상당히 증가했는지 확인합니다.
참고: 이것은 다중 올리고머의 단일 냄비 자체 조립이 합리적인 열 안정성으로 원하는 나노 구조로 협력적으로 접을 수 있는지 확인합니다.
4. 여러 개의 뚜렷한 γPNA 올리고머를 위한 자체 조립 프로토콜
참고: γPNA 나노 구조에 대한 자체 조립 열 램프 프로토콜을 고안하려면, 느린 램프 어닐링이 바람직하다.
- 올리고머 서열이 생성된 경우, 90~20°C의 열 사이클러 냉각에서 22.5h의 샘플을 음결한다. 전형적으로, 2-올리고머 및 3-올리고머 γPNA 서브세트에 대해 수득된 용융 온도는 상이한 용매 조건에 대해 40\u201270°C의 범위에 속한다.
- 다음과 같이 열 사이클러 프로그램: 5분 동안 90°C에서, 0.1°C/min의 일정한 속도로 90°C에서 70°C로, 0.1°C/3분의 속도로 70~40°C까지 경사로, 0.1°C/3분의 속도로 경사로, 0.1°C/min의 속도로 40~20°C로 경사로를 40~20°C로 내려가고 4°C에서 4°C로 경사로를 잡는다(3°C). 샘플은 특성화 전에 12\u201224 h에 대해 4°C로 저장할 수 있습니다.
참고: 나노 섬유 시스템의 2- 및 3- 올리고머 하위 집합은 1배 PBS로 형성될 수 있지만, 전체 미크론 규모의 나노 섬유는 1배 PBS로 집계됩니다. 따라서, 용매 조건은 감마 수정의 종류 및 밀도뿐만 아니라 형성되는 구조의 규모와 크기에 따라 최적화되어야한다. - 미크론 스케일 롱 3-나선 나노 섬유의 경우, 75% DMSO: H2O(v/v), 75% DMF: H2O(v/v), 40% 1,4-Dioxane: H2O(v/v) 용매 최적화 연구15에기초하여 음막 배치 샘플을 준비한다.
- 다음과 같이 막음 배치를 준비합니다(표 4참조). 먼저, 주주식으로부터 0.67 μL을 알리싱하고 탈온수를 사용하여 10μl로 부피를 만들어 각 올리고머에 대해 300 μM 주중 20μM 농도에서 10μL 하위 주를 준비한다.
- 각 올리고머에 대한 20 μM 하위 스톡에서 Aliquot 1 μL을 200 μL PCR 튜브에 추가합니다. 이는 9개의 올리고머에 대해 총 9μL의 부피를 차지합니다.
- 75% DMSO에 대한 무수DMSO/DMF 의 30 μL과 75% DMF 케이스에 1μL의 추가된 분해수를 추가하여 각 올리고머가 500nM 최종 농도에서 40 μL의 최종 부피를 만듭니다. 1,4-Dioxane의 16 μL을 추가하고 40 % 디옥산 용매 조건에 대한 40 μL에 탈이온 된 물로 볼륨을 합니다.
- 4.2 단계에서 언급된 프로토콜을 사용하여 막막 배치를 열 사이클러 및 절전 막에 로드합니다.
5. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 이미징
- 빈 파이펫 팁 상자에서 습도 챔버를 준비합니다. 다음과 같이 설명된 시료 유량 채널의 건조를 방지하기 위해 약 5mL의 물로 상자를 채우십시오(그림 3참조).
- 현미경 슬라이드, 양면 테이프 스트립 2개, 니트로셀룰로오스 코팅 커버슬립으로 유동 챔버를 준비합니다. 니트로셀룰로오스로 커버슬립을 코팅하려면 커버슬립을 아밀 아세테이트와 공기 건조에서 0.1% 콜로디온이 들어 있는 비커에 담급드세요.
- 이소아밀 아세테이트 용매와 아밀 아세테이트에서 20배 의 희석을 시판하여 20배 희석하여 니트로셀룰로오스 용액을 준비한다.
- 비오틴-BSA 1 mg의 바이오틴-BSA를 계량하고 1mL의 1x PBS로 용해시킴으로써 바이오티클화된 소 세럼 알부민(Biotin-BSA) 용액을 준비한다. 1 mg/mL 비오틴-BSA의 플로우 15 μL을 1x PBS 버퍼로 흐름 채널을 비스듬히 배치합니다. 가습 챔버에서 실온에서 2-4 분 동안 유동 채널을 배양합니다.
- 1x PBS의 1mL에서 1 mg의 BSA를 용해시켜 세척 버퍼를 준비합니다. 세척 버퍼의 15 μL을 흐르면 과도한 비오틴-BSA를 세척합니다. 표면을 통과하려면 가습 챔버에서 실온에서 2-4 분 동안 유동 채널을 배양하십시오.
- 스트렙타비딘 0.5 mg의 스트렙타비딘과 1 mg의 BSA를 측정한 다음 1x PBS1mL를 사용하여 용해시킴으로써 스트렙타비딘 용액을 준비하십시오. 1 mg/mL BSA를 함유하는 1x PBS에서 0.5 mg/mL 스트렙타비딘의 플로우 15 μL. 가습 챔버에서 실온에서 2-4 분 동안 유동 채널을 배양합니다. 워시 버퍼의 15 μL을 플로우하여 바운드되지 않은 스트렙타비딘을 씻어내도록 합니다.
- 75% DMSO, 75% DMF 또는 40% 1,4-Dioxane 조건에서 가닥 당 500 nM 농도에서 γPNA 올리고머의 이전에 어닐링된 배치의 플로우 15 μL. 가습 챔버에서 실온에서 2-4 분 동안 유동 채널을 배양합니다.
- DMSO의 트룰록스 10m 스톡에서 10배 나 희석하여 바람직한 용매 조건에서 1m 트롤록스를 준비한다(트룰록2.5 mg을 측정하고 DMSO 1mL에 용해). 나노 구조와 동일한 용매 조성물을 갖는 1m 트룰록의 15 μL로 유량 채널에서 언바운드 나노 구조를 세척한다.
참고: 유동 채널의 >50% DMSO 함량은 TIRF 동안 용매 상태의 굴절의 다른 인덱스로 인해 사소한 신호 장애를 생성할 것이고 이는 일반적으로 커버슬립-워터 TIRF 각도에 대해 보정됩니다. 이것은 10m 트롤록스를 탈온수를 사용하여 10m 트룰록10배를 희석하여 만든 1m 트롤록스로 세척하여 정류할 수 있습니다. 이 기술은 더 명확한 이미지를 제공하지만 유동 채널에서 2상 마이크로 버블을 생성하기 때문에 형성이 발생했는지 여부를 평가하는 데만 유용합니다. 그 결과, 도 4D에도시된 바와 같이 2상계의 인터페이스에서 나노구조가 보일 수 있다. - 60배 오일 침지 목표와 1.5배 확대기를 사용하여 TIRF 이미징을 장착한 형광 현미경을 사용하여 플로우 채널을 슬라이드 홀더 및 이미지로 전송합니다. Cy3 채널을 모니터링하여 60x 또는 90배율로 유동 채널을 스캔합니다(그림 4참조).
6. 전송 전자 현미경 검사법 (TEM) 이미징
- 50mL의 증류수에 0.5g의 우라일 아세테이트를 계량하여 1%의 수성 우라일 아세테이트 스테인 용액을 준비합니다. 주사기에 부착된 0.2 μm 필터를 사용하여 1% 수성 우라일 아세테이트 얼룩용 액액을 걸게 한다.
참고: 또는 상업용 제조업체에서 2%의 수성 우라일 아세테이트를 구입할 수 있습니다. - 300 메쉬 크기의 코퍼 그리드를 코팅한 상용 포름바 서포트 레이어를 구입하십시오.
참고: 폼바 지지층은 2분 이상 DMSO와 같은 용매에 의해 용해될 수 있습니다. 더 긴 시료 인큐베이션의 경우, 구리 그리드에서 실리콘 일산화탄소로 안정화된 시판되는 폼바는 그리드가 탄소 코팅 그리드보다 더 수유성일 수 있으며 도 5C에도시된 바와 같이 활발한 시료 조건 및 전자 빔을 견딜 수 있다. - 15s에 대한 그리드에 샘플의 파이펫 4 μL. 필터 용지를 사용하여 측면에서 그리드와 접촉하는 필터 용지를 가져와 서 샘플을 심지합니다.
- 얼룩 용액의 4 μL을 그리드에 5s로 즉시 추가합니다.
- 이전과 같이 얼룩을 떨어 내고 그리드가 건조했는지 확인하기 위해 1\u20122 분 동안 그리드에 필터 용지를 잡습니다. 샘플은 일반적으로 염색 후 1\u20122 h 내에서 이미지되어야 합니다. 또는 그리드가 완전히 건조하도록 보장되면 이미징 전에 최대 3일 동안 TEM 그리드 저장 상자에 그리드를 저장할 수 있습니다.
- 그리드를 TEM 시편 홀더 및 이미지로 전송하여 80kV에서 작동되는 전송 전자 현미경을 사용하여 10K에서 150K까지 배율(그림 5참조).
7. DNA를 가진 선택적 교체를 기반으로 γPNA-DNA 하이브리드를 위한 다른 형태
- 표준 탈염을 사용하여 25nmol 스케일에서 합성된 상용 올리고뉴클레오티드 제조업체로부터 지정된 서열의 DNA 올리고머(표 5참조)를 획득한다. 20 μM 재고 농도에서 RNase 가없는 탈이온 수를 사용하여 이러한 DNA 서열을 다시 중단하십시오.
- DNA를 가진 인접한 γPNA 가닥 교체를 위해, 서열 D3, D5 및 D9는 가닥 p3, p5 및 p9를 대체할 수 있습니다. 유사하게, DNA를 가진 크로스오버 γPNA 가닥 교체를 위해, 서열 D1, D4 및 D7은 가닥 p1, p4 및 p7을 대체할 수 있다.
- 각 γPNA 또는 DNA 올리고머에 대한 20 μM 하위 주로부터 의 1 μL을 알리쿼트하고 2.7 단계와 같이 200 μL PCR 튜브에 추가합니다. 무수DMSO 30 μL과 RNase 가 없는 탈이온화된 물 1μL을 추가하여 최종 부피를 40 μL로 만듭니다(표 6참조).
- 4.2 단계에서 언급된 프로토콜을 사용하여 막막 배치를 열 사이클러 및 절전 막에 로드합니다.
- 특징은 TIRF 프로토콜을 사용하여 제5항에서 단계 또는 섹션 6에 언급된 TEM 이미징 프로토콜을 사용하는 것을 특징으로 한다(도 6참조).
8. SDS의 다양한 농도에서 γPNA 나노 섬유에 대한 다른 형태
- SDS 20 mg을 측정하고 100 μL의 탈수로 용해하여 20% (wt/v) SDS 주주식을 준비합니다.
- 20% SDS 스톡에서 3 μL을 알리싱하고 탈이온화된 물을 사용하여 10 μL로 부피를 만들어 6%(wt/v) SDS 하위 재고를 준비합니다.
- 다음과 같이 5.25 mM 및 17.5 mM SDS의 최종 농도에서 γPNA 올리고머를 멸폐한다. 각 γPNA 올리고머에 대한 20 μM 하위 주로부터 의 1 μL을 알리쿼트 1 μL하고 2.7 단계에서와 같이 200 μL PCR 튜브에 추가합니다. 무수DMSO 30μL과 6% 및 20% SDS의 1 μL을 추가하여 최종 부피를 40 μL로 만들어 각각 5.25mMM 및 17.5mMM의 SDS 최종 농도를 달성합니다(표 7참조).
- 4.2 단계에서 언급된 프로토콜을 사용하여 다양한 SDS 농도의 막음 배치를 열 사이클러 및 막에 로드합니다.
- TIRF 프로토콜을 사용하여 제5항에서 단계 또는 섹션 6에 언급된 TEM 이미징 프로토콜을 사용하는 SDS의 존재에서 γPNA 나노 구조를 특성화(그림 7참조).
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Representative Results
위의 섹션에서 논의된 프로토콜은 다중, 뚜렷한 γPNA 올리고머를 사용하여 자체 조립 된 나노 섬유 구조의 견고한 생성을 위한 DNA 나노 섬유에서 적응된 SST 모티프의 디자인을 설명합니다. 이 섹션에서는 설명된 프로토콜의 성공적인 재현에서 얻은 데이터의 해석을 설명합니다.
75% DMSO에서 아닐래온 γPNA 올리고머의 TIRF 영상에 대한 제5항에 기재된 프로토콜에 따라:H2O(v/v) 가장 쉽게 도 4A에도시된 바와 같이 미세한 관측하에서 잘 조직된 아키텍처의 증거를 제공한다. 75% DMF: H2O(v/v) 용매 상태는 spicule 모양 또는 바늘 모양의 나노 구조(도4B)로생성되며, 우리의 경험에서 40% 1,4 디옥산: H2O(v/v) 상태는 TIRF 현미경 검사법을 사용하여 볼 때 필라멘트 나노 구조의 희소한 장식을 나타낸다(그림4C). 더욱이, 75% DMSO에서 형성된 γPNA 나노튜브의 샘플:H2O(v/v)는 6항에 언급된 단계 다음 단계 다음 TEM 이미징 동안 높은 배율 또는 나노스코프 해상도에서 나노섬유의 번딩을 시연한다(그림5). 나노구조의 폭의 정량적 분석은 80nm15를초과하는 최대 값을 가진 16.3nm의 중앙값을 나타냈다.
DNA를 이용한 추가 기능을 가능하게 하기 위해 유기 용매 혼합물에서 γPNA-DNA 하이브리드 나노구조를 생성하는 방식을 고안하기 위해, SST 모티브에서 올리고머 위치를 등생 DNA 올리고머로 대체하는 것이 중요하다. 여기에 기재된 나노튜브 구조의 경우 7절에 언급된 적응단계, 인접한 γPNA 올리고머를 대체하는 이소생성 DNA 올리고머는 직선 필라멘트 구조를 형성하는 반면, 크로스오버 γPNA 올리고머의 교체는 TIRF 및 TEM 이미징을 사용하여 볼 때 stellate 구조를 형성한다(도6). 인접한 DNA 올리고머로 대체된 나노 구조의 폭의 정량적 분석은 19nm15주위의 중앙값을 나타냈다.
마지막으로, 8절에서 단계를 조정하면, γPNA 나노섬유는 중요한 미셀 농도(CMC, 8.2 mMM) 이하의 SDS 농도가 있는 상황에서 감소된 번들링과 일치하는 얇은 형태를 채택한다. γPNA 나노섬유는 또한 TIRF이미징(그림 7)을사용하여 볼 때 CMC에 비해 높은 SDS 농도에서 고도로 네트워크된 형태를 채택한다. SDS의 존재하에 자체 조립된 γPNA 올리고머의 TEM 이미징은 5.25 mM SDS 조건이 8\u201212 nm에 이르는 폭으로 구조 번들링에서 가장 실질적인 감소를나타낸다(그림 7C).
그림 1: 펩티드 핵산 올리고머는 복잡한 나노 구조를 위한 빌딩 블록으로 한다.
(A)DNA(PNA), PNA 및 MP 함유 γPNA 단위의 화학적 구조. (그림이 Ref21의허가하에 재인쇄되었습니다.) (B)PNA-PNA 헬리액은 DNA-DNA 헬리액보다 덜 왜곡되어 10.5대신 턴당 18개의 염기분이 있다. (C)이 3-나선 구조 단일 좌초 타일 (SST) 모티프는 각각 2 개의 6 베이스 도메인을 갖는 9 개의 뚜렷한 12 베이스 길이γPNA 올리고머로 구성됩니다. (D)구조 내에 는 단일 나선과 나선에 걸친 "크로스 오버"가닥에 존재하는 "연속"가닥의 두 가지 유형이 있습니다. (E)이 18기 길이의 구조 모티프는 중합하여 미크로른 스케일 필라멘트를 형성할 수 있다. 패널 B, C 및 E는 Ref15의허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다른 용매 조건에서 선택 γPNA 올리고머의 대표적인 용융 곡선.
6기 도메인을 나타내는 2-올리고머(p4, p5) 서브세트는 1x PBS에서 합리적인 열 안정성(블랙 커브)으로 결합할 수 있다. 3-올리고머(p4, p5, p6) 서브세트는 1x PBS(블루 커브)에서 의 약품으로 인한 열 안정성이 증가하고, 용매가 DMF(적점 곡선)와 같은 유기 용매로 변경될 때Tm에 대하여 거의 또는 전혀 불안정하지 않음을 나타낸다. 그림은 Ref15의허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 샘플 TIRF 이미징용 유체 흐름 채널용 플로우 차트입니다.
유량 채널 조립 후 γPNA 나노 섬유의 TIRF 이미징에 대한 샘플 준비에 관련된 단계를 나타내는 단계별 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: TIRF 현미경 이미징의 γPNA 나노 섬유자체 조립은 상이한 용매 조건에서 자체 조립.
γPNA 나노섬유는 TIRF 현미경검사(5 μm scale bar)를 이용하여 시각화한 반면, γPNA 올리고머가 자체 조립될 때 Cy3 채널을 모니터링하면서(A)75% DMSO: 물(v/v),(B)75% DMF: 물(v/v) 및(C)40% 디옥산(v/v). (D)γPNA 나노섬유가 75% DMSO로 자체 조립될 때: 유량채널에 결합된 물(v/v)은 1mM 트로록스로 세척되며, DMSO-물 형태의 2상 마이크로버블은 마이크로버블의 인터페이스를 따라 정렬되는 나노구조와 함께 한다. 그림은 Ref15의허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 75% DMSO: 물에 자체 조립된 γPNA 나노섬유의 TEM 이미징. (v/v) 폼바 지지층 구리 300 메쉬 그리드를 사용합니다.
(A)낮은 배율(15배)으로 시각화된 γPNA 나노섬유의 TEM 영상. (B)높은 배율(150x)에서 시각화된 γPNA 나노섬유의 TEM 이미지는 나노스코픽 해상도에서 폭을 따라 나노튜브를 묶는 것을 나타낸다. (C)구리 그리드상에 폼바-실리콘 일산화탄소 지지층을 이용하여 낮은 배율(10배)으로 시각화된 γPNA 나노섬유의 TEM 이미지는 활발한 시편 조건에서 이미징을 가능하게 한다. 그림은 Ref15의허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: DNA를 가진 선택적 교체를 기반으로 γPNA-DNA 하이브리드를 위한 상이한 형태학.
(A)TIRF(5 μm 스케일 바) 및(C)TEM 이미지(60x 배율)는 인접한 γPNA-DNA 하이브리드를 교체할 때 이소결과 DNA 올리고머(D3, D5 D9)를 이소성 DNA 올리고머(D3, D5 D9)로 대체하는 경우 나노튜브를 직선 필라멘트로를 채택하는 것을 보여준다. (B)TIRF(5 μm 스케일 바) 및(D)TEM 이미지(25배배)는 크로스오버 γPNA 올리고머(p1, p4, p7)를 이소결과 DNA 올리고머(D1, D4 D7)로 교체할 때 γPNA-DNA 하이브리드의 자체 조립의 TEM 이미지(25배배율)를 선보이는 나노섬유를 선보이고 있다. 그림은 Ref15의허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 다양한 SDS 농도에서 γPNA 나노섬유에 대한 상이한 형태.
(A)5.25 mMM 및(B)17.5 mMM의 농도에서 SDS의 존재시 γPNA 나노 섬유의 자체 조립의 TIRF 이미지 (5 μm 스케일 바). CMC(8.2 mMM)보다 적은 SDS 농도가 있는 자가 조립은 형광 강도에 기초한 TIRF 이미지로부터 더 얇은 형태를 나타낸다. (C)나노섬유의 중앙값 폭이 8\u201212 nm 범위에 있는 시스템의 TEM 이미지(100배율)에 의해 확인된다. CMC보다 현저히 높은 농도에서 γPNA 나노튜브는 고도로 네트워크된 나노튜브 구조를 통해 더 높은 순서의 어셈블리를 형성하는 것으로 보인다. 그림은 Ref15의허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| MATLAB 스크립트 문자열 출력 "thisSeq" | 페널티 점수 "이 점수" | ||
| 'acttcgctaaa aacgaacacc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctattatg ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattcca cggtcgttggaa gagatacaaagtg tatctcatttac atagcagtaaatat' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataaa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtgacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata ttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaaa atctgttcctggcggtaaaaa atctgttccttggcggtaaaaa atctgttcc ggcgggtaaaaa atctgttccggttggcggtaaa' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagtaccagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaagcagtcc gcacgggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccctgt ccagagacagc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatctcgt ttcaggacgaga cttgcgtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtggatgaa ttcccgtccaaa cgggaacctta ccgcagtaaggt' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaaa gatagattagtc cctcg gttggggcg ccgaggtcaaac gcataagtttttga' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtgggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtcc tgttcagggcac' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccccataaatag' | 0.072 | ||
| 'actccaatt tggagttgtt ctacccaacaaa atagcgaacggc atagatgccgtt ctggggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccaac ttatgtgcttca ttgccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaaaaga ctactgacataaa cagtagacgatg cgctcgcatcgt' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatccctct agcgttagaagg cataaacccag tttatgcctcac agacaggtgag ctacggacgct ccgtagtcgtcc ctgggggagga' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaaagtg ctccccccccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattg ccgcctcaaat' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgtgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtgggggct tacaagagccga ggcgttggat aacgccctatct cagtaaatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaag gacacggggatgg catagtccatcc tgaggcgtaaaagt gcctcacagcga ctttagttagcgctg ' | 0.0704 | ||
표 1: γPNA 서열 설계의 잠재적 최적화를 위한 20개의 샘플 알고리즘 결과. 20개의 샘플 알고리즘 결과는 열 1의 시퀀스 출력과 열 2의 해당 점수로 생성됩니다. 스크립트의 반복된 반복은 가장 최소한의 점수를 얻기 위해 수행됩니다.
| γPNA 시퀀스 ID | 시퀀스 | 도메인 1 보완 | 도메인 2 보완 |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | p2 도메인 1 | p6-비오틴 도메인 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | p1 도메인 1 | p3 도메인 2 |
| p3 | N-GACATCTTACTC-C | p7 도메인 2 | p2 도메인 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5 도메인 1 | p9 도메인 1 |
| p5 | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4 도메인 1 | p6-비오틴 도메인 2 |
| p6-비오틴 | N-비오틴-GTGAACCGAGGG-C | p1 도메인 2 | p5 도메인 2 |
| p7 | N-AGTTGATGTC-C | p8-Cy3 도메인 1 | p3 도메인 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 도메인 1 | p9 도메인 2 |
| p9 | N-TCCGCATTCTGT-C | p4 도메인 2 | p8-Cy3 도메인 2 |
표 2: 나노섬유에 대한 γPNA 서열 설계 결과. 개별 올리고머 시퀀스는 이 표에 표시된 대로 생성되었다. 밑줄이 밑줄이 있는 베이스는 미니 PEG로 감마 위치 수정을 나타냅니다. 표15의허가하에 표가 수정되었습니다.
| 온도 범위 | 램프 속도 |
| 90°C | 3분 간 기다립니다. |
| 90-80°C | 분0.1°C |
| 80-70°C | 분0.1°C |
| 70-60°C | 0.1°C/3분 |
| 60-50 °C | 0.1°C/3분 |
| 50-40 °C | 0.1°C/3분 |
| 40-30°C | 분0.1°C |
| 30-20 °C | 분0.1°C |
| 4°C | 무기한 보류 |
표 3: 열 사이클러용 절전 램프 프로토콜. 표15의허가하에 표가 수정되었습니다.
| 재고 농도 | 75% DMSO: 물(v/v) 음막 샘플 | 75% DMF: 물(v/v) 멸음 샘플 | 40% 다이옥산: 물(v/v) 담장 샘플 | 최종 농도 | |
| γPNA 올리고머 (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v / v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | 75 % (v / v) |
| 1,4-디옥산 | - | - | - | 16 μL | 40 % (v / v) |
| 탈이온 수 | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 또는 60% (v/v) |
| 총 볼륨 | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
표 4: 다른 용매 조건에서 γPNA 올리고머의 탄음 배치를 준비하기위한 프로토콜.
| DNA 서열 ID | 시퀀스 |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
표 5: γPNA에 대체 올리고머로 이소 결과DNA 서열. 표15의허가하에 표가 수정되었습니다.
| 재고 농도 | DNA 인접 가닥 교체 | DNA 크로스오버 가닥 교체 | 최종 농도 | |
| γPNA 올리고머 (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| DNA 올리고머 (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v / v) |
| 탈이온 수 | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v / v) |
| 총 볼륨 | - | 40 μL | 40 μL | - |
표 6: γPNA-DNA 하이브리드 나노 구조의 멸폐 배치를 75% DMSO: H2O (v/v)에서연속 또는 교차교차 γPNA 올리고머의 이소성 DNA 올리고머를 대체하는 프로토콜.
| 재고 농도 | CMC 이하의 SDS 농도 | CMC 이상의 SDS 농도 | 최종 농도 | |
| γPNA 올리고머 (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5.25 mM |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 μL | 17.5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v / v) |
| 탈이온 수 | - | - | - | 25 % (v / v) |
| 총 볼륨 | - | 40 μL | 40 μL | - |
표 7: CMC 이하의 SDS 농도가 있는 경우 75% DMSO: H2 O(v/v)에서 γPNA 나노 구조의 막음 배치를 준비하기 위한 프로토콜.
보충 도 1: 프로그래밍 스크립트 PNA3nanofiber.m 올리고머 시퀀스를 설계합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서는 기존 핵산 나노 기술 프로토콜을 유기 용매 혼합물에 적응하고 개선하는 데 중점을 둡니다. 여기에 설명된 방법은 선택극성 아프로틱 유기 용매의 정의된 실험 공간 내에서 수정 및 문제 해결에 중점을 둡니다. 다른 확립 된 핵산 나노 기술 프로토콜이 공간 내에서 적응 할 수있는 아직 미개척 잠재력이 있다. 이는 일반적으로 유사한 유기용매(25,26)에서수행되는 폴리머 및 펩티드 합성과 같은 다른 분야에서의 통합을 통해 잠재적인 응용 분야를 향상시킬 수 있다. 또한 위에서 언급한 프로토콜을 연습하는 동안 관찰해야 할 중요한 단계에 중점을 둡니다.
자체 조립을 위한 시료를 준비하는 동안 DMSO 및 DMF 조건에 대해 물의 부피 비율을 25%(v/v)로 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 자체 조립에 사용되는 유기 용매도 무수주식으로부터 이어야 한다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 나노섬유 구조는 증가된 수분 함량에서 소수성 및 골재이다.
이산 길이의 구조를 만들 수 있는 비계 DNA 종이 접기 접근법과는 달리, γPNA 나노섬유 및 기타 이전에 확립된 DNA SST 나노튜브를 위한 현재 SST 모티브 설계는 이산 길이의 구조를 산출하지 않는다. 나노튜브는 다양한 다중 미크로른 길이(최대 11μm)를 달성합니다. 같은 이유로 구조 형성과 관련된 수율을 정량화할 수 없습니다.
그러나, γPNA의 미전하 펩타이드 백본으로 인해, 구조 형성과 관련하여 카운터 이온 균형에 대한 의존도는 없다. 따라서 이미징 버퍼는 자연발생적인 핵산으로 만들어진 나노 구조의 안정화에 일반적으로 필요한 Mg2+와 같은 양이온을 포함할 필요가 없습니다.
마지막으로, 서로 다른 용매 조건에서 γPNA 나노구조 동고 및 응집은 자가 조립 중에 도입된 개별 올리고머 농도에 의존한다. 1 μM 및 개별 올리고머의 더 높은 농도는 번들 및 집계에 대한 성향을 증가시키고 TIRF 또는 TEM 이미징 동안 나노 구조의 명확한 이미징에 영향을 미칩니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 1739308, NSF 경력 보조금 1944130 및 공군 과학 연구 보조금 번호 FA9550-18-1-0199에 의해 부분적으로 지원되었습니다. γPNA 서열은 트루코드 유전자 수리, Inc.의 투물 스리바스타바 박사로부터 받은 관대한 선물이었습니다. 우리는 DNA 디자인 툴박스 MATLAB 코드에 대한 그들의 유용한 대화에 대한 에릭 윈프리 박사와 리잘 하리아디 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 조셉 수한, 마라 설리반 과 생물학적 이미징 센터가 TEM 데이터 수집에 도움을 준 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
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