Summary
Amputation af underekstremiteterne kan forekomme selv efter angioplastik af blokerede beholdere i Critical Limb Ischemia (CLI). Mononukleare stamceller afspejler vaskulær reparation. Denne protokol beskriver kvantificeringen af MPC'er fra cirkulation tæt på angioplastik, og dens forhold til endotel dysfunktion og forudsigelse af underekstremitet amputation.
Abstract
Kritisk limbiskæmi (CLI) repræsenterer et fremskredent stadium af den perifere arteriel sygdom. Angioplastik forbedrer blodgennemstrømningen til underekstremiteterne; nogle patienter udvikler sig dog uigenkaldeligt til amputation af lemmer. Omfanget af vaskulære skader og mekanismerne for vaskulær reparation er faktorer, der påvirker resultatet efter angioplastik. Mononukleare stamceller (MPCs) er reaktive over for vaskulære skader og reparationer, med evnen til at afspejle vaskulære sygdomme. Denne protokol beskriver kvantificering af MPC'er opnået fra blodcirkulationen fra kar tæt på angioplastikstedet samt dets forhold til endotel dysfunktion og dets prædiktive evne til lem amputation i de næste 30 dage efter angioplastik hos patienter med CLI.
Introduction
Perifer arteriel sygdom (PAD) er kendetegnet ved en kronisk og progressiv vaskulær obstruktion med begrænsning afblodforsyningen 1. På globalt plan påvirker PAD af underekstremiteterne omkring 10% af den ældre befolkning, mens op til 7% af sådanne tilfælde underkastes lemmer amputation2,3.
Critical Limb Ischemia (CLI) repræsenterer den mest alvorlige præsentation af PAD1. Patienter oplever normalt smerter i hvile, sår, eller koldbrand kan henføres til okkluderede arterier; mens klinisk prognose er ugunstig og præget af en 30% risiko for amputation af lemmer og dødelighed i løbet af 1 år3,4,5.
Angioplastik er en minimalt invasiv endovaskulær procedure, der kan genoprette blodgennemstrømningen til underekstremiteterne hos patienter med CLI; nogle patienter vil dog uundgåeligt kræve amputation af større lemmer, selv efter angioplastikbehandling1,5. Tidlig identifikation af ugunstige resultater efter angioplastik er ret værdifuld på grund af muligheden for behandlingshåndhævelse.
Traditionelle risikofaktorer kan give en begrænset prædiktiv evne til amputation af større lemmer hos patienter med CLI, der gennemgår angioplastik6. Patofysiologiorienterede biomarkører repræsenterer nye metoder med potentielle kliniske anvendelser, hvilket kan resultere specifikt nyttigt i sygdomme relateret til vaskulær skade7. I dag er deltagelsen af cellulære befolkninger, der ejer endotelreparationsegenskaber, på stedet for den aterosklerotiske plak, i stigende grad blevet anerkendt8,9.
Mononukleare stamceller (MPC' er) er afledt af knoglemarven og egne strukturelle og funktionelle egenskaber ved stamceller med vaskulære regenerative evner. På grund af MPC's evne til at formere sig, migrere og vise vaskulær tilslutning; disse celler er blevet gode kandidater til at afspejle endotel reparation som reaktion på iskæmi10,11,12. Derudover har kontinuerlig interesse for mekanismer, der ligger til grund for vaskulær skade, motiveret udforskning af den prognostiske rolle hos lokale forekommende biomarkører, da de anses for at afspejle vaskulær skade og reparation7,13,14.
Formålet med denne undersøgelse er at beskrive, hvordan man bestemmer mængden af MPC'er, der cirkulerer tæt på den vaskulære obstruktion hos patienter med CLI, der gennemgår angioplastik; og hvordan man vurderer forholdet mellem MPCs med indikatorer for endotel dysfunktion og lemmer amputation.
Sammenlignet med prognosen baseret på comorbiditeter og iboende vaskulære træk viser mængden af lokale MPCs specifik evne til at forudsige klinisk resultat med hensyn til endotel dysfunktion og lemmer amputation. Konsekvent, nogle undersøgelser har beskrevet den prognostiske rolle lignende biomarkører under evalueringen af patienter med PAD15,16.
Baseret på tidligere resultater7, den metode, der er beskrevet her, kan være nyttig til en tidlig identifikation af befolkning med risiko for negative vaskulære resultater i flere kliniske indstillinger, såsom underekstremitet og koronarisk iskæmi, slagtilfælde, vaskulitis, venøs trombose og andre, der involverer vaskulær skade og reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionelle forskningsetiske komité fra Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE godkendte denne potentielle protokol, alle indskrevne patienter gav skriftligt informeret samtykke.
1. Vurdering af vaskulær blok af underekstremiteter, blodprøvetagning og ballon angioplastik
BEMÆRK: Den undersøgelsesprøve, der blev anvendt til dette eksperiment, bestod af 20 diabetikere i alderen 68 år og 10 ud af 20 var mænd. Halvdelen af prøven var rygere, og mest udbredte co-morbiditeter var type 2 diabetes mellitus, systemisk arteriel hypertension og / eller dyslipidemi. Prøven skulle standardiseres for alders-, sex- og co-morbiditeter. Mulig bias på grund af klinisk-demografisk indflydelse på forholdet mellem MPC'er og CLI kunne ikke udelukkes.
- Klinisk sværhedsgrad af iskæmi i henhold til Rutherford-klassifikation13 (se supplerende tabel 1).
- Udfør angiografi i underekstremiteterne, blodprøvetagning og ballon angioplastik.
- Brug antikoagulerende og bedøvende medicin før operationen.
- Placer en 18 G nål i blodkarret på lysken sted valgt.
- Placer en introducerer og fremme en fleksibel guide wire. Derefter ændres den oprindelige vejledning yderligere til en 6 Fr-introduktion.
- Brug periodisk injektion af kontrastmedier eller CO2 under fluoroskopisk vejledning til at identificere arteriebane og vaskulære blokerede steder (Figur 1).
BEMÆRK: Brug kontrastmedie 40 cc, fortyndet 1:1 i 0,9% saltvand, eller CO2 ved 10 til 20 mL per skud ved et tryk på 12 psi. - Introducer to 0,014 Fr navigation guide ledninger og to 0,014 Fr støtte guide ledninger ind i fartøjet og sende dem op til det blokerede sted.
BEMÆRK: To 0,014 Fr guide ledninger (260 cm lang) bruges til navigation og to 0,014 Fr guide ledninger (260 cm lang) bruges til støtte, under en enkelt procedure. - Indfør 5 Fr og 3 Fr katetre sekventielt og indsamle 10 mL blod fra det nærmeste sted til vaskulær obstruktion. Hold blodprøverne på is.
BEMÆRK: Katetre størrelser kan være 5 Fr og 3 Fr, og de ændres under proceduren. - Fremryk en føringsledning igen. Derefter indføre en angioplastik ballon kateter, som indeholder en oppustelig ballon placeret i slutningen af kateteret. Fremryk angioplastikballekateteret, og placer ballonen lige på læsionsstedet. Udfør angioplastik ved at puste ballonen op mod den blokerende plak, der er placeret ved vaskulær væg. Kontroller genoprettelsen af blodgennemstrømningen.
BEMÆRK: En stent kan placeres i det blokerede område for at hjælpe med at holde arterien åben efter proceduren. - Introducer et kateter og gå op til det nærmeste sted til den vaskulære blok. Der opsamles 10 mL blod ved 30 minutters tidsinterval efter angioplastik. Hold blodprøverne på is.
BEMÆRK: Indsamling af blodprøver før og efter angioplastik anbefales at foretage en yderligere vurdering af angioplastikkens indflydelse på antallet af MPC'er. - Fjern alle ledningerne under fluoroskopisk vejledning.
- Giv postoperative plejeprocedurer, herunder antikoaguleringsbehandling ved hjælp af enoxaparin ved 1 mg/kg subkutant hver 12. h, aspirin 100 mg, statin og analgesi. Komprimer på det sted, hvor vaskulær punktering under 24 timer.
2. Kvantificering af cirkulerende mononukleare stamceller (MPC' er) (figur 2)
- Til et friskt 15 mL konisk rør overføres 6 mL af det indsamlede blod og fortyndes 1:1 (v/v) med PBS.
BEMÆRK: Behandl blodet inden for 1 time fra indsamlingen. - Forbered dig på tæthed gradient adskillelse, ved at tilføje 2 mL af massefylden gradient medium til 3 reagensglas hver. Derefter tilsættes 3 lige store aliquots af det fortyndede blod i hvert reagensglas.
BEMÆRK: Reagensglassets maksimale kapacitet må ikke overstige tre fjerdedele. - Centrifuge ved 1.800 x g i 30 minutter ved 4 °C. Saml grænsefladelaget, der er til stede som en ring ved hjælp af en pipette, og overfør til et nyt rør. Der tilsættes 2 mL PBS, og der drejes ved 1.800 x g i 6 min ved 4 °C. Gem pellet som dette vil indeholde MPCs.
- Pellet, der indeholder MPC'er med PBS, vaskes ved centrifugering som beskrevet i trin 2.3. Brug frisk PBS til hver vask og spin ved 1.800 x g i 2 min ved 4 °C. Gentag processen i 6 gange.
- Efter den sidste vask skal du bruge 1 mL PBS til at genbruge cellepillen. 20 μL af celleophænget fortyndes med 20 μL på 0,4% trypanblå, 1:1 (v/v). Brug 10 μL af denne celleaffjedring til celletælling ved hjælp af hæmocytometer og et let mikroskop.
- Aliquot 1 x 106 MPC'er i tidligere mærkede 5 mL flow cytometry rør.
BEMÆRK: Forbered tilsvarende isotypematchede kontrolantistoffer. - Rørene centrifuges ved 1.800 x g i 6 min ved 4 °C. Aspirér og kassér supernatanten.
- Det primære antistof fortyndes i 100 μL antistofinkubationsopløsning [1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] og tilsættes til røret. Genbruges i 10 s og inkuberes i 20 min ved 4 °C, i mørke.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer af primære antistoffer, der anvendes i denne protokol, var CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Protokollen kan standses ved dette trin ved at fastgøre lymfocytter i 4% paraformaldehyd i PBS og opbevare prøver op til 24 timer ved 4 °C. - Centrifuge ved 1.800 x g i 2 min ved 4 °C og kassér supernatanten. Resuspend i 500 μL 1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM.
- Udfør flowcytometrianalyse.
- Opsæt baggrunden med isotype-matchede kontrolantistoffer. Derefter, på FSC / SSC plot vælge lymfocytter spredes, forsøger at udelukke cellulære vragrester, resterende granulocytter, og andre partikler. En sådan fordeling betragtes som 100%.
BEMÆRK: Lymfocytter spredes normalt i den nederste venstre region af plottet. - Brug en port med almindelig immunophenotype, der indeholder et stort antal celler CD45+ og CD34+. Vælg derefter for dobbelte positive immunophenotyper ved hjælp af gate, som tidligere identificerede CD45+, CD34+, og tilføj enten KDR (VEGFR-2)+, CD133+ eller CD184+. Identificer underpopulationer af MPC'er ved hjælp af deres specifikke celleoverflademarkører. Anmeld som procentdelen af lukkede hændelser.
- Opsæt baggrunden med isotype-matchede kontrolantistoffer. Derefter, på FSC / SSC plot vælge lymfocytter spredes, forsøger at udelukke cellulære vragrester, resterende granulocytter, og andre partikler. En sådan fordeling betragtes som 100%.
- Identificer de vigtigste delpopulationer af MPC'er. I denne undersøgelse blev de analyserede immunophenotyper CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ og CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
BEMÆRK: Disse celleoverflademarkører blev brugt til undersøgelsen: CD45 (lymfocytter), CD34 (endotel- og/eller vaskulære celler), KDR (VEGFR-2) (membranmarkør af endotelceller), CD133 (endotel stamceller) og CD184 (hæmatopoietiske stamceller og endotelceller).
3. Forholdet mellem MPC'er og ændring af endotelfunktion og hæmodynamisk test (MUNDD)
- Bestem flow-medieret diilation (MKS), før- og efter-angioplastik.
- Brug en vaskulær lineær transducer til at måle diameteren af brachial arterien.
- Sphygmomanometerets manchet anbringes over målestedet i underarmen og insufflaten ved 50 mmHg over det systoliske blodtryk i 5 minutter og tømmes.
- Bestem igen diameteren af brachial arterien inden for de næste 60 s. Brug ligningen nedenfor til at estimere mund- og klovsyge.
BEMÆRK: Beregn graden af dilatation ved hjælp af ligningen (%) = (maksimal diameter efter forbigående iskæmi - basaldiameter) × 100 / basaldiameter.
- Korrelere antallet af MPC'er med den grundlæggende FMD-værdi og post-angioplastik delta af mund- og klovsyge.
4. Prognostisk evne til MPCs for lemmer amputation
- Planlæg periodiske medicinske aftaler efter ballon angioplastik og patientudladning for at evaluere kvaliteten af blodgennemstrømningen til underekstremiteterne.
- Evaluere klinisk sværhedsgrad af lemmer iskæmi på 2 uger efter angioplastik. Vurder løse hvile smerter, lavere iskæmi, og bevarelse af en funktionel fod, i henhold til Rutherford klassificering13.
- Sammenlign klinisk sværhedsgrad af lemmer iskæmi, ved baseline versus opfølgning. Identificer de tilfælde, der kræver større amputation på grund af ugunstige udfald.
- Korrelere antallet af MPCs med andelen af patienter, der kræver større amputation af underekstremiteterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blodprøver fra blokerede arterier, på stedet adresseret til angioplastik, blev indsamlet fra 20 diabetikere, i alderen 68 år og 10 ud af 20 var mænd. Halvdelen af stikprøvepopulationen var rygere. Vaskulære læsioner blev hovedsageligt scoret som Rutherford klasse VI; der henviser til, at patienterne viste en højere prævalens af type 2-diabetes Mellitus (100 %), forhøjet blodtryk (70 %) og dyslipidemi (55%).
En 30 dages klinisk opfølgning efter underekstremitet angioplastik blev udført. Procentdelen af MPC-delpopulationer ved baseline eller dynamik efter angioplastik blev korreleret (Spearman-analyse) med graden af endotel dysfunktion, som evalueret af mund- og klovsyge; og baseline antallet af MPCs blev sammenlignet mellem patienter, der gennemgår, eller ej, lemmer amputation efter angioplastik (U-Mann Whitney). Undersøgelsen viste, at baseline-MPC'ers delpopulation CD45+CD34+KDR+ negativt korreleret med mund- og klovsyge(figur 3A, venstre), mens ændringen af MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ efter angioplastik i væsentlig grad korreleret med fmd-forbedring (Figur 3B, højre). Desuden blev der observeret et øget basistal for PPC'ers delpopulation CD45+CD34+KDR+ (Figur 4A, B, venstre) hos de patienter, der udviklede sig til amputation af lemmer; samt reduktion efter angioplastik af PPC'ers delpopulation CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figur 4A,C, til højre).
Figur 1: Angiografi og blodindsamling i underekstremiteterne. (A) Vaskulær bane fremgår af kontrast medier under fluoroskopi. (B) Vaskulær obstruktion før angioplastik. (C) Vaskulær obstruktion efter angioplastik. (D) Vaskulær kirurg bruger et kateter til at indsamle blod fra det nærmeste sted til vaskulær obstruktion og atheroma plaque, og Lab forsker er klar til at få blodprøven. Pile angiver stedet for vaskulære forhindringer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Præparat af blodprøver og bestemmelse af mononukleare stamceller (MPC'er). (A)Belægningsgradientforberedelse. (B) Lymfocytter ring adskillelse efter blod centrifugering. (C) Indsamling af lymfocytfasen. D) Centrifugering. (E) Pelletdannelse i bunden af reagensglasset. (F)Antal celleaffjedring. (G) Forberedelse af lymfocytter til strømningscytometri. (H) Bestemmelse af celleunderpopulationer ved strømningscytometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mpcs's forhold til hæmodynamiske indikatorer. (A) Placering af ultralyd til at erhverve mund- og klovsyge og repræsentative resultater. (b) Forholdet mellem delpopulationer af oprindelige %MP'er (venstre, CD45+CD34+KDR+; højre, CD45+CD34+CD133+CD184+) og oprindelige FMD-værdier samt forholdet mellem (C) %MPC efter angioplastik med forbedring af mund- og klovesyge efter angioplastik. Forkortelser: MPC'er, mononukleare stamceller; MKS, Flow medieret dirantering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: MPC'er og prognose for amputation af underekstremiteterne efter angioplastik. (A)Repræsentative flowcytometribilleder af mpc-delpopulationer. (B) Tilknytningen af delpopulationer af basislinjer %MP'er (venstre, CD45+CD34+KDR+; højre, CD45+CD34+CD133+CD184+) eller (C) %MPC efter angioplastik, med amputation af underekstremiteterne efter angioplastik, i løbet af en opfølgning på 30 dage. Forkortelser: MPC'er, mononukleare stamceller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Rutherford's klassificering af sværhedsgraden af lemmer iskæmi. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blodopsamling på det præcise sted for vaskulær blok kan vise tekniske vanskeligheder; derfor udførte vi blodopsamling i nærheden af vaskulær blok. Ligeledes mængden af MPCs tæt på vaskulære plak synes at være meget dynamisk og kan stamme variationer før og efter angioplastik. Ifølge vores observationer anbefales det at evaluere baseline- og 30min-post-angioplastik ændringer i antallet af MPC'er, da de kan afspejle flere patofysiologiske processer, der forekommer inden for vaskulær skade og reparation.
Blodprøvebehandling med henblik på bestemmelse af MPC'er anbefales at blive udført inden for de første 3 timer. Derfor kan der etableres en passende organisationsplan og endda en tidligere simuleringspraksis mellem angiologi-vaskulær kirurgiteam og laboratorieforskere. Isolering af MPC'er bør udføres omhyggeligt, især ved at afsætte blodprøven til tæthedsgradient og vask af pellet indeholdende MPC'er. Vores gruppe bruger til at overføre celler til cytometrirør, tilføje primære antistoffer, fiksere og opbevare celler natten over ved 4 °C; på grund af tidsstyring bekvemmelighed, og flow cytometry læsning ville blive udført dagen efter.
Med hensyn til den rolle, cirkulerende MPCs som en nyttig klinisk biomarkør af vaskulære skader og reparation, er der rapporteret om en vigtig indsats for at standardisere immunophenotyper mellem stamfaderceller17. En omfattende karakterisering bør omfatte delpopulationer af cirkulerende stamceller, der deltager i de forskellige kliniske scenarier inden for vaskulære sygdomme. Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet her, fandt vi, at post-angioplastik reduktion af MPCs subpopulation CD45+CD34+CD133+CD184+ er prædiktiv for større amputation. Denne konstatering understøtter forestillingen om, at inflammatorisk respons under vaskulær skade eller angioplastik stimulerer homing signaler til MPCs, fremme lokale væv reparation18,19.
På samme måde er observationen i overensstemmelse med den rapporterede effekt af reduceret antal CD45+CD34+CD133+ og CD45+CD34+CD133+184+ delpopulationer af MPC'er som en prædiktor for negative kardiovaskulære resultater efter koronar angioplastik7, hvilket kan forklares ved den øgede evne til mindre differentierede phenotyper af endotel progeneratorer til at overholde ekstraular matrix, at formere sig og reagere på vaskulogen stimulus18.
Desuden bemærkede vi, at et øget antal CD45+CD34+KDR+ delpopulation af MPC'er efter angioplastik var relateret til lemmer amputation, selv om de er blevet anset for at bidrage til vaskulær reparation. Denne kontrovers kan forklares på grund af: 1) variationer i undersøgelsens design, da andre undersøgelser har sammenlignet antallet af CD45+CD34+KDR+ MPCs mellem patienter med CLI og sunde kontroller19; 2) variationer i metoderne til blodprøvetagning, herunder stedet og tiden med hensyn til angioplastik og 3) typen af arterie blokeret og vaskkulært.
Prognostisk karakterisering af nye biomarkører, baseret på mekanismer, der er ansvarlige for vaskulær reparation i flere sygdomme, har fået betydelig opmærksomhed i translationel forskning. Dette er den første beskrivelse af en metode til at udforske den rolle, MPCs, lokalt bestemt på et sted tæt på vaskulær blok, i prognosen for lemmer amputation efter angioplastik i tilfælde med CLI. En begrænsning er manglen på MPCs bestemmelse på flere tidspunkter efter angioplastik. Vi mener dog, at vores resultater beriger vaskulær forskning ved at karakterisere MPCs's translationelle rolle under vaskulær skade, reparation og prognostisk potentiale for større amputation hos patienter med CLI. Især mener vi, at den metode, der er beskrevet her, kan være nyttig i forudsigelsen af negative vaskulære resultater i kliniske indstillinger, der involverer en vaskulær skade og reparationsmekanismer, såsom underekstremitet og koronarisk iskæmi, slagtilfælde, vaskulitis og / eller venøs trombose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker støtten fra Institutional Program E015 for projekt-id 356.2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford's vascular surgery (8th ed.). , Saunders Elsevier. Philadelphia, PA. (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O'Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
