Este artigo fornece protocolos para o projeto e auto-montagem de nanoestruturas de oligômeros de ácido nucleírico de peptídeos modificados gama em misturas de solventes orgânicos.
As estratégias atuais em nanotecnologia de DNA e RNA permitem a auto-montagem de uma variedade de nanoestruturas de ácido nucleico em mídia aquosa ou substancialmente hidratada. Neste artigo, descrevemos protocolos detalhados que permitem a construção de arquiteturas de nanofibra em misturas de solventes orgânicos através da auto-montagem de telhas de nucleículos de peptídeos exclusivamente endereçadas, de fio único e gama modificadas (γPNA). Cada telha de fio único (SST) é um oligômero γPNA de 12 bases composto por dois domínios modulares concatenados de 6 bases cada. Cada domínio pode se ligar a um domínio mutuamente gratuito presente em vertentes vizinhas usando complementaridade programada para formar nanofibras que podem crescer até mícrons de comprimento. O motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices. Em contraste com nanoestruturas análogas de DNA, que formam estruturas monodispersas de diâmetro, esses sistemas γPNA formam nanofibras que se agrupam ao longo de suas larguras durante a auto-montagem em misturas orgânicas de solventes. Os protocolos de automontagem descritos aqui, portanto, também incluem um surfactante convencional, Sulfato de Dodecil de Sódio (SDS), para reduzir os efeitos de agrupamento.
Construção bem sucedida de numerosas nanoestruturas complexas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 em mídia aquosa ou substancialmente hidratada feita utilizando ácidos nucleicos de ocorrência natural, tais como DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e RNA11,12 foi mostrado em trabalhos anteriores. No entanto, os ácidos nucleicos de ocorrência natural sofrem alterações conformais helical duplex ou têm estabilizações térmicas reduzidas nas misturas de solventes orgânicos13,14.
Anteriormente, nosso laboratório relatou um método para a construção de nanofibras de 3 hélices usando mímicas de ácido nucleico sintético modificadas de posição gama chamadas ácidos nucleíricos gama-peptídeos (γPNA)15 (Figura 1A). A necessidade de tal desenvolvimento e aplicações potenciais do ácido nucleico sintético imita pna tem sido discutida no campo16,17. Temos mostrado, através de uma adaptação da estratégia de azulejos mono-encalhados (SST) apresentada para nanoestruturas de DNA18,19,20, que 9 oligômeros γPNA sequencialmente distintos podem ser projetados para formar nanofibras de 3 hélices em misturas de solventes orgânicos aprotic polares selecionados, como DMSO e DMF. Os oligômeros γPNA foram ordenados comercialmente com modificações de (R)-dietileno glicol (mini-PEG) em três posições de γ (1, 4 e 8 posições-base) ao longo de cada oligômero de 12 bases com base em métodos publicados por Sahu et al. 21 Essas modificações gama causam a pré-organização helicoidal associada à maior afinidade de ligação e estabilidade térmica de γPNA em relação ao PNA não modificado.
Este artigo é uma adaptação do nosso trabalho relatado no qual investigamos os efeitos da solução solvente e substituição com DNA na formação de nanoestruturas baseadas em γPNA15. O objetivo deste artigo é fornecer descrições detalhadas do projeto, bem como protocolos detalhados para métodos adaptados a solventes que foram desenvolvidos para a auto-montagem e caracterização da nanofibra γPNA. Assim, introduzimos pela primeira vez a estratégia modular SST, uma plataforma geral para o design de nanoestrutura usando o ácido nucleico sintético imitar PNA.
O tom helicoidal para duplexes PNA foi relatado como sendo de 18 bases por turno em comparação com duplexes de DNA, que passam por uma curva por 10,5 bases(Figura 1B). Portanto, o comprimento de domínio dos SSTs γPNA demonstrados foi definido em 6 bases para acomodar um terço de uma curva completa ou 120° de rotação para permitir a interação entre três helices triangularmente dispostas. Além disso, ao contrário dos motivos SST anteriores, cada SST contém apenas 2 domínios, criando efetivamente uma estrutura de fita 1-dimensional que envolve para formar um feixe de três hélices(Figura 1C). Cada oligômero γPNA de 12 bases é modificado gama nas posições 1, 4 e 8 para garantir uma distribuição uniformemente espaçada de grupos mini-PEG em todo o motivo SST global. Além disso, dentro do motivo, existem dois tipos de oligômeros: fios “contíguos” que existem em uma única hélice e fios “crossover” de hélice(Figura 1D). Além disso, os oligômeros P8 e P6 são rotulados com Cy3 fluorescente (estrela verde) e biotina (oval amarelo),respectivamente (Figura 1D),para permitir a detecção da formação da estrutura usando microscopia de fluorescência. Ao todo, o motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices através da complementaridade programada de cada domínio individual ao domínio correspondente em um oligômero vizinho(Figura 1E).
Este artigo se concentra na adaptação e melhoria dos protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico existentes para misturas orgânicas de solventes. Os métodos descritos aqui se concentram em modificações e solução de problemas dentro de um espaço experimental definido de solventes orgânicos apóticos polares selecionados. Ainda há potencial inexplorado para que outros protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico estabelecidos sejam adaptados dentro deste espaço. Isso poderia melhorar aplicações potenci…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de Ciência 1739308, bolsa NSF CAREER 1944130 e pelo Escritório da Força Aérea de Pesquisa científica número FA9550-18-1-0199. As sequências γPNA foram um presente generoso do Dr. Tumul Srivastava da Trucode Gene Repair, Inc. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Erik Winfree e ao Dr. Rizal Hariadi por suas conversas úteis sobre o código MATLAB da Caixa de Ferramentas de DESIGN de DNA. Gostaríamos também de agradecer a Joseph Suhan, Mara Sullivan e ao Centro de Imagem Biológica por sua assistência na coleta de dados TEM.
γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |