Summary
L’amputation de membre inférieur peut se produire même après angioplastie des vaisseaux obstrués dans l’ischémie critique de membre (CLI). Les cellules progénitrices mononucléaires (PMC) reflètent la réparation vasculaire. Le protocole actuel décrit la quantification des MPCs de la circulation près de l’angioplastie, et sa relation avec le dysfonctionnement endothélial et la prédiction de l’amputation de membre inférieur.
Abstract
L’ischémie critique de membre (CLI) représente un stade avancé de la maladie artérielle périphérique. L’angioplastie améliore le flux sanguin vers le membre inférieur; cependant, quelques patients progressent irréversiblement à l’amputation de membre. L’étendue des dommages vasculaires et les mécanismes de réparation vasculaire sont des facteurs affectant des résultats post-angioplastie. Les cellules progénitrices mononucléaires (PMC) sont réactives aux dommages vasculaires et à la réparation, avec la capacité de refléter des maladies vasculaires. Le présent protocole décrit la quantification des MPCs obtenus de la circulation sanguine du navire près du site d’angioplastie, aussi bien que sa relation avec le dysfonctionnement endothélial et sa capacité prédictive pour l’amputation de membre dans les 30 prochains jours après angioplastie dans les patients présentant CLI.
Introduction
La maladie artérielle périphérique (PAD) est caractérisée par une obstruction vasculaire chronique et progressive avec limitation de l’approvisionnement en sang1. À l’échelle mondiale, le PAD des membres inférieurs touche environ 10 % de la population âgée, tandis que jusqu’à 7 % de ces cas sont soumis à l’amputation desmembres 2,3.
Critical Limb Ischemia (CLI) représente la présentation la plus sérieuse de PAD1. Les patients éprouvent habituellement la douleur au repos, aux ulcères, ou à la gangrène attribuables aux artères occluses ; tandis que le pronostic clinique est défavorable et marqué par un risque de 30% d’amputation et de mortalité de membre pendant 1an 3,4,5.
L’angioplastie est une procédure endovasculaire mini-invasive qui peut rétablir le flux sanguin vers le membre inférieur chez les patients atteints de CLI; cependant, quelques patients exigeront inévitablement l’amputation majeure de membre, même après thérapie d’angioplastie1,5. L’identification tôt des résultats défavorables après angioplastie est tout à fait valable, due à la possibilité de l’application de thérapie.
Les facteurs de risque traditionnels peuvent fournir une capacité prédictive limitée pour l’amputation majeure de membre dans les patients présentant CLI subissant l’angioplastie6. Les biomarqueurs orientés vers la pathophysiologie représentent de nouvelles méthodes avec des applications cliniques potentielles, qui peuvent résulter spécifiquement utiles dans les maladies liées aux dommagesvasculaires 7. Aujourd’hui, la participation des populations cellulaires propriétaires de propriétés de réparation endothéliale, sur le site de la plaque athéroclérotique, a été de plus enplus reconnue 8,9.
Les cellules progénitrices mononucléaires (PMC) sont dérivées de la moelle osseuse et possèdent des caractéristiques structurelles et fonctionnelles des cellules souches ayant des capacités régénératrices vasculaires. En raison de la capacité de MPC à proliférer, migrer et montrer l’adhérence vasculaire ; ces cellules sont devenues de bons candidats pour refléter la réparation endothéliale en réponse à l’ischémie10,11,12. En outre, l’intérêt continu pour les mécanismes sous-jacents aux lésions vasculaires a motivé l’exploration du rôle pronostique des biomarqueurs locaux, puisqu’ils sont considérés comme refléter les dommages vasculaireset la réparation 7,13,14.
Le but de la présente étude est de décrire comment déterminer la quantité de MPCs qui circulent près de l’obstruction vasculaire dans les patients présentant CLI subissant l’angioplastie ; et comment évaluer la relation entre les CPM avec des indicateurs de dysfonctionnement endothélial et d’amputation des membres.
Comparé au pronostic basé sur des comorbidités et des dispositifs vasculaires intrinsèques, la quantité de MPCs locaux montrent la capacité spécifique de prévoir des résultats cliniques concernant le dysfonctionnement endothélial et l’amputation de membre. Uniformément, quelques études ont décrit le rôle pronostique des biomarqueurs semblables pendant l’évaluation des patients présentant PAD15,16.
Basé sur des résultatsprécédents 7,la méthode décrite ici peut être utile pour une identification tôt de la population à risque des résultats vasculaires défavorables dans plusieurs arrangements cliniques, tels que l’ischémie inférieure de membre et de coronaire, course, vascularite, thrombose veineuse et d’autres impliquant des dommages vasculaires et la réparation.
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Protocol
Le comité d’éthique de la recherche institutionnelle du Centro Médico Nacional « 20 de Noviembre » ISSSTE a approuvé ce protocole prospectif, tous les patients inscrits ont fourni un consentement écrit éclairé.
1. Évaluation du bloc vasculaire du membre inférieur, de l’échantillonnage sanguin et de l’angioplastie de ballon
REMARQUE : L’échantillon d’étude utilisé pour cette expérience comprenait 20 patients diabétiques, âgés de 68 ans et 10 sur 20 étaient des hommes. La moitié de l’échantillon étaient des fumeurs et les comorbidités les plus répandues étaient le diabète sucré de type 2, l’hypertension artérielle systémique et/ou la dyslipidémie. L’échantillon devait être normalisé pour les morbidités liées à l’âge, au sexe et à la comorbidité. Il n’a pas été possible d’écarter les biais possibles en raison de l’influence clinique et démographique sur la relation entre les CPM et l’IPC.
- Évaluer la gravité clinique de l’ischémie des membres selon la classification13 de Rutherford (voir tableau supplémentaire 1).
- Effectuer l’angiographie des membres inférieurs, l’échantillonnage sanguin et l’angioplastie ballon.
- Utilisez des médicaments anticoagulants et anesthésiques avant la chirurgie.
- Placez une aiguille de 18 G dans le vaisseau sanguin à l’emplacement de l’aine sélectionné.
- Placez un introduction et avancez un fil de guidage flexible. Ensuite, le guide initial est encore modifié pour un introducer 6 Fr.
- Utiliser l’injection périodique de supports de contraste ou de CO2 sous guide fluoroscopique pour identifier la trajectoire des artères et les sites vasculaires bloqués (figure 1).
REMARQUE : Utilisez des supports de contraste 40 cc, dilués 1:1 dans 0,9 % salins, ou CO2 à 10 à 20 mL par tir à une pression de 12 psi. - Introduisez deux fils de guidage de navigation 0.014 Fr et deux fils de guidage de soutien 0.014 Fr dans le navire et avancez-les jusqu’au site bloqué.
REMARQUE: Deux fils de guidage 0.014 Fr (260 cm de long) sont utilisés pour la navigation et deux fils de guidage 0.014 Fr (260 cm de long) sont utilisés pour le support, au cours d’une seule procédure. - Introduire 5 Cathéters Fr et 3 Fr séquentiellement et recueillir 10 mL de sang à partir du site le plus proche de l’obstruction vasculaire. Maintenez des échantillons de sang sur la glace.
REMARQUE : Les tailles des cathéters peuvent être de 5 Fr et 3 Fr, et elles sont modifiées pendant la procédure. - Avancez à nouveau un fil de guidage. Ensuite, introduire un cathéter ballon angioplastie, qui contient un ballon gonflable situé à l’extrémité du cathéter. Avancez le cathéter ballon angioplastie et placez le ballon directement sur le site de la lésion. Effectuez l’angioplastie en gonflant le ballon contre la plaque de blocage située à la paroi vasculaire. Vérifiez la restauration du flux sanguin.
REMARQUE : Un stent peut être placé dans la zone bloquée pour aider à garder l’artère ouverte après l’intervention. - Introduire un cathéter et avancer jusqu’au site le plus proche du bloc vasculaire. Recueillir 10 mL de sang à 30 minutes d’intervalle après l’angioplastie. Maintenez des échantillons de sang sur la glace.
REMARQUE : Il est recommandé de prélever des échantillons de sang avant et après l’angioplastie afin d’évaluer davantage l’influence de l’angioplastie sur le nombre de MPC. - Retirez tous les fils sous guidage fluoroscopique.
- Fournir des procédures de soins postopératoires, y compris la thérapie anti-coagulation à l’aide d’enoxaparine à 1 mg/kg sous-cutané toutes les 12 h, aspirine 100 mg, statine, et analgésie. Compresser sur le site de la ponction vasculaire pendant 24 h.
2. Quantification des cellules progénitrices mononucléaires en circulation (CPM) (Figure 2)
- Dans un nouveau tube conique de 15 mL, transférer 6 mL du sang recueilli et diluer 1:1 (v/v) avec PBS.
REMARQUE : Traiter le sang dans les 1 h de la collecte. - Préparez-vous à la séparation du gradient de densité, en ajoutant 2 mL de gradient de densité moyen à 3 tubes à essai chacun. Ensuite, ajouter 3 aliquots de volume égal du sang dilué dans chaque tube à essai.
REMARQUE : Ne dépassez pas les trois quarts de la capacité maximale du tube à essai. - Centrifugeuse à 1 800 x g pendant 30 min à 4 °C. Recueillir la couche d’interface présente comme un anneau à l’aide d’une pipette, et transférer dans un nouveau tube. Ajouter 2 mL de PBS et tourner à 1 800 x g pendant 6 min à 4 °C. Enregistrez la pastille car cela contiendra des CPM.
- Lavez la pastille contenant des MPCs avec du PBS par centrifugation tel que décrit à l’étape 2.3. Utilisez du PBS frais pour chaque lavage et faites tourner à 1 800 x g pendant 2 min à 4 °C. Répétez le processus pendant 6 fois.
- Après le dernier lavage, utilisez 1 mL de PBS pour réutiliser la pastille cellulaire. Diluer 20 μL de la suspension cellulaire avec 20 μL de 0,4% de bleu trypan, 1:1 (v/v). Utilisez 10 μL de cette suspension cellulaire pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope léger.
- Aliquot 1 x 106 MPCs dans des tubes de cytométrie d’écoulement précédemment étiquetés 5 mL.
REMARQUE : Préparez des anticorps de contrôle correspondants appariés à l’isotype. - Centrifugeuse les tubes à 1 800 x g pendant 6 min à 4 °C. Aspirer et jeter le surnatant.
- Diluer l’anticorps primaire dans 100 μL de solution d’incubation d’anticorps [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] et ajouter au tube. Resuspendez pendant 10 s et incubez pendant 20 min à 4 °C, dans l’obscurité.
REMARQUE : Les concentrations finales d’anticorps primaires utilisés dans le présent protocole étaient CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Le protocole peut être arrêté à cette étape en fixant des lymphocytes dans le paraformaldéhyde de 4% dans PBS et en stockant des échantillons jusqu’à 24 h à 4 °C. - Centrifugeuse à 1 800 x g pendant 2 min à 4 °C et jeter le supernatant. Resuspendez en 500 μL de 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
- Effectuez l’analyse de cytométrie de flux.
- Configurez l’arrière-plan avec des anticorps de contrôle appariés à l’isotype. Puis, à la parcelle FSC/SSC, certains lymphocytes se propagent, essayant d’exclure les débris cellulaires, les granulocytes résiduels et d’autres particules. Cette distribution est considérée comme 100%.
REMARQUE : Les lymphocytes se propagent habituellement dans la région inférieure gauche de la parcelle. - Utilisez une porte avec immunophénotype commun contenant un nombre élevé de cellules CD45+ et CD34+. Ensuite, sélectionnez pour les immunophénotypes double positif à l’aide de la porte qui a précédemment identifié CD45+, CD34+, et en ajoutant soit KDR (VEGFR-2)+, CD133+ ou CD184+. Identifier les sous-populations de PMC par leurs marqueurs spécifiques de surface cellulaire. Indiquez le pourcentage d’événements fermés.
- Configurez l’arrière-plan avec des anticorps de contrôle appariés à l’isotype. Puis, à la parcelle FSC/SSC, certains lymphocytes se propagent, essayant d’exclure les débris cellulaires, les granulocytes résiduels et d’autres particules. Cette distribution est considérée comme 100%.
- Identifier les principales sous-populations de PMC. Dans la présente étude, les immunophénotypes analysés étaient CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ et CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
REMARQUE : Ces marqueurs de surface cellulaire ont été utilisés pour l’étude : CD45 (lymphocytes), CD34 (cellules endothéliales et/ou vasculaires), KDR (VEGFR-2) (marqueur membranaire des cellules endothéliales), CD133 (cellules progénitrices endothéliales) et CD184 (cellules souches hématopoïétiques et cellules endothéliales).
3. Relation des CPM avec modification de la fonction endothéliale et du test hémodynamique (FMD)
- Déterminer la dilatation par céphalo-céphalie (FIÈVRE APF), avant et après l’angioplastie.
- Utilisez un transducteur linéaire vasculaire pour mesurer le diamètre de l’artère brachiale.
- Placez le brassard du sphygmomanomètre au-dessus du site de mesure dans l’avant-bras et insufflez à 50 mmHg au-dessus de la pression artérielle systolique pendant 5 min et dégonflez.
- Déterminez à nouveau le diamètre de l’artère brachiale dans les 60 s suivant. Utilisez l’équation ci-dessous pour estimer la fièvre aphteuse.
REMARQUE : Calculer le degré de dilatation à l’aide de l’équation (%) = (diamètre maximum après ischémie transitoire - diamètre basal) × 100 / diamètre basal.
- Corréler le nombre de CPM avec la valeur de la fièvre aphteuse de base et le delta post-angioplastie de la fièvre aphteuse.
4. Capacité pronostique des MPCs pour l’amputation de membre
- Planifiez des rendez-vous médicaux périodiques après l’angioplastie du ballon et la sortie du patient, afin d’évaluer la qualité du flux sanguin vers le membre inférieur.
- Évaluer la gravité clinique de l’ischémie des membres à 2 semaines après l’angioplastie. Évaluer la résolution des douleurs de repos, l’ischémie inférieure, et la préservation d’un pied fonctionnel, selon la classification Rutherford13.
- Comparez la sévérité clinique de l’ischémie de membre, à la ligne de base par rapport au suivi. Identifier les cas nécessitant une amputation majeure due à des résultats défavorables.
- Corréler le nombre de CPM avec la proportion de patients nécessitant une amputation majeure du membre inférieur.
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Representative Results
Des échantillons de sang provenant d’artères bloquées, sur le site traité pour angioplastie, ont été prélevés auprès de 20 patients diabétiques, âgés de 68 ans et 10 sur 20 étaient des hommes. La moitié de la population échantillonnée fumait. Les lésions vasculaires ont été principalement notées en tant que classe VI de Rutherford ; considérant que les patients présentaient une prévalence plus élevée de diabète sucré de type 2 (100 %), d’hypertension (70 %) dyslipidémie (55 %).
Un suivi clinique de 30 jours après angioplastie inférieure de membre a été effectué. Le pourcentage de sous-populations de MPC à la ligne de base ou la dynamique après angioplastie ont été corrélées (analyse de Spearman) avec le degré de dysfonctionnement endothélial, tel qu’évalué par FMD ; et le nombre de référence de MPCs ont été comparés entre les patients subissant, ou non, l’amputation de membre après angioplastie (U-Mann Whitney). L’étude a montré que les PMC de base sous-population CD45+CD34+KDR+ négativement corrélé avec fmd (Figure 3A, gauche), tandis que le changement de MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ après angioplastie significativement corrélé avec l’amélioration de la fièvre aphteuse (Figure 3B, droite). De plus, on a observé une augmentation du nombre de références de sous-populations de PMC CD45+CD34+KDR+ (figure 4A,B, gauche)chez les patients qui ont évolué vers l’amputation des membres; ainsi que la réduction post-angioplastie des PMC sous-population CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figure 4A,C, droite).
Figure 1 : Angiographie des membres inférieurs et collecte de sang. (A) Trajectoire vasculaire démontrée par les médias de contraste sous fluoroscopie. (B) Obstruction vasculaire avant angioplastie. (C) Obstruction vasculaire après angioplastie. (D) Chirurgien vasculaire utilise un cathéter pour recueillir le sang à partir de l’endroit le plus proche de l’obstruction vasculaire et la plaque d’athéromie, et chercheur de laboratoire est prêt à obtenir l’échantillon de sang. Les flèches indiquent le site des obstructions vasculaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Préparation de l’échantillon de sang et détermination des cellules progénitrices mononucléaires (CPM). (A) Préparation de gradient de densité. (B) Les lymphocytes sonnent la séparation après centrifugation du sang. (C) Collecte de la phase lymphocytes. (D) Centrifugation. (E) Formation de granulés au bas du tube à essai. (F) Nombre de suspensions cellulaires. (G) Préparation des lymphocytes pour la cytométrie d’écoulement. (H) Détermination des sous-populations cellulaires par cytométrie d’écoulement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Relation entre les CPM et les indicateurs hémodynamiques. (A) Position de l’échographie pour acquérir la fièvre aphteuse et les résultats représentatifs. (B) Relation entre les sous-populations de base %MPCs (gauche, CD45+CD34+KDR+; droite, CD45+CD34+CD133+CD184+) et les valeurs fmd de base; ainsi que la relation de (C) %MPCs après angioplastie avec l’amélioration de FMD après angioplastie. Abréviations : MPCs, Cellules progénitrices mononucléaires; FMD, Dilatation médiatisé par flux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : MPCs et pronostic de l’amputation de membre inférieur après angioplastie. (A) Images représentatives de cytométrie de flux des sous-populations de CPM. (B) L’association des sous-populations de base %MPCs (gauche, CD45+CD34+KDR+; droite, CD45+CD34+CD133+CD184+), ou (C) %MPCs après angioplastie, avec amputation des membres inférieurs après angioplastie, au cours d’un suivi de 30 jours. Abréviations : MPCs, Cellules progénitrices mononucléaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dossier supplémentaire 1 : Classification par Rutherford de la gravité de l’ischémie des membres. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La collecte de sang à l’emplacement précis du bloc vasculaire peut montrer des difficultés techniques ; par conséquent, nous avons effectué la collecte de sang à proximité du bloc vasculaire. De même, la quantité de MPCs près de la plaque vasculaire semble être fortement dynamique et peut provenir des variations avant et après l’angioplastie. Selon nos observations, il est recommandé d’évaluer les changements de base et de post-angioplastie de 30 min dans le nombre de MPCs, puisqu’ils peuvent refléter plusieurs processus pathophysiologiques se produisant dans les dommages et la réparation vasculaires.
Il est recommandé d’effectuer le traitement des échantillons de sang pour déterminer les CPM dans les 3 premières heures; par conséquent, un plan d’organisation adéquat, et même une pratique de simulation antérieure, peut être établi entre l’équipe de chirurgie angiologie-vasculaire et les chercheurs de laboratoire. L’isolement des CPM doit être soigneusement effectué, en particulier en déposant l’échantillon de sang dans le gradient de densité et les lavages de la pastille contenant des CPM. Notre groupe utilise pour transférer les cellules dans le tube de cytométrie, ajouter des anticorps primaires, fixer et stocker les cellules pendant la nuit à 4 °C; en raison de la commodité de l’administration du temps, et la lecture de cytométrie de débit serait effectuée le lendemain.
En ce qui concerne le rôle des PMC circulants en tant que biomarqueur clinique utile des dommages et de la réparation vasculaires, des efforts importants ont été rapportés pour normaliser des immunophénotypes entre les cellules progénitrices17. Une caractérisation complète devrait inclure des sous-populations de cellules progénitrices circulantes participant aux différents scénarios cliniques dans les maladies vasculaires. En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons constaté que la réduction post-angioplastie de mpcs sous-population CD45+CD34+CD133+CD184+ est prédictive pour l’amputation majeure. Cette conclusion soutient l’idée que la réponse inflammatoire pendant des dommages vasculaires ou l’angioplastie stimulent des signaux d’homing pour des MPCs, favorisant la réparation localede tissu 18,19.
De même, l’observation est compatible avec l’effet rapporté du nombre réduit de CD45+CD34+CD133+ et CD45+CD34+CD133+184+ sous-populations de PMCs comme prédicteur des résultats cardio-vasculaires défavorables après angioplastie coronaire7, ce qui peut s’expliquer par la capacité accrue de phénotypes moins différenciés des progéniteurs endothéliales à adhérer à la matrice extracellulaire, de proliférer et de répondre au stimulus vasculogénique18.
En outre, nous avons observé qu’un nombre accru de CD45+CD34+KDR+ sous-population de MPCs après angioplastie a été liée à l’amputation de membre bien qu’ils aient été considérés pour contribuer à la réparation vasculaire. Cette controverse peut s’expliquer par : 1) les variations dans la conception de l’étude, puisque d’autres études ont comparé le nombre de CD45+CD34+KDR+ MPCs entre les patients atteints de CLI et de contrôles sains19; 2) variations dans les méthodes d’échantillonnage sanguin, y compris le site et le temps concernant l’angioplastie; et 3) le type d’artère bloquée et vascularisée.
La caractérisation pronostique de nouveaux biomarqueurs, basée sur des mécanismes responsables de la réparation vasculaire dans plusieurs maladies, a reçu une attention significative dans la recherche translationnelle. C’est la première description d’une méthode pour explorer le rôle des MPCs, localement déterminés à un emplacement proche du bloc vasculaire, dans le pronostic de l’amputation de membre après angioplastie dans les cas avec CLI. Une limitation est le manque de détermination des PMC à plus de points de temps après l’angioplastie. Cependant, nous croyons que nos résultats enrichissent le domaine de la recherche vasculaire en caractérisant le rôle translationnel des MPCs pendant des dommages vasculaires, la réparation, et le potentiel pronostique pour l’amputation principale dans les patients présentant CLI. En particulier, nous considérons que la méthode décrite ici peut être utile dans la prédiction des résultats vasculaires défavorables dans les arrangements cliniques impliquant une blessure vasculaire et des mécanismes de réparation, tels que l’ischémie inférieure de membre et coronaire, course, vascularite, et/ou thrombose veineuse.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le soutien du Programme institutionnel E015 pour le projet ID 356.2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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