Summary
即使严重肢体缺血（CLI）中受阻血管成形术，下肢截肢也可能发生。单核先天细胞（MPC）反映血管修复。本协议描述了从接近血管成形术的循环中量化MPC，以及它与内皮功能障碍和下肢截肢预测的关系。
Abstract
严重肢体缺血（CLI）代表外周动脉疾病的晚期。血管成形术改善下肢的血液流动：然而，一些患者不可逆转地进展到截肢。血管损伤程度和血管修复机制是影响血管成形术后结果的因素。单核先天细胞 （MPC） 对血管损伤和修复有反应，具有反映血管疾病的能力。本协议描述了从血管成形术部位附近的血管血液循环中获得的MPC的量化，以及它与内皮功能障碍的关系，以及CLI患者血管成形术后未来30天内截肢的预测能力。
Introduction
外周动脉疾病 （PAD） 的特点是慢性和渐进性血管阻塞，血液供应有限1.在全球范围内，下肢的PAD影响约10%的老年人口，而多达7%的此类病例被提交到截肢2，3。
关键肢体缺血症 （CLI） 代表了 PAD1的最严重表现。患者通常在休息时感到疼痛，溃疡或坏死可归因于动脉被遮挡：而临床预后不利，在1年3、4、5年内截肢及死亡的风险为30%。
血管成形术是一种微创的血管内程序，可以恢复血液流向下肢的患者与CLI：然而，一些患者将不可避免地需要截肢，即使在血管成形术治疗1，5。早期识别血管成形术后的不利结果是相当有价值的，由于治疗执行的可能性。
传统危险因素可能为接受血管成形术6的CLI患者的主要肢体截肢提供有限的预测能力。以病理生理学为导向的生物标志物代表具有潜在临床应用的新方法，在血管损伤相关疾病中可能特别有用。如今，拥有内皮修复性能的细胞种群在动脉粥样硬化斑块的所在地的参与，已日益得到认可。
单核先天细胞（MPC）源自骨髓，具有血管再生能力的干细胞具有自身的结构和功能特征。由于MPC具有扩散、迁移和显示血管依从性的能力;这些细胞已成为良好的候选者，以反映内皮修复，以回应缺血10，11，12。此外，对血管损伤基础机制的持续关注促使人们探索局部生物标志物的预后作用，因为它们被认为反映了血管损伤并修复了7、13、14。
本研究的目的是描述如何确定在进行血管成形术的CLI患者中，在血管阻塞附近传播的MPC数量：以及如何评估MPC与内皮功能障碍和截肢指标之间的关系。
与基于合并症和内脏血管特征的预后相比，局部MPC的数量显示出预测内皮功能障碍和截肢临床结果的具体能力。一直来，一些研究描述了类似的生物标志物在评估PAD15，16患者时的预后作用。
根据先前的结果7，这里描述的方法可能有助于早期识别在几个临床环境中有不良血管结果风险的人口，如下肢和冠状缺血，中风，血管炎，静脉血栓和其他涉及血管损伤和修复。
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Protocol
国家"20德诺维姆布雷"ISSTE中心的机构研究伦理委员会批准了这项未来的议定书，所有登记的患者均表示书面知情同意。
1. 下肢血管块评估、血液取样和气球血管成形术
注：用于此实验的研究样本包括20名糖尿病患者，年龄为68岁，20人中有10人为男性。样本中有一半是吸烟者，最常见的共病是2型糖尿病、全身动脉高血压和/或脂质血症。该样本旨在针对年龄、性别和共同发病率进行标准化。不能排除临床人口影响对MPC和CLI之间关系的可能偏差。
- 根据卢瑟福分类13（ 见 补充表1）评估肢体缺血的临床严重程度。
- 进行下肢血管造影、血液取样和气球血管成形术。
- 手术前使用抗凝血剂和麻醉药。
- 在选择的腹股沟部位将 18 G 针插入血管。
- 放置介绍器并推进灵活的导线。然后，对于 6 Fr 介绍器，初始指南将进一步更改。
- 在荧光指南下定期注射对比介质或 CO2，以确定动脉轨迹和血管阻塞部位（图 1）。
注：使用对比介质 40 cc，稀释 1：1 在 0.9% 盐水，或 CO2 在 10 到 20 mL 每枪在 12 psi 的压力。 - 将两根 0.014 Fr 导航导线和两根 0.014 Fr 支持导线引入船舶，并将它们推进到受阻地点。
注：在单个程序中，两根 0.014 Fr 导线（260 厘米长）用于导航，两根 0.014 Fr 导导导线（260 厘米长）用于支撑。 - 依次引入 5 Fr 和 3 Fr 导管，从离血管阻塞最近的部位收集 10 mL 血液。在冰上保持血液样本。
注：导管尺寸可能是5 Fr和3 Fr，并且它们在操作过程中会更改。 - 再次推进导线。然后，引入血管成形气球导管，其中包含位于导管末端的充气气球。推进血管成形气球导管，将气球放置在病变部位。通过将气球充气到血管壁上的块状斑块上来执行血管成形术。验证血流恢复。
注意：支架可能放置在阻塞区域，以帮助在手术后保持动脉打开。 - 引入导管，并推进到离血管块最近的部位。血管成形术后每隔30分钟采集10 mL的血液。在冰上保持血液样本。
注：建议在血管成形术前后采集血液样本，以进一步评估血管成形术对MPC数量的影响。 - 在荧光引导下取出所有电线。
- 提供术后护理程序，包括每12小时1毫克/千克皮下使用enoxaparin、阿司匹林100毫克、他汀类药物和镇痛药的抗凝固疗法。在24小时内在血管穿刺部位压缩。
2. 循环单核祖细胞（MPCs）的量化（图2）
- 到新鲜的 15 mL 圆锥管，转移收集的血液的 6 mL，用 PBS 稀释 1：1 （v/v）。
注：从采集开始，在1小时内处理血液。 - 准备密度梯度分离，通过增加2 mL的密度梯度介质到3个试管每个。然后，在每个试管中加入3个等量的稀释血液。
注意：不要超过试管最大容量的四分之三。 - 离心机在1，800 x g 30分钟，在4°C。 使用移液器将接口层作为环收集，并转移到一个新的管子中。添加 2 mL 的 PBS，并在 4 °C 下以 1，800 x g 旋转 6 分钟。 保存颗粒，因为这将包含MPC。
- 按照步骤 2.3 的描述，通过离心将含有 PBS 的 MPC 颗粒洗净。每次洗涤使用新鲜的 PBS，在 4 °C 下以 1，800 x g 旋转 2 分钟。 重复该过程6次。
- 最后一次清洗后，使用 1 mL 的 PBS 重新悬念细胞颗粒。稀释 20 μL 的细胞悬架，20 μL 的 0.4% 试盘蓝色，1：1 （v/v）。使用 10 μL 的这种细胞悬架，使用血细胞计和光显微镜进行细胞计数。
- Aliquot 1 x 106 MPC 在以前标记的 5 mL 流细胞管中。
注：准备相应的同型匹配控制抗体。 - 在 4 °C 下将管子在 1，800 x g 上离心 6 分钟。 吸气并丢弃超生剂。
- 稀释抗体孵化液中 100 μL 的原发性抗体 [1 倍 PBS、pH 7.4、EDTA 2 mM、BSA 0.05%]，并添加到管子中。在黑暗中暂停10秒，在4°C下孵育20分钟。
注：本协议中使用的主要抗体的最终浓度为 CD45 1：50、CD34 1：20、KDR 1：50、CD184 1：20、CD133 1：50。在此步骤中，可以通过在PBS中将淋巴细胞固定在4%的准甲醛中，并在4°C下将样品储存至24小时，从而停止协议。 - 离心机在 1，800 x g 2 分钟在 4 °C 和丢弃超纳坦。在500μL的1倍PBS，pH 7.4，EDTA 2 mM中重新悬索。
- 执行流细胞学分析。
- 设置具有同型匹配控制抗体的背景。然后，在FSC/SSC图中选择淋巴细胞扩散，试图排除细胞碎片、残留颗粒细胞和其他颗粒。这种分布被认为是100%。
注：淋巴细胞通常分布在地块的左下部区域。 - 使用含有大量细胞CD45+和CD34+的常见免疫型的门。然后，选择双阳性免疫型使用门，以前识别CD45+，CD34+，并添加KDR（VEGFR-2）+，CD133+或CD184+。 通过特定的细胞表面标记识别MPC子人口。报告为封闭事件的百分比。
- 设置具有同型匹配控制抗体的背景。然后，在FSC/SSC图中选择淋巴细胞扩散，试图排除细胞碎片、残留颗粒细胞和其他颗粒。这种分布被认为是100%。
- 识别 MPC 的主要子人口。在本研究中，分析的免疫型为CD45+CD34+CD133+CD45+CD34+CD184+CD45+CD34+CD133+CD184+：CD45+CD34+KDR+CD45+CD34+KDR+CD133+和 CD45+CD34+KDR+CD1847，17。
注：这些细胞表面标记用于研究：CD45（淋巴细胞）、CD34（内皮细胞和/或血管细胞）、KDR（VEGFR-2）（内皮细胞膜标记）、CD133（内皮祖细胞）和CD184（造血干细胞和内皮细胞）。
3. MPC 与内皮功能和血动力学测试 （FMD） 的修改的关系
- 确定流量介质拉长 （FMD），血管成形术前后。
- 使用血管直线传感器测量胸动脉的直径。
- 将植物烟雾计的袖口放在测量点上方的前臂上，在收缩压上方50 mmHg处放气5分钟，并放气。
- 在接下来的60年代内再次确定胸动脉的直径。使用下面的方程来估计 FMD。
注：使用方程（%）=（瞬态缺血后的最大直径-基底直径）×100/基底直径计算扩张程度。
- 将 MPC 的数量与 FMD 的基线 FMD 值和血管成形术后三角洲相关联。
4. 截肢的MPC的预后能力
- 安排气球血管成形术和患者出院后的定期医疗预约，以评估流向下肢的血液质量。
- 在血管成形术后2周评估肢体缺血的临床严重程度。根据卢瑟福分类13，评估解决休息疼痛，降低缺血和保存功能脚。
- 比较肢体缺血的临床严重程度，在基线与随访。确定因不良结果而需要严重截肢的病例。
- 将MPC的数量与需要截肢的下肢的患者比例联系起来。
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Representative Results
在血管成形术现场，从阻塞动脉采集的血液样本是从20名糖尿病患者身上采集的，年龄为68岁，20人中有10人为男性。样本人口中有一半是吸烟者。血管病变主要得分为卢瑟福六级：而患者显示2型糖尿病（100%）、高血压（70%）的患病率较高和血脂异常（55%）。
下肢血管成形术实施后30天的临床随访。血管成形术后基线或动力学的MPC亚人口百分比与内皮功能障碍程度相关（斯皮尔曼分析），FMD评估：在血管成形术（U-Mann惠特尼）之后接受或不进行肢体截肢的患者之间比较了MPC的基线数。研究表明，基线MPC亚人口CD45+CD34+KDR+负相关与FMD（图3A，左），而MPCCD45+CD34+CD133+CD184+血管成形术后的变化与FMD改善显著相关（图3B，右）。此外，在那些进化为截肢的患者中观察到MPC亚人口CD45+CD34+KDR+（图4A，B，左）的基线数量增加：以及血管成形术后减少MPC亚人口CD45+CD34+CD133+CD184+（图4A，C，右）。
图1：下肢血管造影和采血。（A） 在荧镜检查下，对比介质证明了血管轨迹。（B） 血管成形术前的血管阻塞。（C） 血管成形术后血管阻塞。血管外科医生使用导管从离血管阻塞和动脉瘤斑块最近的部位采集血液，实验室研究人员准备获取血液样本。箭头指示血管阻塞的部位。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：血液样本制备和单核祖细胞（MPC）测定。（A） 密度梯度准备。（B） 血离心后淋巴细胞环分离。（C） 淋巴细胞相的收集。（D） 离心。（E） 试管底部的颗粒形成。（F） 细胞悬架计数。（G） 为流动细胞学准备淋巴细胞。（H） 通过流动细胞学确定细胞亚人口。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：MPC与血动力学指标的关系。（A） 超声波的位置，以获得FMD和代表性的结果。（B） 基线% MPC 子人口 （左， CD45+CD34+KDR+：右， CD45+CD34+CD133+CD184+） 和基线 FMD 值之间的关系：以及血管成形术后（C）% MPCs 与血管成形术后 Fmd 改善的关系。缩写：MPC，单核先天细胞：FMD，流介质除污。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：血管成形术后下肢截肢的MPC和预后。（A） MPC 亚人口代表性流动细胞学图像。（B） 在30天的随访中，基线%MPCs亚人口（左，CD45+CD34+KDR+：右，CD45+CD34 + CD133+CD184+），或（C） % MPCs 后血管成形术， 血管成形术后下肢截肢。缩写：MPC，单核祖细胞。请点击这里查看此数字的较大版本。
补充文件1：卢瑟福对肢体缺血严重程度的分类。请点击这里下载此文件。
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Discussion
血管块精确部位的采血可能显示技术困难：因此，我们在靠近血管块的地方进行了采血。同样，接近血管斑块的MPC数量似乎具有高度动态性，并可能在血管成形术前后产生变异。根据我们的观察，建议评估血管成形术后基线和30分钟后MPC数量的变化，因为它们可能反映血管损伤和修复过程中发生的几个病理生理过程。
建议在前3小时内进行MPC测定的血液样本处理：因此，在血管外科团队和实验室研究人员之间可以建立适当的组织计划，甚至以前的模拟实践。应仔细进行MPC隔离，特别是将血液样本分解成密度梯度，并清洗含有MPC的颗粒。我们组用于将细胞转移到细胞管中，添加原发性抗体，修复和存储细胞过夜在4°C：由于时间管理方便，流量细胞读数将在后天进行。
关于循环MPC作为血管损伤和修复的有用临床生物标志物的作用，据报道，已作出重要努力，以规范祖细胞17之间的免疫表型。一个全面的特征应该包括参与血管疾病中不同临床场景的循环祖细胞的亚人口。使用此处描述的方法，我们发现MPC亚人口CD45+CD34+CD133+CD184+的血管成形术后减少对重大截肢具有预测性。这一发现支持了在血管损伤或血管成形术期间的炎症反应刺激MPC的定位信号，促进局部组织修复18，19的概念。
同样， 观察结果与CD45+CD34+CD133+和CD45+CD34+CD34+CD133+184+MPC亚人口减少的效果一致，作为冠心血管成形术7后心血管不良结果的预测因素，这可以解释为内皮祖细胞的分化程度较低表型的坚持细胞外基质的能力增加， 增殖和响应血管刺激18。
此外，我们观察到，血管成形术后MPC的CD45+CD34+KDR+亚人口数量增加与截肢有关，尽管它们被认为有助于血管修复。这种争议可以解释为：1）研究设计的变化，因为其他研究已经比较了CD45+CD34+KDR+MPC之间的CD45+CDR+MPC患者与健康对照19：2） 血液取样方法的变化，包括部位和血管成形术的时间：和3）动脉阻塞和血管化的类型。
基于几种疾病血管修复机制的新型生物标志物的预后特征，在转化研究中受到高度重视。这是探索MPC作用的方法的第一个描述，在靠近血管块的部位，在CLI的情况下，在血管成形术后截肢的预后。一个限制是血管成形术后在更多时间点缺乏MPC的确定。然而，我们相信，我们的发现丰富了血管研究领域，通过描述MPC在血管损伤、修复和预测CLI患者重大截肢过程中的转化作用。特别是，我们认为此处描述的方法可能有助于预测涉及血管损伤和修复机制的临床环境中的不良血管结果，如下肢和冠状缺血、中风、血管炎和/或静脉血栓形成。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢机构计划 E015 对项目 ID 356.2015 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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