Summary
Dit artikel bevat protocollen voor het ontwerp en de zelfassemblage van nanostructuren van gamma-gemodificeerde peptide nucleïnezuur oligomeren in organische oplosmiddelmengsels.
Abstract
De huidige strategieën in DNA en RNA nanotechnologie maken het mogelijk om een verscheidenheid aan nucleïnezuur nanostructuren in waterige of substantieel gehydrateerde media te assembleren. In dit artikel beschrijven we gedetailleerde protocollen die de bouw van nanovezelarchitecturen in organische oplosmiddelmengsels mogelijk maken door de zelfassemblage van uniek adresseerbare, enkelstrengse, gamma-gemodificeerde peptidenacleïnezuur (γPNA) tegels. Elke single-stranded tile (SST) is een 12-base γPNA oligomer bestaande uit twee samengevoegde modulaire domeinen van elk 6 basissen. Elk domein kan binden aan een wederzijds gratis domein aanwezig op naburige strengen met behulp van geprogrammeerde complementariteit om nanovezels te vormen die kunnen groeien tot micron in lengte. Het SST-motief is gemaakt van 9 totale oligomeren om de vorming van 3-helix nanovezels mogelijk te maken. In tegenstelling tot analoge DNA-nanostructuren, die diameter-monodispersestructuren vormen, vormen deze γPNA-systemen nanovezels die tijdens zelfassemblage in organische oplosmiddelmengsels langs hun breedtes bundelen. Zelfassemblageprotocollen die hier worden beschreven, omvatten daarom ook een conventionele oppervlakteactieve werking, Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS), om bundelingseffecten te verminderen.
Introduction
Succesvolle bouw van talrijke complexe nanostructuren1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in waterige of substantieel gehydrateerde media gemaakt met behulp van nucleïnezuren zoals DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 en RNA11,12 zijn in eerdere werken getoond. Natuurlijk voorkomende nucleïnezuren ondergaan echter duplexsyletische conformatieveranderingen of hebben verminderde thermische stabiliteiten in organische oplosmiddelmengsels13,14.
Eerder heeft ons lab gemeld een methode voor de bouw van 3-helix nanovezels met behulp van gamma-positie gemodificeerde synthetische nucleïnezuur bootst genaamd gamma-peptide nucleïnezuren (γPNA)15 (Figuur 1A). De noodzaak van een dergelijke ontwikkeling en potentiële toepassingen van het synthetische nucleïnezuur bootsen PNA na in het veld16,17. We hebben aangetoond, door middel van een aanpassing van de single-stranded tile (SST) strategie gepresenteerd voor DNA nanostructuren18,19,20, dat 9 sequentieel onderscheiden γPNA oligomers kunnen worden ontworpen om 3-helix nanofibers vormen in geselecteerde polaire aprotische organische oplosmiddel mengsels zoals DMSO en DMF. De γPNA oligomers werden commercieel besteld met wijzigingen van (R)-diethyleenglycol (mini-PEG) op drie γ-posities (1, 4 en 8 basisposities) langs elke 12-base oligomer op basis van methoden gepubliceerd door Sahu et al.. 21 Deze gamma-wijzigingen veroorzaken de spiraalvormige pre-organisatie die wordt geassocieerd met de hogere bindende affiniteit en thermische stabiliteit van γPNA ten opzichte van ongewijzigde PNA.
Dit artikel is een aanpassing van ons gerapporteerde werk waarin we de effecten van oplosmiddeloplossing en substitutie met DNA op de vorming van γPNA-gebaseerde nanostructuren15onderzoeken. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde beschrijvingen van het ontwerp te geven, evenals gedetailleerde protocollen voor oplosmiddel-aangepaste methoden die zijn ontwikkeld voor de zelfassemblage en karakterisering van γPNA nanofiber. Zo introduceren we eerst de modulaire SST-strategie, een algemeen platform voor nanostructuurontwerp met behulp van het synthetische nucleïnezuur nabootst PNA.
De spiraalvormige toonhoogte voor PNA duplexen is gemeld te zijn 18 bases per beurt in vergelijking met DNA duplexen, die ondergaan een beurt per 10,5 bases (Figuur 1B). Daarom werd de domeinlengte van de aangetoonde γPNA SST's vastgesteld op 6 basissen voor een derde van een volledige draai of 120° rotatie om interactie tussen drie driehoekige arrayed helices mogelijk te maken. Ook, in tegenstelling tot eerdere SST motieven, elke SST bevat slechts 2 domeinen, effectief het creëren van een 1-dimensionale lint-achtige structuur die wraps tot een drie-helix bundel(Figuur 1C) vormen. Elke 12-base γPNA oligomer is gamma aangepast op de 1, 4 en 8 posities om een gelijkmatig verdeelde verdeling van mini-PEG groepen over het totale SST-motief te garanderen. Bovendien, binnen het motief, zijn er twee soorten oligomers: "aaneengesloten" strengen die bestaan op een enkele helix en helix-spanning "crossover" strengen (Figuur 1D). Bovendien zijn oligomers P8 en P6 geëtiketteerd met fluorescerende Cy3 (groene ster) en biotine (geel ovaal), respectievelijk(figuur 1D),om detectie van structuurvorming met behulp van fluorescentiemicroscopie mogelijk te maken. In totaal is het SST-motief gemaakt van 9 totale oligomeren om de vorming van 3-helix nanovezels mogelijk te maken door geprogrammeerde complementariteit van elk individueel domein aan het overeenkomstige domein op een naburige oligomer (Figuur 1E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. γPNA-sequentieontwerp
- Download de DNA Design Toolbox22 ontwikkeld door het Winfree Lab op Caltech23 in de map met programmeerscripts voor het ontwerpen van sequenties.
- Open in die map met het ontwerp van de reeks een programmeertaal van de vierde generatie die compatibel is met de bestandsextensie ".m", en voeg vervolgens de eerder gedownloade map 'DNAdesign' toe aan het pad met de volgende opdracht:
>> addpath DNAdesign - Voer vervolgens het volgende script uit met de naam "PNA3nanofiber.m" (zie Aanvullende figuur 1)met de volgende opdracht:
>> PNA3nanofiber - Voer dit script uit om variabelen te maken die 'thisSeqs' en 'thisScore' worden genoemd. De variabele "thisSeqs" bevat de sequenties van de ontworpen oligomers, en "thisScore" is de penalty score.
- Voer het script meerdere keren uit om de meest minimale score te verkrijgen. Een steekproef van 20 van dergelijke oplages is opgenomen in tabel 1.
- Bevestig handmatig de gewenste Watson-Crick complementariteit van elk domein van de gegenereerde sequenties voor het opgegeven SST structurele motief. Sequentiespecificaties voor de 3-helix nanofiber structuur zijn weergegeven in tabel 2.
- Controleer het volgende voor gegenereerde sequenties.
- Vermijd het gebruik van vier opeenvolgende C- en G-bases.
- Selecteer handmatig specifieke sequenties voor N-terminal functionalisatie met fluorescerende kleurstof en biotinemoleculen om fluorescerende microscopiestudies mogelijk te maken.
- Neem een minimum van 3 mini-PEG gamma-wijzigingen op de ruggengraat om vooraf georganiseerde spiraalvormige conformatie in de single-stranded oligomeren zoals beschreven door Sahu et al. 21.
2. Voorbereiding van γPNA-voorraadbundels
- Verkrijg γPNA-componentstrengen van gespecificeerde sequenties bij schaalsynthese van 50 nmol met krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)zuivering van een commerciële fabrikant.
- Resuspend elke streng in gedeïmiseerd water tot 300 μM concentraties. Bewaar de opnieuw opgetrokken strengen in -20 °C vriezer tot enkele maanden tot het nodig is voor experimenten.
3. Smeltcurvestudies van γPNA oligomer subsets
- Verkrijg smelttemperatuurbereiken voor verschillende combinaties van complementaire 2-oligomer- en 3-oligomersubsets door een smeltcurvestudie uit te voeren in waterige buffers zoals 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of voorkeurspolaire organische oplosmiddel zoals Dimethylformamide (DMF) of Dimethylsulfoxide (DMSO) (zie figuur 2).
OPMERKING: Thermische smeltcurven bij >50% van DMF beginnen de bovenste basislijn te verliezen en vertonen ernstige verstoringen mede als gevolg van hoge absorptie van DMF op de golflengte die nodig is voor de experimenten. Dit is een opgemerkt fenomeen in de literatuur24. Het is echter mogelijk om de smeltkrommegen te verkrijgen bij 5 μM per strengconcentraties in deze oplosmiddelomstandigheden.- Aliquot 16,7 μL van de 300 μM-voorraad van elke oligomer en maak het eindvolume tot een 1000 μL, hetzij in 1x PBS of 100% (v/v) DMSO of 100% (v/v) DMF effectief verkrijgen van 5 μM eindconcentratie per oligomer. Breng dit oligomer ondergedompeld mengsel naar een 1 cm optisch pad, quartz cuvette.
- Voer UV-Vis-experimenten met variabele temperatuur uit in een spectrofotometer die is uitgerust met een programmeerbaar temperatuurblok.
- Verzamel gegevenspunten voor de smeltcurven over een temperatuurbereik van 15\u201290 °C voor zowel koelcycli (annealing) als verwarmingscycli met een snelheid van 0,5\u20121 °C/min. Bewaar de monsters 10 minuten op 90 °C voor het koelen en bij 15 °C voor het verwarmen. Bepaal de smelttemperatuur (Tm)vanaf de piek van de eerste afgeleide van de verwarmingscurve.
- Controleer of het smelttemperatuurbereik voor 2-oligomersubsets in alle oplosmiddelgevallen boven de 35 °C ligt. Controleer bovendien of de overeenkomstige 3-oligomer subsets die een extra streng bevatten aan hun gelijkwaardige 2-oligomer subset een aanzienlijke toename van Tm als gevolg van verhoogde co-operativity.
OPMERKING: Dit zou controleren of een enkele pot zelfassemblage van meerdere oligomers samen kan vouwen in de gewenste nanostructuur met redelijke thermische stabiliteit.
4. Zelfassemblageprotocol voor meerdere verschillende γPNA-oligomers
OPMERKING: Om een zelfassemblageremmende hellingsprotocol voor γPNA-nanostructuren te ontwikkelen, is slow-ramp annealing wenselijk.
- In het geval van oligomersequenties, anneal de monsters voor 22,5 uur in een thermische cycler koeling van 90 tot 20 °C. Typisch, smelttemperatuur verkregen voor 2-oligomer en 3-oligomer γPNA subsets liggen in een bereik van 40\u201270 °C voor verschillende oplosmiddel omstandigheden.
- Programmeer de thermische cycler als volgt: houd 5 minuten lang vast op 90 °C, van 90 tot 70 °C bij een constante snelheid van 0,1 °C/min, helling terug van 70 tot 40 °C bij een snelheid van 0,1 °C/3 min, hellingsgraad van 40 tot 20 °C met een snelheid van 0,1 °C/min en houd bij 4 °C (zie tabel 3). Monsters kunnen worden opgeslagen in 4 °C voor 12\u201224 uur vóór karakterisering.
OPMERKING: Terwijl 2- en 3- oligomer subsets van ons nanovezelsysteem zich kunnen vormen in 1x PBS, worden de volledige nanovezels op micronschaal geaggregeerd in 1x PBS. Daarom moeten oplosmiddelomstandigheden worden geoptimaliseerd op basis van de schaal en grootte van de structuur die wordt gevormd, evenals het type en de dichtheid van gammawijzigingen. - Voor micron schaal lange 3-helix nanovezels, bereiden anneale batch monsters in 75% DMSO: H2O (v/ v), 75% DMF: H2O (v/ v), 40% 1,4-Dioxane: H2O (v/ v) op basis van oplosmiddel studies optimalisatie15.
- Bereid anneale batches als volgt voor (zie tabel 4). Bereid eerst 10 μL-subvoorraden voor op 20 μM-concentraties van de hoofdvoorraden van 300 μM voor elke oligomer door 0,67 μL uit de hoofdvoorraad te halen en het volume op 10 μl te maken met gedeïmiseerd water.
- Aliquot 1 μL uit de 20 μM subvoorraden voor elke oligomer en voeg het toe aan een 200 μL PCR buis. Dit is goed voor een totaal volume van 9 μL voor 9 oligomeren.
- Voeg ofwel 30 μL watervrije DMSO/DMF toe voor de 75% DMSO en 75% DMF-gevallen met een extra 1 μL gedeïmiseerd water om een eindvolume van 40 μL te maken bij elke oligomer bij 500 nM eindconcentraties. Voeg 16 μL 1,4-Dioxaan toe en maak het volume met gedeïmiseerd water tot 40 μL voor de 40% dioxaanoplosmiddelconditie.
- Laad de anneale batches op de thermische cycler en anneal met behulp van het protocol vermeld in stap 4.2.
5. Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie beeldvorming
- Bereid een vochtigheidskamer uit een lege pipettipsdoos. Vul het vak met ongeveer 5 mL water om te voorkomen dat de als volgt omschreven monsterstroomkanalen worden droogt (zie figuur 3).
- Bereid de flowkamer voor met een microscoopdia, 2 dubbelzijdige tapestrips en met nitrocellulose gecoate coverslip. Om de coverslip met nitrocellulose te coaten, dompelt u de coverslip in een beker met 0,1% collodion in amylacetaat en luchtdroog.
- Bereid de nitrocelluloseoplossing voor door een 20-voudige verdunning van commercieel verkrijgbare 2% collodion in amylacetaat met isoamyascetaat oplosmiddel te maken.
- Bereid biotinylated runderserum albumine (Biotine-BSA) oplossing voor door 1 mg Biotine-BSA te wegen en op te lossen in 1 mL van 1x PBS. Stroom 15 μL van 1 mg/mL Biotin-BSA in 1x PBS buffer door het plaatsen van het stroomkanaal onder een hoek. Broed het stroomkanaal gedurende 2-4 min bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
- Bereid de wasbuffer voor door 1 mg BSA op te lossen in 1 mL van 1x PBS. Was de overtollige Biotine-BSA door 15 μL van de wasbuffer te stromen. Om het oppervlak te passeren, het stroomkanaal gedurende 2-4 minuten in een bevochtigde kamer uit te broeden.
- Bereid de streptavidin-oplossing voor door 0,5 mg streptavidin en 1 mg BSA te meten en vervolgens op te lossen met 1 mL 1x PBS. Stroom 15 μL van 0,5 mg/mL streptavidin in 1x PBS met 1 mg/mL BSA. Broed het stroomkanaal gedurende 2-4 min bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Stroom 15 μL van de wasbuffer om ongebonden Streptavidin weg te spoelen.
- Stroom 15 μL van eerder geannealed batch γPNA oligomeren bij 500 nM concentratie per streng in 75% DMSO, 75% DMF of 40% 1,4-Dioxaanaandoening. Broed het stroomkanaal gedurende 2-4 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
- Bereid 1 mM Trolox in voorkeur oplosmiddelomstandigheden door 10-voudig verdunnen van een 10 mM voorraad Trolox in DMSO (meet 2,5 mg Trolox en los op in 1 mL DMSO). Was de niet-gebonden nanostructuren in het stroomkanaal met 15 μL van 1 mM Trolox met dezelfde oplosmiddelsamenstelling als de nanostructuren.
OPMERKING: De >50% DMSO-inhoud in het stroomkanaal zou kleine signaalstoringen veroorzaken als gevolg van de verschillende brekingsindex van de oplosmiddeltoestand tijdens TIRF, die doorgaans is gekalibreerd voor de TIRF-hoeken van de coverslipwater. Dit kan worden verholpen door te wassen met 1 mM Trolox gemaakt door het verdunnen van de 10 mM Trolox 10-voudig met behulp van gedeïmiseerd water. Deze techniek biedt duidelijkere beelden, maar is alleen nuttig om te beoordelen of vorming heeft plaatsgevonden, echter, omdat het produceert twee-fase microbellen in het stroomkanaal. Als gevolg hiervan kunnen nanostructuren zichtbaar zijn op de interface van de twee fasen zoals weergegeven in figuur 4D. - Breng het stroomkanaal over op de schuifhouder en het beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met TIRF-beeldvorming met behulp van een doelstelling van 60x olieonderdompeling en een 1,5x vergrootglas. Scan het stroomkanaal op 60x of 90x vergroting door het Cy3-kanaal te monitoren (zie figuur 4).
6. Beeldvorming van transmissieelektronen microscopie (TEM)
- Weeg 0,5 g uranylacetaat af in 50 mL gedestilleerd water om een 1% waterige uranylacetaatvlekoplossing te bereiden. Filter de 1% waterige uranylacetaatvlekoplossing met behulp van een 0,2 μm filter dat aan een spuit is bevestigd.
OPMERKING: Als alternatief kan 2% waterig uranylacetaat worden gekocht bij een commerciële fabrikant. - Koop commercieel beschikbare formvar support layer gecoate Copper roosters met een maaswijdte van 300.
OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat de formvar-ondersteuningslaag kan worden opgelost door oplosmiddelen zoals DMSO na 2 min. Voor langere monster incubatie zijn commercieel beschikbare formvar gestabiliseerd met siliciummonoxide op kopernetten beschikbaar die het mogelijk maken het net hydrofieler te maken dan met koolstof bedekte rasters en bestand is tegen krachtige monsteromstandigheden en elektronenbundel, zoals weergegeven in figuur 5C. - Pipet 4 μL monster op het rooster voor 15 s. Gebruik een stuk filterpapier om het monster af te wicken door het filterpapier vanaf de zijkant in contact te brengen met het raster.
- Voeg onmiddellijk 4 μL van de vlekoplossing toe aan het rooster voor 5 s.
- Wick uit de vlek als voorheen en houd het filter papier tegen het rooster voor 1 \u20122 min om ervoor te zorgen dat het rooster droog is. Monsters moeten meestal worden afgebeeld binnen 1\u20122 h na het bevlekken. Als ervoor wordt gezorgd dat het net volledig droog is, kunnen roosters tot 3 dagen voor beeldvorming in een OPSLAGbox van het TEM-raster worden opgeslagen.
- Breng het raster over op een TEM-specimenhouder en -afbeelding met behulp van een transmissieelektronenmicroscoop die bij 80 kV wordt bediend met vergroting variërend van 10 K tot 150K (zie figuur 5).
7. Verschillende morfologieën voor γPNA-DNA hybriden op basis van selectieve vervanging door DNA
- Verkrijg DNA-oligomers van gespecificeerde sequenties (zie tabel 5) van commerciële oligonucleotidefabrikanten die op 25 nmolschaal zijn gesynthetiseerd met behulp van standaarddesalting. Resuspend deze DNA sequenties met behulp van RNase-vrij gedeïmiseerd water bij 20 μM voorraadconcentraties.
- Voor aaneengesloten γPNA strengvervangingen met DNA kunnen sequenties D3, D5 en D9 strengen p3, p5 en p9 vervangen. Ook voor crossover γPNA streng vervangingen met DNA, sequenties D1, D4 en D7 kunnen strengen p1, p4 en p7 vervangen.
- Aliquot 1 μL uit de 20 μM subvoorraden voor elke γPNA of DNA oligomer en voeg het toe aan een 200 μL PCR buis zoals in stap 2.7. Voeg 30 μL watervrije DMSO en 1 μL RNase-vrij gedeïmiseerd water toe om het eindvolume op 40 μL te maken (zie tabel 6).
- Laad de anneale batches op de thermische cycler en anneal met behulp van het protocol vermeld in stap 4.2.
- Karakteriseren γPNA-DNA hybride nanostructuren met behulp van het TIRF protocol volgende stappen in sectie 5 of met behulp van TEM imaging protocol genoemd in sectie 6 (zie figuur 6).
8. Verschillende morfologieën voor γPNA-nanovezels in verschillende concentraties van SDS
- Bereid een SDS-hoofdvoorraad van 20% (wt/v) voor door 20 mg SDS te meten en op te lossen in 100 μL gedeïmiseerd water.
- Bereid een SDS-ondervoorraad van 6% (wt/v) voor door 3 μL uit de 20% SDS-voorraad te halen en het volume op 10 μL te maken met gedeïmiseerd water.
- Anneal de γPNA oligomers in de laatste concentraties van 5,25 mM en 17,5 mM SDS als volgt. Aliquot 1 μL uit de 20 μM subvoorraden voor elke γPNA oligomer en voeg het toe aan een 200 μL PCR buis zoals in stap 2.7. Voeg 30 μL watervrije DMSO en 1 μL van 6% en 20% SDS toe om het eindvolume tot 40 μL te maken om SDS-eindconcentraties van respectievelijk 5,25 mM en 17,5 mM te bereiken (zie tabel 7).
- Laad de anneale batches van verschillende SDS-concentraties op de thermische cycler en anneal met behulp van het protocol vermeld in stap 4.2.
- Karakteriseer γPNA-nanostructuren in aanwezigheid van SDS met behulp van het TIRF-protocol volgens stappen in sectie 5 of met behulp van het TEM-beeldvormingsprotocol vermeld in punt 6 (zie figuur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protocollen besproken in de bovenstaande secties beschrijven het ontwerp van een aangepast SST motief van DNA nanovezels voor de robuuste generatie van zelf geassembleerde nanovezels structuren met behulp van meerdere, verschillende γPNA oligomers. Deze sectie beschrijft de interpretatie van gegevens verkregen uit de succesvolle recreatie van de beschreven protocollen.
Naar aanleiding van het protocol beschreven in punt 5 voor TIRF-beeldvorming van monsters van γPNA-oligomers die in 75% DMSO zijn geannealed: H2O (v/v) levert het meest gemakkelijk bewijs van goed georganiseerde architecturen onder microscopische waarnemingen, zoals blijkt uit figuur 4A. 75% DMF: H2O (v/v) oplosmiddelconditie resulteert in spicule-vormige of naaldachtige nanostructuren (Figuur 4B) en, in onze ervaring, de 40% 1,4 dioxaan: H2O (v/v) conditie toont schaarse decoratie van filamenteuze nanostructuren bij bekeken met behulp van TIRF microscopie (Figuur 4C). Bovendien tonen de monsters van γPNA nanobuisjes gevormd in 75% DMSO: H2O (v/v) bundeling van nanovezels bij hoge vergroting of nanoscopische resoluties tijdens TEM-beeldvorming volgens de in punt 6 genoemde stappen (figuur 5). Kwantitatieve analyses van de breedte van de nanostructuren toonden een mediane breedte van 16,3 nm met een maximumwaarden van meer dan 80 nm15.
Voor het ontwikkelen van een schema voor het genereren van γPNA-DNA hybride nanostructuren in organische oplosmiddelenmengsels om verdere functionalisatie met BEHULP van DNA mogelijk te maken, is het belangrijk om te overwegen dat de oligomerische positie in het SST-motief wordt vervangen door isosequentiele DNA-oligomers. Aanpassing van de in punt 7 genoemde stappen voor het geval van de hier beschreven nanobuisconstructie, isosequential DNA-oligomeren die de aaneengesloten γPNA oligomeren vervangen, vormt rechte filamenteuze structuren, terwijl vervanging van de crossover γPNA oligomers stellatische structuren vormt wanneer deze worden bekeken met behulp van TIRF en TEM-beeldvorming (figuur 6). Kwantitatieve analyses van de breedte van de nanostructuren die werden vervangen door aaneengesloten DNA-oligomeren toonden mediane breedtes rond 19 nm15.
Ten slotte, bij de aanpassing van stappen van sectie 8, γPNA nanovezels nemen dunnere morfologieën in overeenstemming met verminderde bundeling in de aanwezigheid van SDS concentraties onder de kritische micelle concentraties (CMC, 8,2 mM). γPNA nanovezels nemen ook zeer genetwerkte morfologieën aan bij hoge SDS-concentraties in vergelijking met de CMC wanneer ze worden bekeken met behulp van TIRF-beeldvorming (figuur 7). TEM-beeldvorming van γPNA oligomers zelf geassembleerd in aanwezigheid van SDS geeft aan dat de 5,25 mM SDS-toestand de meest substantiële vermindering van de structurele bundeling aangeeft met breedtes variërend van 8\u201212 nm zoals weergegeven in (Figuur 7C).
Figuur 1: Peptide nucleïnezuur oligomeren als bouwstenen voor complexe nanostructuren.
a) Chemische structuren van DNA (PNA), PNA en MP-bevattende γPNA-eenheden. (Figuur is herdrukt met toestemming van Ref21.) (B) PNA-PNA helices zijn minder gedraaid dan DNA-DNA helices, met 18 bases per beurt in plaats van 10,5. (C) Dit drie-helix structurele single stranded tile (SST) motief bestaat uit 9 verschillende 12-base-long γPNA oligomers, elk met twee zes-base domeinen. (D) Binnen de structuur zijn er twee soorten oligomers: "aaneengesloten" strengen die bestaan op een enkele helix en helix-spanning "crossover" strengen. (E)Dit 18-base-lange structurele motief kan polymeriseren om micron-schaal filamenten te vormen. De panelen B, C en E zijn gewijzigd met toestemming van Ref15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve smeltkrommeten van geselecteerde γPNA-oligomeren in verschillende oplosmiddelomstandigheden.
2-oligomer (p4, p5) subset met 6-base domeinen kan binden met redelijke thermische stabiliteit (zwarte curve) in 1x PBS. 3- oligomer (p4, p5, p6) subset toont verhoogde thermische stabiliteit als gevolg van samenwerking in 1x PBS (blauwe curve) en toont weinig tot geen instabiliteit met betrekking tot Tm wanneer oplosmiddel wordt veranderd in organische oplosmiddelen zoals DMF (rode gestippelde curve). Figuur is gewijzigd met toestemming van Ref15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Stroomdiagram voor vloeiend stroomkanaal voor voorbeeld TIRF-beeldvorming.
Een stapsgewijze workflow die stappen aangeeft die betrokken zijn bij de voorbereiding van het monster voor TIRF-beeldvorming van γPNA-nanovezels na de assemblage van het stroomkanaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: TIRF-microscopiebeeldvorming van γPNA nanovezel zelf geassembleerd in verschillende oplosmiddelomstandigheden.
γPNA-nanovezels gevisualiseerd met behulp van TIRF-microscopie (5 μm-schaalbalk) terwijl het Cy3-kanaal wordt gevisualiseerd wanneer γPNA-oligomeren zelf worden geassembleerd in (A) 75% DMSO: water (v/v),(B)75% DMF: water (v/v) en (C) 40% Dioxaan: water (v/v) oplosmiddelcondities. (D) Wanneer γPNA-nanovezels zelf in 75% DMSO worden geassembleerd: water (v/v) dat aan het stroomkanaal wordt gebonden, wordt gewassen met 1mM Trolox in water, tweefasenmicrobellen van DMSO-watervorm met nanostructuren die langs de interface van de microbellijnen worden uitgelijnd. Figuur is gewijzigd met toestemming van Ref15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: TEM-beeldvorming van γPNA-nanovezels zelf geassembleerd in 75% DMSO: water. (v/v) met behulp van formvar-ondersteuningslaag koperen 300-mesh-rasters.
(A) TEM-beelden van γPNA-nanovezels gevisualiseerd onder lage vergroting (15x). (B) TEM-beelden van γPNA-nanovezels die onder hoge vergroting (150x) worden gevisualiseerd, tonen bundeling van nanobuisjes langs de breedte bij nanoscopische resoluties. (C) TEM-beelden van γPNA-nanovezels die onder lage vergroting (10x) met behulp van een Formvar-Silicon Monoxide-ondersteuningslaag op een koperen raster worden gevisualiseerd, maken beeldvorming mogelijk onder krachtige monsteromstandigheden. Figuur is gewijzigd met toestemming van Ref15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Verschillende morfologieën voor γPNA-DNA hybriden op basis van selectieve vervanging met DNA.
(A) TIRF (5 μm scale bar) en (C) TEM-beelden (60x vergroting) van zelfassemblage van γPNA-DNA hybriden bij vervanging van aaneengesloten γPNA oligomers (p3, p5, p9) door isosequential DNA oligomers (D3, D5 D9) tonen nanobuisjes die een rechte filamentmorfologie aannemen. (B) TIRF (5 μm scale bar) en (D) TEM-beelden (25x vergroting) van zelfassemblage van γPNA-DNA-hybriden bij vervanging van crossover γPNA oligomers (p1, p4, p7) door isosequential DNA oligomers (D1, D4 D7) tonen nanofibers die een stellate morfologie aannemen. Figuur is gewijzigd met toestemming van Ref15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Verschillende morfologieën voor γPNA nanovezels in verschillende concentraties van SDS.
TIRF-beelden (5 μm-schaalbalk) van zelfassemblage van γPNA-nanovezels in aanwezigheid van SDS bij concentraties van (A) 5,25 mM en (B) 17,5 mM. Zelfassemblage in aanwezigheid van SDS-concentraties minder dan de CMC (8,2 mM) toont dunnere morfologieën van TIRF-beelden op basis van fluorescentieintensiteit. (C) Dit wordt geverifieerd door TEM-beelden (100x vergroting) van het systeem waar de mediane breedte voor nanovezels ligt in het bereik van 8\u201212 nm. Bij concentraties die aanzienlijk boven de CMC liggen, lijken γPNA-nanobuisjes hogere ordersamenstellingen te vormen via zeer genetwerkte nanobuisstructuren. Figuur is gewijzigd met toestemming van Ref15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| MATLAB script string output "thisSeq" | Penalty Score "thisScore" | ||
| "acttcgctaaaa cgaagtgaggaa cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg " | 0.08 | ||
| "ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgccgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacgataagg tatctcatttac atagcagtaaat " | 0.0544 | ||
| "tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta " | 0.0688 | ||
| "gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga " | 0.0528 | ||
| "cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatg gcaatagtcaag tattgct gcgtagcagg " | 0.0656 | ||
| "aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc " | 0.0592 | ||
| "gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga " | 0.0688 | ||
| "tagccccagt gggctatctcgt ttcaggacgaga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt " | 0.0656 | ||
| "taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt " | 0.0736 | ||
| "aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga " | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| "actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac " | 0.064 | ||
| "ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcca ttgccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt " | 0.0688 | ||
| "gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctcac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggacga " | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| "tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat " | 0.0624 | ||
| "tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag " | 0.0656 | ||
| "agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct " | 0.0688 | ||
| "cggcaaactatg ttgccgattt acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtt gcctcagcga ctttagtcgctg " | 0.0704 | ||
Tabel 1: 20 voorbeeldalgoritalistische resultaten voor mogelijke optimalisatie van het γPNA-sequentieontwerp. 20 voorbeeldalgoritalistische resultaten met sequentieuitvoeren in kolom 1 en de bijbehorende score in kolom 2. Herhaalde iteraties van het script worden uitgevoerd om de meest minimale score te verkrijgen.
| γPNA-reeks-ID | Volgorde | Aanvulling op domein 1 | Aanvulling op domein 2 |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | p2-domein 1 | p6-Biotine domein 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | p1-domein 1 | p3-domein 2 |
| p3 | N-GACATCTTACTC-C | p7-domein 2 | p2-domein 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5-domein 1 | p9-domein 1 |
| p5 | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4-domein 1 | p6-Biotine domein 2 |
| p6-Biotine | N-Biotine-GTGAACCGAGGG-C | p1-domein 2 | p5-domein 2 |
| p7 | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3-domein 1 | p3-domein 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7-domein 1 | p9-domein 2 |
| p9 | N-TCCGCATTCTGT-C | p4-domein 2 | p8-Cy3-domein 2 |
Tabel 2: γPNA sequentieontwerpresultaten voor nanovezels. Individuele oligomersequenties werden gegenereerd zoals aangegeven in deze tabel. Onderstreepte basen geven de gamma-positie wijzigingen met mini-PEG. Tabel is gewijzigd met toestemming van Ref15.
| Temperatuurbereik | Opritsnelheid |
| 90 °C | Houd 3 minuten vast |
| 90-80 °C | 0,1°C/minuut |
| 80-70 °C | 0,1°C/minuut |
| 70-60 °C | 0,1°C/3 minuten |
| 60-50 °C | 0,1°C/3 minuten |
| 50-40 °C | 0,1°C/3 minuten |
| 40-30 °C | 0,1°C/minuut |
| 30-20 °C | 0,1°C/minuut |
| 4 °C | Houd voor onbepaalde tijd |
Tabel 3: Anneal ramp protocol voor thermische cycler. Tabel is gewijzigd met toestemming van Ref15.
| Voorraadconcentratie | 75% DMSO: water (v/v) anneale monster | 75% DMF: water (v/v) anneale monster | 40% dioxaan: water (v/v) anneale monster | Definitieve concentratie | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | 75 % (v/v) |
| 1,4-dioxaan | - | - | - | 16 μL | 40 % (v/v) |
| gedeïioneerd water | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 of 60% (v/v) |
| Totaal volume | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tabel 4: Protocol voor de voorbereiding van anneale partijen γPNA-oligomer in verschillende oplosmiddelomstandigheden.
| DNA-sequentie-ID | Volgorde |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tabel 5: Isosequential DNA sequenties als vervanging oligomeren naar γPNA. Tabel is gewijzigd met toestemming van Ref15.
| Voorraadconcentratie | DNA Aaneengesloten strengvervangingen | DNA Crossover streng vervangingen | Definitieve concentratie | |
| γPNA oligomer (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| DNA oligomer (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| gedeïioneerd water | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v/v) |
| Totaal volume | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabel 6: Protocol voor de voorbereiding van anneale batches van γPNA-DNA hybride nanostructuren in 75% DMSO: H2O (v/v) door vervanging van aaneengesloten of crossover γPNA oligomers door isosequential DNA oligomers.
| Voorraadconcentratie | SDS-concentraties onder CMC | SDS-concentraties boven CMC | Definitieve concentratie | |
| γPNA oligomer (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| gedeïioneerd water | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Totaal volume | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabel 7: Protocol voor de voorbereiding van anneale partijen γPNA-nanostructuren in 75% DMSO: H2O (v/v) in aanwezigheid van SDS-concentraties onder en boven CMC.
Aanvullende figuur 1: Programmeerscript PNA3nanofiber.m voor het ontwerpen van oligomersequenties. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel richt zich op het aanpassen en verbeteren van bestaande nucleïnezuur nanotechnologie protocollen ten opzichte van organische oplosmiddel mengsels. De hier beschreven methoden richten zich op modificaties en probleemoplossing binnen een gedefinieerde experimentele ruimte van geselecteerde polaire aprotische organische oplosmiddelen. Er is nog onontgonnen potentieel voor andere gevestigde nucleïnezuur nanotechnologie protocollen worden aangepast in deze ruimte. Dit zou potentiële toepassingen kunnen verbeteren door integratie op andere gebieden zoals polymeer- en peptidesynthese die doorgaans worden uitgevoerd in vergelijkbare organische oplosmiddelen25,26. Daarnaast richten we ons hier op kritieke stappen die moeten worden waargenomen tijdens het beoefenen van de bovengenoemde protocollen.
Tijdens de voorbereiding van het monster voor zelfassemblage is het belangrijk om de volumepercentages van water op 25% (v/v) te houden voor DMSO- en DMF-omstandigheden. Daarom is het belangrijk om te erkennen dat het organische oplosmiddel dat voor zelfassemblage wordt gebruikt, ook uit watervrije voorraden moet komen. De nanovezelstructuren zijn hydrofoob en aggregaat in een verhoogd watergehalte.
In tegenstelling tot steigers DNA origami benaderingen die structuren van discrete lengtes kan creëren, de huidige SST motief ontwerp voor γPNA nanovezels en andere eerder gevestigde DNA SST nanobuisjes levert geen structuren van discrete lengtes. Nanobuisjes polymeriseren het bereiken van een bereik van multi-micron lengtes (tot 11 μm). Om dezelfde reden kan de opbrengst in verband met structuurvorming niet worden gekwantificeerd.
Echter, als gevolg van de niet-geladen peptide ruggengraat van γPNA, zijn er geen afhankelijkheden van counter ionenbalans in relatie tot structuurvorming. Imaging buffers, daarom, niet nodig om kationen zoals Mg2 + meestal nodig voor de stabilisatie van nanostructuren gemaakt van natuurlijk voorkomende nucleïnezuren op te nemen.
Ten slotte zijn γPNA nanostructuurbundeling en aggregatie in verschillende oplosmiddelomstandigheden ook afhankelijk van de individuele oligomerconcentraties die tijdens zelfassemblage worden geïntroduceerd. Concentraties variërend van 1 μM en hoger van individuele oligomeren verhogen de neiging tot bundeling en aggregatie en beïnvloeden de heldere beeldvorming van nanostructuren tijdens TIRF of TEM-beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Science Foundation grant 1739308, NSF CAREER grant 1944130 en door het Air Force Office of Science Research subsidienummer FA9550-18-1-0199. γPNA sequenties waren een genereus geschenk van Dr Tumul Srivastava van Trucode Gene Repair, Inc. We willen dr. Erik Winfree en Dr. Rizal Hariadi bedanken voor hun nuttige gesprekken over DNA Design Toolbox MATLAB code. We willen ook Joseph Suhan, Mara Sullivan en het Center for Biological Imaging bedanken voor hun hulp bij het verzamelen van TEM-gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
- Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518 (2018).
- Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
- Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
- Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007 (2014).
- Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339 (2000).
- Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
- Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
- Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930 (2017).
- Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
- Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
- Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
- Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
- DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
- Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
- Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
- Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247 (2007).
