Summary
Este artigo fornece protocolos para o projeto e auto-montagem de nanoestruturas de oligômeros de ácido nucleírico de peptídeos modificados gama em misturas de solventes orgânicos.
Abstract
As estratégias atuais em nanotecnologia de DNA e RNA permitem a auto-montagem de uma variedade de nanoestruturas de ácido nucleico em mídia aquosa ou substancialmente hidratada. Neste artigo, descrevemos protocolos detalhados que permitem a construção de arquiteturas de nanofibra em misturas de solventes orgânicos através da auto-montagem de telhas de nucleículos de peptídeos exclusivamente endereçadas, de fio único e gama modificadas (γPNA). Cada telha de fio único (SST) é um oligômero γPNA de 12 bases composto por dois domínios modulares concatenados de 6 bases cada. Cada domínio pode se ligar a um domínio mutuamente gratuito presente em vertentes vizinhas usando complementaridade programada para formar nanofibras que podem crescer até mícrons de comprimento. O motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices. Em contraste com nanoestruturas análogas de DNA, que formam estruturas monodispersas de diâmetro, esses sistemas γPNA formam nanofibras que se agrupam ao longo de suas larguras durante a auto-montagem em misturas orgânicas de solventes. Os protocolos de automontagem descritos aqui, portanto, também incluem um surfactante convencional, Sulfato de Dodecil de Sódio (SDS), para reduzir os efeitos de agrupamento.
Introduction
Construção bem sucedida de numerosas nanoestruturas complexas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 em mídia aquosa ou substancialmente hidratada feita utilizando ácidos nucleicos de ocorrência natural, tais como DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e RNA11,12 foi mostrado em trabalhos anteriores. No entanto, os ácidos nucleicos de ocorrência natural sofrem alterações conformais helical duplex ou têm estabilizações térmicas reduzidas nas misturas de solventes orgânicos13,14.
Anteriormente, nosso laboratório relatou um método para a construção de nanofibras de 3 hélices usando mímicas de ácido nucleico sintético modificadas de posição gama chamadas ácidos nucleíricos gama-peptídeos (γPNA)15 (Figura 1A). A necessidade de tal desenvolvimento e aplicações potenciais do ácido nucleico sintético imita pna tem sido discutida no campo16,17. Temos mostrado, através de uma adaptação da estratégia de azulejos mono-encalhados (SST) apresentada para nanoestruturas de DNA18,19,20, que 9 oligômeros γPNA sequencialmente distintos podem ser projetados para formar nanofibras de 3 hélices em misturas de solventes orgânicos aprotic polares selecionados, como DMSO e DMF. Os oligômeros γPNA foram ordenados comercialmente com modificações de (R)-dietileno glicol (mini-PEG) em três posições de γ (1, 4 e 8 posições-base) ao longo de cada oligômero de 12 bases com base em métodos publicados por Sahu et al. 21 Essas modificações gama causam a pré-organização helicoidal associada à maior afinidade de ligação e estabilidade térmica de γPNA em relação ao PNA não modificado.
Este artigo é uma adaptação do nosso trabalho relatado no qual investigamos os efeitos da solução solvente e substituição com DNA na formação de nanoestruturas baseadas em γPNA15. O objetivo deste artigo é fornecer descrições detalhadas do projeto, bem como protocolos detalhados para métodos adaptados a solventes que foram desenvolvidos para a auto-montagem e caracterização da nanofibra γPNA. Assim, introduzimos pela primeira vez a estratégia modular SST, uma plataforma geral para o design de nanoestrutura usando o ácido nucleico sintético imitar PNA.
O tom helicoidal para duplexes PNA foi relatado como sendo de 18 bases por turno em comparação com duplexes de DNA, que passam por uma curva por 10,5 bases(Figura 1B). Portanto, o comprimento de domínio dos SSTs γPNA demonstrados foi definido em 6 bases para acomodar um terço de uma curva completa ou 120° de rotação para permitir a interação entre três helices triangularmente dispostas. Além disso, ao contrário dos motivos SST anteriores, cada SST contém apenas 2 domínios, criando efetivamente uma estrutura de fita 1-dimensional que envolve para formar um feixe de três hélices(Figura 1C). Cada oligômero γPNA de 12 bases é modificado gama nas posições 1, 4 e 8 para garantir uma distribuição uniformemente espaçada de grupos mini-PEG em todo o motivo SST global. Além disso, dentro do motivo, existem dois tipos de oligômeros: fios "contíguos" que existem em uma única hélice e fios "crossover" de hélice(Figura 1D). Além disso, os oligômeros P8 e P6 são rotulados com Cy3 fluorescente (estrela verde) e biotina (oval amarelo),respectivamente (Figura 1D),para permitir a detecção da formação da estrutura usando microscopia de fluorescência. Ao todo, o motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices através da complementaridade programada de cada domínio individual ao domínio correspondente em um oligômero vizinho(Figura 1E).
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Protocol
1. design de sequência γPNA
- Baixe a caixa de ferramentas de design de DNA22 desenvolvida pelo Winfree Lab na Caltech23 na pasta contendo scripts de programação para projetar sequências.
- Dentro dessa pasta de design de sequência, abra uma linguagem de programação de quarta geração compatível com a extensão de arquivo ".m", e adicione a pasta "DNAdesign" previamente baixada ao caminho usando o seguinte comando:
>> addpath DNAdesign - Execute posteriormente o seguinte script chamado "PNA3nanofiber.m" (ver Figura Suplementar 1) usando o seguinte comando:
>> PNA3nanofiber - Execute este script para criar variáveis chamadas "thisSeqs" e "thisScore". A variável "thisSeqs" contém as sequências dos oligômeros projetados, e "thisScore" é a pontuação de penalidade.
- Execute o script várias vezes para obter a pontuação mais mínima. Uma amostra de 20 dessas corridas é mostrada na Tabela 1.
- Confirme manualmente a complementaridade watson-crick desejada de cada domínio das sequências geradas para o motivo estrutural SST especificado. As especificações de sequência para a estrutura de nanofibra de 3 hélices são mostradas na Tabela 2.
- Verifique o seguinte para sequências geradas.
- Evite usar quatro bases C e G consecutivas.
- Selecione manualmente sequências específicas para funcionalização de n-terminal com moléculas de corante fluorescente e biotina para permitir estudos de microscopia fluorescente.
- Inclua um mínimo de 3 mini-PEG modificações gama na espinha dorsal para permitir a conformação helicoidal pré-organizada nos oligômeros de uma única cadeia, conforme descrito por Sahu et al. 21
2. Preparação de fios de estoque γPNA
- Obtenha fios de componentes γPNA de sequências especificadas em síntese de escala de 50 nmol com purificação de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de um fabricante comercial.
- Resuspend cada fio em água deionizada para concentrações de 300 μM. Armazene os fios resuspendados em -20 °C congelador até vários meses até que seja necessário para experimentação.
3. Estudos de curvas de fusão de subconjuntos de oligômeros γPNA
- Obtenha faixas de temperatura de fusão para diferentes combinações de subconjuntos complementares de 2-oligômeros e 3-oligômeros executando um estudo de curva de derretimento em tampões aquosos como 1x salina tamponada fosfato (PBS) ou solvente orgânico polar preferido, como Dimethylformamida (DMF) ou sulfoxida dimetil (DMSO) (ver Figura 2).
NOTA: As curvas de fusão térmica em >50% do DMF começam a perder a linha de base superior e apresentam distúrbios graves em parte devido à alta absorção de DMF no comprimento de onda necessário para os experimentos. Este é um fenômeno notável na literatura24. No entanto, é possível obter as curvas de fusão a 5 μM por retração concentrações nestas condições de solvente.- Alíquota de 16,7 μL do estoque de 300 μM de cada oligômero e faça o volume final para um DMF de 1000 μL, seja em 1x PBS ou 100% (v/v) DMSO ou 100% (v/v) DMF efetivamente obtendo 5 μM de concentração final por oligômero. Transfira esta mistura de subconjunto de oligômero para um caminho óptico de 1 cm, cuvette de quartzo.
- Realize experimentos UV-Vis de temperatura variável em um espectotômetro equipado com um bloco de temperatura programável.
- Colete pontos de dados para as curvas de fusão sobre uma faixa de temperatura de 15\u201290 °C para ciclos de resfriamento (ressarcimento) e aquecimento (derretimento) a uma taxa de 0,5\u20121 °C/min. Mantenha as amostras por 10 minutos a 90 °C antes de esfriar e a 15 °C antes de aquecer. Determine a temperatura de fusão (Tm) do pico do primeiro derivado da curva de aquecimento.
- Verifique se as faixas de temperatura de fusão para subconjuntos de 2 oligômeros estão acima de 35 °C em todos os casos de solvente. Além disso, verifique se os subconjuntos correspondentes de 3 oligômeros que contêm uma vertente adicional ao seu subconjunto equivalente de 2 oligômeros mostra um aumento considerável no Tm devido ao aumento da cooperaperatividade.
NOTA: Isso verificaria se um único pote de auto-montagem de vários oligômeros pode dobrar cooperativamente na nanoestrutura desejada com estabilidade térmica razoável.
4. Protocolo de automontagem para múltiplos oligômeros γPNA distintos
NOTA: Para elaborar um protocolo de rampa térmica de auto-montagem para nanoestruturas γPNA, é desejável a ressarcimento em rampa lenta.
- No caso das sequências de oligômeros geradas, as amostras são de 22,5 h em um cicloviário térmico de 90 a 20 °C. Normalmente, a temperatura de fusão obtida para subconjuntos γPNA de 2-oligômeros e 3-oligomer situa-se em faixas de 40\u201270 °C para diferentes condições de solvente.
- Programe o cicloviário térmico da seguinte forma: mantenha a 90 °C por 5 min, rampa para baixo de 90 a 70 °C a uma taxa constante de 0,1 °C/min, rampa para baixo de 70 a 40 °C a uma taxa de 0,1 °C/3 min, rampa para baixo de 40 a 20 °C a uma taxa de 0,1 °C/min e manter a 4 °C (ver Tabela 3). As amostras podem ser armazenadas em 4 °C por 12\u201224 h antes da caracterização.
NOTA: Enquanto subconjuntos de 2 e 3- oligômeros do nosso sistema de nanofibra podem se formar em 1x PBS, as nanofibras em escala de micron completa agregam em 1x PBS. Portanto, as condições de solvente devem ser otimizadas com base na escala e tamanho da estrutura que está sendo formada, bem como no tipo e densidade das modificações gama. - Para micron escala longa 3-hélices nanofibras, prepare amostras de lote anneal em 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxane: H2O (v/v) com base em estudos de otimização de solventes15.
- Prepare os lotes anneal da seguinte forma (ver Tabela 4). Primeiro, prepare 10 sub-estoques de μL em concentrações de 20 μM dos estoques principais de 300 μM para cada oligômero, aliquoting 0,67 μL do estoque principal e fazendo o volume para 10 μl usando água desionizada.
- Alíquota 1 μL dos subestos de 20 μM para cada oligômero e adicione-a a um tubo PCR de 200 μL. Isso representa um volume total de 9 μL para 9 oligômeros.
- Adicione 30 μL de DMSO/DMF anidro para os casos DMSO de 75% e 75% DMF com um adicional de 1 μL de água desionizada para fazer um volume final de 40 μL com cada oligômero a 500 nM concentrações finais. Adicione 16 μL de 1,4-Dioxano e faça o volume com água deionizada a 40 μL para a condição de solvente de dioxano de 40%.
- Carregue os lotes anneal no ciclo de tempo térmico e ressar o protocolo mencionado na etapa 4.2.
5. Imagem total de ressonância magnética de reflexão interna (TIRF)
- Prepare uma câmara de umidade a partir de uma caixa de pontas de pipeta vazia. Encha a caixa com aproximadamente 5 mL de água para evitar a secagem dos canais de fluxo amostral descritos da seguinte forma (ver Figura 3).
- Prepare a câmara de fluxo com um slide de microscópio, 2 tiras de fita de duas faces e tampas revestidas de nitrocelulose. Para revestir o talo com nitrocelulose, mergulhe a mancha em um béquer contendo 0,1% de colodion em acetato de amilo e ar-seco.
- Prepare a solução de nitrocelulose fazendo uma diluição de 20 vezes disponível comercialmente em acetato de amilo com solvente de acetato isoamyl.
- Prepare a solução biotinylated de soro bovino (Biotin-BSA) pesando 1 mg de Biotin-BSA e dissolvendo-a em 1 mL de 1x PBS. Flua 15 μL de 1 mg/mL Biotin-BSA em 1x de buffer PBS colocando o canal de fluxo em um ângulo. Incubar o canal de fluxo por 2-4 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
- Prepare o tampão de lavagem dissolvendo 1 mg de BSA em 1 mL de 1x PBS. Lave o excesso de Biotin-BSA fluindo 15 μL do tampão de lavagem. Para passar pela superfície, incubar o canal de fluxo por 2-4 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
- Prepare a solução streptavidin medindo 0,5 mg de streptavidina e 1 mg de BSA e, em seguida, dissolvendo usando 1 mL de 1x PBS. Fluxo 15 μL de 0,5 mg/mL streptavidin em 1x PBS contendo 1 mg/mL BSA. Incubar o canal de fluxo por 2-4 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Flua 15 μL do tampão de lavagem para lavar Streptavidin sem saída.
- Fluxo 15 μL de lote anteriormente enaltado de oligômeros γPNA a 500 nM de concentração por fio em 75% DMSO, 75% DMF ou 40% 1,4-Dioxano condição. Incubar o canal de fluxo por 2-4 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
- Prepare 1 mM Trolox em condições de solvente preferencial, diluindo 10 vezes de um estoque de 10 mM de Trolox em DMSO (medir 2,5 mg de Trolox e dissolver em 1 mL de DMSO). Lave as nanoestruturas desvinculadas no canal de fluxo com 15 μL de trolox de 1 mM com a mesma composição de solventes das nanoestruturas.
NOTA: O teor de >50% DMSO no canal de fluxo produziria pequenos distúrbios de sinal devido ao diferente índice de refração da condição de solvente durante a TIRF, que é tipicamente calibrado para ângulos de TIRF de água coberta. Isso pode ser corrigido lavando com trolox de 1 mM feito diluindo o Trolox 10 vezes de 10 vezes usando água desionizada. Esta técnica fornece imagens mais claras, mas só é útil para avaliar se a formação ocorreu, no entanto, porque produz micro-bolhas de duas fases no canal de fluxo. Como resultado, as nanoestruturas podem ser visíveis na interface das duas fases, como mostrado na Figura 4D. - Transfira o canal de fluxo para o suporte de slides e imagem usando um microscópio de fluorescência equipado com imagem TIRF usando um objetivo de imersão em óleo de 60x e uma lupa de 1,5x. Escaneie o canal de fluxo em ampliação de 60x ou 90x monitorando o canal Cy3 (ver Figura 4).
6. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
- Pese 0,5 g de acetato de urânyl em 50 mL de água destilada para preparar uma solução de mancha de acetato de urândalo 1%. Filtre a solução de mancha de acetato de urânyl de 1% aquosa usando um filtro de 0,2 μm ligado a uma seringa.
NOTA: Alternativamente, 2% de acetato aquoso de urano poderia ser comprado de um fabricante comercial. - Compre grades de cobre revestidas de camada de suporte de formvar disponíveis comercialmente com tamanho de 300 malhas.
NOTA: É importante notar que a camada de suporte formvar pode ser dissolvida por solventes como o DMSO além de 2 minutos. Para maior incubação amostral, formvar comercialmente disponível estabilizado com monóxido de silício em redes de cobre estão disponíveis que permitem que a rede seja mais hidrofílica do que as grades revestidas de carbono e pode suportar condições vigorosas de amostra e feixe de elétrons, como mostrado na Figura 5C. - Pipeta 4 μL de amostra na grade para 15 s. Use um pedaço de papel filtro para retirar a amostra, trazendo o papel filtro em contato com a grade lateral.
- Adicione imediatamente 4 μL da solução de manchas na rede para 5 s.
- Descarve a mancha como antes e segure o papel do filtro contra a grade por 1\u20122 min para ter certeza de que a grade está seca. As amostras devem ser tipicamente imagens dentro de 1\u20122 h após a coloração. Alternativamente, se a rede estiver completamente seca, as grades podem ser armazenadas em uma caixa de armazenamento de grade TEM por até 3 dias antes da imagem.
- Transfira a grade para um suporte de espécime TEM e imagem usando um microscópio eletrônico de transmissão operado a 80 kV com ampliação variando de 10 K a 150K (ver Figura 5).
7. Diferentes morfologias para híbridos γPNA-DNA baseados na substituição seletiva com DNA
- Obtenha oligômeros de DNA de sequências especificadas (ver Tabela 5) de fabricantes comerciais de oligonucleotídeos sintetizados em escala de 25 nmol usando desalização padrão. Resuspenque essas sequências de DNA usando água deionizada livre de RNase a concentrações de estoque de 20 μM.
- Para substituições contíguas de fios γPNA com DNA, as sequências D3, D5 e D9 podem substituir os fios p3, p5 e p9. Da mesma forma, para substituições de fios crossover γPNA com DNA, as sequências D1, D4 e D7 podem substituir os fios p1, p4 e p7.
- Aliquot 1 μL dos sub-estoques de 20 μM para cada γPNA ou oligômero de DNA e adicioná-lo a um tubo PCR de 200 μL como na etapa 2.7. Adicione 30 μL de DMSO anidro e 1 μL de água deionizada sem RNase para fazer o volume final a 40 μL (ver Tabela 6).
- Carregue os lotes anneal no ciclo de tempo térmico e ressar o protocolo mencionado na etapa 4.2.
- Caracterize nanoestruturas híbridas γPNA-DNA usando o protocolo TIRF seguindo etapas na seção 5 ou usando o protocolo de imagem TEM mencionado na seção 6 (ver Figura 6).
8. Diferentes morfologias para nanofibras γPNA em concentrações variadas de SDS
- Prepare um estoque principal SDS de 20% (wt/v) medindo 20 mg de SDS e dissolvendo-o em 100 μL de água deionizada.
- Prepare um sub-estoque SDS de 6% (wt/v) aliquoting 3 μL do estoque SDS de 20% e fazendo o volume para 10 μL usando água deionizada.
- Anneal os oligômeros γPNA em concentrações finais de 5,25 mM e 17,5 mM SDS da seguinte forma. Aliquot 1 μL dos sub-estoques de 20 μM para cada oligômero γPNA e adicione-o a um tubo PCR de 200 μL como na etapa 2.7. Adicione 30 μL de DMSO anidro e 1 μL de 6% e 20% SDS para fazer o volume final a 40 μL para alcançar concentrações finais de SDS de 5,25 mM e 17,5 mM, respectivamente (ver Tabela 7).
- Carregue os lotes anneal de diferentes concentrações de SDS no ciclocicr térmico e anneal usando o protocolo mencionado na etapa 4.2.
- Caracterize nanoestruturas γPNA na presença de SDS utilizando o protocolo TIRF seguindo etapas na seção 5 ou usando o protocolo de imagem TEM mencionado na seção 6 (ver Figura 7).
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Representative Results
Os protocolos discutidos nas seções acima descrevem o desenho de um motivo SST adaptado de nanofibras de DNA para a geração robusta de estruturas de nanofibras auto-montadas usando múltiplos oligômeros γPNA. Esta seção descreve a interpretação dos dados obtidos a partir da recriação bem sucedida dos protocolos descritos.
Seguindo o protocolo descrito na seção 5 para imagem TIRF de amostras de oligômeros γPNA annealed em 75% DMSO: H2O (v/v) mais facilmente fornece evidências de arquiteturas bem organizadas sob observações microscópicas como mostrado na Figura 4A. 75% DMF: H2O (v/v) condição de solvente resulta em nanoestruturas em forma de espícula ou agulha(Figura 4B) e, em nossa experiência, a condição de 40% 1,4 dioxano: H2O (v/v) apresenta decoração esparsa de nanoestruturas de fisobramia quando vista usando microscopia TIRF(Figura 4C). Além disso, as amostras de nanotubos γPNA formados em 75% DMSO: H2O (v/v) demonstram agrupamento de nanofibras em altas ampliações ou resoluções nanoscópicas durante as imagens TEM seguindo as etapas mencionadas na seção 6 (Figura 5). Análises quantitativas da largura das nanoestruturas mostraram uma largura mediana de 16,3 nm com valores máximos além de 80 nm15.
Para elaborar um esquema para gerar nanoestruturas híbridas γPNA-DNA em misturas de solventes orgânicos para permitir uma maior funcionalidade usando DNA, é importante considerar a posição oligomerica no motivo SST sendo substituída por oligômeros de DNA isosequenciais. Adaptando as etapas mencionadas na seção 7 para o caso do construto de nanotubos descrito aqui, os oligômeros de DNA isosequenciais que substituem os oligômeros contíguos γPNA formam estruturas fisordenadas retas, enquanto a substituição dos oligômeros γPNA crossover forma estruturas estelares quando vistas usando imagem TIRF e TEM(Figura 6). Análises quantitativas da largura das nanoestruturas que foram substituídas por oligômeros de DNA contíguos mostraram larguras medianas em torno de 19 nm15.
Finalmente, ao adaptar passos da seção 8, as nanofibras γPNA adotam morfologias mais finas consistentes com agrupamento reduzido na presença de concentrações de SDS abaixo de suas concentrações críticas de micela (CMC, 8,2 mM). As nanofibras γPNA também adotam morfologias altamente em rede em altas concentrações de SDS em comparação com seu CMC quando visualizadas usando imagem TIRF(Figura 7). As imagens TEM dos oligômeros γPNA auto-montadas na presença de SDS indicam que a condição de SDS de 5,25 mM indica as reduções mais substanciais no agrupamento estrutural com larguras que variam de 8\u201212 nm como mostrado na(Figura 7C).
Figura 1: Oligômeros de ácido nucleírico peptídeo como blocos de construção para nanoestruturas complexas.
(A) Estruturas químicas de DNA (PNA), PNA e unidades γPNA contendo MP. (A figura foi reimpressa com permissão do Ref21.) (B) As helices PNA-PNA são menos torcidas que as helices de DNA-DNA, tendo 18 bases por curva em vez de 10,5. (C) Este motivo de azulejo único de três hélices (SST) consiste em 9 oligômeros γPNA de 12 bases distintos, cada um com dois domínios de seis bases. (D) Dentro da estrutura há dois tipos de oligômeros: fios "contíguos" que existem em uma única hélice e fios "crossover" de hélice. (E) Este motivo estrutural de 18 bases pode polimerizar para formar filamentos em escala de micron. Os painéis B, C e E foram modificados com permissão do Ref15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curvas representativas de derretimento de oligômeros γPNA selecionados em diferentes condições de solvente.
Subconjunto de 2 oligômeros (p4, p5) mostrando que domínios de 6 bases podem se ligar com estabilidade térmica razoável (curva preta) em 1x PBS. 3- oligômero (p4, p5, p6) subconjunto mostra aumento da estabilidade térmica devido à cooperatividade em 1x PBS (curva azul) e mostra pouca ou nenhuma instabilidade em relação a Tm quando solvente é alterado para solventes orgânicos como DMF (curva pontilhada vermelha). A figura foi modificada com permissão do Ref15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráfico de fluxo para canal de fluxo fluido para a amostra de imagem TIRF.
Um fluxo de trabalho passo a passo indicando etapas envolvidas na preparação da amostra para imagens TIRF de nanofibras γPNA após a montagem do canal de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem de microscopia TIRF de nanofibra γPNA auto-montada em diferentes condições de solvente.
Nanofibras γPNA visualizadas usando microscopia TIRF (barra de escala de 5 μm) enquanto monitoram o canal Cy3 quando os oligômeros γPNA são auto-montados em (A) 75% DMSO: água (v/v), (B) 75% DMF: água (v/v) e (C) 40% Dioxano: água (v/v) condições de solvente. (D) Quando as nanofibras γPNA auto-montadas em 75% DMSO: a água (v/v) ligada ao canal de fluxo é lavada com trolox de 1mM na água, microbolhas de duas fases de dMSO-água forma com nanoestruturas alinhadas ao longo da interface da microbolhas. A figura foi modificada com permissão do Ref15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem TEM de nanofibras γPNA auto-montadas em 75% DMSO: água. (v/v) utilizando camada de suporte formvar de cobre 300 grades de malha.
(A) Imagens TEM de nanofibras γPNA visualizadas sob baixa ampliação (15x). (B) Imagens TEM de nanofibras γPNA visualizadas sob alta ampliação (150x) mostram agrupamento de nanotubos ao longo da largura em resoluções nanoscópicas. (C) Imagens TEM de nanofibras γPNA visualizadas sob baixa ampliação (10x) usando uma camada de suporte de monóxido Formvar-Silicon em uma grade de cobre permite imagens sob condições vigorosas de espécimes. A figura foi modificada com permissão do Ref15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diferentes morfologias para híbridos γPNA-DNA baseados na substituição seletiva com DNA.
(A) TIRF (barra de escala de 5 μm) e (C) imagens TEM (ampliação de 60x) de auto-montagem de híbridos γPNA-DNA ao substituir oligômeros γPNA contíguos (p3, p5, p9) com oligômeros de DNA isosequenciais (D3, D5 D9) mostram nanotubos adotando uma morfologia de filamento reto. (B) TIRF (barra de escala de 5 μm) e (D) imagens TEM (ampliação de 25x) de auto-montagem de híbridos γPNA-DNA ao substituir oligômeros crossover γPNA (p1, p4, p7) com oligômeros de DNA isosequenciais (D1, D4 D7) mostram nanofibers adotando uma morfologia estelar. A figura foi modificada com permissão do Ref15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Diferentes morfologias para nanofibras γPNA em concentrações variadas de SDS.
Imagens TIRF (barra de escala de 5 μm) de auto-montagem de nanofibras γPNA na presença de SDS em concentrações de (A) 5,25 mM e (B) 17,5 mM. A automontagem na presença de concentrações de SDS inferiores às cmc (8,2 mM) mostra morfologias mais finas de imagens TIRF baseadas na intensidade da fluorescência. (C) Isso é verificado por imagens TEM (ampliação de 100x) do sistema onde a largura mediana para nanofibras está na faixa de 8\u201212 nm. Em concentrações significativamente acima do CMC, os nanotubos γPNA parecem formar conjuntos de ordem mais alta através de estruturas nanotubos altamente em rede. A figura foi modificada com permissão do Ref15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Saída de string de script MATLAB "thisSeq" | Pontuação de penalidade "thisScore" | ||
| 'acttcgctaaaaa cgaagtgagga cagtatttcctc aacgagaacacc ctcgttgcccgc ttttaggcgggc ggattgatactg caatcccatagc ggtgttgctatg ' | 0.08 | ||
| 'ccctcccgaccg ggagggttcagg cacttgcctgaa tggcgttgctat acgccattccaa cggtcgttggaa gagatacaagtg tatctcatttac atagcagtaaat ' | 0.0544 | ||
| 'tcgcaggagaca ctgcgaggataa aacggcttatcc ccacttgccccg aagtggacgatt tgtctcaatcgt aaatgtgccgtt acattttaccaa cggggcttggta ' | 0.0688 | ||
| 'gagccccctact gggctcttgata tttcgctatcaa tccacgaccgcc cgtggacaataa agtaggttattg acagatgcgaaa atctgttccttt ggcggtaaagga ' | 0.0528 | ||
| 'cgggagaaccac ctcccgtttagg cttgaccctaaa gcttacactcgc gtaagccgatga gtggtttcatcg gcaatagtcaag tattgccctgct gcgagtagcagg ' | 0.0656 | ||
| 'aatgagccgtgc ctcattttatct tagggcagataa ctttcgccacaa cgaaagcagtcc gcacggggactg caatacgcccta gtattggaggaa ttgtggttcctc ' | 0.0592 | ||
| 'gatggaagcccc tccatcgcctgt ccagagacaggc aagtcaagtagg tgacttttattg ggggctcaataa gcaacgctctgg cgttgctcggtg cctactcaccga ' | 0.0688 | ||
| 'tagccccccagt gggctatcgt ttcaggacgaga cttgcggtgtcg cgcaagagtatt actgggaatact gatttacctgaa taaatcaaaggc cgacacgccttt ' | 0.0656 | ||
| 'taggcaacagac tgcctaccactc tttggagagtgg tagcccctgcgg gggctattcatc gtctgtgatgaa ttcccgtccaaa cgggaaacctta ccgcagtaaggt ' | 0.0736 | ||
| 'aatgtgtctatc cacattcccttc cgccaagaaggg gtgctgttatgc cagcacgactaa gatagattagtc cctcggttggcg ccgaggtcaaac gcataagtttga ' | 0.0768 | ||
| 'ttggcgttatcc cgccaaatgctt ggacgaaagcat accgagtgaaca ctcggtggggtc ggataagacccc tctacatcgtcc tgtagagtgccc tgttcagggcac ' | 0.0576 | ||
| 'ctgtaaggtctc ttacaggtgctt cacgcaaagcac ttcgggatggag cccgaacaatct gagaccagattg gcggactgcgtg gtccgcctattt ctccataaatag ' | 0.072 | ||
| 'actccaatctat tggagttttgtt ctacccaacaaa cgctcaagtaat tgagcgaacggc atagatgccgtt ctgcgggggtag ccgcaggtcttc attactgaagac ' | 0.064 | ||
| 'ggttgttccacg acaacctgaagc ttatgtgcttca ttgccccgagcg gggcaatctttc cgtggagaaaga ctactgacataa cagtagacgatg cgctcgcatcgt ' | 0.0688 | ||
| 'gatttgctgtct caaatcccttct agcgttagaagg cataaaacccag tttatgcctcac agacaggtgagg ctacggaacgct ccgtagtcgtcc ctgggtggacga ' | 0.0688 | ||
| 'gaaggtctaatg accttcatcctg gcagttcaggat ttggtagcggag taccaaaaatcg cattagcgattt acgacaaactgc tgtcgtaagtgg ctccgcccactt ' | 0.0576 | ||
| 'tgtagttggtct actacacccttg ggacatcaaggg ttcggcaggcgg gccgaacgctaa agaccattagcg acgagtatgtcc actcgtattttg ccgcctcaaaat ' | 0.0624 | ||
| 'tggaaccttgta gttccattcgca atcacctgcgaa ccacacttactg gtgtggtcggct tacaagagccga ggcgttggtgat aacgccctatct cagtaaagatag ' | 0.0656 | ||
| 'agaggtcgtatt acctctgtgagt cggtttactcac actttccagcaa gaaagtccatcc aatacgggatgg tagcccaaaccg gggctaaggcga ttgctgtcgcct ' | 0.0688 | ||
| 'cggcaaactatg ttgccgatttct acttacagaaat cgtgtcctaaag gacacgggatgg catagtccatcc tgaggcgtaagt gcctcacagcga ctttagtcgctgg ' | 0.0704 | ||
Tabela 1: 20 resultados algorítmicos de amostra para otimização potencial do design de sequência γPNA. 20 resultados algorítmicos amostrais com saídas sequenciais na coluna 1 e sua pontuação correspondente na coluna 2. As iterações repetidas do script são realizadas para obter a pontuação mais mínima.
| ID de sequência γpNA | Seqüência | Complemento do domínio 1 | Complemento do domínio 2 |
| p1 | N-AATAGCGTTCAC-C | p2 domínio 1 | p6-Biotina domínio 1 |
| p2 | N-GCTATTGAGTAA-C | p1 domínio 1 | p3 domínio 2 |
| p3 | N-GACATCTTACTC-C | p7 domínio 2 | p2 domínio 2 |
| p4 | N-CTGGCGTGCGGA-C | p5 domínio 1 | p9 domínio 1 |
| p5 | N-CGCCAGCCCTCG-C | p4 domínio 1 | p6-Biotina domínio 2 |
| p6-Biotina | N-Biotin-GTGAACCGAGGG-C | p1 domínio 2 | p5 domínio 2 |
| p7 | N-AGTTTTGATGTC-C | p8-Cy3 domínio 1 | p3 domínio 1 |
| p8-Cy3 | N-Cy3-AAAACTACAGAA-C | p7 domínio 1 | p9 domínio 2 |
| p9 | N-TCCGCATTCTGT-C | p4 domínio 2 | p8-Cy3 domínio 2 |
Tabela 2: resultados de projeto de sequência γPNA para nanofibras. Sequências individuais de oligômeros foram geradas conforme indicado nesta tabela. Bases sublinhadas indicam as modificações de posição gama com mini-PEG. A tabela foi modificada com permissão do Ref15.
| Faixa de Temperatura | Taxa de rampa |
| 90 °C | Segure por 3 minutos |
| 90-80 °C | 0,1°C/minuto |
| 80-70 °C | 0,1°C/minuto |
| 70-60 °C | 0,1°C/3 minutos |
| 60-50 °C | 0,1°C/3 minutos |
| 50-40 °C | 0,1°C/3 minutos |
| 40-30 °C | 0,1°C/minuto |
| 30-20 °C | 0,1°C/minuto |
| 4 °C | Mantenha-se indefinida |
Tabela 3: Protocolo de rampa de anneal para ciclofaixa térmica. A tabela foi modificada com permissão do Ref15.
| Concentração de estoque | 75% DMSO: água (v/v) amostra de anneal | 75% DMF: água (v/v) amostra de anneal | 40% de dioxano: água (v/v) amostra de anneal | Concentração Final | |
| γPNA oligômero (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | - | - | 75 % (v/v) |
| Dmf | - | - | 30 μL | - | 75 % (v/v) |
| 1,4-dioxano | - | - | - | 16 μL | 40 % (v/v) |
| água deionizada | - | 1 μL | 1 μL | 15 μL | 25 ou 60% (v/v) |
| Volume total | - | 40 μL | 40 μL | 40 μL | - |
Tabela 4: Protocolo para a preparação de lotes anneal de oligômero γPNA em diferentes condições de solvente.
| ID de sequência de DNA | Seqüência |
| D1 | 5'-AATAGCGTTCAC-3' |
| D3 | 5'-GACATCTTACTC-3' |
| D4 | 5'-CTGGCGTGCGGA-3' |
| D5 | 5'-CGCCAGCCCTCG-3' |
| D7 | 5'-AGTTTTGATGTC-3' |
| D9 | 5'-TCCGCATTCTGT-3' |
Tabela 5: Sequências de DNA isosequenciais como oligômeros substitutos ao γPNA. A tabela foi modificada com permissão do Ref15.
| Concentração de estoque | DNA Substituições de fios contíguos | Substituições de fios de crossover de DNA | Concentração Final | |
| γPNA oligômero (x6) | 20 μM | 6 μL (1 μL x 6) | 6 μL (1 μL x 6) | 500 nM |
| Oligômero de DNA (x3) | 20 μM | 3 μL (1 μL x 3) | 3 μL (1 μL x 3) | 500 nM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| água deionizada | - | 1 μL | 1 μL | 25 % (v/v) |
| Volume total | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabela 6: Protocolo para preparação de lotes anneal de nanoestruturas híbridas γPNA-DNA em 75% DMSO: H2O (v/v) através da substituição de oligômeros γPNA contíguos ou crossovers por oligômeros de DNA isosequenciais.
| Concentração de estoque | Concentrações de SDS abaixo de CMC | Concentrações de SDS acima de CMC | Concentração Final | |
| γPNA oligômero (x9) | 20 μM | 9 μL (1 μL x 9) | 9 μL (1 μL x 9) | 500 nM |
| 6% SDS | 6% (wt/v) | 1 μL | - | 5,25 mM |
| 20% SDS | 20% (wt/v) | - | 1 μL | 17,5 mM |
| Dmso | - | 30 μL | 30 μL | 75 % (v/v) |
| água deionizada | - | - | - | 25 % (v/v) |
| Volume total | - | 40 μL | 40 μL | - |
Tabela 7: Protocolo para preparação de lotes anneal de nanoestruturas γPNA em 75% DMSO: H2O (v/v) na presença de concentrações de SDS abaixo e acima de CMC.
Figura suplementar 1: Roteiro de programação PNA3nanofiber.m para projetar sequências de oligômeros. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Este artigo se concentra na adaptação e melhoria dos protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico existentes para misturas orgânicas de solventes. Os métodos descritos aqui se concentram em modificações e solução de problemas dentro de um espaço experimental definido de solventes orgânicos apóticos polares selecionados. Ainda há potencial inexplorado para que outros protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico estabelecidos sejam adaptados dentro deste espaço. Isso poderia melhorar aplicações potenciais através da integração em outros campos, como a síntese de polímeros e peptídeos, que normalmente são realizadas em solventes orgânicos similares25,26. Além disso, focamos aqui em passos críticos a serem observados enquanto praticamos os protocolos acima mencionados.
Durante a preparação da amostra para automontagem, é importante manter os percentuais de volume de água em 25% (v/v) para as condições de DMSO e DMF. Assim, é importante reconhecer que o solvente orgânico utilizado para a automontagem deve ser também de estoques anidros. As estruturas de nanofibra são hidrofóbicas e agregadas no aumento do teor de água.
Ao contrário das abordagens de origami de DNA andaimes que podem criar estruturas de comprimentos discretos, o design atual de motivo sst para nanofibras γPNA e outros nanotubos SST de DNA previamente estabelecidos não produz estruturas de comprimentos discretos. Nanotubos polimerizam alcançando uma gama de comprimentos multi-mícrons (até 11 μm). Pela mesma razão, o rendimento associado à formação da estrutura não pode ser quantificado.
No entanto, devido à espinha dorsal do peptídeo não cobrado de γPNA, não há dependências do equilíbrio contra íon em relação à formação da estrutura. Os buffers de imagem, portanto, não precisam incluir frases como mg2+ normalmente necessárias para a estabilização de nanoestruturas feitas a partir de ácidos nucleicos de ocorrência natural.
Por fim, o agrupamento e a agregação de nanoestruturas γPNA em diferentes condições de solventes também dependem das concentrações individuais de oligômeros introduzidas durante a automontagem. Concentrações que variam de 1 μM e mais alto de oligômeros individuais aumentam a propensão para agrupamento e agregação e afetam imagens claras de nanoestruturas durante a imagem TIRF ou TEM.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de Ciência 1739308, bolsa NSF CAREER 1944130 e pelo Escritório da Força Aérea de Pesquisa científica número FA9550-18-1-0199. As sequências γPNA foram um presente generoso do Dr. Tumul Srivastava da Trucode Gene Repair, Inc. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Erik Winfree e ao Dr. Rizal Hariadi por suas conversas úteis sobre o código MATLAB da Caixa de Ferramentas de DESIGN de DNA. Gostaríamos também de agradecer a Joseph Suhan, Mara Sullivan e ao Centro de Imagem Biológica por sua assistência na coleta de dados TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
References
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